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CN103069006A - 区别表达的胚胎或母源基因组区的鉴定及其用途 - Google Patents

区别表达的胚胎或母源基因组区的鉴定及其用途 Download PDF

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CN103069006A
CN103069006A CN2011800357719A CN201180035771A CN103069006A CN 103069006 A CN103069006 A CN 103069006A CN 2011800357719 A CN2011800357719 A CN 2011800357719A CN 201180035771 A CN201180035771 A CN 201180035771A CN 103069006 A CN103069006 A CN 103069006A
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CN
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embryonic
fetal
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CN2011800357719A
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T·斯固尔
V·R·埃克美弗
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Esoterix Genetic Laboratories LLC
Original Assignee
Esoterix Genetic Laboratories LLC
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Abstract

本发明提供鉴定和表征母源循环中区别表达的胚胎或母源基因组区的新方法。本发明的母源循环中过表达的胚胎基因组区的鉴定允许无需富集或纯化而胚胎DNA的精确的分析，其提供更简单的，更精确的和有效的早期怀孕中出生前诊断。本发明对于早期怀孕期间期间（例如,头三个月期间）非侵袭出生前诊断是特别有用的。

Description

区别表达的胚胎或母源基因组区的鉴定及其用途
【技术领域】
本申请要求2010年7月23日提交的美国临时申请No.61/367,254的优先权。美国临时申请No.61/367,254的公开通过引用以其整体在本文合并。
【背景技术】
母源循环中无细胞胚胎DNA的分子分析已显示为在胚胎非整倍性，其他胚胎遗传异常和怀孕并发症的非-侵袭性出生前诊断中许诺的方法。许多既有的诊断方法和技术一般在临床病例中良好实施，其中母源血浆中无细胞胚胎DNA的级分超过25%。但是，当治疗性干预不再是选项时，该水平的胚胎DNA一般仅在怀孕晚期达到。已观察到，母源血浆中的无细胞胚胎DNA的级分在妊娠的9和13周之间怀孕的头三个月内在0%到5～10%之间改变。为了在怀孕的头三个月内达到临床有用的精确度，任何目前开发的测定通常需要胚胎物质的显著富集。
【发明概述】
本发明提供用于母源循环中区别表达的（例如,过表达的或亚表达的）胚胎或母源基因组区的鉴定和表征的新方法。尤其是，本发明的母源循环中过表达的胚胎基因组区的鉴定可允许不富集或纯化地胚胎DNA的精确的分析，导致更简单的，更精确的和有效的出生前诊断测定。本发明是对于早期怀孕期间（例如,头三个月期间）非侵袭出生前诊断特别有用的。
在一些实施方式中，本发明提供鉴定母源样品中的区别表达的胚胎或母源基因组区的方法，包括下列步骤：定量存在于母源样品中的胚胎或母源基因组区；测定相比参照量的胚胎或母源基因组区的相对丰度，由此测定是否胚胎或母源基因组区在母源样品中区别表达；其中胚胎或母源基因组区不对应于非整倍性区。
在一些实施方式中，参照量指示母源样品中胚胎或母源核酸的平均表达。在一些实施方式中，测定相对丰度的步骤包括比较定量的量与参照量，而且其中如果定量的量以统计学置信不同于参照量，胚胎或母源基因组区被鉴定为在母源样品中区别表达。
在一些实施方式中，参照量指示母源样品中胚胎或母源核酸的过表达。在一些实施方式中，测定相对丰度的步骤包括比较定量的量与参照量，而且其中如果定量的量以统计学置信基本上相同于或大于参照量，胚胎或母源基因组区被鉴定为在母源样品中过表达。
在一些实施方式中，参照量指示母源样品中胚胎或母源核酸的亚表达。在一些实施方式中，测定相对丰度的步骤包括比较定量的量与参照量，而且其中如果定量的量以统计学置信基本上相同于或小于参照量，胚胎或母源基因组区被鉴定为在母源样品中亚表达。
在一些实施方式中，本发明的方法定量胚胎基因组区。在一些实施方式中，参照量指示母源样品中胚胎核酸的平均表达。在一些实施方式中，胚胎核酸的平均表达是5%。在一些实施方式中，如果定量的量在参照量以上，胚胎基因组区被鉴定为以统计学置信在母源样品中过表达。
在一些实施方式中，本发明的方法定量母源基因组区。在一些实施方式中，参照量指示母源样品中母源核酸的平均表达。在一些实施方式中，母源核酸的平均表达是95%。在一些实施方式中，如果定量的量在参照量以下，母源基因组区被鉴定为以统计学置信在母源样品中亚表达。
在一些实施方式中，本发明的方法的定量步骤包括定量胚胎基因组区和对应母源基因组区。在一些实施方式中，胚胎基因组区的相对丰度通过比较胚胎基因组区的定量的量与对应母源基因组区的定量的量来测定。在一些实施方式中，胚胎基因组区自对应母源基因组区特殊地可检测。在一些实施方式中，胚胎基因组区含有父源地贡献的序列。在一些实施方式中，胚胎基因组区含有不同于对应母源基因组区的序列。在一些实施方式中，胚胎基因组区含有至少一个不同于对应母源基因组区多态核苷酸。在一些实施方式中，胚胎基因组区含有不同于对应母源基因组区的甲基化模式。在一些实施方式中，胚胎基因组区相比对应母源基因组区含有拷贝数变异（CNV）。
在一些实施方式中，本发明的方法以高通量形式实施。在一些实施方式中，本发明的方法同时定量多个胚胎或母源基因组区。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括下列步骤：首先自母源样品制备总DNA。在一些实施方式中，本发明的方法还包括下列步骤：首先自母源样品制备无细胞DNA。在一些实施方式中，本发明的方法还包括下列步骤：首先产生含有待定量的胚胎或母源基因组区的核酸片段。
在一些实施方式中，适合于本发明的母源样品选自：细胞，组织，全血，血浆，血清，尿，粪便，唾液，脐带血，绒毛膜绒毛样品，绒毛膜绒毛样品培养物，羊水，羊水培养物，经子宫颈灌洗液，及其组合。在特定实施方式中，适合于本发明的母源样品是母源血。
在一些实施方式中，适合于本发明的母源样品从一个个体得到。在一些实施方式中，适合于本发明的母源样品从多个个体得到。
在一些实施方式中，本发明的方法的定量步骤包括DNA测序步骤。在一些实施方式中，DNA测序步骤包括高-通量单分子测序步骤。在一些实施方式中，DNA测序步骤包括无偏的DNA测序步骤。在一些实施方式中，DNA测序步骤覆盖大于1，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90或100个基因组当量。
在一些实施方式中，DNA测序步骤包括下列步骤：用光信号标记胚胎或母源基因组区。在一些实施方式中，光信号选自荧光和/或发光信号。在一些实施方式中，荧光信号由花青苷-3和/或花青苷-5产生。
在一些实施方式中，本发明的方法还在测序步骤之前包括下列步骤：将含有待定量的胚胎或母源基因组区的核酸分子（例如,核酸片段）捕获到固体表面。
在一些实施方式中，本发明的定量步骤涉及获得可归因于胚胎或母源基因组区的个体序列读取计数。在一些实施方式中，本发明的定量步骤还涉及比较可归因于胚胎基因组区的个体序列读取计数与可归因于对应母源基因组区的个体序列读取计数。
在一些实施方式中，本发明的定量步骤包括下列步骤：实施数字PCR。
在一些实施方式中，本发明的定量步骤包括下列步骤：实施桥式PCR。
在一些实施方式中，本发明的定量步骤包括下列步骤：使用经与胚胎或母源基因组区特异性结合的纳米报告子标记的探针杂交个体核酸分子。根据本发明的实施方式的纳米报告子描述于美国专利公开No.20100047924，其内容通过引用并入。
在一些实施方式中，本发明的定量步骤包括下列步骤：实施基于阵列的比较性基因组杂交（aCGH）。在一些实施方式中，aCGH步骤使用与胚胎或母源基因组区特异性结合的探针。在一些实施方式中，探针用光信号标记。在一些实施方式中，光信号选自荧光和/或发光信号。在一些实施方式中，aCGH步骤涉及测定可归因于胚胎或母源基因组区的信号水平。
在一些实施方式中，在本发明的方法中使用的统计学置信通过N-因素ANOVA，Student氏t检验，Fisher氏精确测试，或多测试修正测定。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括下列步骤：测定胚胎基因组区的过表达因数。
在一些实施方式中，本发明的方法还包括在不同个体间比较鉴定的区别表达的胚胎或母源基因组区。在一些实施方式中，本发明的方法还包括下列步骤：确认鉴定的区别表达的胚胎或母源基因组区（例如,由数字PCR或再测序）。
在特定实施方式中，本发明提供鉴定在母源样品中通常过表达的胚胎基因组区的方法，包括下列步骤：表征母源样品中的胚胎基因组区及对应母源基因组区；测定相比对应母源基因组区的胚胎基因组区的相对丰度；及如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以上，将胚胎基因组区鉴定为在母源样品中过表达，其中胚胎基因组区不是非整倍性区。
在特定实施方式中，本发明提供鉴定在母源样品中通常亚表达的母源基因组区的方法，包括下列步骤：表征母源样品中的母源基因组区及对应胚胎基因组区；测定相比对应胚胎基因组区的母源基因组区的相对丰度；及如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以下，将母源基因组区鉴定为在母源样品中亚表达，其中对应胚胎基因组区不是非整倍性区。
在特定实施方式中，本发明提供鉴定在母源样品中通常过表达的胚胎基因组区的方法，包括下列步骤：表征母源样品中的胚胎基因组区；测定相比参照的胚胎基因组区的相对丰度；及如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以上，将胚胎基因组区鉴定为在母源样品中过表达，其中胚胎基因组区不是非整倍性区。在特定实施方式中，适合于本发明的参照指示母源样品中胚胎核酸的平均表达。
在特定实施方式中，本发明提供鉴定在母源样品中通常亚表达的母源基因组区的方法，包括下列步骤：表征母源样品中的母源基因组区；测定相比参照的母源基因组区的相对丰度；及如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以下，将母源基因组区鉴定为在母源样品中亚表达，其中母源基因组区不对应于非整倍性区。在特定实施方式中，适合于本发明的参照指示母源样品中母源核酸的平均表达。
在一些实施方式中，本发明也提供各种非侵袭诊断的方法，包括下列步骤：表征通过使用本文所述的方法鉴定的过表达的胚胎基因组区。
本发明的其他特征，目的和优势将在以下发明详述，图和权利要求中显而易见。但是，应明白，发明详述，图和权利要求，尽管指示本发明的实施方式，仅以例证，而非限制方式给出。本发明的范围之内的各种变化和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。
【定义】
为了本发明更容易明白，以下首先定义特定术语。以下术语和其他术语的另外的定义贯穿说明书给出。
在本申请中，使用“或”是指“和/或”，除非另外陈述。如在本申请中使用，术语“包含（comprise）”和该术语的变异，诸如“包含（comprising）”和“包含（comprises）”，不旨在排除其他添加剂，组分，整体或步骤。如在本申请中使用，术语“约”和“大致”将用作相当体。本申请中使用的有或无约/大致的任何数字意指涵盖由关联领域中的普通技术人员同意的任何正常波动。在特定实施方式中，术语“大致”或“约”指称以任意方向（大于或小于）落入陈述的参照值的25%，20%，19%，18%，17%，16%，15%，14%，13%，12%，11%，10%，9%，8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%或更小的一系列值，除非另外陈述或自情景另外明白（除非其中该数会超过可能的值的100%）。
等位基因：如本文所用，短语“等位基因”与“等位基因变体”互换使用，及指称座位或基因的变体。在一些实施方式中，不同等位基因或等位基因变体是多态的。
扩增：如本文所用，术语“扩增”指称本领域知道的用于拷贝靶核酸，由此增加选择的核酸序列的拷贝数的任何方法。扩增可为指数或线性的。靶核酸可为DNA或RNA。一般而言，以此方式扩增的序列形成“扩增子”。扩增可用各种方法实现，包括但不限于聚合酶链反应（“PCR”），基于转录的扩增，等温扩增，滚环扩增，等。扩增可用相对近似量的引物对的各引物实施，以产生双链扩增子。但是，不对称PCR可用于扩增主要或完全单链产物，如为本领域所熟知（例如,Poddar et al.Molec.And Cell.Probes 14:25-32（2000））。此可通过使用各对引物通过相对于所述对的另一引物显著减少一个引物的浓度（例如,100倍差异）来达到。由不对称PCR的扩增通常是线性的。本领域技术人员会明白，不同扩增方法可一起使用。
非整倍性：如本文所用，术语“非整倍性”指称异常数的全染色体或部分染色体。一般而言，非整倍性导致可为在发育的早期阶段致死，导致随后怀孕中流产或导致活的但异常怀孕的遗传不平衡。最频繁的和临床显著非整倍性涉及单数染色体（严格地“非整倍体性”），其中有3组（“三体性”）或仅1组（“单体性”），代替正常对的染色体。
动物：如本文所用，术语“动物”指称动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”指称在发育的任何阶段的人。在一些实施方式中，“动物”指称在发育的任何阶段的非-人动物。在特定实施方式中，非-人动物是哺乳动物（例如,啮齿动物,小鼠,大鼠,兔,猴,狗,猫,绵羊,牛,灵长类动物，和/或猪）。在一些实施方式中，动物包括，但不限于，哺乳动物，鸟，爬行动物，两栖动物，鱼，昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可为转基因动物，遗传-加工的动物和/或克隆。
大致：如本文所用，术语“大致”或“约”，如应用于一个或更多目标值，指称近似于陈述的参照值的值。在特定实施方式中，术语“大致”或“约”指称以任意方向（大于或小于）落入陈述的参照值的25%，20%，19%，18%，17%，16%，15%，14%，13%，12%，11%，10%，9%，8%，7%，6%，5%，4%，3%，2%，1%或更小的一系列值，除非另外陈述或自情景另外明白（除非其中该数会超过可能的值的100%）。
生物学样品：如本文所用，术语“生物学样品”包括自生物学源获得的任何样品。在特定实施方式中，生物学源是受试者。生物学样品可，以非限制性例的方式，包括血，羊水，血清，尿，粪便，表皮样品，皮肤样品，颊拭子，精子，羊水，培养的细胞，骨髓样品和/或绒毛膜绒毛自受试者。方便的生物学样品可通过，例如，自口腔前庭表面刮细胞来获得。任何生物学样品的细胞培养物也可用作生物学样品，例如，绒毛膜绒毛样品的培养物和/或羊水培养物诸如羊水细胞培养物。生物学样品也可为，例如，自任何器官或组织（包括活组织检查或尸检样本）获得的样品，可包含细胞（无论原代细胞或培养的细胞），为任何细胞，组织或器官，组织培养物调节的培养基。在一些实施方式中，适合于本发明的生物学样品是已处理而释放或另外使本文所述的核酸检测可利用的样品。适合的生物学样品可从生命的阶段诸如胎儿，年轻成年，成年（例如,怀孕的女性）等得到。也可使用固定的或冷冻的组织。术语“生物学样品”和“生物学样本”互换使用。
拷贝数：如本文所用，短语“拷贝数”当参照座位使用时，指称每基因组或基因组当量存在的该座位的拷贝数。“正常拷贝数”当参照座位使用时，指称正常个体中存在的正常或野生型等位基因的拷贝数。在特定实施方式中，拷贝数为0～2，包括端点。在特定实施方式中，拷贝数为0～3，0～4，0～6，0～7，或0～多于7拷贝，包括端点。在座位的拷贝数在群中个体之间大大改变的实施方式中，估计的中位拷贝数可被取为用于计算和/或比较目的的“正常拷贝数”。
对应胚胎或母源基因组区：如本文所用，术语“对应胚胎或母源基因组区”指称自胚胎或母源核酸，但定位于相同的染色体位置的基因组区。
补体：如本文所用，术语“补体”，“互补”和“互补性”，指称核苷酸序列根据Watson/Crick配对规则的配对。例如，序列5’-GCGGTCCCA-3’具有5’-TGGGACCGC-3'的互补序列。补体序列也可为与DNA序列互补的RNA序列。通常不见于天然的核酸的特定碱基可包括在互补核酸中，包括但不限于肌苷，7-脱氮鸟嘌呤，锁核酸（LNA），及肽核酸（PNA）。互补不需求是完美的；稳定的双联体可含有错配的碱基对，简并体或不匹配的碱基。核酸技术的本领域技术人员可考虑许多变量包括，例如，寡核苷酸长度，寡核苷酸的碱基组成和序列，离子强度和错配的碱基对的发生率依经验确定双联稳定性。
对照：如本文所用，术语“对照”具有是针对其结果比较的标准物的本领域-明白的含义。一般而言，对照用于通过分离变量以便制造关于该变量的结论来增加实验中的完整性。在一些实施方式中，对照是与测试反应或测定同时实施以提供比较的反应或测定。在一实验中，应用“测试”（即,被测试的变量）。在第2实验中，“对照”，未应用被测试的变量。在一些实施方式中，对照是历史对照（即,之前实施的测试或测定,或之前知道的量或结果）。在一些实施方式中，对照是或包含打印的或另外保存的记录。对照可为阳性对照或阴性对照。在一些实施方式中，对照也被称为参照。
粗产物：如本文所用，术语“粗产物”，当关联生物学样品使用时，指称处于基本上未精制的状态的样品。例如，粗产物样品可为细胞裂解物或活组织检查组织样品。粗产物样品可存在于溶液中或作为干制备物。
区别表达的：如本文所用，术语“区别表达的”指称自基线偏离的基因组区（例如,胚胎或母源）的表达水平。一般而言，基线指示母源循环（例如,母源血）中胚胎或基因组核酸的平均表达。区别表达的区可为过表达的或亚表达的区。如本文所用，术语“过表达的”或“过表达”指称以统计学置信在基本上基线以上的基因组区的表达水平。如本文所用，术语“亚表达的”或“亚表达”指称以统计学置信在基本上基线以下的基因组区的表达水平。
缺失：如本文所用，术语“缺失”包括自天然存在的核酸移出一个或更多核苷酸的突变。
基因：如本文所用，术语“基因”指称负责离散细胞（例如,细胞内或细胞外）产物和/或功能的离散核酸序列。更特别是，术语“基因”指称包括编码蛋白的部分和任选地包括涉及由目标基因编码的蛋白的表达的调节的调控序列，诸如启动子，增强子，终止子，等的核酸。如本文所用，术语“基因”也可包括不编码蛋白而是提供功能RNA分子诸如tRNA，rRNA，等的转录用模板的核酸。或者，基因可限定用于特定事件/功能的基因组位置，诸如蛋白和/或核酸结合位点。
基因型：如本文所用，术语“基因型”指称生物的遗传体质。更特别是，术语指称存在于个体的等位基因的同一性。基因分型是用生物学测定阐明个体的基因型的过程。个体或DNA样品的基因分型一般指称在知道的多态位点由个体具有的2个等位基因的关于核苷酸碱基的同一性性质。
杂交：如本文所用，术语“杂交”或“杂交”指称2个互补核酸链在适当严格条件下彼此退火的过程。适合于杂交的寡核苷酸或探针一般含有长度10～100个核苷酸（例如,长度18～50,12～70,10～30,10～24,18～36个核苷酸）。核酸杂交技术为本领域所熟知。见，例如，Sambrook，等人，1989，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港出版社，Plainview，N.Y。本领域技术人员明白如何估计及调整杂交条件的严格度，使得具有至少期望的水平的互补的序列会稳定地杂交，而那些具有更低互补的则不会。例如关于杂交条件和参数，见，例如，Sambrook，等人，1989，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港出版社，Plainview，N.Y.；Ausubel,F.M.et al.1994,Current Protocolsin Molecular Biology.John Wiley & Sons,Secaucus,N.J.。
个别解析的：如本文所用，术语“个别解析的”在本文所用，指示，当可视化时，可能区别一个聚合物或克隆和其相邻聚合物或克隆。可视化可通过使用其信号个别解析的报告子标记物，例如荧光团实现。个体解析度的需求确保可在各合成步骤检测个体单体并合。
插入或添加：如本文所用，术语“插入”或“添加”指称导致相比天然存在的分子，一个或更多氨基酸残基或核苷酸的添加的氨基酸或核苷酸序列的变化。
体外：如本文所用，术语“体外”指称在人工环境，例如，在试管或反应容器，在细胞培养物，等中，而非在多-细胞生物之内发生的事件。
体内：如本文所用，术语“体内”指称在多-细胞生物诸如非-人动物之内发生的事件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”指称已（1）自起初产生时与其关联的组分的至少一些分离的（无论在天然和/或在实验环境中），和/或（2）人工产生的，制备的和/或生产的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可从至少约10%，约20%，约30%，约40%，约50%，约60%，约70%，约80%，约90%，约95%，约98%，约99%，基本上100%或100%的与它们起初关联的其他组分分离。在一些实施方式中，分离的剂是大于约80%，约85%，约90%，约91%，约92%，约93%，约94%，约95%，约96%，约97%，约98%，约99%，基本上100%或100%纯。如本文所用，如果其是基本上无其他组分，则物质是“纯”的。如本文所用，术语“分离的细胞”指称不含在多-细胞生物中的细胞。
标记的：术语“标记的”和“用可检测的剂或部分标记的”在本文所用互换，以表明实体（例如,核酸探针,抗体,等）可，例如通过与另一实体（例如,核酸,多肽,等）结合来可视化。可检测的剂或部分可选择为使得其产生可测量的信号，且其强度涉及（例如,比例于）结合的实体的量。用于标记和/或检测蛋白和肽的广泛的系统为本领域所知。标记的蛋白和肽可制备通过并合，或缀合于，由光谱，光化学，生物化学，免疫化学，电，光学，化学品或其他手段可检测的标记物。标记物或标记部分可为直接可检测的（即,其不需要可检测的任何进一步反应或操作,例如,荧光团是直接可检测的）或其可为间接可检测的（即,其使得通过与与可检测的另一实体,例如,在与包含报告子诸如荧光团的适当的抗体反应之后通过免疫染色可检测的半抗原反应或结合来可检测的）。适合的可检测的剂包括，但不限于，放射性核素，荧光团，化学发光剂，微粒，酶，比色标记物，磁标记物，半抗原，分子信标，适体信标等。
座位：如本文所用，术语“座位”指称染色体上特定DNA序列的特定位置。如本文所用，特定DNA序列可具有任何长度（例如,1，2,3,10,50或更多核苷酸）。在一些实施方式中，座位是或包含基因或部分基因。在一些实施方式中，座位是或包含基因的外显子或部分外显子。在一些实施方式中，座位是或包含基因的内含子或部分内含子。在一些实施方式中，座位是或包含基因的调控元件或部分调控元件。在一些实施方式中，座位相关于疾病，病症和/或病情。例如，在座位的突变（包括缺失,插入,剪接突变,点突变,等）可与疾病，病症和/或病情相关。
核型分析：如本文所用，术语“核型分析”包括真核生物细胞中染色体数的确定。
母源样品：如本文所用，术语“母源样品”指称自怀孕的女性获得的生物学样品。见生物学样品的定义。
正常：如本文所用，术语“正常”，当用来修饰术语“拷贝数”或“座位”或“基因”或“等位基因”时，指称以最高百分率存在于群中的拷贝数或座位，基因或等位基因，例如，野生型数或等位基因。当用来修饰术语“个体”或“受试者”时，它们指称携带以最高百分率存在于群中的拷贝数或座位，基因或等位基因的个体或个体组，例如，野生型个体或受试者。一般而言，正常“个体”或“受试者”不具有特定疾病或病情，且也不是疾病或病情的携带者。术语“正常”也在本文用来定性自正常或野生型个体或受试者分离的生物学样本或样品，例如，“正常生物学样品”。
多重PCR：如本文所用，术语“多重PCR”指称各通过使用不同引物对引发的2个或更多区的扩增。
引物：如本文所用，术语“引物”指称能与核酸样品中的互补序列杂交的短单链寡核苷酸。一般而言，引物作为模板依赖性DNA合成的起始点。脱氧核糖核苷酸可由DNA聚合酶加入引物。在一些实施方式中，该脱氧核糖核苷酸添加到引物也被称为引物延伸。术语引物，如本文所用，包括可为合成的全部形式的引物，包括肽核酸引物，锁核酸引物，硫代磷酸酯修饰的引物，标记的引物等。用于PCR反应的“引物对”或“引物组”一般指称一组引物，其一般包括“正向引物”和“反向引物”。如本文所用，“正向引物”指称退火到dsDNA的反义链的引物。“反向引物”退火到dsDNA的正义链。
多态性：如本文所用，术语“多态性”指称多于一种形式的基因或其部分的共存。
探针：如本文所用，术语“探针”，当参照核酸用探针使用时，指称具有可与目标核酸结合或杂交的特定核苷酸序列（例如,RNA或DNA）的核酸分子。一般而言，探针通过一种或更多类型的化学键，通常通过氢键合形成与互补或基本上互补序列的核酸特异性结合（或特异性杂交）。在一些实施方式中，在实时PCR反应中探针可与DNA扩增子的核酸结合。
相对丰度：如本文所用，术语“相对丰度”指称相比参照量的目标基因组区的量。任何适当的参照量可用于测定目标基因组区的相对丰度。见，参照量的定义。一般而言，相对丰度包括尤其是2个基因组区（例如,胚胎DNA对比对应母源基因组DNA）的量之间的比，百分率（例如,DNA总量中胚胎DNA的百分率），倍数变化，标准化的量。术语“相对丰度”与“相对量”互换使用。
参照量：如本文所用，术语“参照量”指称可用作比较标准物或对照以计算目标基因组区的相对丰度的任何量。一般而言，参照量可为指示总量，平均量，过表达的或亚表达的量的量。例如，参照量可为量指示关联母源样品（例如,母源血）中的核酸总量，胚胎核酸总量，母源核酸总量，知道的不过表达或亚表达的对照区的量或多个对照区的平均量，知道的过表达的区的量或多个过表达的区的平均量，知道的亚表达的区的量或多个过表达的区的平均量，或对应于目标区的基因组区（例如,胚胎或母源）的量。参照量可为自与目标区同时实施以提供比较的定量反应或测定获得的量；历史参照（即,自之前实施的测定的量或结果,或之前知道的量或结果）；打印的或另外保存的记录；或预定的阈值。在一些实施方式中，参照量指示母源血中胚胎核酸的平均表达（例如,3%,5%,10%,15%或20%）。在一些实施方式中，参照量指示母源血中母源核酸的平均表达（例如,97%,95%,90%,85%或80%）。
正义链对比反义链：如本文所用，术语“正义链”指称包括功能蛋白的至少部分编码序列的双链DNA（dsDNA）的链。如本文所用，术语“反义链”指称是正义链的反向互补体的dsDNA的链。
信号：如本文所用，术语“信号”指称可检测的和/或可测量的实体。在特定实施方式中，信号是由人眼可检测的，例如，可见。例如，信号可为或可涉及可见光谱中色彩的强度和/或波长。该信号的非限制性例包括自化学反应诸如酶促反应得到的着色的沉淀物及着色的可溶性产物。在特定实施方式中，信号是使用设备可检测的。在一些实施方式中，信号从当激发时发射荧光的荧光团产生，其中光是用荧光检测器可检测的。在一些实施方式中，信号是或涉及由分光光度计可检测的光（例如,可见光和/或紫外线光）。例如，可将由化学发光反应产生的光用作信号。在一些实施方式中，信号是或涉及辐射，例如，由放射性同位素发射的辐射，红外线辐射，等。在特定实施方式中，信号是物理实体的性质的直接或间接指示物。例如，信号可用作生物学样品中和/或反应容器中核酸的量和/或浓度的指示物。
特定：如本文所用，术语“特定”，当关联寡核苷酸引物使用时，指称，在适当的杂交或洗涤条件下，能与目标靶杂交及基本上不与不是目标的核酸杂交的寡核苷酸或引物。优选更高水平的序列同一性及包括至少60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，98%，99%或100%序列同一性。在一些实施方式中，当将寡核苷酸和核酸比对时，特定寡核苷酸或引物含有与待杂交或扩增的部分核酸至少4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45，50，55，60，65，70或更多序列同一性碱基。
受试者：如本文所用，术语“受试者”指称人或任何非-人动物（例如,小鼠,大鼠,兔,狗,猫,牛,猪,绵羊,马或灵长类动物）。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方式中，受试者是人。受试者可为患者，其指称提供给用于疾病的诊断或治疗的医疗提供者的人。术语“受试者”在本文与“个体”或“患者”互换使用。受试者可患或易受疾病或病症，但可或可不显示疾病或病症的症状。
基本上：如本文所用，术语“基本上”指称呈现总和或接近-总程度或目标特征或性质的程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员会明白，生物学和化学现象罕见，即便有，接近完成和/或进行到完全或达到或避免绝对结果。本文所用的术语“基本上”因此旨在捕获许多生物学和化学现象中固有的完全性的潜在缺乏。
基本上互补：如本文所用，术语“基本上互补”指称可在严格杂交条件下杂交的2个序列。本领域技术人员会明白，基本上互补序列不需求沿着它们的全长杂交。在一些实施方式中，“严格杂交条件”指称至少如以下严格的杂交条件：在50%甲酰胺，5XSSC，50mMNaH2PO4，pH6.8，0.5%SDS，0.1mg/mL超声处理鲑鱼精子DNA，及5XDenhart氏溶液中于42℃杂交过夜；用2XSSC，0.1%SDS于45℃洗涤；及用0.2XSSC，0.1%SDS于45℃洗涤。在一些实施方式中，严格杂交条件应不允许在20个连续的核苷酸的延伸物上多于2个碱基不同的2个核酸杂交。
取代：如本文所用，术语“取代”指称，相比天然存在的分子，一个或更多氨基酸或核苷酸分别被不同氨基酸或核苷酸取代。
野生型：如本文所用，术语“野生型”指称自然界存在的典型或最常见的形式。
【发明详述】
本发明提供，尤其是，鉴定及表征母源循环中区别表达的（例如,过表达的或亚表达的）胚胎或母源基因组区的方法。本发明包括识别自胎儿DNA的特定基因组区可通常在母源循环中过表达，且该过表达的胚胎基因组区的鉴定可允许基于该过表达的区，无需胚胎DNA的显著富集或纯化而精确的出生前诊断。需知，胚胎基因组区的过表达可由多因素诸如DNA结构，细胞细节，在凋亡期间的DNA断裂过程，及血中DNA酶可接近性导致。
一般而言，本发明的方法涉及定量存在于母源循环中的一种或更多目标胚胎或母源基因组区，及测定相比适当的参照量，个体胚胎或母源基因组区的相对丰度。各种参照量可用于测定相对丰度。在一些实施方式中，指示母源循环中胚胎或母源核酸的平均表达的参照量用于测定相对丰度，且如果基因组区的相对丰度以统计学置信不同于参照量，基因组区被鉴定为区别表达。指示过表达或亚表达的参照量也可用于测定相对丰度。
一般而言，根据本发明鉴定的区别（例如,过或亚）表达的区不对应于非整倍性区。
区别表达的区，尤其是，相对过表达的胚胎基因组区，可用于无需显著胚胎DNA富集或纯化而开发出生前诊断测定。在特定实施方式中，相对过表达的胚胎基因组区对于基于至少以下2特性鉴定出生前诊断有用：（1）相比其他胚胎区，母源循环中的胚胎基因组区的标准化的量的过表达；和/或（2）胚胎基因组区和对应母源区之间的分裂（即,比）。关于后者特性，需知，母源循环中特定胚胎基因组区的相对过表达可为对应母源区的相对亚表达的结果。这2个特性的分析可展示，例如，特定胚胎基因组区是相比对应母源区相对过表达的，但可相比其他胚胎基因组区相对亚表达。理想情况下，出生前诊断测定中使用的胚胎基因组区是相比对应母源区相对过表达的，且是相比其他胚胎基因组区相对过表达的。
本发明的各种方面在以下部分描述详细。这些部分未意指限制本发明。各部分可应用于本发明的任何方面。在本申请中，“或”是指“和/或”，除非另外陈述。
【多态区的鉴定】
为了辅助区别表达的胚胎或母源基因组区的精确的确定，本发明的方法一般利用可区别胚胎基因组区和对应母源基因组区的表征测定。因此，在一些实施方式中，本发明涉及首先鉴定自它们的对应母源基因组区特殊地可检测的那些胚胎基因组区的步骤。此步骤也被称为鉴定多态区的步骤。如本文所用，术语“多态区”包括含有序列变异（诸如SNP）的那些区和具有同一序列、但由于表观遗传修饰（诸如甲基化）另外特殊地可检测的区二者。
一般而言，自它们的对应母源区特殊地可检测的胚胎基因组区含有父源地贡献的序列。在一些实施方式中，父源地贡献的序列（或信息来源的由其）作为胚胎核酸（或由其来源的信息）的标记物。例如，包括比较胚胎核酸与母源核酸的方法的描述旨在包括将父源地贡献的核酸与母源核酸比较的实施方式。在分析或使用父源地贡献的核酸的实施方式中，父源地贡献的核酸旨在包括胚胎核酸。在一些实施方式中，胚胎基因组区是特殊地可检测的，因为其含有不同于对应母源基因组区（例如,一个或更多多态核苷酸）的序列。在一些实施方式中，胚胎基因组区是特殊地可检测的，因为其相比对应母源区含有拷贝数变异（CNV）。在一些实施方式中，胚胎基因组区是特殊地可检测的，因为其含有甲基化模式或不同于对应母源基因组区的其他表观遗传修饰。检测甲基化的方法为本领域所知，且可适于根据本发明使用。一般而言，为检测不同甲基化模式，可处理核酸以将甲基化的及未甲基化的核苷酸转变为不同核苷酸。例如，在一些DNA甲基化检测测定中，核酸用转变未甲基化的鸟嘌呤碱基但不转变甲基化的鸟嘌呤碱基，或反之亦然的剂处理。例如，亚硫酸氢钠将未甲基化的鸟嘌呤转变为胸腺嘧啶，但不转变甲基化的鸟嘌呤。由此，甲基化可通过用该剂处理核酸（例如,DNA），然后实施一种或更多测定处理的核酸的序列的技术来检测，由此测定是否核酸中的一个或更多鸟苷被甲基化。例如，可将硫酸氢钠处理与测序方法（例如,单分子测序），或引物延伸方法组合，以便测定在一个或更多位点的DNA甲基化。替代性地或另外地，DNA甲基化可通过使用区别甲基化的及未甲基化的位点的抗体，例如，甲基化-特异性抗CpG抗体来检测。
各种方法可用于鉴定多态区。在一些实施方式中，多态区可通过基因分型母源核酸来鉴定。需知，基因型可在任何个体座位测定。各种基因分型测定或技术是在本领域中可利用的，且可适应于实践本发明。例示基因分型测定包括，但不限于PCR，DNA片段分析，等位基因特定寡核苷酸（ASO）探针，DNA测序及与DNA微阵列或珠核酸杂交。在一些实施方式中，适合的基因分型技术包括限制性片段长度多态性（RFLP），末端限制性片段长度多态性（t-RFLP），扩增的片段长度多态性（AFLP），及多重连接-依赖性探针扩增（MLPA）。
一般而言，适合于本发明的基因分型测定是足够敏感的，以鉴定母亲和胎儿之间的多态区的实质性数。在一些实施方式中，根据本发明鉴定多于100，500，1,000，2,000，4,000，6,000，8,000或10,0000多态区/染色体。在一些实施方式中，对鉴定的多态区测序，及测定多态性（例如,SNP）的特定性质。
多态区然后根据本发明表征和/或定量，以鉴定各种母源样品中区别表达的基因组区。
【母源样品和其制备】
任何各种母源样品可适宜于随本文公开的方法使用。一般而言，可使用含有胚胎和母源核酸的任何母源样品。母源样品的类型包括，但不限于，细胞，组织，全血，血浆，血清，尿，粪便，唾液，脐带血，绒毛膜绒毛样品羊水，及经子宫颈灌洗液。也可根据发明的方法使用任何前述母源样品的细胞培养物，例如，绒毛膜绒毛培养物，羊水和/或羊水细胞培养物，血细胞培养物（例如,淋巴细胞培养物），等。
在一些实施方式中，从怀孕的女性由非-侵袭性方法得到适合的母源样品。例如，适合的母源样品可为自怀孕的女性获得的母源血，血清，血浆或羊水。在特定实施方式中，适合的母源样品是母源血（例如,外周静脉血）。
适合的母源样品可从在怀孕的各阶段（例如,在第1个月,第2个月或头三个月期间）的个体得到。在一些实施方式中，适合的母源样品在头三个月期间获得，例如，在妊娠的4～13周之间（例如,在6～13周之间,在8～13周之间,在9～13周之间）。一般而言，适合的母源样品从正常怀孕的个体得到。在一些实施方式中，适合的母源样品从一个个体得到。在一些实施方式中，适合的母源样品是自多个个体合并的样品。
在一些实施方式中，从母源样品制备总DNA。在一些实施方式中，从母源样品制备无细胞的DNA。制备总DNA或无细胞的DNA的各种方法和试剂盒是在本领域中可利用的和可用于实践本发明。例如，核酸可从母源样品由各种技术诸如由Maniatis，等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港，N.Y，pp.280-281（1982）描述的那些提取。可用于自母源样品制备无细胞的DNA的例示商业试剂盒包括，但不限于，QIAamp DNA Blood Midi Kit（Qiagen），High Pure PCR模板制备试剂盒（Roche Diagnostics），及MagNA Pure LC（Roche Diagnostics）。
可使用各种量的母源样品。在一些实施方式中，适合的母源样品含有具有多于1（例如,多于2,5,10,15,20,25,50,100,200,500，1,000，5,000或10,000）个基因组当量的总或无细胞的DNA。需知，在头三个月期间10～20ml的母源血含有总DNA的约10,000个基因组当量。由此，在一些实施方式中，适合的母源样品可含有约20ml，15ml，10ml，5ml，4ml，3ml，2ml，1ml，0.5ml，0.1ml，0.01ml或0.001ml的母源血。
在一些实施方式中，将DNA制备物随机片段化，以产生适合的长度的片段用于分析。待表征的核酸可具有可变的长度。例如，它们可为至少50bp长度。在一些实施方式中，它们可为150～4000bp长度。各种方法可用于产生核酸片段诸如超声处理，限制酶消化，鸟枪法，及其他。例示方法描述于2003年10月9日公开的美国专利申请2002/0190663Al，其教导以它们的整体并入本文。
在一些实施方式中，片段可进一步处理，使得不同片段的端全部含有相同的DNA序列。具有通用端的片段可然后用单对的扩增引物在单反应中扩增。具有通用端的片段也可由通用捕获探针捕获到固体支持物。
在一些实施方式中，为获得无偏的定量，在它们通过，例如，测序或杂交表征之前，不对母源样品中的核酸实施克隆或扩增。
需知，虽然本说明书通篇说到DNA，也可分析见于母源血的胚胎RNA。如描述于Ng等人，“mRNA of placental origin is readilydetectable in maternal plasma,”Proc.Nat.Acad.Sci.,100(8):4748-4753，（2003），可在母源血浆中检测hPL（人胎盘催乳激素）和hCG（人绒毛膜促性腺激素）mRNA转录物。例如，可使用编码在胎盘中表达的及在目标染色体上存在的基因的mRNA。在此情况中，RNA酶H minus（RNA酶H--）反转录酶（RT）可用于制备检测用cDNA。
【表征及定量基因组区】
各种测定可用于表征和/或定量目标胚胎或母源基因组区。例如，适合的方法可涉及计数含有目标胚胎或母源基因组区的个体核酸分子/片段，或测量在微阵列上多态探针（例如,SNP特异性探针）的信号强度变化（例如,使用基于阵列的比较性基因组杂交（aCGH）技术）。各种方法可用于计数个体核酸分子，包括但不限于尤其是DNA测序（例如,高通量单分子测序），数字PCR，桥式PCR，乳剂PCR，纳米串技术。例示方法在以下描述更多细节。
【单分子测序】
在本发明的特定实施方式中，方法包括母源样品中核酸的单分子测序，例如，为了表征和/或定量具有特定序列组成的胚胎和/或母源基因组区。尤其是，单分子测序技术允许具有多态核苷酸的个体核酸分子的评估，及获得可归因于不同多态区的序列读取计数。
各种单分子测序方法已描述于本领域和可用于实践本发明。见，例如，Braslaysky et al.,(2003),Proc.Natl.Acad.Sci.,100:3960-64;Greenleaf et al.,(2006),Science,313:801;Harris et al.,(2008)Science,320:106-109;Eid et al.,(2009),Science,323:133-138;Pushkarev et al.,(2009),Nature Biotechnology,27:847-850;Fan et al.,(August2008),Proc.Natl.Acad.Sci.,Early Edition；各文献的整个内容通过引用在本文合并。一般在单分子测序技术中，将核酸片段，其在测序反应期间作为模板，固定到固体支持物，使得至少部分核酸片段是个别光学-可解析的。
适合于本发明的固体支持物可为核酸可共价附接的任何固体表面，诸如，例如胶乳珠，葡聚糖珠，聚苯乙烯，聚丙烯表面，聚丙烯酰胺凝胶，金表面，玻璃表面和硅晶片。在一些实施方式中，固体支持物是玻璃表面。在一些实施方式中，固体支持物是载玻片，例如，玻璃载玻片。
将核酸附接到本文所用的固体支持物的手段指称任何化学或非-化学附接方法，包括可化学修饰的官能团。“附接”涉及核酸由共价连接或经不可逆被动吸附或经分子之间的亲和性固定到固体支持物（例如,由生物素化的分子固定到亲和素-包被的表面）。一般而言，附接具有无法通过用水或水性缓冲剂在DNA-变性条件下洗涤来移出的足够的强度。“本文所用的可化学修饰的官能团”指称基团诸如，例如，磷酸基团，羧酸或醛部分，氢硫基或氨基。
在一些实施方式中，适合于本发明的固体支持物具有衍生的表面。在一些实施方式中，固体支持物的衍生的表面随后用双功能交联基团修饰，以提供官能化的表面，优选用反应性交联基团修饰。本文所用的“衍生的表面”指称已用化学反应性基团，例如氨基，氢硫基或丙烯酸基团修饰的表面。本文所用的“官能化的表面”指称已用特定官能团，例如马来酸或琥珀酸官能部分修饰的衍生的表面。
在一些实施方式中，将核酸片段（其可包含全部或部分胚胎或母源基因组区）的各分子在不同位置附接于固体支持物。在一些实施方式中，固定到固体支持物的核酸片段可检测标记（例如,用可产生光信号的可检测的部分标记）。例如，核酸片段可退火到可检测标记的寡核苷酸引物。固体支持物上各单分子的位置可由检测标记物（例如,可检测的部分）和记录的各分子的位置的仪器读。在一些实施方式中，核酸片段的可检测的标记物在记录位置之后移出。例如，在可检测的标记物包含荧光部分的实施方式中，可检测的标记物可通过光漂白荧光部分移出。替代性地或另外地，可检测的标记物可自核酸片段切割。
在一些实施方式中，捕获寡核苷酸固定到固体或半固体支持物，以辅助核酸片段（例如,多核苷酸）的捕获及固定，如在本文进一步描述。
通过使用固定的核酸片段作为模板来实施测序反应。将引物与核酸片段杂交，以形成引物/模板双联体。在一些实施方式中，将核酸片段修饰为包括互补于使用的引物的适配体。在一些实施方式中，将引物固定到固体表面，且将核酸片段经它们与引物的杂交附接于固体表面。
在一些实施方式中，实施焦磷酸测序（即,由合成测序）。特别是，在一种或更多核苷酸或核苷酸类似物（例如,dNTP）及一种或更多核酸聚合酶的存在下，在对于允许引物延伸至少一个碱基适合的条件下实施模板-依赖性引物延伸。一般而言，在测序反应期间合并的核苷酸被可检测标记（例如,用可产生光信号的可检测的部分标记）。检测及记载自标记物发出的信号；特定信号可相关于特定核苷酸或核苷酸类似物的特性，由此揭示模板核酸片段上对应互补核苷酸的特性。在一些实施方式中，可检测的信号在一轮并合之后移出和/或毁坏（例如,如在本文描述），由此辅助标记的核苷酸或核苷酸类似物的进一步延伸和检测。
可优化测序，以达到将正确的核苷酸快速和完全添加到引物/模板复合物中的引物，同时限制不正确的核苷酸的错合并。例如，可降低dNTP浓度以减少不正确的核苷酸错合并到引物。不正确的dNTP的Km值可高至相比正确的核苷酸的Km值1000倍更高，指示dNTP浓度的减小可减少核苷酸错合并的速度。由此，在一些实施方式中，测序反应中dNTP的浓度是大致5～20μM。
此外，相对短反应时间可用于减少错合并的概率。例如，对于接近约400个核苷酸/s的最大速度的并合速度而言，大致25ms的反应时间会足以确保99.99%的引物链的延伸。
可检测的部分可根据需要直接或间接合并到核苷酸，核苷酸类似物，多核苷酸或其他分子。适合的可检测的部分包括，尤其是，荧光部分和发光部分。在一些实施方式中，荧光部分包含花青苷染料，例如，花青苷-3和/或花青苷5。适合的可检测的部分的例在本文进一步描述。
在一些实施方式中，单分子测序以高-通量样式，例如，用平行实施的许多测序反应实施。例如，适合于本发明的高通量单分子测序测定可同时表征达数千，数百万或数十亿的分子。并行测序反应不需要同步实施；可实施异步反应，且与本发明的方法相容。
根据本发明的方法，在一些实施方式中，获得个体序列读取计数，其归因于胚胎或母源基因组区。在一些实施方式中，基于胚胎和母源核酸之间的多态性的知识，和与多态核苷酸关联的不同标记物的检测实现将序列读取计数归因于胚胎或母源基因组区。
在一些实施方式中，对大部分（例如,多于10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%，99%或大于99%）的基因组测序。在一些实施方式中，以平均至少10倍（10×基因组当量）覆盖测序的至少一个基因组区，即，有平均10个读数或更多给定基因组区。在一些实施方式中，覆盖是至少20x，至少30x，至少40x，至少50x，至少60x，至少70x，至少80x，至少90x，至少100x，至少110x，至少120x，或更多时间。在一些实施方式中，覆盖是100倍（100×基因组当量）或更高。
在一些实施方式中，采用无偏的核酸测序方法。即，在全部测序读数之中的特定序列的表达反映母源样品中对应核酸的表达。在一些实施方式中，通过不在测序反应之间扩增模板核酸来至少部分达到无偏的核酸测序。在一些实施方式中，模板核酸在测序反应期间也不扩增。在一些实施方式中，无偏的DNA序列使用亮荧光团和激光激发，以自固定到表面的个体DNA分子检测焦磷酸测序事件，消除对扩增的需求。
在一些实施方式中，以确保群中的全部物种核酸等同扩增的方式，通过扩增（在测序反应期间和/或在测序反应之前）模板核酸至少部分达到无偏的核酸测序。例如，乳剂PCR可用于以无偏的方式扩增核酸。见讨论乳剂PCR部分。
本领域知道及已描述适合的序列分析的试剂（例如,核苷酸和/或核苷酸类似物,核酸聚合酶,等），固体支持物，设备和方法。见，例如，美国专利No.7,169,560；7,220,549；7,276,720；7,279,563；7,282,337；7,397,546；7,424,371；7,476,734；7,482,120；7,491,498；7,501,245；7,593,109；7,635,562；7,666,593；7,678,894；及7,753,095，各整个内容通过引用在本文合并。各种可商购的试剂盒诸如真单分子测序(tSMS)TM（Helicos）可用于实践本发明。
【数字PCR】
在一些实施方式中，数字PCR用于表征及定量多态胚胎或母源基因组区。一般而言，数字PCR涉及自最低限度稀释的样品扩增单DNA模板，因此产生完全来源自一种模板的扩增子，且可用不同荧光团检测，以区别及计数不同多态区（例如,胚胎对比母源区）。由此，数字PCR将自常规PCR获得的指数，模拟信号转化为线性，数字信号，允许PCR产物的统计学分析。
数字PCR技术在本领域良好描述。见，Vogelstein B.and KinzlerK.W.,(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.96,pp9236-9241;PohlG.and Shih L.M.,(2004),Expert.Rev.Mol.Diagn.,4(1),41-47，其教导通过引用在此合并。
在一些实施方式中，将自母源样品制备的DNA首先稀释到多-孔（例如,96-孔,384-孔）板，平均每2孔一种模板（即,平均0.5个模板分子（基因组当量）/孔）。为了测定最佳稀释，可首先定量DNA，以测定原母源样品中基因组当量的量。
自单模板分子的扩增的PCR产物基本上在序列上均质，各种技术可用于表征各孔中的序列含量。一般而言，基于荧光探针的检测方法是特别有用的。例如，为定量胚胎或母源多态区，设计一对PCR引物和一对分子信标用于各SNP。一般而言，分子信标是分别在它们的5’和3’端含有荧光染料和猝灭剂的单链寡核苷酸。除了对应于SNP和荧光标记物（绿色或红色）的核苷酸之外，两种信标是同一的。一般而言，分子信标包括发卡结构，其导致荧光团更接近猝灭剂，及当不与PCR产物杂交时不发射荧光。与它们的互补核苷酸序列杂交之后，猝灭剂自荧光团远离，导致增加的荧光。一般而言，计算具有绿色或红色荧光的2种等位基因-特异性信标的荧光强度的比，以测定各个体孔中的等位基因类型。用计数的数百或数千孔，可测定母源和胚胎（或父源）等位基因的相对丰度。
各种数字PCR方法，试剂和设备为本领域所知，情况可适应于实践本发明。见，例如，美国专利No.6,143,496，6,440,706，6,753,147和7,704,687，各整个内容通过引用在本文合并。
【桥式PCR】
在一些实施方式中，桥式PCR用于表征和/或定量胚胎或母源基因组区。桥式PCR也被称为固相PCR或2-维PCR。一般而言，桥式PCR在固体表面或凝胶之内发生，由此产生可同时测序或与多态探针杂交的大数的“PCR集落”（聚合酶产生的集落）。
在一些实施方式中，桥式PCR涉及一般扩增反应，其中DNA样品被随机片段化，然后处理，使得不同片段的端全部含有相同的DNA序列。例如，DNA片段可连接到通用适配体序列。具有通用端的片段可然后在单反应中用单对的扩增引物扩增。一般而言，DNA片段首先在扩增之前在各反应位点，在表面上，或凝胶之内个别解析到单分子水平，其确保，扩增的分子形成可然后进一步分析的离散集落。
在一些实施方式中，这些并行扩增反应在为好几千并行化学反应提供大表面积的“流动池”（基本上水-密性的显微镜载玻片）表面发生。流动池表面用对应于在样品制备阶段期间连接的适配体的序列的单链寡核苷酸包被。单链，适配体-连接的片段结合到暴露于用于基于聚合酶的延伸的试剂的流动池表面。引发由连接到表面上的互补寡聚体的片段“桥”的游离/远端发生。可使用各种其他固体表面代替流动池表面。例如，适合于本发明的固体表面可包括，但不限于，胶乳珠，葡聚糖珠，聚苯乙烯，聚丙烯表面，聚丙烯酰胺凝胶，金表面，玻璃表面和硅晶片。
桥式扩增的各种方法为本领域所熟知。见，例如，2010年6月7日提交的美国临时申请系列No.61/352,062，美国专利No.7,115,400，美国公开No.20090226975，及Bing D.H.等人，“Bridge Amplification:A Solid Phase PCR System for the Amplification and Detection ofAllelic Differences in Single Copy Genes,”Seventh InternationalSymposium on Human Identification（在Promega网站可利用），全部通过引用在此合并。
各种方法可用于表征由桥式PCR产生的扩增的核酸的序列内容。在一些实施方式中，可由合成测序含有扩增的核酸的百万PCR集落。例如，Illumina氏Solexa测序技术可适应于根据本发明表征及定量胚胎或母源区。例如，可使含有百万簇的固体表面经历用延伸及成像的自动化的循环测序。测序的第1循环涉及首先并合单荧光核苷酸，之后是整个表面的高解析度成像。这些像表示对于第1碱基收集的数据。任何背景以上的信号鉴定簇（或PCR集落）的物理位置，及荧光发射鉴定4种碱基中的哪个合并在该位置。重复此循环，一次一个碱，产生一系列像，各表达在特定簇的单碱基延伸。碱基判定用经时鉴定发射色彩的算法来衍化。由此，可归因于特定胚胎或母源基因组区的个体序列读取计数可获得。
在一些实施方式中，含有扩增的核酸的簇可通过使用荧光探针杂交来表征。例如，为区别及定量胚胎或母源多态区，可对于各SNP设计一对分子信标。一般而言，分子信标是分别在它们的5’和3’端含有荧光染料和猝灭剂的单链寡核苷酸。除了对应于SNP和荧光标记物（绿色或红色）的核苷酸之外，两种信标相同。一般而言，分子信标包括发卡结构，其导致荧光团更接近猝灭剂，及当不与PCR产物杂交时不发出荧光。在与它们的互补核苷酸序列杂交之后，猝灭剂自荧光团远离，导致增加的荧光。一般而言，计算具有绿色或红色荧光的2种等位基因-特异性信标的荧光强度的比，以测定各簇中的等位基因类型。用计数的数百或数千簇，可测定母源和胚胎/父源等位基因的相对丰度。
【乳剂PCR】
在一些实施方式中，乳剂PCR用于表征及定量胚胎或母源基因组区。一般而言，乳剂PCR可用于产生具有克隆扩增的DNA的小珠，即，各珠含有自单分子模板由PCR产生的一种类型的扩增子。例示乳剂PCR描述于2005年1月3日公开的Dressman et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,100,8817(Jul.22,2003)and Dressman et al.PCTpublication W02005010145,“METHOD AND COMPOSITIONS FORDETECTION AND ENUMERATION OF GENETICVARIATIONS,”，且就其基于珠的过程的描述通过引用在此合并。
例如，将用捕获寡核苷酸（或集落引物）包被的珠与具有互补衔接子或标记序列的核苷酸混合。将含有对于PCR的全部必需组分的水性混合物加结合引物的珠和模板DNA与油/去污剂混合物一起搅拌，以产生微乳剂。水性隔室（其可被例证为在油层中的小滴）含有平均<1个模板分子和<1个珠。可在一或更少滴中描绘不同模板（母源和胚胎），以表示其序列一个或许多核苷酸不同的2个模板分子。使微乳剂如在常规PCR中一样温度循环。如果DNA模板和珠在单水性隔室中在一起存在，珠结合的寡核苷酸作为扩增用引物。
由各种材料及以各种尺寸制造的珠可用于本发明。例如，适合的珠可为磁珠，塑料珠，金粒子，纤维素粒子，聚苯乙烯粒子，等。适合的珠可为小，例如。1～2，到几百，例如，200～1000μm直径的尺寸范围的微粒。在一些实施方式中，可商购的控制的-孔隙玻璃（CPG）或聚苯乙烯支持物在本发明中用作固相支持物。该支持物用碱不稳定接头和附接的初始核苷可利用，例如，Applied Biosystems（Foster City,Calif.）。
在一些实施方式中，含有克隆扩增的核酸的珠可通过焦磷酸测序（即,由合成测序）表征。例如，可使含有扩增的DNA的珠与测序需要的酶一起经历含有大量的pl-体积孔（其对于单珠足够大）的测序机。在一些实施方式中，焦磷酸测序使用萤光素酶以产生光作为读取，及测序机对每个添加的核苷酸取孔的图像，及记录。可获得可归因于胚胎或母源基因组区的序列读取计数。适合的测序机是可商购的，包括454Life Sciences’s Genome Sequencer FLX。
【与标条码的探针的单分子杂交】
在一些实施方式中，使用与标条码的探针的单分子杂交的技术可用于表征及定量胚胎或母源基因组区。一般而言，该技术使用分子“条码”和单分子成像，以不扩增地在单反应中检测及计数特定核酸靶。一般而言，将各色彩-编码的条码附接于对应于目标基因组区的单靶-特异性探针。与对照混合在一起，它们形成多重化的CodeSet。在一些实施方式中，2种探针用于杂交各个体靶核酸。报告子探针携带信号；捕获探针允许复合物固定用于数据收集。在杂交之后，过量探针移出，及可由数据收集用数字分析仪分析固定的探针/靶复合物。对色码计数及对各靶分子（例如,目标胚胎或母源基因组区）列表。适合的数字分析仪包括由Nanostring Technologies提供的
Figure BDA00002759066700281
分析系统。
方法，包括分子“条码”的试剂，适合于纳米串技术的设备还描述于美国申请公开No.20100112710，20100047924，20100015607，各整个内容通过引用在本文合并。
【半导体测序】
在一些实施方式中，半导体测序方法用于表征及定量胚胎或母源基因组区。本文所用的术语“半导体测序,""半导体pH敏感测序,""复制检测测序,""直接复制检测测序"和"半导体复制检测测序"是同义的，且通常指称Pourmand及同事们的方法。见例如，Pourmand etal.,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:6466-6470。例示半导体测序的系统在此情景中包括，例如，Ion Torrent技术（Life Technologies,Guilford,CT）。如同由本领域知道的及在本文描述的合成测序的其他方法，半导体测序方法对于测序固定到固体支持物，即，合并电荷传感器的大规模并行阵列上的核酸片段是有用的，以检测在DNA复制期间质子的实时释放。一般而言，将样品DNA片段化，例如，10～50，50～150，50～100，100～200，200～400，400～4000bp序列，优选约100个核苷酸。序列制备为含由具有适配体序列的设计的PCR引物连接或合并的侧接适配体的库。库片段然后通过使用乳剂PCR克隆扩增，以形成用模板DNA包被的粒子。将粒子沉积在大规模并行阵列上，其在对于DNA复制适合的条件下，在DNA聚合酶的存在下依次接触脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTP）。dNTP各并合到生长的双联DNA导致质子释放，导致由电荷传感器可检测的电荷变化。由此，大规模并行阵列的特定孔中的电荷变化（即,pH变化）指示特定dNTP的并合。电荷无变化指示特定dNTP未合并。多质子释放（例如,2,3,4或更多）质子释放指示合并特定dNTP的对应序列。大规模并行阵列中各孔的电荷变化与特定dNTP的存在的关联由此提供DNA样品的序列。
单向测序需要仅一个融合引物对，且会自扩增子的仅一端产生读数。可进行双向的测序用于最佳结果，自扩增子的两端及全长产生高质量读数。
靶区的长度可优化。例如，用具有100个核苷酸的典型读长，序列的头20～25个核苷酸对应于PCR引物的靶特定序列，且不会产生信息性的数据。因此，在一些情况中，采用约75bp的靶区。
覆盖需求的深度依赖于样品突变的预期的频度，及决定每大规模并行阵列给出的固定的量的序列通量包括的扩增子数。例如，对于根据标准孟德尔遗传模式的生殖系突变，100%或50%的读数预期含有给定序列变体。认为，在这些情况中，100～200×的覆盖的平均深度提供足够数量的读数，以用统计学置信检测变体。对于异源样品，例如，异源癌样品中以可变的和一般低频度存在的体细胞突变的高置信检测，达1000-2000X的更深覆盖被认为需要。
方法，试剂和设备还描述于Pourmand及同事的精细工作，例如，US7,785,785，通过引用以其整体及为全部目的在本文合并。
【可检测的实体】
任何广泛的可检测的剂可在本发明的实践中使用。适合的可检测的剂包括，但不限于：各种配体，放射性核素；荧光染料；化学发光剂（诸如,例如,吖啶鎓酯,稳定化的二氧杂环丁烷等）；生物发光剂；光谱可分辩的无机荧光半导体纳米晶体（即,量子点）；微粒；金属纳米粒子（例如,金,银,铜,铂,等）；纳米簇；顺磁金属离子；酶；比色标记物（诸如,例如,染料,胶体金,等）；生物素；地高辛配基；半抗原；及抗血清或单克隆抗体可对其利用的蛋白。
在一些实施方式中，可检测的部分是生物素。生物素可结合到亲和素（诸如链霉亲和素），其一般缀合（直接或间接）到本身可检测的其他部分（例如,荧光部分）。
除了关联本文所述的各种方法描述的例示可检测的实体之外，以下描述了一些其他可检测的部分的非限制性例。
【荧光染料】
在特定实施方式中，可检测的部分是荧光染料。具有广泛的化学结构和物理特征的多种知道的荧光染料适宜于在本发明的实践中使用。荧光可检测的部分可由激光器用由检测器捕获的发射的光刺激。检测器可为电荷耦合装置（CCD）或共聚焦显微镜，其记录其强度。
适合的荧光染料包括，但不限于，荧光素和荧光素染料（例如,荧光素异硫代花青苷或FITC,萘并荧光素,4',5’-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素,6-羧基荧光素或FAM,等），羰基花青苷，部花青苷，苯乙烯基染料，氧鎓醇染料，藻红蛋白，赤藓红，伊红，若丹明染料（例如,羧基四甲基若丹明或TAMRA,羧基若丹明6G,羧基-X-若丹明（ROX），丽丝胺若丹明B,若丹明6G,若丹明绿,若丹明红,四甲基若丹明（TMR），等），香豆素和香豆素染料（例如,甲氧基香豆素,二烷基氨基香豆素,羟基香豆素,氨基甲基香豆素（AMCA），等），俄勒冈绿染料（例如,俄勒冈绿488,俄勒冈绿500,俄勒冈绿514,等），德克萨斯红，德克萨斯红-X，谱REDTM，谱GREENTM，花青苷染料（例如,CY-3TM,CY-5TM,CY-3.5TM,CY-5.5TM,等），ALEXAFLUORTM染料（例如,ALEXA FLUORTM350,ALEXA FLUORTM488,ALEXA FLUORTM532,ALEXA FLUORTM546,ALEXA FLUORTM568,ALEXA FLUORTM594,ALEXA FLUORTM633,ALEXAFLUORTM660,ALEXA FLUORTM680,等），BODIPYTM染料（例如,BODIPYTMFL,BODIPYTMR6G,BODIPYTMTMR,BODIPYTMTR,BODIPYTM530/550,BODIPYTM558/568,BODIPYTM564/570,BODIPYTM576/589,BODIPYTM581/591，BODIPYTM630/650，BODIPYTM650/665，等），IRDyes（例如,IRD40,IRD700,IRD800,等），等。对于适合的荧光染料和将荧光染料偶联到其他化学实体诸如蛋白和肽的方法的更多例，见，例如，“The Handbook of FluorescentProbes and Research Products”,9th Ed.,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。荧光标记剂的有利的性质包括高摩尔吸收系数，高荧光量子产率，及光稳定性。在一些实施方式中，标记荧光团在可见光谱（即,在400和750nm之间）而非在光谱的紫外线范围（即,少于400nm）内呈现吸收和发射波长。
可检测的部分可包括多于一个化学实体，诸如在荧光共振能量转移（FRET）中。共振转移导致发射强度的总体增强。例如，见Ju et.al.,(1995),Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA),92:4347，整个内容通过引用在本文合并。为了达到共振能量转移，第1荧光分子（“供体”氟）吸收光，及通过激发的电子的共振将其转移到第2荧光分子（“受体”氟）。在一方法中，供体和受体染料可连接在一起及附接到寡引物。将供体和受体染料连接到核酸的方法已之前描述于，例如，Lee等人的美国专利No.5,945,526，整个内容通过引用在本文合并。可使用的染料的供体/受体对包括，例如，荧光素/四甲基若丹明，IAEDANS/荧光素，EDANS/DABCYL，荧光素/荧光素，BODIPY FL/BODIPY FL，及荧光素/QSY7染料。见，例如，Lee et al的美国专利No.5,945,526。许多这些染料也是可商购的，例如，自Molecular Probes Inc.（Eugene,OR）。适合的供体荧光团包括6-羧基荧光素（FAM），四氯-6-羧基荧光素（TET），2'-氯-7'-苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素（VIC），等。
【酶】
在特定实施方式中，可检测的部分是酶。适合的酶的例包括，但不限于，在ELISA中使用的那些，例如，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶，等。其他例包括β-葡萄糖醛酸糖苷酶，β-D-葡萄糖苷酶，脲酶，葡萄糖氧化酶，等。可将酶使用接头基团诸如碳二亚胺，二异氰酸酯，戊二醛，等缀合于分子。
【放射性同位素】
在特定实施方式中，可检测的部分是放射性同位素。例如，分子可为同位素-标记的（即,可含有已由具有不同于通常见于自然界的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子取代的一个或更多原子）或可将同位素附接于分子。可合入分子的同位素的非限制性例包括氢，碳，氟，磷，铜，镓，钇，锝，铟，碘，铼，铊，铋，砹，钐和镥的同位素（即,3H,13C,14C,18F,19F,32P,35S,64Cu,67Cu,67Ga，90Y，99mTc，111In，125I，123I，129I，131I，135I，186Re，187Re，201Tl，212Bi，213Bi，211At，153Sm，177Lu）。
在一些实施方式中，信号扩增通过使用标记的树状聚体作为可检测的部分来达到（见,例如,Physiol Genomics,3:93-99,2000），整个内容通过引用以它们的整体在本文合并。荧光标记的树状聚体可获自Genisphere（Montvale,N.J.）。这些可由本领域知道的方法化学缀合于寡核苷酸引物。
【测定相对丰度】
各种方法可用于测定胚胎或母源区的相对丰度。如本文所用，术语“相对丰度”指称相比参照量的目标基因组区的量。相对丰度可测定为尤其是比，百分率，倍数变化，标准化的量。
一般而言，为测定相对丰度，目标胚胎或母源基因组区的量首先由包括本文所述的那些的各种方法（例如,单分子测序,数字PCR,桥式PCR,乳剂PCR,纳米串技术或aCGH）测量或定量。然后将此量与参照量比较。参照量可为量指示核酸总量，关联母源样品（例如,母源血）中胚胎或母源核酸的总量。在此情况中，胚胎或母源区的相对丰度一般测定为关联DNA总量的百分率。
在一些实施方式中，将胚胎基因组区和对应母源基因组区的量定量。胚胎基因组区的相对丰度可通过比较胚胎基因组区的量与对应母源区的量来测定。可将相对丰度与预定的阈值比较，以便测定是否胚胎基因组区区别表达。一般而言，在此情况中，预定的阈值指示关联母源样品中胚胎核酸和母源核酸之间的平均比。如果相对丰度以统计学置信在预定的阈值以上，胚胎基因组区被鉴定为过表达。
在一些实施方式中，母源基因组区的相对丰度可通过比较母源基因组区的量与对应胚胎基因组区的量来测定。相对丰度可将比较与预定的阈值以便测定是否母源基因组区区别表达。一般而言，在此情况中，预定的阈值指示关联母源样品中母源核酸和胚胎核酸之间的平均比。如果相对丰度以统计学置信在预定的阈值以下，母源基因组区被鉴定为亚表达。
在一些实施方式中，相对丰度可通过比较关联母源样品中胚胎或母源基因组区的定量的量与分别指示胚胎或母源基因组区的平均表达的参照量来测定。该平均表达可通过使用与目标区同时实施的相同的测定来定量知道不在母源样品中过表达或亚表达的对照区的量来测定。在一些实施方式中，多对照区可定量及平均，以获得指示平均表达的参照量。适合的参照量也可为历史参照（即,自之前实施的测定的量或结果,或之前知道的量或结果）。在此情况中，如果定量的量相比参照量统计学地不同（例如,更大或更小），目标胚胎或母源区被鉴定为区别表达（例如,过表达或亚表达）。
在一些实施方式中，相对丰度可通过比较关联母源样品中胚胎或母源基因组区的定量的量与指示胚胎或母源基因组区的过表达的参照量来测定。该参照可通过使用与目标区同时实施的相同的测定来定量已知在母源样品中过表达的对照区的量来测定。在一些实施方式中，多个过表达的对照区可定量及平均，以获得指示过表达的参照量。适合的参照量也可为历史参照（即,自之前实施的测定的量或结果,或之前知道的量或结果）。在此情况中，如果定量的量是以统计学置信基本上相同或大于参照量，目标胚胎或母源区被鉴定为过表达。
在一些实施方式中，相对丰度可通过比较关联母源样品中胚胎或母源基因组区的定量的量与指示胚胎或母源基因组区的亚表达的参照量来测定。该参照可通过使用与目标区同时实施的相同的测定来定量已知在母源样品中亚表达的对照区的量来测定。在一些实施方式中，多个亚表达的对照区可定量及平均，以获得指示亚表达的参照量。适合的参照量也可为历史参照（即,自之前实施的测定的量或结果,或之前知道的量或结果）。在此情况中，如果定量的量是以统计学置信基本上相同或小于参照量，目标胚胎或母源区被鉴定为亚表达。
在一些实施方式中，测定每个体多态基因组区或座位的相对丰度，且可表示连续体模型（例如,线或曲线）。可将连续谱与分别指示胚胎或母源核酸的平均表达的基线比较，且任何以统计学置信自基线偏离的基因组区或座位可被鉴定为区别表达的（例如,过表达或亚表达的）。在一些实施方式中，指示在母源循环（例如,母源血）中胚胎核酸的平均表达的参照量可为约3%，5%，10%，15%，20%或25%。在一些实施方式中，指示母源循环（例如,母源血）中母源核酸的平均表达的参照量可为约97%，95%，90%，85%，80%或75%。
在基因组区被鉴定为相比参照量过表达的或亚表达的一些实施方式中，测定基因组区的“过表达因数”或“亚表达因数”。例如，如果胚胎基因组区被测定为相比指示母源样品中胚胎核酸的平均表达（例如,5%）的参照量过表达（例如,10%），胚胎基因组区超过参照量的观察的量的因数计算为“过表达因数”。在此情况中，过表达因数是2。
一般而言，如以下描述或根据其他本领域知道的方法应用统计学测试，以测定是否量的差异或相似性是统计学地显著。
【统计学分析】
一般而言，统计学地分析数据，以测定是否2值是相同或不同（例如,是否基因组区的量与参照量相同的或不同）。本领域建立各种统计学测试和统计学意义的量度，且可根据本发明使用。分析均匀地分布和/或推定为均匀地分布的数据的通常使用的统计学测试的非限制性例（例如,参数测试）包括Student氏t检验（包括1-样品t检验,2-样品t检验及匹配的配对t检验）和方差分析（ANOVA;单因素和2-因素或重复量度（例如,N-因素ANOVA））。
分析不是均匀地分布的数据的通常使用的统计学测试的非限制性例包括Wilcoxon Rank-Sum测试和Mann Whitney U测试。
严格度（例如,通过p-值和/或q-值的截止值,如下解释）可根据标准设置，和/或可就给定数据组依经验设置。要使用的统计学测试的选择可依赖于一种或更多因素，包括但不限于数据分布，实施的比较的类型（例如,实验数据与参照值对比2组实验数据彼此）和样品之间的关系（例如,匹配的对（诸如用匹配的对照的实验样品）对比无关系）。在一些实施方式中，使用多于一个统计学测试，例如，为确认目的。
在一些实施方式中，使用适合于小样品尺寸的统计学测试。
在一些实施方式中，使用多（例如,多于2）组之间的关系的分析。例如，N-因素ANOVA测试（也被称为重复的测量ANOVA测试）一般化Student氏t检验至多于2组。N-因素ANOVA测试可根据本发明的方法使用，用于更有效在多组之间比较。
在一些实施方式中，将多测试修正应用于调整源于多统计学测试的p-值，以校正可自多测试出现的误差（例如,增加的数的假阳性或显著结果）。多测试修正一般涉及自重复多次的统计学测试再计算概率。在一些实施方式中，使用Bonferroni修正。多测试修正方法为本领域所知。对于该方法的回顾，见，例如，Noble，（2009），NatureBiotechnology,27:1135-1137，整个其内容通过引用并入。
在一些实施方式中，使用涉及2类别变量之间的关系的分析的统计学测试。
例如，Fisher氏精确测试可用于精确地计算自无效假说的偏差的显著性；Fisher氏精确测试可用于情况，其中样品尺寸小。见，例如，Weisstein,Eric W.,“Fisher’s Exact Test.”From Math World--AWolfram Web Resource，在Wolfram.com网站可利用，整个内容通过引用在本文合并。
一般使用统计学意义的2个指标来评价数据。P-值指示如果无效假说不是真，获得观察的值的概率。例如，无效假说可为给定胚胎基因组区具有平均表达。更低p-值指示统计学意义；即，无效假说不是真的且应拒绝的增加的似然性。Q-值指示当特定测试被认为显著时，假发现率，即发生的假阳性的比例的量度。如同p-值，更低q-值指示更大显著性。在一些实施方式中，使用p-值截止值。在一些实施方式中，使用q-值截止值。在一些实施方式中，使用p-值和q-值截止值二者。在一些实施方式中，使用p<0.05的p-值截止值。在一些实施方式中，使用更严格p-值截止值，例如，p<0.01，p<0.005，p<0.001，等。在一些实施方式中，使用q<0.2的q-值。在一些实施方式中，使用更严格q-值截止值例如，q<0.1，p<0.05，p<0.01，等。p-值和q-值截止值的任何组合可用于使用截止值的实施方式，例如，p<0.05与q<0.2组合。
在一些实施方式中，定量的数据首先在统计学分析之前标准化。一般而言，标准化是分离在重复的测量的数据中的统计学误差的过程。标准化有时基于性质。分位数标准化，例如，是基于量度的量值（分位数）的标准化。在一些实施方式中，标准化指称由共同变量的多组数据的区分，以便规避变量对数据的效应，由此允许成为待比较的数据组的特征的基础：此允许待比较的不同尺度的数据，通过使它们至共同尺度。例如，胚胎或母源样品中的母源基因组区的定量的量可相对样品中基因组DNA的总量标准化，以规避原材料中量变异的效应。
【验证和临床应用】
在一些实施方式中，可在不同生物学个体之间比较区别表达的胚胎或母源基因组区。鉴定及确证一贯地过表达或亚表达的区。验证可由相同的技术的重复，和/或由另外的技术进行。例如，单分子测序结果可，例如，由数字PCR或通过再测序核酸确认。再测序可由相同的方法和/或由其他方法，例如，Sanger测序实现。可计算各确证的区别表达的区的过表达或亚表达因数。
可基于它们的染色体位置，及关联的遗传疾病，病症或病情为临床应用鉴定确证的过表达或亚表达的胚胎或母源基因组区。在一些实施方式中，也提供区别表达的区的过表达或亚表达因数和/或DNA序列。在一些实施方式中，本发明提供记载与染色体位置，关联的遗传疾病，病症或病情相关的信息，确证的区别表达的胚胎或母源基因组区的过表达或亚表达因数和/或DNA序列的计算机可读介质。
确证的区别表达的胚胎或母源基因组区可用于开发或改善与任何区别表达的区关联的任何基因组失常及关联的遗传疾病，病症和病情的非-侵袭性出生前诊断。如本文所用，遗传失常可包括，但不限于，核酸碱基取代，扩增，缺失，复制，转位，拷贝数变异，非整倍性（例如,多倍性,三体性,等）和嵌合体。例如，母源循环中相对过表达的胚胎基因组区的表征可提供本文所述的各种基因组失常的更稳健的分析，因此，提供关联的遗传疾病，病症或病情的更精确的出生前诊断。在一些实施方式中，母源循环中相对过表达的胚胎基因组区的表征可用于开发用简化的，最小或无富集或纯化的胚胎DNA的非-侵袭性诊断测定。在一些实施方式中，母源循环中相对过表达的胚胎基因组区的表征可用于检测早期怀孕期间（例如,在妊娠的4～13周,4～9周或4～6周之间）的胚胎异常。在一些实施方式中，母源循环中在第13，14，15，16，18，21，22，X染色体或其任何组合上相对过表达的胚胎基因组区的表征可用于检测染色体异常包括但不限于结构异常，非整倍性（例如,多倍性,三体性,等），嵌合体，突变及关联的遗传疾病，病症和病情包括但不限于Turner氏综合征，Down综合征（三体性21），Edward氏综合征（三体性18），Patau综合征（三体性13），三体性14，三体性15，三体性16，三体性22，三倍性，四倍性和性染色体异常包括但不限于XO，XXY，XYY和XXX。
【实施例】
【实施例1：用于鉴定母源血中胚胎DNA的过表达的区的单分子测序】
以平均100x或更大基因组覆盖对从自多个个体的母源血浆的无细胞的DNA实施高-通量单分子测序。
将自母源样品的核酸片段化及变性为单链。将多聚A尾加入各分子。然后将单核酸分子捕获到流动池之内表面，各单分子捕获到不同位置。
通过使用各分子作为模板无扩增地进行测序反应。每次添加一个荧光-标记的核苷酸（dCTP,dGTP,dATP或dTTP），及由DNA聚合酶合并到生长的互补链。洗涤出未合并的核苷酸。激光用于在合并的标记的核苷酸上的激发的荧光团。在一或更多像中检测及记录得到的发射的信号，及信号位置。然后将合并的核苷酸的荧光标记物由将合并的核苷酸落在后的高度有效切割过程移出，然后将另一核苷酸加入持续循环。由此对各单分子跟踪核苷酸并合，以测定各个体DNA分子的确切的序列。
用5%的胚胎DNA级分，平均起来，95%的序列读数预期来自母源核酸和5%的序列读数预期来自胚胎核酸。实施来自胚胎或母源核酸的序列读取计数的统计学分析，以鉴定在无细胞的胚胎DNA中过表达的区。
例如，过表达的座位可在标位到该座位的基因组位置的100个总读数中具有20个胚胎序列读数和80个母源序列读取。Fisher氏精确测试用于基于观察的计数的相比预期的计数的p-值鉴定该区，用于给定平均胚胎级分。将多测试修正应用于增加此方法的特异性。然后将胚胎DNA过表达的区在不同生物学个体之间比较，且选择最一贯地过表达的座位用于在数字PCR测定中或由其他手段验证。
【实施例2：用于表征和/或定量多态胚胎或母源基因组区的数字PCR】
采用数字PCR来表征及定量多态胚胎或母源基因组区。将自最低限度稀释的母源样品的核酸片段化及变性为单链，然后将其扩增，以产生完全来源自一种模板的扩增子，且可用不同荧光团检测，以区别及计数不同多态区（例如,胚胎对比母源区）。在此过程中，首先将自母源样品制备的DNA以调整到获得约平均每2孔一个模板的浓度在384-孔多-孔板上稀释。
对各SNP设计一对PCR引物和一对分子信标，分子信标分别在它们的5’和3’端具有荧光染料和猝灭剂。除了对应于SNP和荧光标记物（例如,绿色或红色）的核苷酸之外，两个信标是相同的。与它们的互补核苷酸序列杂交之后，猝灭剂自荧光团远离，导致增加的荧光。计算具有绿色或红色荧光的2种等位基因-特异性信标的荧光强度的比，以测定各个体孔中的等位基因类型。用计数的数百或数千孔，可测定母源和胚胎（或父源）等位基因的相对丰度。如在实施例1中描述进行统计学分析。
【实施例3：用于表征和/或定量胚胎或母源基因组区的桥式PCR】
在流动池中进行桥式PCR，以表征和/或定量胚胎或母源基因组区。将DNA样品随机片段化，然后连接到通用适配体序列。流动池表面用对应于通用适配体序列的单链寡核苷酸包被。然后，当单链，适配体-连接的片段结合到暴露于用于基于聚合酶的延伸的试剂的流动池表面时，将具有通用端的片段在单反应中用单对的扩增引物扩增。引发随连接到在表面的互补寡聚体的片段“桥”的游离的/远端发生，导致许多拷贝的DNA样品。采用由合成的测序，以对DNA样品测序。特别是，使含有百万的簇的流动池表面经历用延伸及成像的自动化的循环，使用例如，Illumina’s Solexa Sequencing Technology测序。测序的各循环涉及合并单荧光核苷酸的步骤，之后是整个表面的高解析度成像。任何在背景以上的信号鉴定簇（或PCR集落）的物理位置，及荧光发射鉴定4种碱基中的哪种在该位置合并。重复此循环，一次一个碱基，产生各表示在特定簇的单碱基延伸的一系列像。碱基判定源于鉴定经时发射色彩的算法。由此，获得可归因于特定胚胎或母源基因组区的个体序列读取计数。统计学分析如在实施例1中描述进行。
【实施例4：用于表征和/或定量胚胎或母源基因组区的乳剂PCR】
乳剂PCR用于表征及定量胚胎或母源基因组区。用克隆扩增的DNA产生小珠，其中各珠含有自单分子模板由PCR产生的一种类型的扩增子。将用捕获寡核苷酸包被的珠与具有互补衔接子或标记序列的核苷酸混合。将含有PCR的全部必需组分的水性混合物加结合引物的珠和模板DNA与油/去污剂混合物一起搅拌，以产生微乳剂。水性隔室含有平均<1模板分子和<1珠。微乳剂如在常规PCR中一样温度循环。如果DNA模板和珠在单水性隔室中一起存在，珠结合的寡核苷酸作为扩增用引物。
由各种材料制造的珠，例如，磁珠，塑料珠，金粒子，纤维素粒子，聚苯乙烯粒子等，及各种尺寸的珠用于乳剂PCR。适合的珠可为小，例如，1～2，至几百，例如，200～1000μm直径的尺寸范围的微粒。在一些实施方式中，在本发明中采用可商购的控制的-孔隙玻璃（CPG）或聚苯乙烯支持物作为固相支持物。该支持物用碱不稳定接头和附接的初始核苷可利用，例如，Applied Biosystems（Foster City,Calif.）。
通过本领域知道的焦磷酸测序表征含有克隆扩增的核酸的珠。由此获得可归因于胚胎或母源基因组区的序列读取计数。适合的测序机包括454Life Sciences’s Genome Sequencer FLX。
统计学分析如在实施例1中描述进行。
【实施例5：用于表征和/或定量胚胎或母源基因组区的用标条码的探针的单分子杂交】
将用标条码的探针的单分子杂交，如在本领域知道，用于表征及定量胚胎或母源基因组区。因此，分子条码和单分子成像对于在单反应中无扩增地检测及计数特定核酸靶是有用的。将各色彩-编码的条码附接于对应于目标基因组区的单靶-特异性探针。2种探针（即,所谓的“报告子”和“捕获”探针）用于杂交各个体靶核酸。报告子探针携带信号，及捕获探针允许待固定的复合物，用于数据收集。在杂交之后，移出过量探针，及为数据收集由
Figure BDA00002759066700401
分析系统数字分析仪（Nanostring Technologies,Seattle WA）分析固定的探针/靶复合物。就各靶分子（例如,目标胚胎或母源基因组区）计数及列表色码。
统计学分析如在实施例1中描述进行。
【实施例6：用于表征和/或定量胚胎或母源基因组区的半导体测序】
半导体测序用于表征及定量胚胎或母源基因组区。将自母源样品的样品DNA片段化及变性为具有约100bp的单链。库通过合并由具有适配体序列的设计的PCR引物合并的双向的侧接适配体来构建。通过使用乳剂PCR克隆扩增库片段，以形成用模板DNA包被的粒子。将粒子沉积在合并电荷传感器的大规模并行阵列上，以检测在DNA复制期间质子的实时释放。进而大规模并行阵列在DNA聚合酶的存在下，在对于DNA复制适合的条件下与各脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTP）依次接触。dNTP各并合到生长的双联DNA导致质子释放，导致由电荷传感器可检测的电荷变化。在大规模并行阵列中各孔的电荷变化与特定dNTP的存在的关联提供DNA样品的序列。
统计学分析如在实施例1中描述进行。
【其他实施方式】
通过考虑本文公开的本发明的说明书或实践，本发明的其他实施方式会对于本领域技术人员而言是显而易见的。本说明书和实施例仅旨在例示，本发明的实际范围由以下权利要求指示。
【参考文献的合并】
本申请中引用的全部出版物和专利文献如各个体出版物或专利文献的内容并入本文相同的程度通过引用以它们的整体并入本文。

Claims (61)

1.鉴定母源样品中的区别表达的胚胎或母源基因组区的方法，包括下列步骤：
定量存在于母源样品中的胚胎或母源基因组区；
测定相比参照量的胚胎或母源基因组区的相对丰度，由此测定是否胚胎或母源基因组区在母源样品中区别表达；
其中胚胎或母源基因组区不对应于非整倍性区。
2.权利要求1的方法，其中参照量指示母源样品中胚胎或母源核酸的平均表达。
3.权利要求2的方法，
其中测定相对丰度的步骤包括比较定量的量与参照量，而且
其中如果定量的量以统计学置信不同于参照量，胚胎或母源基因组区被鉴定为在母源样品中区别表达。
4.权利要求1的方法，其中参照量指示母源样品中胚胎或母源核酸的过表达。
5.权利要求4的方法，
其中测定相对丰度的步骤包括比较定量的量与参照量，而且
其中如果定量的量以统计学置信基本上相同于或大于参照量，胚胎或母源基因组区被鉴定为在母源样品中过表达。
6.权利要求1的方法，其中参照量指示母源样品中胚胎或母源核酸的亚表达。
7.权利要求6的方法，
其中测定相对丰度的步骤包括比较定量的量与参照量，而且
其中如果定量的量以统计学置信基本上相同于或小于参照量，胚胎或母源基因组区被鉴定为在母源样品中亚表达。
8.权利要求1的方法，其中方法定量胚胎基因组区。
9.权利要求8的方法，其中参照量指示母源样品中胚胎核酸的平均表达。
10.权利要求9的方法，其中胚胎核酸的平均表达是约5%。
11.权利要求8的方法，其中如果定量的量在参照量以上，胚胎基因组区被鉴定为在母源样品中过表达。
12.权利要求1的方法，其中方法定量母源基因组区。
13.权利要求12的方法，其中参照量指示母源样品中母源核酸的平均表达。
14.权利要求13的方法，其中母源核酸的平均表达是约95%。
15.权利要求12的方法，其中如果定量的量在参照量以下，母源基因组区被鉴定为在母源样品中亚表达。
16.权利要求1的方法，其中定量步骤包括定量胚胎基因组区和对应母源基因组区。
17.权利要求16的方法，其中测定步骤包括通过比较胚胎基因组区的定量的量与对应母源基因组区的定量的量来测定胚胎基因组区的相对丰度。
18.权利要求1的方法，其中胚胎基因组区自对应母源基因组区特殊地可检测。
19.权利要求1的方法，其中胚胎基因组区包含父源地贡献的序列。
20.权利要求18的方法，其中胚胎基因组区包含不同于对应母源基因组区的序列。
21.权利要求20的方法，其中胚胎基因组区包含至少一个不同于对应母源基因组区多态核苷酸。
22.权利要求18的方法，其中胚胎基因组区包含不同于对应母源基因组区的甲基化模式。
23.权利要求18的方法，其中胚胎基因组区相比对应母源基因组区包含拷贝数变异（CNV）。
24.权利要求1的方法，其中方法同时定量多个胚胎或母源基因组区。
25.权利要求1的方法，其中方法还包括首先自母源样品制备总DNA的步骤。
26.权利要求1的方法，其中方法还包括首先自母源样品制备无细胞DNA的步骤。
27.权利要求1的方法，其中方法还包括首先产生包含待定量的胚胎或母源基因组区的核酸片段的步骤。
28.权利要求1的方法，其中母源样品选自：细胞，组织，全血，血浆，血清，尿，粪便，唾液，脐带血，绒毛膜绒毛样品，绒毛膜绒毛样品培养物，羊水，羊水培养物，经子宫颈灌洗液，及其组合。
29.权利要求28的方法，其中母源样品是母源血。
30.权利要求1的方法，其中母源样品从一个个体得到。
31.权利要求1的方法，其中母源样品从多个个体得到。
32.权利要求1的方法，其中定量步骤包括DNA测序步骤。
33.权利要求32的方法，其中DNA测序步骤包括高-通量单分子测序步骤。
34.权利要求32的方法，其中DNA测序步骤包括无偏的DNA测序步骤。
35.权利要求32的方法，其中DNA测序步骤覆盖大于100个基因组当量。
36.权利要求32的方法，其中DNA测序步骤包括用光信号标记胚胎或母源基因组区的步骤。
37.权利要求36的方法，其中光信号选自荧光和/或发光信号。
38.权利要求37的方法，其中荧光信号由花青苷-3和/或花青苷-5产生。
39.权利要求32的方法，其中方法还包括在测序步骤之前将包含胚胎或母源基因组区的核酸分子捕获到固体表面的步骤。
40.权利要求32的方法，其中定量步骤包括获得可归因于胚胎或母源基因组区的个体序列读取计数。
41.权利要求40的方法，其中定量步骤还包括比较可归因于胚胎基因组区的个体序列读取计数与可归因于对应母源基因组区的个体序列读取计数。
42.权利要求1的方法，其中定量步骤包括实施数字PCR的步骤。
43.权利要求1的方法，其中定量步骤包括实施桥式PCR的步骤。
44.权利要求1的方法，其中定量步骤包括使用经与胚胎或母源基因组区特异性结合的纳米报告子标记的探针杂交个体核酸分子的步骤。
45.权利要求1的方法，其中定量步骤包括实施基于阵列的比较性基因组杂交（aCGH）的步骤。
46.权利要求45的方法，其中aCGH步骤使用与胚胎或母源基因组区特异性结合的探针。
47.权利要求46的方法，其中探针用光信号标记。
48.权利要求47的方法，其中光信号选自荧光和/或发光信号。
49.权利要求47的方法，其中aCGH步骤包括测定可归因于胚胎或母源基因组区的信号水平。
50.权利要求1的方法，其中统计学置信通过N-因素ANOVA，Student氏t检验或Fisher氏精确测试测定。
51.权利要求1的方法，其中多测试修正在统计学置信上实施。
52.权利要求1的方法，其中方法还包括测定胚胎基因组区的过表达因数。
53.权利要求1的方法，其中方法还包括在不同个体间比较鉴定的区别表达的胚胎或母源基因组区。
54.权利要求1的方法，其中方法还包括由数字PCR或再测序确认鉴定的区别表达的胚胎或母源基因组区。
55.非-侵袭性诊断的方法，其包括表征通过使用权利要求1的方法鉴定的过表达的胚胎基因组区的步骤。
56.鉴定在母源样品中通常过表达的胚胎基因组区的方法，包括下列步骤：
表征母源样品中的胚胎基因组区及对应母源基因组区；
测定相比对应母源基因组区的胚胎基因组区的相对丰度；以及
如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以上，将胚胎基因组区鉴定为在母源样品中过表达，其中胚胎基因组区不是非整倍性区。
57.鉴定在母源样品中通常亚表达的母源基因组区的方法，包括下列步骤：
表征母源样品中的母源基因组区及对应胚胎基因组区；
测定相比对应胚胎基因组区的母源基因组区的相对丰度；以及
如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以下，将母源基因组区鉴定为在母源样品中亚表达，其中对应胚胎基因组区不是非整倍性区。
58.鉴定在母源样品中通常过表达的胚胎基因组区的方法，包括下列步骤：
表征母源样品中的胚胎基因组区；
测定相比参照的胚胎基因组区的相对丰度；以及
如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以上，将胚胎基因组区鉴定为在母源样品中过表达，其中胚胎基因组区不是非整倍性区。
59.权利要求58的方法，其中参照指示母源样品中胚胎核酸的平均表达。
60.鉴定在母源样品中通常亚表达的母源基因组区的方法，包括下列步骤：
表征母源样品中的母源基因组区；
测定相比参照的母源基因组区的相对丰度；以及
如果以统计学置信测定的相对丰度在预定的阈值以下，将母源基因组区鉴定为在母源样品中亚表达，其中母源基因组区不对应于非整倍性区。
61.权利要求60的方法，其中参照指示母源样品中母源核酸的平均表达。
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