CN103054869A - 含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备以lsd1为靶标药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物做为一类新的抗肿瘤药物先导化合物的应用，属于药物化学领域。本发明所述的化合物具有如下结构通式：该类化合物对组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）起到了良好的抑制作用，可作为进一步开发的候选或者先导化合物应用于制备抗癌药物。

Description

含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备以LSD1为靶标药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物作为新的组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）抑制剂的应用。

背景技术

组蛋白赖氨酸去甲基化酶1（Lysine Specific Demethylase 1，LSD1）是2004年由哈佛大学医学院ShiYang教授发现的第一个组蛋白去甲基化酶(YangShi. Cell.  2004 , 119, 941–953)，能够去除组蛋白H3K4、H3K9的单、双甲基化，从而调节组蛋白和其他蛋白的相互作用，并影响基因转录的激活和抑制，染色体失活等重要生命过程。

LSD1是一个黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）依赖的去甲基化酶，在去甲基化的过程中能够生成一分子的过氧化氢和甲醛。LSD1还是氨基氧化酶的同源蛋白，和多胺氧化酶（Polyamine Oxidase, PAO）相似度为22.4%，和单胺氧化酶A和B（Monoamine Oxidases A and B）相似度为17.6%。

LSD1在多种肿瘤细胞中LSD1的表达量显著高于正常细胞，如神经母细胞瘤、眼癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等。而实验证明，通过RNAi技术或小分子抑制剂在细胞水平降低LSD1表达量或降低LSD1的活性能抑制细胞增殖并诱导一些细胞分化相关基因的表达；在小分子单胺氧化酶抑制剂PCPA的作用下亦能抑制多种肿瘤细胞和实体瘤的生长。因此，LSD1抑制剂不仅能作为表观遗传学的研究工具用于阐述生物学功能，而且能作为表观遗传学药物用于肿瘤的预防和治疗。

点击化学由2001年诺贝尔化学奖获得者美国化学家Sharpless首次提出，目前主要指的是一类Cu(I)催化的叠氮化合物与炔基化合物反应生成1, 2, 3-三氮唑五元环化合物的反应。由于其反应条件温和、产率高，产物后处理简单等诸多优点而在药物先导化合物的优化、化合物库的组建中得到了广泛应用。1, 2, 3-三唑表现出了多种有趣的生物活性，例如抗菌，抗炎，抗过敏，抗结核，抗HIV活性等。许多上市的药物结构中都具有1, 2, 3-三唑结构片段，例如β-内酰胺酶抑制剂他唑巴坦（式.1）。最近，其在抗肿瘤药物先导化合物发现中的应用受到越来越多的关注。多个研究小组利用点击化学将1, 2, 3-三唑和其他药效基团进行连接，合成得到了一些具有优秀抗肿瘤活性和抑制MAO活性的化合物。例如Kamal小组在鬼臼毒素中引入1, 2, 3-三唑(式.2)，合成得到了一系列抗肿瘤活性优于etoposide的化合物（H.M.Sampath Kumar. European Journal of Medicinal Chemistry.  2011, 46, 1983-1991）；Marvin J. Miller将1,2,3-三唑和芳酰胺结合(式.3)，发现了一类新型的具有优异抗肿瘤活性的化合物（Marvin J. Miller. J. Med. Chem.  2010 , 53, 3389-3395)；而Qing Zhu小组利用Click合成多个三唑基衍生物（式4）并具有较好的抗MAO-A活性（Qing Zhu. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 2010, 20, 6222-6225）。    

另外，氨基二硫代甲酸酯类化合物，由于其广泛的生物活性，如具有抗菌、抗炎、杀虫、抗肿瘤、防辐射以及螯合重金属等作用而引起药物化学领域的广泛关注。利用点击化学将1,2,3-三唑活性片段引入到氨基二硫代甲酸酯结构中，合成新型含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物，研究新型含三唑基结构的氨基二硫代甲酸酯类化合物抑制LSD1的活性，对进一步研究以LSD1为靶点的新型抗肿瘤药物，开发自主知识产权药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新型含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物作为制备抑制LSD1活性先导药物的应用。

本发明所述一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯类化合物具有如下通式：

          

           

R₁为H，不同位置的单取代C1-C5的烷基、甲氧基、氟、氯、溴、三氟甲基或多取代的氟、多取代的氯、多取代溴或多取代的甲氧基等。

通式I中优选：R₁为不同位置的单取代C1-C3的烷基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基或多取代的氟、多取代的氯、多取代的甲氧基等。

通式I中优选如下化合物：

  I-1：R₁=o-F的衍生物；

  I-2：R₁=p-F的衍生物；

  I-3：R₁=p-Cl的衍生物；

  I-4：R₁=o-Cl的衍生物；

  I-5：R₁=p-CH₃的衍生物；

 I-6：R₁=p-OCH₃的衍生物；

 I-7:  R₁=o-CF₃的衍生物；

 I-8：R₁=m, p-diCl的衍生物；

 I-9：R₁=m, p, m-triOCH₃的衍生物；

 I-10：R₁=o, o-diF的衍生物。

通式II中优选：R₁为不同位置的单取代C1-C3的烷基、甲氧基、氟、氯或者多取代的氟、多取代的氯、多取代的甲氧基等。

通式II中优选如下化合物：

 II-1：R₁=o-F的衍生物；

 II-2：R₁=p-Cl的衍生物；

 II-3：R₁=p-CH₃的衍生物；

 II-4：R₁=p-OCH₃的衍生物；

 II-5:  R₁=o-CF₃的衍生物；

 II-6：R₁=m, p-diCl的衍生物；

 II-7：R₁=m, p, m-triOCH₃的衍生物；

 II-8：R₁=o, o-diF的衍生物。

本发明所述的一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯类化合物主要通过下列方法制得：

1. 通式（I）的制备方法

有机溶剂中，化合物（IV）和通式（V）中的化合物在CuI/有机碱、CuSO₄/抗坏血酸钠或Cu/CuSO₄条件下发生1,3-环加成反应，所用的有机碱为三乙胺，二异丙基乙基胺；所用的有机溶剂为乙腈，叔丁醇/水，四氢呋喃/水，N, N-二甲基甲酰胺/水，乙醇/水等；反应温度在0-90⁰C之间，通常在室温进行。所得产物经柱层析或者重结晶等提纯得到纯产品。重结晶所用溶剂为乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿中的一种或其中两种的混合物。 

 R₁为H，不同位置的单取代C1-C5的烷基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基或多取代的氟、多取代的氯、多取代的甲氧基等。

2. 通式（IV）的制备方法：

     溶剂中，将商业可得的叔丁氧羰基单保护哌嗪在碱性条件下和二硫化碳、溴丙炔或者氯丙炔发生亲核反应，所用的碱是碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、十一水磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、三乙胺等中的一种；所用的溶剂为丙酮、N, N-二甲基甲酰胺、乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、1，2-二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二氧六环，蒸馏水其中之一或其中任意两种或三种的混合物；所得产物经柱层析或者重结晶等提纯得到纯产品。重结晶所用溶剂为乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿中的一种或其中两种的混合物。    

     3. 通式（II）的制备方法：

     通式（I）所示化合物在有机溶剂、酸性条件下脱去叔丁氧羰基，得通式（II）化合物。所用的酸为三氟乙酸、氯化氢、溴化氢等；所用的有机溶剂为二氯甲烷、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、四氢呋喃等；反应温度在-10-60⁰C之间，通常在室温进行。所得产物经柱层析或者重结晶等提纯得到纯产品。    

                                                   

 R₁为H，不同位置的单取代C1-C5的烷基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基或多取代的氟、多取代的氯、多取代的甲氧基等。

与现有的技术相比，本发明首次利用经典的点击化学将1,2,3-三唑活性单元与氨基二硫代甲酸酯结合，简单高效，绿色环保的合成含三唑结构的氨基二硫代甲酸酯类化合物。体外LSD1活性抑制试验表明，本发明所提供含三唑结构的氨基二硫代甲酸酯类化合物对LSD1活性具有明显的抑制作用，其中通式（I）中I-1：R₁=o-F; I-3：R₁=o-Cl；I-2：R₁=p-F; I-5：R₁=p-CH₃; I-6：R₁=p-OCH₃的衍生物，通式（II）中II-4：R₁=p-OCH₃衍生物对LSD1的抑制活性明显优于苯环丙胺，可以将其做为活性成分用于制备组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂药物。

附图说明

图 1为本发明合成的I-1、I-3、I-5、I-2、I-6、II-4化合物终浓度0.5μM时在胃癌细胞系MGC-803中对LSD1底物H3K9me2、H3K4me2 表达量的调节作用Western Blot定性图；

图 2为本发明合成的I-1、I-3、I-5、I-2、I-6、II-4化合物终浓度0.5μM时在胃癌细胞系MGC-803中对LSD1底物H3K9me2表达量的调节作用Western Blot图灰度分析半定量柱形图；

图3为本发明合成的I-1、I-3、I-5、I-2、I-6、II-4化合物终浓度0.5μM时在胃癌细胞系MGC-803中对LSD1底物H3K4me2 表达量的调节作用Western Blot图灰度分析半定量柱形图。

具体实施方式

为了对本发明进行更好的说明，特举实施例如下：

通式(V)的制备参考以下文献制得：

(a) Ina.Wilkening.; Giuseppe del Signore.; C.P.R.Hackenberger. Chem. Commun.  2011, 47, 349-351. (b) Mingyu Hu.; Junqi Li.; ShaoQ Yao. Org. Lett, 2008, 10, 5529-5531.。

实施例 1 中间体（IV）的制备

将CS₂（10mmol）逐滴加入到叔丁氧羰基单保护哌嗪（10mmol）和Na₃PO₄（6mmol）的丙酮溶液中，室温搅拌30分钟后加入溴丙炔（11mmol）搅拌反应，TLC跟踪检测。反应结束后，抽滤，滤液减压浓缩，浓缩物用二氯甲烷（3×50mL）和饱和食盐水萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，浓缩物重结晶或柱层析分离得化合物IV。收率92%，白色固体。¹H NMR (400 MHz, Actone-d₆, δ, ppm): 4.28 (br, 2H), 4.14 (d, 2H, J=2.68Hz), 4.00 (br, 2H), 3.58 (br, 4H), 2.78 (t, 1H, J=2.68Hz), 1.46 (s, 9H); HRMS (ESI) calcd for C₁₃H₂₁N₂O₂S₂ [M+H]⁺:301.1044, found: 301.1046。

实施例 2 通式（I）所示，R₁ = o-F的衍生物(I-1)的制备

    将化合物IV（5mmol）和2-氟苄基叠氮（5mmol）用THF-H₂O (30-30mL)溶解，搅拌下加入五水硫酸铜（0.25mmol），抗坏血酸钠（0.5mmol），室温搅拌反应3-4小时，跟踪监测反应。反应结束后，向反应体系中加入H₂O（40mL），反应体系用EtOAc（3×50mL）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-1。收率79.0%，白色固体，熔点：109-110^oC。IR( KBr, cm^-1) ν :3454, 2979, 1693, 1494, 1478, 1279, 1167, 1012, 986, 932, 791, 757, 695; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ , ppm): 7.66 (s, 1H), 7.09-7.38 (m, 4H), 5.55 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.52 (t, 4H, J=5.20Hz), 1.47 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 196.42, 161.72, 159.26, 154.41, 144.00, 130.89, 130.81, 130.51, 130.48, 124.82, 124.78, 122.96, 121.98, 121.84, 115.92, 115.71, 80.63, 47.66, 47.61, 53.4, 31.84, 28.34; HRMS(ESI) calcd for C₂₀H₂₇FN₅O₂S₂ [M+H]⁺: 452.1590, found: 452.1598.。

实施例 3 通式（I）所示，R₁ = p-F的衍生物（I-2）的制备

    将化合物IV（5mmol）和4-氟苄基叠氮（5mmol）用THF-H₂O（30-30mL）溶解，搅拌下加入五水硫酸铜（0.25mmol），抗坏血酸钠（0.5mmol），加毕室温搅拌反应1-2小时，跟踪监测反应。反应结束后，向反应体系中加入H₂O（30mL），反应体系用EtOAc（3×50mL）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-2。收率78.7%，白色固体，熔点：105-106^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν : 3447, 2975, 1691, 1460, 1423, 1219, 1167, 1039, 935, 788, 746; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 7.59 (s, 1H), 7.34-7.87 (m, 3H), 5.55 (s, 2H), 4.72 (s, 2H), 4.26 (br, 2H), 3.92 (br, 2H), 3.56 (t, 4H, J=5.24Hz), 1.47 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, acetone-d₆,δ, ppm): 195.7, 154.8, 141.9, 133.7, 133.1, 133.1, 130.2, 129.71, 127.7, 123.6, 78.4, 50.8, 31.8, 27.6; HRMS(ESI) calcd for C₂₀H₂₈N₅O₃S₂ [M+H]⁺: 450.1634, found: 450.1638.。

实施例 4 通式（I）所示，R₁ = p-Cl的衍生物（I-3）的制备

     将化合物IV（3mmol）和4-氯苄基叠氮（3mmol）用THF-H₂O（20-20mL）溶解，搅拌下加入五水硫酸铜（0.15mmol），抗坏血酸钠（0.3mmol），加毕室温搅拌反应2-3小时，跟踪监测反应。反应结束后，向反应体系中加入H₂O（30mL），反应体系用EtOAc（3×40mL）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-3。收率85.5%，白色固体，熔点：177-178^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν :3446, 3130, 2979, 2914, 1678, 1491, 1422, 1224, 1161, 1024, 994, 932, 777, 543, 499; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 7.59 (s, 1H), 7.35 (d, 2H, J = 8.4Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.4Hz), 5.45 (s, 2H), 4.68 (s, 2H), 4.29 (br, 2H), 3.90 (br, 2H), 3.54 (t, 4H, J = 5.2Hz), 1.47(s, 9H);¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 196.4, 154.4, 144.4, 134.8, 134.1, 129.4, 129.3, 122.8, 80.7, 53.4, 31.7, 28.4; HRMS(ESI) calcd for C₂₀H₂₇ClN₅O₂S₂ [M+H]⁺: 468.1295, found: 468.1291.。  

实施例 5 通式（I）所示，R₁ = o-Cl的衍生物（I-4）的制备

     将化合物IV（3mmol）和4-氯苄基叠氮（3mmol）用THF-H₂O（20-20mL）溶解，搅拌下加入五水硫酸铜（0.15mmol），抗坏血酸钠（0.3mmol），加毕室温搅拌反应2-3小时，跟踪监测反应。反应结束后，向反应体系中加入H₂O（30mL），反应体系用EtOAc（3×40mL）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-4。收率85.5%，白色固体，熔点：177-178^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν :3446, 3130, 2979, 2914, 1678, 1491, 1422, 1224, 1161, 1024, 994, 932, 777, 543, 499; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 7.59 (s, 1H), 7.35 (d, 2H, J = 8.4Hz), 7.20 (d, 2H, J = 8.4Hz), 5.45 (s, 2H), 4.68 (s, 2H), 4.29 (br, 2H), 3.90 (br, 2H), 3.54 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 1.47(s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 196.4, 154.4, 144.4, 134.8, 134.1, 129.4, 129.3, 122.8, 80.7, 53.4, 31.7, 28.4; HRMS(ESI) calcd for C₂₀H₂₇ClN₅O₂S₂ [M+H]⁺: 468.1295, found: 468.1291.。  

实施例 6 通式（I）所示，R₁ = p-CH₃的衍生物（I-5）的制备

    将化合物IV（5mmol）和4-甲基苄基叠氮（5mmol）用乙腈（40mL）溶解，搅拌下加入碘化亚铜（0.5mmol），三乙胺（10mmol），加毕室温搅拌反应4-6小时，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系真空浓缩，浓缩物用EtOAc（50mL）溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-5。收率79.9%，白色固体，熔点：182-183^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν:3454, 2975, 1682, 1457, 1422, 1224, 1078, 994, 933, 867, 772, 524; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 7.55 (s, 1H), 7.16(s, 4H), 5.43 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 4.29 (br, 2H), 3.91 (br, 2H), 3.51 (t, 4H, J=5.16Hz), 2.35 (s, 3H), 1.47 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 196.5, 154.4, 138.7, 131.6, 129.8, 128.1, 80.6, 54.01, 31.9, 28.4, 21.2; HRMS(ESI) calcd for C₂₁H₃₀N₅O₂S₂ [M+H]⁺: 448.1841, found: 448.1840.。

实施例 7 通式（I）所示，R₁ = p-OCH₃的衍生物（I-6）的制备

    将化合物IV（3mmol）和4-甲氧基苄基叠氮（3mmol）用乙腈（30mL）溶解，搅拌下加入碘化亚铜（0.3mmol），三乙胺（6mmol），加毕室温搅拌反应2-3小时，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系真空浓缩，浓缩物用EtOAc（50mL）溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用乙酸乙酯重结晶，得产物I-6。收率85.8%，白色固体，熔点：129-130^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν :3502, 3125, 2975,1686, 1542, 1453, 1281, 1173, 1016, 982, 932, 775, 698 ; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 7.54 (s, 2H), 7.21 (d, 2H, J=8.0), 6.88 (d, 2H, J=8.0), 5.41 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 4.29 (br, 2H), 3.90 (br, 2H),3.80 (s, 3H), 3.51 (t, 4H, J=5.2Hz), 1.47 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 196.4, 164.0, 161.6, 154.4, 130.5, 130.5, 130.0, 129.9, 116.2, 116.0, 80.7, 53.4, 31.8, 28.3; HRMS (ESI) calcd for C₂₁H₃₀N₅O₃S₂ [M+H]⁺:464.1790, found:464.1794.。

实施例 8 通式（I）所示，R₁ = o-CF₃的衍生物（I-7）的制备

    将化合物IV（5mmol）和2-三氟甲基苄基叠氮（5mmol）用乙腈（40mL）溶解，搅拌下加入碘化亚铜（0.5mmol），二异丙基乙基胺（7.5mmol），加毕室温搅拌反应2-3小时，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系真空浓缩，浓缩物用EtOAc（50mL）溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和食盐水洗涤，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-7。收率81.5%，白色固体，熔点：138-139^oC。IR( KBr, cm^-1) ν:3454, 2979, 1693, 1494, 1478, 1279, 1167, 1012, 986, 932, 791, 757, 695; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ , ppm): 8.15 (s, 1H), 7.04-7.39 (m, 4H), 5.54 (s, 2H), 4.83 (s, 2H), 4.30 (br, 2H), 3.91(br, 2H) 3.52 (t, 4H, J=5.24Hz), 1.47(s, 9H); HRMS (ESI) calcd for C₂₁H₂₇F₃N₅O₂S₂ [M+H]⁺: 502.1558, found:502.1559.。

实施例9通式（I）所示R₁ = m, p-diCl的衍生物（I-8）的制备

    将化合物IV（4mmol）和3,4-二氯苄基叠氮（4mmol）用叔丁醇-水（30-30mL）溶解，搅拌下加入五水硫酸铜（0.8mmol），铜粉（4mmol），加毕室温搅拌反应3-5小时，跟踪监测反应。反应结束后，向反应体系中加入H₂O（30mL），反应体系用EtOAc（3×40mL）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-8。收率90.2%，白色固体，熔点：153-154^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν:3129, 2984, 1693, 1470, 1347, 1159, 1131, 990, 963, 798, 740, 698, 542 ; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.64 (s, 1H), 7.43 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.35 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.08 (dd, 1H, J ₁=2.0 Hz, J ₂=8.2 Hz), 5.44 (s, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.30 (br, 2H), 3.91 (br, 2H), 3.52 (t, 4H, J = 5.1Hz), 1.47 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 196.3, 154.4, 144.6, 134.8, 133.3, 133.1, 131.1, 129.9, 127.2, 122.9, 80.7, 52.8, 31.7, 28.3; HRMS (ESI) calcd for C₂₀H₂₆Cl₂N₅O₂S₂ [M+H]⁺: 502.0905, found: 502.0900.。

实施例10通式（I）所示R₁ = m, p, m-triOCH₃的衍生物（I-9）的制备

    将化合物IV（5mmol）和3,4,5-三甲氧基苄基叠氮（5mmol）用叔丁醇-水（40-40mL）溶解，搅拌下加入五水硫酸铜（1mmol），铜粉（5mmol），加毕室温搅拌反应3-5小时，跟踪监测反应。反应结束后，向反应体系中加入H₂O（30mL），反应体系用EtOAc（3×40mL）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-9。收率83.4%，白色固体， 熔点：134-135^oC。IR( KBr, cm^-1) ν:3453, 2979, 1693, 1494, 1478, 1279, 1167, 1012, 986, 932, 791, 757, 695 ; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃,δ, ppm): 7.63 (s, 1H), 6.48 (s, 2H), 5.41 (s, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.30 (br, 2H), 3.91 (br, 2H), 3.85 (s, 3H), 3.84 (s, 6H), 3.55 (t, 4H, J=5.24Hz), 1.48 (s, 9H);HRMS (ESI) calcd for C₂₃H₃₄N₅O₂S₂ [M+H]⁺: 524.2001, found: 524.2005.。

实施例 11 通式（I）所示, R₁ =o, o-diF的衍生物（I-10）的制备

    将化合物IV（5mmol）和2,6-二氟苄基叠氮（5mmol）用THF-H₂O（30-30mL）溶解，搅拌下加入五水硫酸铜（1mmol），铜粉（5mmol），加毕室温搅拌反应2-3小时，跟踪监测反应。反应结束后，向反应体系中加入H₂O（30mL），反应体系用EtOAc（3×40mL）萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物用丙酮重结晶，得产物I-10。收率78.4%，白色固体，熔点：141-142^oC。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.71 (s, 1H), 7.32-7.41 (m, 1H), 6.94-6.99 (m, 2H), 5.58 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 4.30 (br, 2H), 3.90 (br, 2H), 3.53 (s, 4H), 1.47 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 196.43, 162.66, 162.59, 160.16, 160.10, 154.41, 131.51, 131.40, 131.30, 111.94, 111.88, 111.75, 111.69, 110.95, 110.76, 110.57, 80.62, 41.39, 31.85, 28.35; HRMS (ESI) calcd for C₂₀H₂₆F₂N₅O₂S₂ [M+H]⁺:470.1496, found:470.1498.。

实施例 12  通式（II）所示, R₁ = o-F的衍生物（II-1）的制备 

    将化合物I-1（2mmol）用二氯甲烷（20mL）溶解，冰浴下加入CF₃COOH （40mmol），加毕改为室温搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系减压浓缩，浓缩物用二氯甲烷（30mL）溶解，分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-1。收率96.7%，淡黄色固体，熔点：93-94^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν :3138, 2910, 1693, 1474, 1425, 1219, 1132, 1031, 996, 933, 785, 763, 731, 694; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.67 (s, 1H), 7.09-7.34 (m, 4H), 5.55 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 4.30 (br, 2H), 3.93 (br, 2H), 2.94 (t, 4H, J = 4.8 Hz); HRMS (ESI) calcd for C₁₅H₁₉FN₅S₂ [M+H]⁺:352.1066, found: 352.1064.。

实施例 13 通式（II）所示, R₁ = p-Cl的衍生物（II-2）的制备

    将化合物I-3（2mmol）用二氯甲烷（20mL）溶解，冰浴下加入CF₃COOH （40mmol），加毕改为室温搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系减压浓缩，浓缩物用二氯甲烷（30mL）溶解，分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-2。收率97.9%，淡黄色固体熔点：138-139^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν:3138, 2910, 1693, 1474, 1425, 1219, 1031, 996, 933, 785, 763, 694; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.60 (s, 1H), 7.35 (d, 2H, J = 8.1 Hz ), 7.20 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 5.45 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.90 (br, 2H), 2.94 (s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm):196.03, 164.07, 161.60, 144.33, 130.47, 130.44, 129.97, 129.88, 122.74, 116.21, 116.00, 53.41, 45.15, 31.7; HRMS (ESI) calcd for C₁₅H₁₉FN₅S₂ [M+H]⁺:352.1066, found: 352.1063.。

实施例 14 通式（II）所示, R₁ = p-CH₃的衍生物(II-3)的制备

    将化合物I-5（2.5mmol）用二氯甲烷（20mL）溶解，冰浴下加入CF₃COOH（50mmol），加毕改为室温搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系减压浓缩，浓缩物用二氯甲烷（30mL）溶解，分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-3。收率94.0%，淡黄色固体，熔点：74-75^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν:3135, 2910, 1697, 1474, 1425, 1219, 1031, 996, 933, 785, 763, 731, 695; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.56 (s, 1H), 7.16-7.33 (m, 4H), 5.43 (s, 2H), 4.67 (s, 2H), 4.31 (br, 2H), 3.92 (br, 2H), 2.96 (br, 4H), 2.35 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm):195.82, 138.61, 131.59, 129.74, 128.08, 122.72, 53.96, 31.80, 29.68, 21.17; HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₂₂N₅S₂ [M+H]⁺:348.1317, found: 348.1319.。

实施例 15 通式（II）所示, R₁=p-OCH₃的衍生物（II-4）的制备  

    将化合物I-6（4mmol）冰浴下用氯化氢的1,4-二氧六环溶液（4mol/L, 30mL）溶解，加毕保持冰浴搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系减压浓缩，浓缩物用二氯甲烷（30mL）溶解，分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-4。收率98.7%， 淡黄色固体，熔点：95-96^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν :3138, 2910, 1693, 1474, 1425, 1383, 1219, 1031, 996, 933, 785, 763, 694; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.55 (s, 1H), 7.24 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 6.91 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 5.42 (s, 2H), 4.68 (s, 2H), 4.31 (br, 2H), 3.95 (br, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.96 (t, 4H, J = 4.6 Hz); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm):195.75, 159.89, 144.12, 129.61, 126.61, 122.53, 114.45, 55.34, 53.69, 45.63, 31.79; HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₂₂N₅OS₂ [M+H]⁺:364.1266, found: 364.1263。

实施例 16通式（II）所示，R₁=o-CF₃的衍生物（II-5）的制备

    将化合物I-7（2.00g, 4mmol）冰浴下用氯化氢的1,4-二氧六环溶液（4mol/L, 30mL）溶解，加毕保持冰浴搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系减压浓缩，浓缩物用二氯甲烷（30mL）溶解，分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-7 1.52g，收率94.5%，淡黄色固体，熔点：151-152^oC。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ , ppm): 7.66 (s, 1H), 7.65 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.36 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 5.57 (s, 2H), 4.71 (s, 2H), 4.33 (br, 2H), 3.91(br, 2H), 2.98(s, 4H,); HRMS (ESI) calcd for C₁₆H₁₉F₃N₅S₂ [M+H]⁺: 402.1034, found: 402.1035.。

实施例 17通式（II）所示，R₁=m, p-diCl的衍生物（II-6）的制备

    将化合物I-8（5mmol）冰浴下用氯化氢的1,4-二氧六环溶液（4mol/L, 40mL）溶解，加毕保持冰浴搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系减压浓缩，浓缩物用二氯甲烷（30mL）溶解，分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-5。收率95.5%，淡黄色固体，熔点：122-123^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν:3138, 2910, 1693, 1474, 1425, 1219, 1163, 1031, 996, 933, 785, 763, 694; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.65 (s, 1H), 7.45 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.35（d, 1H, J = 1.9 Hz), 7.10 (dd, 1H, J ₁ = 2.0 Hz, J ₂ = 8.3 Hz), 5.44 (s, 2H), 4.70 (s, 2H), 4.31 (br, 2H), 3.92 (br, 2H), 2.95 (s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm):195.62, 144.87, 134.79, 133.27, 133.07, 131.09, 129.86, 127.17, 122.92, 52.81, 45.63, 31.56; HRMS (ESI) calcd for C₁₅H₁₈Cl₂N₅S₂ [M+H]⁺:402.0381, found: 402.0369.。

实施例 18 通式（II）所示，R₁=m, p, m-triOCH₃, n=1的衍生物（II-7）的制备

    将化合物I-9（2mmol）冰浴下用氯化氢饱和乙酸乙酯溶液（30mL）溶解，加毕改为室温搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-6。收率96.0%，淡黄色固体，熔点：120-121^oC。IR ( KBr, cm^-1) ν:3138, 2910, 1693, 1474, 1425, 1219, 1031, 996, 933, 785, 763, 694; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 7.64 (s, 1H), 6.47 (s, 2H), 5.40 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 4.30 (br, 2H), 3.91 (br, 2H), 3.83(s, 3H), 3.82(s, 6H), 2.93(s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃, δ, ppm):195.63, 153.66, 144.42, 138.23, 130.15, 122.83, 105.16, 60.85, 56.23, 54.35, 45.72, 31.68; HRMS (ESI) calcd for C₁₈H₂₆N₅O₃S₂ [M+H]⁺:424.1477, found: 424.1472.。

实施例 19  通式（II）所示，R₁=o, o-diF, n=1的衍生物（II-8）的制备

    将化合物I-10（3mmol）用氯化氢饱和乙酸乙酯溶液（40mL）溶解，加毕改为室温搅拌反应，跟踪监测反应。反应结束后，将反应体系分别用饱和碳酸氢钠，水，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得产物II-7。收率93.3%，淡黄色固体，熔点：144-145^oC。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃, δ, ppm): 8.10 (s, 1H), 7.50-7.86(m, 3H), 4.89 (s, 2H), 4.37 (br, 2H), 3.93 (br, 2H), 3.05(s, 4H); HRMS (ESI) calcd for C₁₅H₁₈F₂N₅S₂ [M+H]⁺:370.0792, found: 370.0795.。   

实施例20上述化合物的LSD1抑制活性测定：

1.实验方法：

样品为实施例所合成的上述化合物、纯化而得；样品储备液：称取3-5 mg样品置于1.5 mL EP管中，然后用DMSO配制成浓度是20 mM的溶液，4 °C保存放置，实验时根据所需浓度用DMSO稀释。将待测样品与LSD1蛋白于室温孵育后，加入LSD1反应底物H3K4me2并孵育反应，最后加入荧光染料Amplex和辣根过氧化酶HRP室温孵育，在酶标仪上激发光530 nm，发射光590 nm检测荧光数值:

试验结果采用SPSS软件计算IC₅₀值。

2．实验结果

实验结果如下例表1所示。

 表 1 上述化合物对LSD1及对人胃癌细胞MGC-803，乳腺癌细胞MCF-7，前列腺癌细胞PC3，食管癌细胞EC-109抗肿瘤活性评价数据：

实施例21已筛选的LSD1抑制剂在细胞水平对LSD1活性的抑制作用

1.  实验方法：

    样品为实施例20所筛选出的化合物I-1、I-3、I-5、I-2、I-6、II-4。样品储备液：称取3-5 mg样品置于1.5 mL EP管中，然后用DMSO配制成浓度是20 mM的溶液，4 °C保存放置，实验时根据所需浓度用DMSO稀释。取对数生长期的胃癌细胞系MGC-803，消化接种于100mL细胞培养瓶中培养至80%满，加入终浓度0.5μM的化合物I-1、I-3、I-5、I-2、I-6、II-4，24小时候用酸沉淀法提取组蛋白并用BCA法定量。加入6×Loading Buffer后蛋白变性，根据蛋白浓度计算上样体积，加1.5μg蛋白于配置好的12%SDS-PAGE胶中电泳，电用完后用硝酸纤维素膜进行半干转，5%牛奶封闭电转完的硝酸纤维素膜2h后，加入抗体H3K4me2或H3K4me9进行一抗过夜孵育。次日用PBST洗膜3次并加入二抗体显影曝光。根据曝光出的条带颜色分析检测抑制剂在细胞水平对LSD1活性的抑制作用。

2．实验结果

实验结果见附图1-3所示。结果表明：本发明合成的化合物对LSD1活性有抑制作用，明显优于苯环丙胺，可以将其做为活性成分用于制备组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂药物。

Claims (6)

1.具有通式(I)所示结构的一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备药物中的应用，其特征在于，将其做为活性成分用于制备组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂药物；

                                                          

R₁为H，不同位置的单取代C1-C5的烷基、甲氧基、氟、氯、溴、三氟甲基或多取代的氟、多取代的氯、多取代溴或多取代的甲氧基。

2.如权利要求1所述的一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备药物中的应用，其特征在于，通式I中优选：R₁为不同位置的单取代C1-C3的烷基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基或多取代的氟、多取代的氯或多取代的甲氧基。

3.如权利要求2所述的一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备药物中的应用，其特征在于，优选如下化合物：

 I-1：R₁=o-F的衍生物；

 I-2：R₁=p-F的衍生物；

I-3：R₁=p-Cl的衍生物；

 I-4：R₁=o-Cl的衍生物；

 I-5：R₁=p-CH₃的衍生物；

 I-6：R₁=p-OCH₃的衍生物；

I-7:  R₁=o-CF₃的衍生物；

 I-8：R₁=m, p-diCl的衍生物；

I-9：R₁=m, p, m-triOCH₃的衍生物；

  I-10：R₁=o, o-diF的衍生物。

4.具有通式(II)所示结构的一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备药物中的应用，其特征在于，将其做为活性成分用于制备组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1抑制剂药物；

               

R₁为H，不同位置的单取代C1-C5的烷基、甲氧基、氟、氯、溴、三氟甲基或多取代的氟、多取代的氯、多取代溴或多取代的甲氧基。

5.如权利要求4所述的一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备药物中的应用，其特征在于，优选：R1为不同位置的单取代C1-C3的烷基、甲氧基、氟、氯、三氟甲基或者多取代的氟、多取代的氯、多取代的甲氧基。

6.如权利要求5所述的一类含三唑基的氨基二硫代甲酸酯化合物在制备药物中的应用，其特征在于，优选如下化合物：

 II-1：R₁=o-F的衍生物；

 II-2：R₁=p-Cl的衍生物；

 II-3：R₁=p-CH₃的衍生物；

 II-4：R₁=p-OCH₃的衍生物；

 II-5:  R₁=o-CF₃的衍生物；

 II-6：R₁=m, p-diCl的衍生物；

II-7：R₁=m, p, m-triOCH₃的衍生物；

  II-8：R₁=o, o-diF的衍生物。

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