CN103045497A - 一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用。该软腐欧文氏菌于2012年8月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCCNo.6433。本发明得到的软腐欧文氏菌能够诱导植物本身产生抗性反应，对植物起到免疫激活作用。经验证，该软腐欧文氏菌中起免疫激活作用的物质是其产生的一种蛋白，将其命名为EccPR蛋白，该蛋白用于植物免疫激活，能使植物体内抗性基因表达明显提高，从而有效地诱导植物对病原菌起到抗性作用。

Description

一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用。 

背景技术

我国是当今世界首屈一指的农业大国，但由于多方面的原因，重大病害出现的频率和面积明显增加，造成的产量损失都在10%左右。河北省主要农作物、经济作物如小麦、玉米、棉花等和大棚蔬菜每年因病虫害的损失也是巨大的，据估计可达数十亿元。为了对付严重的农作物病害，农业生产者大量使用化学农药。化学农药的施用也确实对农作物病害的控制做出了巨大的贡献。但是，化学农药的大量施用也正在显示着严重的负面影响。因此，在全球范围内研究、开发和生产安全、无毒副作用、对环境友好的生物制剂成为新产业的发展重点。随着生物防治、绿色农业等呼声日益高涨，植物抗病免疫技术的研究成为近年兴起的重要研究领域。 

植物免疫抗病激活剂是一些生物和非生物因子,能够诱导植物独特的生理状态，植物能够更好或更快或者既好又快的调配防卫反应的生理状态，使植物防御病虫害的状态处在临界，达到一触即发，当病害在侵染植物时，植物会在短时间内借助于诱导因子激发植物整体的抗性水平，调动整个植物的免疫能力，激活植物自身抗病相关基因的表达，抵抗病原物的侵染，自身不对病原菌起作用，不会使病原菌产生抗药性，用量低、高效、诱导的植物抗病谱广、抗病持续时间长，这对于植物病害的可持续控制具有重要的意义。 

软腐欧文氏菌是一种广泛的致病菌，主要发生在大白菜、卷心菜、菜花、马铃薯等作物上，主要为害叶、茎及块茎。叶染病近地面老叶先发病，病部呈不规则暗褐色病斑，湿度大时腐烂。茎部染病多始于伤口，再向茎干蔓延，后茎内髓组织腐烂，具恶臭，病茎上部枝叶萎蔫下垂，叶变黄。块茎染病多由皮层伤口引起，初呈水浸状，后薯块组织崩解，发出恶臭。 

发明内容

本发明的目的提供一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌、从其中提取的免疫激活蛋白及其应用。 

本发明采取的技术方案： 

一种具有植物免疫激活作用的胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601，于2012年8月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 6433。

所述的软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其提取方法如下： 

（1）将mini-Tn5-Km转座子插入软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中，筛选出不能使烟草叶片出现过敏反应即叶片上出现坏死斑的突变菌；

（2）利用转座子mini-Tn5-Km上的Km标签，通过RACE-PCR扩增上述突变菌中转座子插入点两端的DNA片段，经过测序拼接后，获得DNA序列；

（3）将步骤（2）得到的DNA序列连接到pET30a(+)上，并将其转入到大肠杆菌E.coli BL21中，获得工程菌E.coli BL21（pET30a-EccPR）；

（4）将工程菌E.coli BL21（pET30a-EccPR）诱导培养获得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白。

所述的免疫激活蛋白的应用。 

本发明的有益效果：本发明得到的软腐欧文氏菌能够诱导植物本身产生抗性反应，对植物起到免疫激活作用。经验证，该软腐欧文氏菌中起免疫激活作用的物质是其产生的一种蛋白，将其命名为EccPR蛋白，该蛋白用于植物免疫激活，能使植物体内抗性基因表达明显提高，从而有效地诱导植物对病原菌起到抗性作用。 

具体实施方式

本发明筛选得到一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601，该菌株作为病原菌侵染拟南芥时，不能使拟南芥染病，而且将这种菌接种于烟草叶片，烟草叶片能够过敏反应，出现坏死斑。 

本发明从软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中提取EccPR蛋白的过程如下： 

（1）将mini-Tn5-Km转座子插入软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中获得突变菌种库，筛选出不能使烟草叶片出现过敏反应的突变菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601108，即在该菌株中转座子的插入破坏了软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中能使植物对病原菌产生抗性的功能单元的结构；

（2）利用转座子mini-Tn5-Km上的Km标签，通过RACE-PCR扩增转座子插入点两端的DNA片段，经过测序拼接后，获得DNA序列；

（3）将步骤（2）得到的DNA序列连接到pET30a(+)上，并将其转入到大肠杆菌E.coli BL21中，获得工程菌E.coli BL21（pET30a-EccPR）；

（4）将工程菌E.coli BL21（pET30a-EccPR）诱导培养获得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白EccPR，其具体过程为：

将工程菌E.coli BL21（pET30a-EccPR）单菌落挑起于LB培养基中在37℃下进行过夜培养，将其作为母种，第二天将母种以1%接种量接种于液体LB培养基中，在37℃下进行培养5-7小时，在其培养液中加入0.4mM的IPTG进行诱导培养，诱导6-8小时后，将该培养液进行离心，获得的菌体然后将其水悬浮并煮沸10-15分钟，离心后将上清冷冻干燥，获得含有70-80%发酵免疫激活蛋白EccPR的粗蛋白，如果要获得纯免疫激活蛋白EccPR，则将其过层析柱即可得到纯品免疫激活蛋白EccPR。

本发明得到的EccPR蛋白在诱导植物产生抗病性中应用： 

将浓度为1mg/ml的EccPR免疫激活蛋白溶液分别喷施到拟南芥、黄瓜和烟草上，每7天喷施一次，每次喷施蛋白总量为20-25mg/株，总共喷施3次。最后一次喷施20天后，分别在拟南芥上接种丁香假单胞杆菌DC3000，在黄瓜上接种枯萎病菌，在烟草上接种软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc。同时用不喷施EccPR免疫激活蛋白溶液的植物个体做对照。培养72小时后，发现在没有喷施激活蛋白EccPR的植物上都染病，而喷施的植物上染病率是20%，而且这些染病的植物都产生了过敏反应。用激活蛋白EccPR处理过的植物叶片中的病原菌数目比未处理的降低了45%，而且相应的抗性基因表达都有明显的提高：PR1提高7.3倍，PR5提高1.8倍，PDF1.2提高11.7倍，Thi2.1提高21.1倍，VSP2.1提高43.4倍。这些说明EccPR免疫激活蛋白是一种有效的诱抗剂，能够有效的诱导植物对病原菌起到抗性作用，而且这种使用方法能够最佳诱导植物产生抗性。

EccPR蛋白还具有促进种子萌发和促进植物生长的作用： 

将免疫激活蛋白EccPR纯品溶解在水中，分别配制不同浓度的溶液，溶液浓度分别为0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml、100mg/ml。将这些不同浓度的免疫激活蛋白EccPR分别浸泡拟南芥、黄瓜和烟草种子2个小时后，正常培养种子，结果发现免疫激活蛋白EccPR的浓度大于或等于0.1 mg/ml时，能够促进这三种种子的萌发速度，提高这三种种子的萌发率。而且发现1mg/ml提高种子的萌发率达到21%。

将拟南芥、黄瓜和烟草幼苗分别在含有终浓度为1mg/ml的EccPR免疫激活蛋白的MS液体培养基中进行培养，培养20天后，拟南芥、黄瓜和烟草的根长分别增加12%、5%、10%，鲜重分别增加16%、8%、12%。这些说明EccPR蛋白能够促进植物的生长。 

Claims (3)

1.一种具有植物免疫激活作用的软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601，其特征在于其于2012年8月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No. 6433。

2.由权利要求1所述的软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中提取的免疫激活蛋白，其特征在于其提取方法如下：

（1）将mini-Tn5-Km转座子插入软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. Carotovora strain Ecc 601中，筛选出不能使烟草叶片出现过敏反应即叶片上出现坏死斑的突变菌；

（2）利用转座子mini-Tn5-Km上的Km标签，通过RACE-PCR扩增上述突变菌中转座子插入点两端的DNA片段，经过测序拼接后，获得DNA序列；

（3）将步骤（2）得到的DNA序列连接到pET30a(+)上，并将其转入到大肠杆菌E.coli BL21中，获得工程菌E.coli BL21（pET30a-EccPR）；

（4）将工程菌E.coli BL21（pET30a-EccPR）诱导培养获得具有植物免疫激活作用的免疫激活蛋白。

3.权利要求2所述的免疫激活蛋白的应用。