CN103011916B - 一种有机菌液的制备方法、该方法制得的有机菌液及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有机菌液的制备方法、该方法制得的有机菌液及应用。所述有机菌液从草木灰、糠醛渣、粪便、活性淤泥、农作物秸秆等富含有机质工农业废弃物中选育，通过筛选、扩繁后制得。该有机菌液具有菌种活性高的特点，可在微生物肥料生产时用作菌种母剂或直接作为拌种剂使用。

Description

一种有机菌液的制备方法、该方法制得的有机菌液及应用

技术领域

本发明涉及生物菌肥用有机菌液，属于微生物肥料领域。  

背景技术

随着我国农村经济结构的调整，农业产业化进程的加快，沼渣、草木灰、糠醛渣、动物粪便等工农业废弃物的排放量在大幅度增加。根据国家环保局开展的污染调查显示：仅2010年全国排放量为19亿吨，为同年工业固体废物（7.8亿吨）的2.4倍，COD排放已达7118万吨，大大超过了工业废水与生活废水的COD排放量之和。这严重导致了乡村生态环境的恶化，它不仅污染空气、水体和土壤，而且滋生了大量的苍蝇蚊虫和多种病源微生物，给人们的健康带来了严重的威胁。

化学肥料的推广对农业增产增收起到了关键作用，然而，多年来由于长期施用化学肥料，有机肥不足，有机、无机养分比例失调，致使农田生态环境、土壤理化性状和土壤微生物系统受到不同程度的破坏，在一定程度上影响了农产品的产量品质。由于农田长期不合理地施用大量的农药、化肥、除草剂、生长调节剂等化学合成物质，再加上农业自身废弃物的不当处置，污水灌溉和“三废”不达标排放以及酸雨等一系列问题，造成我国耕地污染不断积累和加重。农业生态环境和农产品的安全性正遇到前所未有的严峻挑战，农业污染已成为困扰我国农业发展的重要问题。

工农业生产产生的固体废弃物既含有氮磷钾钙镁硫等大量和中量元素，还含有对作物生长起重要作用的硼、铜、铁、锰、锌等微量元素和大量的有机质，是一种迟、速兼备的肥料。因此，用该废弃物制成的肥料具有速效、迟效两种功能，可做基肥和追肥，既可减少化肥、农药的施用量，降低成本，又能有效地提高农作物的产量和品质。活性有机菌可将无机元素转化为有益植物生长的有机化合物，改善土壤氧化还原条件，减低氮素脱氧和氧化过程，从而降低硝酸盐含量。相对而言，生物肥料充分利用微生物的某种特征，以增加土壤中有效养分为目的，其施用量一般不大，在其生产过程中所消耗的能量也很少，且施用生物肥料的同时还可减少化肥的施用量，因而节约了施肥成本。复合微生物肥料不仅可以提高化学肥料的有效利用率，还有改善土壤的功效。应用试验表明：用孢芽孢杆菌生产的复合微生物肥料连续使用两年以上，土壤中有益放线菌数量增加8.4倍，固氮菌增加39倍，从而达到活化、蔬松土壤，提高土壤肥力的作用，有益微生物菌的大量繁殖，可以把多年沉积固定在土壤中的化学肥料活化后再一次供农作物吸收利用。同时土壤中侧孢芽孢杆菌数量的增加，对土传真菌性病害以及根结线虫能进行有效生物防治，其防治率可高达70-80%，与化学农药防效相当，从而减少化学农药的使用量，提高农作物的品质和产量以及抗重茬的能力。复合微生物肥料在农业生产中应用表明，在化学肥料利用率的提高，疏松土壤，减少江河污染，培肥地力，减少病虫害的发生，增强作物的抗逆性等方面都有着非常好的效果。 

有机菌液是活性有机菌肥的核心，直接决定了活性有机菌肥的功效。现有技术中活性有机菌肥的菌种一般从菌种库中选择。有些菌种在实验室条件下其功能表现优异，但在实际生产肥料或用于农田时，由于环境的差异，可能存活率低，使用后难以达到预期的效果。另外，现有技术中也有采用复合菌种（不产生拮抗作用的2-3个菌株）来生产肥料，但是用复合菌种是一个比较复杂的问题，不能简单地认为，微生物的复合(或联合)就是好多菌混合发酵，或是简单的发酵后混合、组合。各菌种生长需要的温度、适度、酸碱度等指标不同，之间可能存在拮抗现象，可能造成复合菌种效果不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有机菌液及其制备方法，其菌种性强，功能多样，与有机肥中的营养元素复合好。本发明的另一目的是提供该有机菌液的应用。

本发明有机菌液的制备方法采用的技术方案是：

一种有机菌液的制备方法，其特征在，包括如下步骤：

A)菌种选择：从制造有机肥的原料中选取若干样品，从上述样品中分离出芽孢杆菌、酵母菌、丝状真菌、光合细菌、乳酸菌株、放线菌若干株；

通过统计分析，筛选上述菌株，在每个菌种中确定出效能最高的菌株作为核心菌种；在室内培养条件下，将不同菌种两两在同一培养皿中培养，观察之间有无拮抗现象，若发现拮抗现象，则从其同一类中另外选择菌株培养；通过比较观察试验，在芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌各选一种与这三种菌种中的其它两种菌种不拮抗的生物菌种作为必选菌种；在光合细菌菌株、乳酸菌菌株、放线菌菌株各选一种与这三种菌种中的其它两种菌种和上述必选菌种不拮抗的生物菌种作为可选菌种；

B)确定菌种最佳接种量和原料配比：按照牛肉膏1.1％-2.0％、蛋白胨1.1％-2.0％、氯化钠0.55％-0.65％、琼脂2％-3％，其余为水的基本量，制作基本培养基，基本培养基的pH值控制在6-8.5；在基本培养基中接入上述三种必选菌种和可选菌种的一种或多种，放入摇床，装液量为培养容器体积的20％-50%，摇床转速为160-190转/分钟；按照菌种接种量、培养基中的每一种物质设置基本量增加10%、增加20%、减少10%和减少20%共4个级别，改变培养基各成分的组成；观察各菌株生长情况，确定最佳接种量，确定培养基中各组分适合的比例，制作出选择性培养基； 

C)斜面菌种制备：在选择性培养基中分别接入三种必选菌种和可选菌种的一种或多种，置于28℃恒温箱培养72h，之后置于冰箱内保存，备用；

D)克氏瓶菌种制备:取克氏瓶若干个，分别装入选择性培养基，灭菌后每个克氏瓶中接入一种斜面菌种，置于36-45℃恒温箱内培养72h，备用；

E)菌种悬浮液制备：将上述克氏瓶中的菌种在无菌条件下加入250mL无菌水，制成悬浮液；将克氏瓶中悬浮液倒入无菌的减压瓶内，包扎后即为菌种悬浮液；

一级种子液制备：在减压瓶中将上述悬浮液接入灭菌的选择性培养基中，在36-45℃下发酵20h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分，制得一级种子液；所述一级种子液中选择性培养基的重量比为50％-60％，其余为上述各种菌种悬浮液；

G)有机菌液制备：在发酵罐中注入选择性培养基，将上述种子液按照占选择性培养基重量10％-12％的比例接入发酵罐，在36-45℃下培养72h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分；当含菌量达到活菌数50亿株/mL以上，即为有机菌液。

进一步，所述制造有机肥的原料是指草木灰、糠醛渣、粪便、活性淤泥、农作物秸秆等富含有机质工农业废弃物中的一种或数种。

进一步，在步骤F与步骤G之间还包括二级种子液制备的步骤，所述二级种子液制备的步骤为：在选择性培养基中加入0.3％-0.5％的淀粉、0.5％-0.7％的蔗糖、0.3％的磷酸氢二钾、0.16％-0.20％的磷酸二氢钾、4.0％-5.0％的豆粕、10%的锯末后注入发酵罐；接种选择性培养基重量比为2％-5％的一级种子液；温度控制在36-45℃，搅拌转速150-180转/分，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，发酵24h后制成二级种子液。

进一步，所述步骤F中，在减压瓶中，芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌的菌种悬浮液接入量分别占总菌种悬浮液接入量的30％-50％、15％-25％、15％-25％。

进一步，所述步骤F中，在减压瓶中，接入悬浮液时，先接入必选菌种的悬浮液，培养一段时间以后再接入可选菌种的悬浮液。

所述草木灰为生物发电厂中植物燃烧后的灰烬，含钾量为6-12％。所述糠醛渣是生物质类物质如玉米芯、玉米秆、稻壳、棉籽壳以及农副产品加工下脚料中的聚戊糖成分水解生产糠醛产生的生物质类废弃物;优选有机质含量大于70%以上的糠醛渣。所述动物粪便为人畜的粪便，机质含量一般大于14%。所述农作物秸秆为水稻、小麦等农作物秸秆，有机质含量平均为15%左右。所述城市淤泥为城市污水处理厂处理生活污水的淤泥，有机质含量一般在50%以上。

经本发明研究人员发现，现有理论中的一些制作有机菌肥的有益菌种，在实际生产中并不能充分发挥其应有的效果，这是因为传统理论并不能完全模拟实际生产中的情况，例如温度、湿度、酸碱度等情况，可能存在着很大的误差。有机肥料所使用的草木灰、糠醛渣、动物粪便等，其成分、沉积年份、所处的湿度、温度情况差异很大，如果简单按照传统的理论选用菌种，很难达到理想的效果。为此，发明人想到了以现有理论为指导，从实际生产的原料中选取菌种。因为每一个环境都有其特定的微生物菌群，只有从这个环境中选取的经过竞争，存活量大的优势菌种，才能有效保证选择的菌种在用该原料制得的肥料中活性更高。另外，微生物菌的种类不同，其特点、功效，使用后效果差异较大，微生物菌功能有单一和多功能之分。过去常用的微生物菌有固氮菌（根瘤菌），溶磷菌（巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌），硅酸盐细菌即解钾菌（胶质芽孢杆菌）等，功能比较单一。复合菌（不产生拮抗作用的2-3个菌株）有着相互协同的作用效果，单独使用单一一类菌种，均不能达到本发明有机肥的效果。选择微生物菌时，在考虑其功能特点的同时，必需考虑所使用的微生物菌的抗逆性，即选择抗高温、抗干燥、抗酸碱、抗盐份能力强的微生物菌种，这是复合微生物肥料产业化的关键因素。有些菌种在实验室条件下其功能表现优异，但在肥料生产或保存过程中大量死亡，存活率低，使用后难以达到预期的效果，因此在选择微生物菌时应从功能的特点和抗逆性综合考虑选择，其综合指标高的菌株才是优秀的复合微生物肥料生产和应用的菌种。

芽孢杆菌（Bacillaceae）是细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。孢芽杆菌的作用是：保湿性强，形成强度极为优良的天然材料聚麸胺酸，为土壤的保护膜，防止肥份及水分流失；有机质分解力强，增殖的同时，会释出高活性的分解酵素，将难分解的大分子物质分解成可利用的小分子物质；产生丰富的代谢生成物，合成多种有机酸、酶、生理活性等物质，及其它多种容易被利用的养份；抑菌、灭害力强，具有占据空间优势，抑制有害菌、病原菌等有害微生物的生长繁殖；除臭，可以分解产生恶臭气体的有机物质、有机硫化物、有机氮等，大大改善场所的环境。其特性是：代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍；生命力强，无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）；体积大，体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。由于芽孢对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力，所以芽孢杆菌是我们从生产肥料的有机物中选择的目标菌种之一。

酵母菌是一种单细胞真菌，在有氧和无氧环境下都能生存，属于兼性厌氧菌。在有氧的情况下，它能把有机质中的糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在时，酵母菌生长较快。用酵母菌作发酵剂制作生态有机肥，具有发酵快，发酵好，既能高温发酵，又能低温发酵，大大缩短制作时间，降低成本等特点，所以酵母菌是我们从生产肥料的有机物中选择的目标菌种之一。

丝状真菌即是霉菌。霉菌是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。霉菌的孢子具有小、轻、干、多，以及形态色泽各异、休眠期长和抗逆性强等特点，每个个体所产生的孢子数，经常是成千上万的，有时竟达几百亿、几千亿甚至更多。这些特点有助于霉菌在自然界中随处散播和繁殖。植物利用的钾主要来自土壤，但土壤中绝大部分钾是以矿物钾的形式存在，多存在于铝硅酸盐矿石中，不易被植物直接利用。只有当矿物钾经过物理、化学及生物风化作用转变为速效钾后，才为植物所利用。丝状真菌对含钾矿物具有极强的分解作用。所以丝状真菌是我们从生产肥料的有机物中选择的目标菌种之一。

光合细菌(简称PSB)是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌适应性强，能忍耐高浓度的有机废水，对酚、氰等毒物有一定的忍受和分解能力，具有较强的分解转化能力。光合细菌可增加生物固氮作用，提高根际固氮效应，增进土壤肥力。此外，光合细菌对作物病害控制方面也有一定作用。光合细菌是我们从生产肥料的有机物中选择的目标菌种之一。

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。乳酸菌可以降低土壤中硝酸离子浓度，解决土壤酸化问题；乳酸菌体内细胞之中水分约70%，有大量乳酸菌时，可保持土壤水分，同时乳酸菌还可以吸收空气中约20%的水分保持一定的土壤水分；乳酸菌含糖及乳酸，因而促进了那些以微生物及其分解产物为食的土壤微型动物(如蚯蚓类、甲虫类)的数量大量的增加，使整个耕层的微生态系统组成发生根本变化，提高了土壤生物活性和缓冲能力；有效微生物在土壤中的迅速繁殖和不断补充，抑制了土壤中病原微生物的侵袭和发展；抑制有害微生物的生存与繁殖，减轻并逐步消除土传病虫害和连作障碍；不用除草剂，可抑制与消除杂草：乳酸菌能生成乳酸和生理活性物质，乳酸可使杂草的种皮变软，使其容易吸收水份，并受生理活性物质的影响而打破休眠；增强植物的代谢功能，提高光合作用，促进种子发芽，根系发达，早开花，多结实。乳酸菌是我们从生产肥料的有机物中选择的目标菌种之一。

放线菌（Actinomycete）是原核生物的一个类群。大多数有发达的分枝菌丝。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。典型丝状放线菌主要属于链霉菌属（StrepHomyces）和小单孢菌属（Micromonospora）两类。均属好气性异养型，能够广泛利用纤维素、半纤维素、蛋白质、木质素等含碳和含氮化合物。最适pH值为6.8-7.5，最适温度为25-30℃。农田土壤中检出的放线菌主要是链霉菌属。放线菌是我们从生产肥料的有机物中选择的目标菌种之一。

菌株的筛选和联合菌群的应用，是许多科学家正在致力的工作。联合菌群的应用是一个比较复杂的问题，不能简单地认为，微生物的复合(或联合)就是好多菌混合发酵，或是简单的发酵后混合、组合。新菌种的选育、改造和重组，单一功能向多功能发展(如肥药合一)，与营养元素或有机物的合理复合等。生物技术的发展给菌株的重组、改造提供了基础和可能。发明人经实践生产、摸索发现，从生产肥料的有机物中选择含量最高以上六种细菌，只要相互之间不发生拮抗，就能发挥很好的肥效，达到改善土壤的目的。

筛选菌种时，可以采用代谢通量分析方法。确定菌种最佳接种量和原料配比时，也可以采用正交试验和响应面法，这样效率高；在相同发酵时间情况下，发酵更彻底，产品质量更高，没有臭味。代谢通量分析（metabolic flux analysis，MFA）是用计量矩阵模型表示拟稳态假设下胞内反应的一种定量分析方法。它假定一定时间内，胞内中间代谢产物的浓度不变，根据代谢途径中各反应的计量关系以及实验中测得的底物消耗速率或者产物生成速率，基于质量平衡以及可能的能量平衡来确定未知的反应速率，进而确定代谢网络的通量分配图。代谢通量分析不仅精确的定量描述代谢特性，还可以提供一些菌体生理方面更深入的一些信息。通过比较代谢通量的变化，我们就可以对遗传和环境扰动的影响给予充分的评价，并能对特定途径和反应的重要性进行准确的描述。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。本发明统计分析、筛选高效微生物菌剂时，可以参考代谢通量分析的理论。

增加二级种子液培育步骤，可以进一步扩繁菌种。由于芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌在实际生产中作用最大，可优先繁殖；其加入的量也可以较可选菌种大一些。

本发明所述的有机菌液，由上述方法制得。

该有机菌液可在微生物肥料生产用作菌种母剂，并可按0.5-1％比例添加到有机肥中混合使用。由于这些菌种是从生产微生物肥料的原料中选育的，通过了自然选择，因此活性更高，微生物的存活率达到95%以上。由于菌种之间不产生拮抗，因而可以共生；由于菌种多，各菌种之间有不同的功效，因此能达到复合的效果。

该有机菌液也可以直接用作拌种剂，作为拌种剂时，添加到农作物种子中混合，用于播种到农田中。

该有机菌液也可用于制作固体菌粉，所述固体菌粉的制作方法为：向有机菌液中加入吸附基质吸附，经板框过滤机脱水浓缩，再在40-60℃热风中干燥，形成含水量＜5％的固体菌粉；所述吸附基质为草炭土、轻质碳酸钙、硅藻土或粘土中的一种或数种。固体菌粉可以加入有机肥中，也可作为拌种剂使用。

本发明从草木灰、糠醛渣等固体废弃物中筛选、培育菌种液，有助于使这些固体废弃物充分发酵，并通过自身活动分解灰分及土壤中的无机磷化物和无机钾盐，使易流失的水溶性无机盐经过一系列生物降解化合反应，形成了K4[Fe(CN)6]等大分子多酸型络合物、多齿配位体和各种螯合物，减少养分流失，以提高肥效和利用率；同时由于利用了工农业废渣，也是实现环保的一大举措。

具体实施方式

实施例1。

从要生产肥料的糠醛渣、草木灰采集含有特定微生物的有机物质样品100个，分离出芽孢杆菌56株、酵母菌132株、光合菌27株、放线菌18株、乳酸菌23株、丝状真菌18株。通过统计分析，从各类菌种中确定16株优良的菌株。对16种备选菌株按照芽孢杆菌、酵母菌、放线菌和丝状真菌、光合菌和乳酸菌进行归类，首先在每一类中选择出效能最高的菌株作为核心菌种。在室内培养条件下，将不同菌种两两在同一培养皿中培养，观察之间有无拮抗现象，若发现拮抗现象，则从其同一类中另外选择菌株培养。通过比较观察试验，确定芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌为生物发酵剂的基本组成菌种，另外1株光合菌菌株、1株乳酸菌菌株和1株放线菌菌株为产品的组成菌种，产品共含6个菌种。

在实验室模拟工厂生产发酵过程，对影响发酵的各因素逐一进行试验，确定适合每种有益微生物的最适培养条件。按照牛肉膏1.1％-2.0％、蛋白胨1.1％-2.0％、氯化钠0.55％-0.65％、琼脂2％-3％，其余为水的基本量，制作基本培养基，基本培养基的pH值控制在6-8.5；在基本培养基中接入上述三种必选菌种和可选菌种的一种或多种，放入摇床，装液量为培养容器体积的20%-50%，摇床转速为160-190转/分钟；按照菌种接种量、培养基中的每一种物质设置基本量增加10%、增加20%、减少10%和减少20%共4个级别，改变培养基各成分的组成；观察各菌株生长情况，确定培养基中各组分适合的比例，制作出选择性培养基。正常情况下，芽孢杆菌在20-50℃范围内均能正常生长，酵母菌的生长温度范围在10-50℃，放线菌和丝状真菌的生长温度在20-70℃。也可以在各生长温度范围内缩小温度梯度试验，确定其最佳培育温度。

斜面菌种制备。在选择性培养基中分别接入上述菌种，置于28℃恒温箱培养72h，之后置于冰箱内保存，备用；

克氏瓶菌种制备:取克氏瓶若干个，分别装入选择性培养基，灭菌后每个克氏瓶中接入一种斜面菌种，置于36-45℃恒温箱内培养72h，备用。

菌种悬浮液制备：将上述克氏瓶中的菌种在无菌条件下加入250mL无菌水，制成悬浮液；将克氏瓶中悬浮液倒入无菌的减压瓶内，包扎后即为菌种悬浮液。

一级种子液制备：在减压瓶中将上述悬浮液接入灭菌的一级种子液中，在36-45℃下发酵20h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分；所述一级种子液中选择性培养基的重量比为50％-60％，其余为上述各种菌种悬浮液。

有机菌液制备：在发酵罐中注入选择性培养基，将上述种子液按照占选择性培养基重量10％-12％的比例接入发酵罐，在36-45℃下培养72h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分；当含菌量达到活菌数50亿株/mL以上，即为有机菌液。

实施例2。

从生产肥料的活性污泥、畜禽粪便、草木灰、农作物秸秆中采集含有特定微生物的有机物质样品100个，分离出芽孢杆菌52株、酵母菌112株、光合菌26株、放线菌20株、乳酸菌25株、丝状真菌20株。通过统计分析，从各类菌种中确定24株优良的菌株。对24种备选菌株按照芽孢杆菌、酵母菌、放线菌和丝状真菌、光合菌和乳酸菌进行归类，首先在每一类中选择出效能最高的菌株作为核心菌种。在室内培养条件下，将不同菌种两两在同一培养皿中培养，观察之间有无拮抗现象，若发现拮抗现象，则从其同一类中另外选择菌株培养。通过比较观察试验，确定芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌为生物发酵剂的基本组成菌种，另外1株光合菌菌株、1株乳酸菌菌株，产品共含5个菌种。

在实验室模拟工厂生产发酵过程，对影响发酵的各因素逐一进行试验，确定适合每种有益微生物的最适培养条件。可利用高代谢通量分析技术筛选高效微生物菌剂，采用正交试验和响应面法确定菌种最佳接种量和原料配比，具体做法是：按照牛肉膏1.1％-2.0％、蛋白胨1.1％-2.0％、氯化钠0.55％-0.65％、琼脂2-3％，其余为水的基本量，制作基本培养基，基本培养基的pH值控制在6-8.5；在基本培养基中接入上述三种必选菌种和可选菌种的一种或多种，放入摇床，装液量为培养容器体积的20-50%，摇床转速为160-190转/分钟；按照菌种接种量、培养基中的每一种物质设置基本量增加10%、增加20%、减少10%和减少20%共4个级别，改变培养基各成分的组成；观察各菌株生长情况，确定培养基中各组分适合的比例，制作出选择性培养基。正常情况下，芽孢杆菌在20-50℃范围内均能正常生长，酵母菌的生长温度范围在10-50℃，放线菌和丝状真菌的生长温度在20-70℃。也可以在各生长温度范围内缩小温度梯度试验，确定其最佳培育温度。高代谢通量分析技术是指是用计量矩阵模型表示拟稳态假设下胞内反应的一种定量分析方法。它假定一定时间内，胞内中间代谢产物的浓度不变，根据代谢途径中各反应的计量关系以及实验中测得的底物消耗速率或者产物生成速率，基于质量平衡以及可能的能量平衡来确定未知的反应速率，进而确定代谢网络的通量分配图。代谢通量分析不仅精确的定量描述代谢特性，还可以提供一些菌体生理方面更深入的一些信息。通过比较代谢通量的变化，我们就可以对遗传和环境扰动的影响给予充分的评价，并能对特定途径和反应的重要性进行准确的描述。正交试验又叫正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。响应面是指通过一系列确定性实验，用多项式函数来近似隐式极限状态函数。通过合理地选取试验点和迭代策略，来保证多项式函数能够在失效概率上收敛于真实的隐式极限状态函数的失效概率。

斜面菌种制备。在选择性培养基中分别接入上述菌种，置于28℃恒温箱培养72h，之后置于冰箱内保存，备用；

克氏瓶菌种制备:取克氏瓶若干个，分别装入选择性培养基，灭菌后每个克氏瓶中接入一种斜面菌种，置于36-45℃恒温箱内培养72h。

菌种悬浮液制备：将上述克氏瓶中的菌种在无菌条件下加入250mL无菌水，制成悬浮液；将克氏瓶中悬浮液倒入无菌的减压瓶内，包扎后即为菌种悬浮液。在减压瓶芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌的菌种悬浮液接入量分别占总菌种悬浮液接入量的30％-50％、15％-25％、15％-25％。接入菌种是先接入芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌的菌种悬浮液，培养8小时以后再接入其他菌种的悬浮液。

一级种子液制备：在减压瓶中将上述悬浮液接入灭菌的一级种子液中，在36-45℃下发酵20h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分；所述一级种子液中选择性培养基的重量比为50％-60％，其余为上述各种菌种悬浮液。

二级种子液制备：在选择性培养基中加入0.3％-0.5％的淀粉、0.5％-0.7％的蔗糖、0.3％的磷酸氢二钾、0.16％-0.20％的磷酸二氢钾、4.0-5.0％的豆粕、10%的锯末后注入发酵罐；接种选择性培养基重量比为2％-5％的一级种子液；温度控制在36-45℃，搅拌转速150-180转/分，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，发酵24小时后制成二级种子液。

有机菌液制备：在发酵罐中注入选择性培养基，将上述种子液按照占选择性培养基重量10％-12％的比例接入发酵罐，在36-45℃下培养72h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分；当含菌量达到活菌数50亿株/mL以上，即为有机菌液。

实施例3。

一种拌种剂，即实施例2制得的有机菌液。按照占播种油菜种子的重量的0.05-0.10％的比例添加到农作物种子中混合，用于播种到农田中。选择有机质含量为45%的有机肥料，不采用拌种剂拌种，编号为1；另外一组有机质含量为45%的有机肥料，采用上述方法拌种，编号为2。  按50kg/亩的量分别将1、2施于两块油菜田中，油菜为品种为秦优7号，播种后20天测量各油菜田的油菜叶柄长度、叶绿素含量、可溶性糖含量。结果表明，油菜叶柄长度、叶绿素含量、可溶性糖均提高了10%以上。

实施例4。

一种活性有机菌肥，该有机菌肥为发酵后有机肥加入实施例2制得菌种液后制得。加入量为重量比的0.7％。所述有机肥由糠醛渣、草木灰、活性污泥堆放后制得，其中有机质的含量为45%。堆放要求宽4m，高2m。保持温度为65-75℃，含水量为67-70％，pH值为8.0-9.0。每1-2天翻垛一次，检测微生物含量、pH值、温度、含水量、有机质含量等指标，视实际情况向混合物中加入水、菌液、糠醛渣、草木灰，视腐熟程度或垛内温度确定翻垛次数。当垛内含水量稳定在10％-20%，温度为顶到稳定在45-50℃、pH值降到6.5-6.9时，腐熟过程完成，得到有机肥。加入上述菌种液后获得有机菌肥。

Claims (5)

1.一种有机菌液的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

A)菌种选择：从制造有机肥的原料中选取若干样品，从上述样品中分离出芽孢杆菌、酵母菌、丝状真菌、光合细菌、乳酸菌株、放线菌若干株；所述制造有机肥的原料是指草木灰、糠醛渣、粪便、活性淤泥、农作物秸秆中的一种或数种；

通过统计分析，筛选上述菌株，在每个菌种中确定出效能最高的菌株作为核心菌种；在室内培养条件下，将不同菌种两两在同一培养皿中培养，观察之间有无拮抗现象，若发现拮抗现象，则从其同一类中另外选择菌株培养；通过比较观察试验，在芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌各选一种与这三种菌种中的其它两种菌种不拮抗的生物菌种作为必选菌种；

在光合细菌菌株、乳酸菌菌株、放线菌菌株各选一种与这三种菌种中的其它两种菌种和上述必选菌种不拮抗的生物菌种作为可选菌种；

B)确定菌种最佳接种量和原料配比：按照牛肉膏1.1％-2.0％、蛋白胨1.1％-2.0％、氯化钠0.55％-0.65％、琼脂2％-3％，其余为水的基本量，制作基本培养基，基本培养基的pH值控制在6-8.5；在基本培养基中接入上述三种必选菌种和可选菌种的一种或多种，放入摇床，装液量为培养容器体积的20％-50%，摇床转速为160-190转/分钟；按照菌种接种量、培养基中的每一种物质设置基本量增加10%、增加20%、减少10%和减少20%共4个级别，改变培养基各成分的组成；观察各菌株生长情况，确定最佳接种量，确定培养基中各组分适合的比例，制作出选择性培养基； 

C)斜面菌种制备：在选择性培养基中分别接入上述三种必选菌种和可选菌种的一种或多种，置于28℃恒温箱培养72h，之后置于冰箱内保存，备用；

D)克氏瓶菌种制备:取克氏瓶若干个，分别装入选择性培养基，灭菌后每个克氏瓶中接入一种斜面菌种，置于36-45℃恒温箱内培养72h，备用；

E)菌种悬浮液制备：将上述克氏瓶中的菌种在无菌条件下加入250mL无菌水，制成悬浮液；将克氏瓶中悬浮液倒入无菌的减压瓶内，包扎后即为菌种悬浮液；

F)一级种子液制备：在减压瓶中将上述悬浮液接入灭菌的选择性培养基中，在36-45℃下发酵20h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分，制得一级种子液；所述一级种子液中选择性培养基的重量比为50％-60％，其余为上述各种菌种悬浮液；

所述步骤中，在减压瓶中，芽孢杆菌、酵母菌和丝状真菌的菌种悬浮液接入量分别占总菌种悬浮液接入量的30％-50％、15％-25％、15％-25％；在减压瓶中，接入悬浮液时，先接入必选菌种的悬浮液，培养一段时间以后再接入可选菌种的悬浮液；

G)有机菌液制备：在发酵罐中注入选择性培养基，将上述种子液按照占选择性培养基重量10％-12％的比例接入发酵罐，在36-45℃下培养72h，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，搅拌速度为150-250转/分；当含菌量达到活菌数50亿株/mL以上，即为有机菌液。

2.如权利要求1所述的一种有机菌液的制备方法，其特征在于，在步骤F与步骤G之间还包括二级种子液制备的步骤，所述二级种子液制备的步骤为：在选择性培养基中加入0.3％-0.5％的淀粉、0.5％-0.7％的蔗糖、0.3％的磷酸氢二钾、0.16％-0.20％的磷酸二氢钾、4.0％-5.0％的豆粕、10%的锯末后注入发酵罐；接种选择性培养基重量比为2％-5％的一级种子液；温度控制在36-45℃，搅拌转速150-180转/分，通气量与液体体积比值为0.5-1.0，发酵24h后制成二级种子液。

3.如权利要求1到2任意一权利要求所述方法制得的有机菌液的应用，其特征在于：该有机菌液可以用作拌种剂，用于播种到农田中。

4.如权利要求1到2任意一权利要求所述方法制得的有机菌液的应用，其特征在于：该有机菌液可在微生物肥料生产时用作菌种母剂，或按0.5％-1％比例添加到有机肥中混合使用。

5.如权利要求1到2任意一权利要求所述方法制得的有机菌液的应用，其特征在于：该有机菌液可用于制作固体菌粉，所述固体菌粉的制作方法为：向有机菌液中加入吸附基质吸附，经板框过滤机脱水浓缩，再在40-60℃热风中干燥，形成含水量＜5％的固体菌粉；所述吸附基质为草炭土、轻质碳酸钙、硅藻土或粘土中的一种或数种。