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CN102984961A - 减少食物中生物胺的方法 - Google Patents

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CN102984961A
CN102984961A CN201180033860XA CN201180033860A CN102984961A CN 102984961 A CN102984961 A CN 102984961A CN 201180033860X A CN201180033860X A CN 201180033860XA CN 201180033860 A CN201180033860 A CN 201180033860A CN 102984961 A CN102984961 A CN 102984961A
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J.W.塔姆斯
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H.奥斯特达尔
T.沃尔蒙德
P.M.尼尔森
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Novo Nordisk AS
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Abstract

本发明涉及通过将饮料和/或饮料中间物与具有转谷氨酰胺酶活性的酶相接触以减少饮料中生物胺含量的方法。

Description

减少食物中生物胺的方法
技术领域
本发明涉及减少食物中生物胺的含量的方法。更具体而言，本发明涉及在低蛋白食物例如饮料像葡萄酒(wine)和啤酒中减少生物胺的方法。甚至更具体而言，本发明涉及使用具有转谷氨酰胺酶活性的酶在低蛋白食物例如饮料像葡萄酒和啤酒中减少生物胺的含量。
发明背景
生物胺是一组有机含氮化合物。它们通常由活生物体的代谢形成和降解。它们可天然存在或通过氨基酸的脱羧或通过醛和酮的胺化和氨基交换形成。
在低浓度，生物胺，特别是在体内内源产生的那些，对于许多生理功能例如调节体温、胃容量、胃pH、脑活动等是必需的。然而，已显示食用含有高浓度的生物胺的食物引起一些不良反应，如头疼，低或高血压，恶心，心悸，和在严重情况下甚至是死亡。
当有利于微生物或生化活性的条件持续时，生物胺可能会在含有蛋白质或游离氨基酸的食物和饮料中形成。此类食物和饮料的实例包括但不限于鱼、鱼类产品、肉类产品(香肠)、蛋、奶酪、发酵乳制品、巧克力、坚果、发酵的和新鲜的果实、蔬菜如德国泡菜(sauerkraut)和豆制品包括酱油、啤酒和葡萄酒。因此，认为食物中生物胺的存在和浓度与腐败和发酵，特别是由微生物造成的腐败和发酵相关。
已知啤酒和葡萄酒以不同量和组成含有许多不同生物胺。组胺、酪胺、腐胺、异戊胺(isopentylamine)和β-苯乙胺为葡萄酒中一些常见的生物胺。
人体具有特定酶如例如二胺氧化酶(DAO)和单胺氧化酶(MAO)以将食物中低量的生物胺代谢并因此解毒为生理学上活性较低的降解产物。然而，当摄入具有高浓度生物胺的食物时，该解毒系统无法充分地消除生物胺。而且，在一些人中，当由于多种因素如遗传组成(genetic makeup)、疾病、药物作用等而使这些酶活性不充分时，甚至低量的生物胺也无法得到有效代谢。若代谢效率低下，生物胺很容易被肠/消化道(gut)吸收，导致毒性作用。因此担心生物胺涉及食物腐败、食物安全和食物不耐受，并必需尽力确保其在食物中的含量尽可能低。
许多国家正在审阅对于规章框架的提案以封顶食品中生物胺的上限。欧盟(EU)类似地致力于生物胺的规章框架，其旨在将生物胺囊括于与对变应原提出的类似规章之下。
减少食物中生物胺含量的方法是已知的，例如，已使用胺氧化酶以酶法减少食物中的生物胺含量。
US4725540公开了用于制备含胺氧化酶材料的工艺和用于代谢食物中的组胺、产生相应的不含组胺的产物的工艺，其中组胺经代谢形成非有害的代谢产物。
Punakivi等,Talanta68(2006)1040-1045公开了用转谷氨酰胺酶酶法确定生物胺的工艺。
然而，对于减少食物中生物胺含量的更多工艺的需求持续存在。
发明内容
在一个方面，本发明涉及减少饮料中生物胺含量的方法，其包括将所述饮料和/或饮料中间物与转谷氨酰胺酶相接触。
在另一个方面，本发明涉及转谷氨酰胺酶用于减少饮料中生物胺含量的用途。
在一个方面，所述转谷氨酰胺酶可从链霉菌属(Streptomyces)获得。
在一个方面，所述食物是饮料或饮料中间物。
在一个方面，所述饮料蛋白含量低。
在一个方面，所述饮料是麦芽汁。
在另一个方面，所述饮料是含酒精的(alcoholic)。
在一个方面，所述饮料是葡萄酒。
在另一个方面，所述饮料是啤酒。
在一个方面，所述生物胺选自酪胺、组胺及其组合。
在一个方面，所述接触是在肽结合的谷氨酰胺的存在下进行的。
在另一个方面，所述接触是在肽结合的谷氨酰胺不存在时进行的。
在一个方面，在用所述酶处理后减少了至少50%的生物胺。
在一个方面，所述与酶的接触在pH3.0至6.5进行。
发明详述
本发明人发现了一种减少食物，特别是含有低量蛋白质/氨基酸的饮料中生物胺的量的方法。本发明人令人意想不到地发现用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理饮料或饮料中间物可减少此类材料中以及通过加工此类食物、中间物或原材料而制成的产物中的生物胺含量。
因此在一个方面，本发明涉及减少饮料中生物胺含量的方法，其包括将所述饮料和/或饮料中间物与具有转谷氨酰胺酶活性的酶相接触。
生物胺是一组有机含氮化合物。它们通常由活生物体的代谢形成和降解。它们通常由氨基酸的脱羧或通过醛和酮的胺化和氨基交换形成。它们可内源存在(在生物内部)或天然存在(在生物体外，从头合成)或可在微生物对食物的代谢后形成。生物胺的实例包括但不限于组胺、酪胺、β-苯乙胺、色胺、腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、丁胺、二甲胺、乙醇胺、乙胺、己胺、吲哚、异丙胺、异戊胺、甲胺、2-甲基丁基胺、吗啉、戊胺、哌啶、丙胺、吡咯烷、腐胺和5-羟色胺(serotonine)。
术语食物包括饮料、饮料中间物和固体食物材料。
饮料在本领域中是已知的。饮料的实例包括但不限于乳，果汁，葡萄酒，啤酒，例如但不限于由从出芽的谷物或未出芽的谷物或它们的混合物制成的啤酒，爱尔啤酒(ale)、烈性爱尔啤酒(strong ale)、苦啤酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、出口啤酒(export beer)、麦芽酒(maltliquor)、大麦啤酒(barley wine)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)，柠檬汁，麦芽汁，乳相关产品，例如但不限于可可乳(cocoa milk)、全脂乳(wholemilk)、全脂乳(full fatted milk))、增香乳(flavoured milk)、均化乳(homogenizedmilk)、脱脂乳(skimmed milk)、复原乳粉(reconstituted milk powder)、炼乳(condensed milk)、乳清(whey)、乳清渗透物(whey permeate)、酪乳(butter milk)、发酵乳(fermented milk)、酸奶(yoghurt)、凝乳(curd)。
短语“饮料中间物”指在饮料制造过程中形成的材料。饮料中间物的实例包括但不限于麦芽汁、未加工的果汁、未加工的啤酒、未加工的葡萄酒、未加工的乳、发酵的可可豆。有时，饮料中间物本身可食用，在此情况下其亦可为“饮料”。
在一个方面，所述饮料蛋白含量低。蛋白含量低的饮料为具有少于5%，如少于2%，如少于1%，如少于0.5%，如少于0.1%，如少于0.01%，如少于0.001%蛋白质w/w的饮料。蛋白含量低的饮料的实例包括但不限于啤酒和葡萄酒。
在另一个方面，所述饮料是含酒精的。含酒精的饮料为含有乙醇的饮料。普通的含酒精的饮料包括啤酒、葡萄酒和烈酒(spirits)。啤酒和葡萄酒通过发酵含糖或淀粉的材料形成。烈酒，其具有相对于啤酒和葡萄酒更高的醇含量，是通过发酵继以蒸馏产生的。优选的含酒精的饮料为啤酒和葡萄酒。含酒精的饮料亦包括作为普通的含酒精的饮料和非含酒精的饮料的混合物的含酒精的饮料，例如但不限于啤酒和烈酒的混合物，或者葡萄酒和烈酒的混合物，或者烈酒和果汁的混合物。
在一个方面，所述饮料是葡萄酒。葡萄酒和葡萄酒酿造(winemaking)在本领域是已知的。葡萄酒酿造，或酿制葡萄酒(vinification)是产生葡萄酒的工艺，以选择葡萄开始，并以装瓶的葡萄酒产品结束。葡萄酒酿造涉及多种工艺，其包括但不限于选择葡萄及其品种，其收获和去梗，初步粉碎和发酵，后发酵，熟化(maturation)，勾兑(blending)和澄清(fining)，过滤，冷稳定化(coldstabilization)，和装瓶。简言之，通常的葡萄酒酿造工艺可如下所述：选择葡萄，并手动或使用机械收获机收获。然后将葡萄一般地粉碎、去梗，并允许初发酵。在初发酵过程中，酵母(其通常已经存在于葡萄上，或作为培养物外源添加)摄食鲜葡萄汁(must)(果浆)中的糖份，并增殖，产生二氧化碳和醇。若需要，亦添加额外的糖(葡萄汁增糖(chaptalization))。在醇发酵工艺的过程中或之后，亦可发生苹果乳酸发酵，其中苹果酸由细菌转化为乳酸。在初发酵之后，使得葡萄酒产品或粗葡萄酒进行后发酵和熟化过程，其通常花费大约3-6个月，或对于长陈酿葡萄酒(long aging wine)多至18个月。在此阶段中，啤酒在厌氧条件或接近厌氧条件储藏以防止氧化变质。在后发酵之后，亦对葡萄酒进行换桶(rack)以使其与酒泥(lees)分开。换桶(racking)是将葡萄酒虹吸与酒泥分开置于新的、干净的桶或罐以允许其澄清，并助其稳定化的过程。酒泥指死亡酵母或剩余酵母和其它颗粒的沉积物，其发生沉淀，或在发酵和陈化之后通过“澄清”作用被带到葡萄酒桶(vat)底部。在葡萄酒陈化过程中换桶工艺重复数次。在熟化之后的任何时间，亦可使葡萄酒进行冷稳定化的过程。在冷稳定化过程中，葡萄酒的温度下降至接近冻结1至2周。这导致酒石酸晶体与葡萄酒分开，并粘附于装酒容器(holding vessel)的侧壁上。当将葡萄酒从该容器排干时，酒石酸晶体留下来，和/或过滤所述葡萄酒以确保其去除。在蛋白质稳定化过程中，不稳定的蛋白质通过吸附于澄清剂如膨润土上而去除，防止其在装瓶的葡萄酒中沉淀。在后发酵之后，对葡萄酒进行勾兑和澄清。在勾兑过程中，将来自不同批次和/或不同葡萄的葡萄酒混合在一起以获得一致的味道。在澄清过程中，使用称为澄清剂的作用剂去除鞣质/单宁，减少涩味，并去除会使得葡萄酒浑浊的微观颗粒。在勾兑和澄清之后，用防腐剂如二氧化硫和山梨酸钾处理葡萄酒，并进行过滤。过滤是由此将颗粒状物质从葡萄酒去除的过程，即，使葡萄酒穿过一系列过滤器。在过滤之后，葡萄酒有时通过0.65或0.45微米的膜进行过滤除菌，然后将葡萄酒装瓶并销售。
在葡萄酒中，生物胺可能来自鲜葡萄汁，它们已存在其中，或可由来自天然菌落的酵母、添加的酵母在醇发酵过程中形成；或通过参与苹果乳酸发酵的细菌的作用而形成。
在另一个方面，所述饮料为啤酒。啤酒酿造的过程是本领域的技术人员熟知的。常规的步骤可以如下方式概述：起始材料是出芽的(即，湿化的、出芽的且随后干燥的)大麦和/或未出芽的附属物(adjunct)(称为麦芽粉(grist))。在制醪/淀粉糖化(mashing)过程中，将麦芽粉磨碎并与水混合，加热并搅拌，在麦芽中天然存在的酶的帮助下将糖类降解为可发酵的糖。在制醪之后，需要将液体提取物(麦芽汁)与固形物(酒糟颗粒和附属物)分开以获得澄清的麦芽汁。该过程称为过滤麦芽汁(lautering)。在过滤麦芽汁之前，将醪液温度升至约75-78℃(165-173°F)(称作出醪(mashout))。麦芽汁过滤是重要的，因为固形物富含大量蛋白质，改性不良的淀粉(poorly modified starch)，脂肪材料，硅酸盐，和多酚(鞣质/单宁)以及蛋白质。在收集第一麦芽汁之后的酒糟中保留的提取物亦可通过在过滤饼顶部添加热水来洗出。该工艺称为淋洗(sparging)。热水流经酒糟并溶解剩余的提取物。稀释的麦芽汁称为第二麦芽汁，且其提取物与第一麦芽汁的起始重力相比下降至1-2%。在添加啤酒花(hop)之后，将麦芽汁煮沸。由此将多种物质包括几种蛋白变性，且会发生多酚的沉淀。在冷却和去除沉淀之后，将最终的啤酒麦芽汁(a)通气并添加酵母。在主发酵(通常持续5-10日)之后，去除大部分酵母，并将所谓的新啤酒(green beer)(b)储藏于低温，通常在0-5℃储藏一至12周。在此期间，剩余的酵母会与多酚一同沉淀。为了去除剩余的过量多酚，进行了过滤。这时，发酵成的啤酒(c)可在装瓶之前碳化。二氧化碳不仅导致感受到的满口感(fullness)和醇厚感(body)并作为增味剂，其还起到增强起泡潜力的作用，并在延长产品的储藏期限中起重要作用。
术语“啤酒”用于本文中旨在至少涵盖由如下所制备的啤酒：从未出芽的谷物制备的醪液以及从出芽的谷物制备的所有醪液，还有从出芽的和未出芽的谷物的混合物制备的所有醪液。术语“啤酒”亦涵盖以附属物制备的啤酒，和具有所有可能的醇含量的啤酒。
在一个方面所述饮料中间物是麦芽汁。
在另一个方面所述饮料中间物是用于制备麦芽汁的醪液。
在一个方面，所述生物胺是酪胺。
酪胺是衍生自氨基酸酪氨酸的生物胺。其亦称作4-(2-氨基乙基)苯酚或4-羟基苯乙胺。
在另一个方面，所述生物胺是组胺。
组胺是衍生自氨基酸组氨酸的生物胺。其亦称作2-(1H-咪唑-4-基)乙胺。
在本发明的上下文中，具有转谷氨酰胺酶活性的酶可为催化肽结合的谷氨酰胺的γ-羧基酰胺基团(酰基供体)和伯胺(酰基受体)(例如，肽结合的赖氨酸)之间的酰基转移的酶。游离酸酰胺和氨基酸亦发生反应。因此，蛋白质和肽可以此方式交联。转谷氨酰胺酶亦可在例如若缺乏胺时，以H2O作为酰基受体催化蛋白质中谷氨酰胺残基的脱氨基。
根据本发明的转谷氨酰胺酶亦可称作，例如蛋白质谷氨酰胺-γ-谷氨酰基转移酶(protein glutamine-gamma-glutamyl transferase)，因子XIIIa，纤维蛋白连接酶，血纤稳定因子，谷氨酰胺酰基肽γ-谷氨酰基转移酶(glutaminylpeptidegamma-glutamyltransferase)，多胺转谷氨酰胺酶(polyamine transglutaminase)，组织转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase)或R-谷氨酰胺酰基-肽:胺γ-谷氨酰基转移酶(R-glutaminyl-peptide:amine gamma-glutamyl transferase)或TG酶或甚至“肉胶(meat glue)”。转谷氨酰胺酶的组包括但不限于分配于亚类EC2.3.2.13的酶。
转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)是催化游离胺基团(例如蛋白质或肽结合的赖氨酸)和蛋白质或肽结合的谷氨酰胺的γ-羧酰胺基团之间的共价键的形成的酶家族。肽结合的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团充当酰基供体，而蛋白质和肽结合的赖氨酸残基的6-氨基基团充当受体，以获得分子内或分子间的N(6)-(5-谷氨酰基)赖氨酸交联。这些酶通常需要钙作为辅因子。
该酶催化的反应可表示如下：
蛋白质谷氨酰胺+烃基胺<=>蛋白质N(5)-烃基谷氨酰胺+NH3
转谷氨酰胺酶可从许多来源获得，包括但不限于：Phytophthora cactorum，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)，茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)等。
具有转谷氨酰胺酶活性的酶亦可为商业上可获得的。实例包括但不限于可从Ajinomoto[Ajinomoto CO.INC.Tokyo,Japan]获得的Saprona
Figure BDA00002713836000072
[可从，例如Fermenta Pro Food Services,Bratislava,Slovakia获得]。
根据本发明使用的转谷氨酰胺酶优选是纯化的。术语“纯化的”用于本文中涵盖酶蛋白制备物，其中所述制备物富集所述酶蛋白。此种富集可例如为：去除产生酶蛋白的生物的细胞，通过蛋白质特异性沉淀或使用层析方法(其中所述酶蛋白选择性吸附于层析基质并从其洗脱)去除非蛋白材料。转谷氨酰胺酶可纯化至使得仅少量其它蛋白质存在的程度。表述“其它蛋白质”具体指其它酶。待用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶可为“基本上纯的”，即基本上不含来自产生该酶的生物的其它组分，所述生物可为天然存在的微生物或用于重组产生转谷氨酰胺酶的遗传修饰的宿主微生物。
然而，对于根据本发明的用途，所述转谷氨酰胺酶无需那么纯。其可例如包含其它酶。
在一个优选的方面，待用于本发明的方法的转谷氨酰胺酶已经纯化至在总蛋白质中含有至少20%，优选至少30%，至少40%或至少50%(w/w)的转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶的量可根据制备物的活性测量结果除以转谷氨酰胺酶的比活性(活性/mg EP)来计算，或可通过SDS-PAGE或本领域中已知的任何其它方法定量。总蛋白质的量可例如通过氨基酸分析来测量。
在本发明的方法的一个实施方案中，具有转谷氨酰胺酶活性的酶是重组产生的。对于本发明的转谷氨酰胺酶的来源和/或对于根据本发明的用途并无任何限制。因此，术语转谷氨酰胺酶不仅包括从任何属的微生物获得的天然或野生型转谷氨酰胺酶，而且还包括其呈现转谷氨酰胺酶活性的任何突变体、变体、片段等，以及合成的转谷氨酰胺酶，如改组的转谷氨酰胺酶，和共有的转谷氨酰胺酶(consensus transglutaminase)。此类遗传工程的转谷氨酰胺酶可如本领域中一般所知的，例如通过定点诱变，通过PCR(使用含有所需突变的PCR片段作为PCR反应中的一个引物)或通过随机诱变来制备。共有蛋白质的制备描述于例如EP897985。基因改组一般性描述于例如WO95/22625和WO96/00343。转谷氨酰胺酶基因的重组可通过如Ness,J.E.等,于NatureBiotechnology,Vol.20(12),pp.12511255,2002中所述的合成改组(syntheticshuffling)不依赖于亲本的特定序列来完成。设计了在其DNA序列中简并以提供亲本转谷氨酰胺酶组中所见的所有氨基酸可能性的合成的寡核苷酸，并根据参考文献装配基因。改组可对于全长序列进行，或仅对于部分序列进行然后再与基因其余部分组合以给出全长序列。
所述酶可例如从蘑菇属(Agaricus)，例如双孢蘑菇(A.bisporus)；Ascovaginospora；曲霉属，例如黑曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awamori)，臭曲霉(A.foetidus)，日本曲霉(A.japonicus)，米曲霉(A.oryzae)；毛壳菌属(Chaetomium)；Chaetotomastia；网柄菌属(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌(D.discoideum)；毛霉属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)，高大毛霉(M.mucedo)，细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如少根根霉(R.arrhizus)，日本根霉(R.japonicus)，匍枝根霉(R.stolonifer)；核盘霉属(Sclerotinia)，例如白腐核盘霉(S.libertiana)；毛癣菌属(Trichophyton)，例如红色毛癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，短小芽孢杆菌(B.pumilus)，嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)；金黄杆菌属(Chryseobacterium)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)，阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；Miriococcum；Myrothesium；毛霉属；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；Phytophthora，例如P.cactorum；变形菌属(Proteus)，例如普通变形菌(P.vulgaris)；普罗维登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)；密孔菌属(Pycnoporus)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)，血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)，粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如抗生链霉菌(S.antibioticus)，栗色球孢链霉菌(S.castaneoglobisporus)，利迪链霉菌(S.lydicus)，茂原链霉菌(S.mobaraensis)，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；Streptoverticilium，例如S.mobaraensis；栓菌属(Trametes)；木霉属(Trichoderma)，例如里氏木霉(T.reesei)，绿色木霉(T.viride)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)的菌株获得。
具有转谷氨酰胺酶活性的酶可单独使用或优选以酶组合物的形式使用。此类酶组合物对于本领域技术人员是已知的。酶组合物亦可含有其它帮助稳定化酶的稳定剂。本发明的组合物可为任何适于所述用途的形式，例如为干粉或颗粒的形式，特别是无尘颗粒的形式，液体形式，特别是稳定化液体的形式，固定化形式，或受保护的酶的形式。颗粒可例如如美国专利号4,106,991和美国专利号4,661,452(两者均授予Novo Industri A/S)中公开的产生，并可任选地通过本领域中已知的方法涂覆。液体酶制备物可例如根据公认的方法，通过添加营养学上可接受的稳定剂如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有机酸来稳定化。受保护的酶可根据EP238,216中公开的方法来制备。
一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是可从链霉菌属(Streptomyces)获得的转谷氨酰胺酶。另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是可从茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)获得的转谷氨酰胺酶。另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是可从利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)获得的转谷氨酰胺酶。另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是
Figure BDA00002713836000091
另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是具有转谷氨酰胺酶活性的钙非依赖性酶。另一种优选的具有转谷氨酰胺酶活性的酶是具有半胱氨酸作为活性中心的酶。此类酶的实例包括但不限于
术语“可从…获得的”如用于本文与给定来源相联应意指由核酸序列编码的多肽是由所述来源产生，或由其中存在来自所述来源的核酸序列的重组细胞(亦称为宿主细胞)产生。在一个优选实施方案中，所述多肽分泌至胞外。取决于在重组产生方法中采用的宿主，本发明的转谷氨酰胺酶可为糖基化的或可为非糖基化的。此外，本发明的转谷氨酰胺酶亦可包括起始的经修饰的甲硫氨酸残基，在一些情况中作为宿主介导的过程的结果。
所述宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
可用的宿主细胞是细菌细胞如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，或链霉菌属细胞，或乳酸菌细胞，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)。乳酸菌包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)，乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的菌种。
其他宿主细胞可为真菌细胞(包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi,第八版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上)
在一个方面，所述真菌宿主细胞为酵母细胞。“酵母”如用于本文中包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，应将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。所述酵母宿主细胞可为假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)细胞。
所述真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，且碳分解代谢是专性需氧的。相对而言，酵母如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，且碳分解代谢可为发酵的。
丝状真菌宿主细胞的实例为枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属(Trichoderma)菌种的细胞，但不限于此。
在本发明的产生方法中，使用本领域已知方法在适合于产生所述转谷氨酰胺酶的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的实验室或工业发酵罐中的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果转谷氨酰胺酶分泌到营养培养基中，该转谷氨酰胺酶能够从所述培养基中直接回收。如果转谷氨酰胺酶不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
所得的具有转谷氨酰胺酶活性的酶可以使用本领域已知的方法回收。例如，该酶可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的具有转谷氨酰胺酶活性的酶可以通过本领域已知的多种方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。
术语“接触”是将饮料或饮料中间物与酶彼此接触或紧邻的过程。许多将饮料与酶接触的方法在本领域中是已知的。例如，所述酶可添加至饮料或食物中，反之亦然。所述酶亦可为固定化的形式，并与饮料/食物相接触。
在一个方面，所述酶在酿造过程中制醪/淀粉糖化时添加至醪液。在另一个方面，所述酶在过滤麦芽汁时添加至麦芽汁。在又一个方面，所述酶在煮浆(mashing off)时添加至醪液。在另一个方面，所述酶在装瓶之前添加至啤酒。
在一个方面，所述酶在酿制葡萄酒过程中添加至鲜葡萄汁。在另一个方面，所述酶在发酵过程中添加。在另一个方面，所述酶在苹果乳酸发酵过程中添加。在另一个方面，所述酶在换桶过程中添加。
在一个方面，接触是在肽结合的谷氨酰胺存在下进行的。
术语“肽结合的谷氨酰胺”指含有通过另外的氨基酸或化学残基结合于一侧或任一侧上的谷氨酰胺残基的肽或蛋白质。所述肽为至少2个氨基酸残基长，并可为天然的或合成的，并任选地含有其它非天然侧基或端基。肽结合的谷氨酰胺的实例是肽z-Gln-Gly-OH，亦称作N-苄氧羰基谷氨酰基-L-甘氨酸，商业上可从
Figure BDA00002713836000121
(Sigma-Aldrich,Missouri,USA)获得。优选的肽结合的谷氨酰胺为可从食物来源和其它营养学上可接受的来源(例如但不限于大豆，酪蛋白水解物，谷蛋白，或明胶)获得的肽结合的谷氨酰胺。
在另一个方面，所述接触是在肽结合的谷氨酰胺不存在时进行的。
在一个方面，通过实施本发明的方法，减少了至少50%的存在于饮料或饮料中间物或食物中的生物胺。该减少是作为在与酶接触之前和之后存在于样品中的生物胺的百分比来计算的。在另一个方面，减少了至少40%，如至少45%，如至少50%，如至少55%，如至少60%，如至少65%，如至少70%，如至少75%，如至少80%，如至少81%，如至少82%，如至少83%，如至少84%，如至少85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%，如至少91%，如至少92%，如至少93%，如至少94%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%的存在于饮料或饮料中间物或食物中的生物胺。
在一个方面，通过实施本发明的方法，减少了至少50%的存在于饮料或饮料中间物或食物中的组胺。该减少是作为在与酶接触之前和之后存在于样品中的组胺的百分比来计算的。在另一个方面，减少了至少40%，如至少45%，如至少50%，如至少55%，如至少60%，如至少65%，如至少70%，如至少75%，如至少80%，如至少81%，如至少82%，如至少83%，如至少84%，如至少85%，如至少86%，如至少87%，如至少88%，如至少89%，如至少90%，如至少91%，如至少92%，如至少93%，如至少94%，如至少95%，如至少96%，如至少97%，如至少98%，如至少99%的存在于饮料或饮料中间物或食物中的组胺。
存在多种可用于检测食物样品中的生物胺含量的方法。这些方法在本领域中一般是已知的。这些包括但不限于层析方法如气相、液相、高效液相层析、纸层析、薄层层析、纸和毛细管电泳，其它方法像放射免疫测定法或酶联免疫吸附测定法。酶方法亦可用于确定食物中的生物胺含量。这些方法使用酶如胺氧化酶以将生物胺转化为其相应的醛，连同释放过氧化氢和氨。然后过氧化氢和氨可通过比色方法检测。
一种根据本发明检测生物胺含量的优选方法是层析方法，此种方法描述于实施例1。
待使用的具有转谷氨酰胺酶活性的酶的量通常会取决于特定需求和特定酶。转谷氨酰胺酶添加的量优选足以在指定的时间内造成理想的生物胺减少。通常，在约0.1mg至约1000mg酶蛋白(EP)每升底物(即饮料或饮料中间物)范围内的转谷氨酰胺酶添加是充分的，特别是约1mg至约500mg酶蛋白(EP)每升底物，特别是约10mg至约500mg酶蛋白(EP)每升底物，且更特别是约50mg至约200mg酶蛋白(EP)每升底物。调整减少生物胺所需的具体酶的量属于本领域技术人员的一般常识。
或者，所述酶可根据酶活性单位添加。转谷氨酰胺酶的活性以TGH单位测量。一个TGHU(转谷氨酰胺酶氧肟酸单位，TransGlutaminase HydroxamateUnit)是使用Z-Gln-Gly和羟胺作为底物在37℃，pH6，每分钟产生1μmol氧肟酸(盐)的酶的量。通常添加的酶活性的范围会在约2.0TGHU至约25000TGHU每升底物，如约20TGHU至约25000TGHU每升底物，如约200TGHU至约12000TGHU每升底物，如约1000TGHU至约5000TGHU每升底物。
接触应进行合适长度的时间(温育时间)以允许样品中生物胺的减少。一般而言，基于饮料的性质选择温育时间。举例而言，在啤酒或麦芽汁的情况下，温育应为数小时或数日的数量级，而在葡萄酒的情况下，温育应为多日至数周的数量级。而且，温育时间亦取决于原始样品中生物胺的浓度，使用的酶的浓度等。调整减少生物胺所需的温育时间属于本领域技术人员的一般常识。
温育温度通常会取决于使用的转谷氨酰胺酶，并通常根据该转谷氨酰胺酶的最佳反应温度来选择。本领域技术人员会知道如何鉴定酶的最佳温度。合适的温度亦取决于饮料/食物的性质以及添加酶的生产阶段。举例而言，对于啤酒，合适的温度会在约40℃至约80℃的范围，优选在45℃至75℃的范围，更优选在50℃至70℃的范围，甚至更优选在50℃至65℃的范围。对于葡萄酒，合适的温度会取决于葡萄酒的性质和葡萄酒的年份。举例而言，对于白葡萄酒，合适的温度范围为约15℃至约25℃，优选为约18℃至约22℃的范围。对于红葡萄酒，合适的温度范围为约20℃至约35℃，优选为25℃至30℃。
接触应在转谷氨酰胺酶有活性的最适pH进行。一般而言，pH应为3.0至9.0的范围，优选3.0至7.5的范围，甚至更优选3.0至7.0的范围，最优选3.0至6.5的范围。本领域技术人员能够调整pH水平以获得最佳的酶活性。本领域技术人员亦能够基于饮料的特性选择合适的酶。合适pH的选择取决于饮料/食物的性质和添加酶的生产阶段。
实施例
材料和方法
下文描述了同时检测样品中的酪胺和组胺的层析方法。
层析实验使用具有荧光分光光度检测器(激发：340nm，发射：460nm)的DIONEX Summit HPLC进行。分离在40℃以1mg/分钟的流速使用来自Phenomenx的C18110A柱(粒度3μm)(之前有用C18填充的保护柱)进行。应用下述洗脱液：A(0.56%三甲胺缓冲液，pH7.5，离子强度20mM)和B(90%乙腈和10%Milli-Q水)。
乙腈商业上可从Merck获得，而三甲胺、酪胺和组胺从Sigma-Aldrich获得。
施加下述梯度：
时间(分钟) %A %B
0-5 100 0
5 60 30
5-20 每分钟减少2% 每分钟增加2%
20 30 60
20-25 0 100
两种胺(0.5mM酪胺和0.5mM组胺)各自的标准溶液在水溶液中制备，并在暗处储藏于4℃。衍生化过程如下所述进行：将10mg/mL OPA试剂(Agilent Technologies,P.N.5061-3335)和硼酸(盐)缓冲液(0.4N在Milli-Q水中)用Milli-Q水稀释4倍。将10μL硼酸(盐)缓冲液，2μLOPA和2μL样品与100μLMilli-Q水混合，接着注入柱。
组胺具有9.8分钟的保留时间，而酪胺具有12.7分钟的保留时间。两个峰与样品中存在的氨基酸分离良好。
实施例1
使用转谷氨酰胺酶(TG酶)，二胺氧化酶(DAO)和单胺氧化酶(MAO)减少样品中的生物胺。
通过转谷氨酰胺酶、二胺氧化酶和单胺氧化酶去除组胺和酪胺在缓冲液系统、麦芽汁和啤酒中评估。
来自茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶如EP2175737中公开的获得。
DAO(D7876)，MAO(A M7316)，组胺，酪胺和z-Gln-Gly从Sigma Aldrich获得
根据下文将42μL麦芽汁(通常为100%麦芽的麦芽汁，12°P)与下述混合：
·7μL储液，由10mM组胺和10mM酪胺组成
·50μL10mM z-Gln-Gly或50μL10mM磷酸盐缓冲液pH5.8
·1.05μLTG酶储液，由9.5mg EP/mL组成
HPLC测量根据实施例1在37℃振荡下(900rpm)温育1小时之后进行。
上表说明在生物胺与TG酶存在下分别去除了44.3和8.8%的组胺和酪胺，而在生物胺连同TG酶和肽结合的谷氨酰胺(z-Gln-Gly)存在下分别去除了100和86.7%的组胺和酪胺。
MAO和DAO：
在缓冲液系统中，将存在或不存在0.5mg EP DAO/mL或0.25mg EPMAO/mL的0.156mM组胺，0.156mM酪胺在振荡下(900rpm)根据下表在pH4.2，5.8，6.5，7.2(37℃)温育1小时或在37，50，60和70℃(pH7.2)温育1小时。在麦芽汁和啤酒系统中，将由10mM组胺和10mM酪胺和83μL麦芽汁组成的7μL储液根据下表与下述混合：
·10μL10mg/mL DAO或
·1μL0.05mg/mL MAO+9μL10mM磷酸盐缓冲液或
·10μL10mM磷酸盐缓冲液
HPLC测量根据实施例1在37℃至70℃的不同温度下[在振荡下(900rpm)]温育1小时之后进行。
样品 pH 温度(℃) 酶 组胺峰的%面积 酪胺峰的%面积
缓冲液 7.2 37 - 100 100
缓冲液 4.2 37 DAO 49.7 84.5
缓冲液 5.8 37 DAO 39.3 88.6
缓冲液 6.5 37 DAO 32.0 87.2
缓冲液 7.2 37 DAO 24.3 95.7
缓冲液 7.2 37 - 100 100
缓冲液 7.2 37 DAO 24.3 95.7
缓冲液 7.2 50 DAO 0.1 92.0
缓冲液 7.2 60 DAO 42.6 99.1
缓冲液 7.2 70 DAO 85.8 94.6
缓冲液 7.2 37 - 100 100
缓冲液 4.2 37 MAO 70.5 59.7
缓冲液 5.8 37 MAO 78.9 56.1
缓冲液 6.5 37 MAO 69.2 42.7
缓冲液 7.2 37 MAO 82.8 28.0
缓冲液 7.2 37 - 100 100
缓冲液 7.2 37 MAO 82.8 28.0
缓冲液 7.2 50 MAO ND 33.9
缓冲液 7.2 60 MAO 66.4 58.9
缓冲液 7.2 70 MAO 71.1 67.3
麦芽汁 5.8 50 - 10.3 0
麦芽汁+组胺和酪胺 5.8 50 - 100 100
麦芽汁+组胺和酪胺 5.8 50 DAO 20.1 101
麦芽汁+组胺和酪胺 5.8 37 MAO 98.4 73.6
啤酒 4.2 37 - 0 0
啤酒+组胺和酪胺 4.2 37 - 100 100
啤酒+组胺和酪胺 4.2 37 DAO 86.1 98.3
啤酒+组胺和酪胺 4.2 37 MAO 89.4 93.5
上述结果说明DAO完全减少了组胺在缓冲液系统(50℃,pH7.2)中的水平，和MAO将酪胺在缓冲液系统(37℃,pH7.2)中的水平从100减少至28%。DAO能够将组胺在麦芽汁(50℃,pH5.8)中从100减少至20%，和在啤酒(37℃,pH4.2)中从100减少至86%。MAO对于在麦芽汁和啤酒系统中减少酪胺不是非常有效。
总之，转谷氨酰胺酶对于在麦芽汁系统中在相同时间内去除组胺和酪胺与MAO和DAO相比较优。
实施例2
进行了用转谷氨酰胺酶、MAO和DAO处理的样品的氨基酸分析以查看麦芽汁样品氨基酸组成中是否存在任何重大变化。
进行了类似于如上所述的方法，但具有下述例外的层析实验。
应用了下述洗脱液：A(0.56%三甲胺缓冲液，pH7.5，离子强度20mM)和B(45%乙腈，45%甲醇和10%Milli-Q水)。应用了下述梯度：
时间(分钟) %A %B
0 88 12
12 88 12
50 60 40
59 39 61
60 18 82
60.5 0 100
62.5 0 100
63 88 12
67 88 12
在0.1N HCl中制备了组成为2.5mM每种氨基酸包括正缬氨酸(Norvalin)(内标)的标准溶液。标准曲线通过上述溶液的下述稀释制成：用0.1N HCl稀释2，8，16，32，64和128x。
在每个HPLC小瓶中，添加700μLMilli-Q水，100μL内标，200μL样品。衍生化过程如下所述进行：将10mg/mL OPA试剂(Agilent technologies,P.N.5061-3335)，FMOC试剂(Agilent technologies,P.N.5061-3337)和硼酸(盐)缓冲液(0.4N在Milli-Q水中)用Milli-Q水稀释4倍。将2μL来自上面说明的HPLC小瓶中的混合物，10μL硼酸(盐)缓冲液，2μLOPA试剂，2μLFMOC试剂，10μL硼酸(盐)缓冲液和100μLMilli-Q水添加并注入柱。
确定了实施例2中所述用转谷氨酰胺酶、MAO和DAO处理的麦芽汁样品的以%相对面积表示的氨基酸概貌：
Figure BDA00002713836000171
Figure BDA00002713836000181
根据上表，显然总氨基酸含量在样品之间是类似的，仅TG酶和z-Gly-gln的共同作用，而非TG酶自身减少了赖氨酸。
Figure BDA00002713836000182
Figure BDA00002713836000191
根据上表，显然总氨基酸含量不受MAO和DAO作用的影响。

Claims (15)

1.一种减少饮料中生物胺含量的方法，其包括将所述饮料和/或饮料中间物与具有转谷氨酰胺酶活性的酶相接触。
2.权利要求1的方法，其中所述具有转谷氨酰胺酶活性的酶是可从链霉菌属(Streptomyces)获得的。
3.权利要求1的方法，其中所述生物胺选自酪胺、组胺及其组合。
4.权利要求1的方法，其中所述接触是在肽结合的谷氨酰胺存在下进行的。
5.权利要求1的方法，其中所述接触是在肽结合的谷氨酰胺不存在时进行的。
6.权利要求1的方法，其中减少了至少50%的生物胺。
7.权利要求1的方法，其中所述饮料具有少于5%(w/w)的蛋白含量。
8.权利要求1的方法，其中所述饮料是麦芽汁。
9.权利要求1的方法，其中所述饮料是含酒精的。
10.权利要求8的方法，其中所述含酒精的饮料是啤酒。
11.权利要求8的方法，其中所述含酒精的饮料是葡萄酒。
12.权利要求1的方法，其中所述接触是在pH3.0-6.5进行的。
13.权利要求1的方法，其中具有转谷氨酰胺酶活性的酶的浓度是约0.1mg至约1000mg酶蛋白(EP)每升饮料或饮料中间物。
14.具有转谷氨酰胺酶活性的酶用于减少饮料中生物胺含量的用途。
15.一种具有低含量的生物胺的饮料，其通过权利要求1的方法获得。
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