CN102971436B - 用于检测真菌性病原体的方法 - Google Patents
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Abstract
无症状阶段期间病原体的早期检测可以用于基于采用可用于防止形成疾病以及相关产量损失的方法的及时需要。此外，它可以用于预测作物生产量以及由检疫部门来监测待进行国际贸易的样品中病原体的存在。我们创新地设计了用于PCR扩增真菌rDNA序列的通用引物，用HinFI酶限制性消化PCR产物并且通过PathDec工具分析限制性片段，使得在小于6小时内甚至在可见地出现病症之前就可以鉴定和检测几乎所有苹果的真菌性病原体。
Description
下面的说明书具体地说明了本发明及其实现方式：
技术领域
本发明涉及用于检测和鉴定真菌性病原体的通用引物组。
在本研究中开发的病原体检测系统可以用于辨别真菌性病原体，甚至在无症状阶段期间检测果园中存在的真菌性病原体，确定需要的杀真菌剂基础喷雾量，以及在各种真菌性疾病引起严重产量损失时预测作物产量的估计值。此外，它可以用于检疫部门对进出口样品进行常规监测。
背景技术
存在几种可用于检测植物和动物真菌性病原体的方法。这些方法大多数使用真菌rDNA序列的保守性以及变异性用来检测病原体。该rDNA包括编码的18S、5.8S以及28SRNA；分散有称为ITS1以及ITS2的两个非编码ITS序列（Whiteetal.1990；PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications.AcademicPress,Inc.,SanDiegoPages315-322）。靶向ITS区的特异性引物对已经用于检测特定的病原体并且这类引物与属特异性通用引物相结合已经用于辨别有限组的病原体。参考美国专利6080543，该专利使用在ITS区中的这种变异性用来辨别葡萄孢聚壳菌（Eutypellavitis）、葡萄藤猝倒病菌（Eutypalata）、葡萄生拟茎点霉（Phomopsisviticola）以及棉色二孢菌（Diplodiagossypina）这些葡萄植物的真菌性病原体。特异性引物已经用于辨别小麦匍匐核腔菌（Pvrenophoratritici-repentis）和圆核腔菌（Pyrenophorateres）（美国专利6358680）以及核果链核盘菌（Monilinialaxa）和果生链核盘菌（Moniliniafructicola）（美国专利6221595）的存在。美国专利申请20030099975说明了用于检测链格孢属（Alternariaspp.）、嗜果枝孢霉（Cladosporiumcarpophilum）以及尖锐刺盘孢（Colletotrichumacutatum）的PCR检测法，其中使用特异性引物来辨别这些病原体。通过使用特异性引物来检测病原体还用来检测食品中的污染。例如，WIPO专利申请WO/2000/046397说明了用于特异性检测食品中链格孢（Alternaria）的技术。美国专利6858387说明了使用种属特异性引物和通用引物的组合来检测几种真菌物种。在美国专利申请20080227108中，发明人通过计算出ITS区的PCR扩增区的序列变异性辨别出样品中存在的不同种类的曲霉菌（Aspergillus）。上述技术的缺点是它们依赖于用于鉴别病原体的病原体特异性引物。一些研究已经专注于设计病原体特异性探针并且将它们用在基于杂交和微阵列的检测中，用来检测和辨别样品中存在的各种真菌性病原体。在此方面，可以参考以下专利：美国专利6372430、EP0422872A2、EP0422873B1、WO/1998/055649A1、WO/1996/021741A1、美国专利5519127、美国专利5707802、美国专利5426027等。Sholbergetal.2005（PlantDis.89:1143-1150）开发了一种DNA宏阵列，其中在尼龙膜上固定与苹果真菌性病原体扩展青霉菌（Penicilliumexpansum）、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、白叉丝单囊壳（Podosphaeraleucotricha）、苹果黑星病菌（Venturiainaequalis）以及解淀粉欧文氏菌（Erwiniaamylovora）（一种细菌病原体）的ITS序列间隔区相应的寡核苷酸。作者已经成功地检测这些病原体并且将它们与紧密相关的种类区分开。虽然基于杂交和微阵列的技术允许使用者一次检测几种病原体，然而主要的缺点是这些技术是技术敏感的、耗时的、昂贵的并且依赖于针对有待检测的每种病原体特异性探针的可用性。
除了这些方法，PCR-PFLP的稳健性还用于辨别真菌性病原体的各种研究中。ITS特异性PCR紧接着RFLP分析已经显示将胶孢炭疽菌（Colletotrichemgloeosporioides）与辣椒炭疽菌C.capsici（Tapia-Tusselletal.2008；MolBiotechnol.40:293-8.）以及将纳雪梨黑星病菌（Venturianashicola）与梨黑星病菌（V.pirina）（LeCametal.2001；Phytopathology91:900-904）精确地区分开。使用ITS特异性通用引物和担子菌（basiodiomycete）特异性引物的组合得到的PCR产物的RFLP分析可以区别引起云杉木白腐病和棕腐病的担子菌（basiodiomycete）（Jasalavichetal.2000；Appliedandenvironmentalmicrobiology.4725-4734）。PCR-PFLP分析可以将葡萄藤猝倒病菌（Eutypalata）（维管癌病原体）与葡萄藤树干病原菌（葡萄生拟茎点霉（Phomopsisviticola）、球二孢属（Botryodiplodiasp.）、暗色支顶孢aleophilum（Phaeoacremoniumaleophilum）以及暗色支顶孢chlamydospora（Phaeomoniellachlamydospora）以及几种其他的葡萄病菌属种（Eutypasp）区别开（Rolshausenetal.2004；PlantDis.88:925-929）。该技术还用于区别导致洋葱茎腐病的葡萄孢属种（Botrytisspecies）（Nielsenetal.2002；PlantDis.86:682-686），区别引起的桉树（Eucalyptus）叶病的小球壳属种（Mycoshaerellaspecies）（Kularatneetal.2004；Mycol.Res.108:1476-1493），在桉树（Eucalyptus）相关的外生菌根的真菌中鉴别变异（种间和种内）（Glenetal.2001；MycologicalresearcA.105:843-858），以及检测六种医学上重要的假丝酵母属种（Mirhendietal.2006;.J.Med.Mycol.47:225-229）。可以参考美国专利5780271，该专利说明了使用PCR-RFLP来区别疫霉属种。600bpPCR扩增子指示样品中存在疫霉属种，当用HaeIII限制酶消化时，该扩增子产生多态性从而将恶疫霉（P.cactorum）与致病疫霉（P.infestans）区别开。使用真菌ITS特异性通用引物连同SBFS（苹果煤污病与蝇粪病复合病）引物一起，Duttweileretal.2008（PlantDis.92:794-799）可以得到PCR扩增子，当用HaeIII限制酶消化时，该扩增子可以将与SBSF相关的致病性真菌区别到种的水平。类似地，ITS区PCR扩增紧接着RFLP分析可以辨别引起苹果蓝霉病的青霉菌属种（Pianzzolaetal.2004；PlantDis.88:23-28）。可供使用的基于PCR-RFLP的技术主要存在的缺点是它们主要检测有限数量/组的病原体。
专利文献：
EP0422872A2NucleicacidprobesandApr,2006Weisburgetal.
methodsfordetectingfungi
EP0422873B1NucleicacidprobesandMay,2000Weisburgetal.
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Cryptococcusneoformans
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DNAcellsinblood
US5519127NucleicacidprobesfortheMay,1996Shahetal.
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Carnii
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US6221595DetectionofMoniliniaspp.Apr,2001Becketal.
Usingpolymerasechainreaction
US6358680DetectionofwheatandbarleyMar,2002Becketal.
fungalpathogensusingthe
PCR
US6372430NucleicacidsfordetectingApr,2002Morrisonetal.
Aspergillusspeciesandother
filamentousfungi
USapplicationDetectionoffungalpathogensMay,2003Barnettetal.
20030099975usingthepolymerasechain
reaction
USapplicationMolecularidentificationof
20080227108Aspergillusspecies
WO/1996/021741A1NucleicacidprobesfortheJul,1996Sandhuetal.
detectionandidentificationof
fungi
WO/1998/055649A1NucleicacidprobesfortheDec,1998Sandhuetal.
detectionandidentificationof
fungi
WO/2000/046397NucleicacidbasedassayandAug,2000Kashietal.
kitforthedetectionof
alternariacontaminationin
foodproducts
发明内容
发明目的：
本发明的主要目的是设计并且提供通用引物组，该引物组扩增用于检测真菌性病原体的真菌rDNA序列的ITS区。
本发明的另一个目的是提供用于检测以及鉴别真菌性病原体的方法，包括：从一个或多个真菌菌丝体和/或一个或多个感染的组织中分离DNA，使用设计的通用引物对PCR扩增它们的ITS2区，适当的限制酶消化，通过凝胶电泳分辨（解析，resolution）多态性条带以及通过PathDec工具分析得到的RFLP条带，该工具将得到的RFLP条带图案与通过计算机（insilico）分析得到的预先存储的病原体特异性条带图案进行比较用来检测和区别各种真菌性病原体。
相对于现有技术本发明的一个或多个新颖性和创造性步骤：
已经设计出许多基于PCR的方法用来检测植物和动物的多种真菌性病原体。这些技术大多数已经被开发用来一次性检测一种特定的病原菌或有限数量的病原体。靶向病原体ITS区的特异性引物对已经用于检测特定的病原体并且这类引物与属特异性通用引物结合已经用于区别少量的病原体。我们创新地设计了ITRRF1以及ITRRF1通用引物，使用这些引物进行PCR扩增，用HinFI酶限制性消化PCR产物，将凝胶显影，以及通过基于PERL的工具PathDec，来分析这些限制性片段，使得在小于6小时时间内甚至在可见地出现病症之前可以鉴别和检测大多数真菌性病原体。甚至在不使用专用的图像处理工具/仪器的情况下，PathDec帮助使用者分析复杂的RFLP条带图案以便鉴别和区分样品中存在的真菌性病原体。
附图说明
图1表示使用ITRRF1以及ITRRR1通用型真菌引物的PCR扩增。泳道1：链格孢（Alternariaalternata）；泳道2：苹果黑星病菌（Venturiainaequalis）；泳道3：围小丛壳菌（Glomerellacingulata）；泳道4：尖锐刺盘孢（Colletotrichumacutatum）；泳道5：灰葡萄孢（Botrytiscinerea）；泳道6：内寄生真菌（Endophyticfungus）；泳道7：100bp梯。
图2表示使用HinFI限制酶的PCR-RFLP分析。泳道1：20bp梯；泳道2：链格孢（Alternariaalternata）；泳道3：苹果黑星病菌（Venturiainaequalis）；泳道4：围小丛壳菌（Glomerrellacingulata）；泳道5：尖锐刺盘孢（Colletotrichumacutatum）；泳道6：灰葡萄孢（Botrytiscinerea）。
图3表示用来区别三种不同苹果真菌性病原体混合物的PCR-RFLP分析。泳道1：20bp梯；泳道2：链格孢（Alternariaalternata），苹果黑星病菌（Venturiainaequalis），小丛壳属叶斑病原体（Glomerellaleafspotpathogen）的混合物。
图4表示用来区别四种不同苹果真菌性病原体混合物的PCR-RFLP分析。泳道1：20bp梯；泳道2：链格孢（Alternariaalternata），苹果黑星病菌（Venturiainaequalis），小丛壳属叶斑病原体（Glomerellaleafspotpathogen）以及灰葡萄孢（Botrytiscinerea）的混合物。
图5表示在无症状阶段链格孢（Alternariaalternata）感染的叶片的PCR-RFLP分析。泳道1：100bp梯；泳道2：模拟感染的苹果叶片；泳道3：链格孢（Alternariaalternata）感染的苹果叶片。
图6PathDecV1.0的流程图
表1表示使用HinFI酶的苹果真菌性病原体的ITRRFl和ITRRRl引物可扩增的rDNA序列的计算机（Insilico）限制性酶切分析。
表2表示用于证实本研究中开发的方法有效性的真菌性病原体。
发明综述
因此，本发明提供了用于检测和鉴别真菌性病原体的通用引物组以及方法。所述方法包括从真菌菌丝体或有症状的/无症状的组织中分离DNA，通过通用型真菌特异性ITRRF1以及ITRRR1引物PCR扩增真菌rDNA，通过适当的酶限制性消化PCR产物，通过凝胶电泳分辨（解析）得到的条带，将凝胶显影并且通过PathDec工具（但不限于它）来解释结果，用来显示样品中存在/缺少病原体以及提供它们的百分比概率。
在本发明的一个实施方式中，提供了用于检测真菌性病原体具有SeqIDNo.1和SeqIDNo.2的通用引物组。
在本发明的另一个实施方式中，引物组具有如下特征：
i.所述正向引物长度为21链节，而反向引物为23链节，
ii.G+C含量在43-48%的范围内，
iii.Tm在53°C的范围内，
iv.退火温度优选在50-60°C的范围内，最佳为54°C。
在本发明的另一个实施方式中，提供了引物组，其中通过在引物对的5’或3’方向上在正向引物和反向引物两者中添加或缺失5个核苷酸来改变它们的长度。
在本发明的另一个实施方式中，提供了用于鉴别不可培养型真菌的引物组。
在本发明的另一个实施方式中，提供了用于鉴别真菌性病原体的方法，包括以下步骤：
a.设计具有SeqIDNo.1和SeqIDNo.2的通用引物，
b.通过使用在步骤a中得到的引物来PCR扩增真菌rDNA，
c.使用选自包括RsaI、EcoRI、HindIII、HaeII、HaeIII、HinFI、PhoI、MspI、TaqI等的组的限制酶来限制性消化在步骤b中得到的PCR产物从而产生限制性片段长度多态性，
d.通过凝胶电泳分辨在步骤c中得到的条带，
e.将在步骤d中得到的PCR-RFLP条带信息输入到PathDec工具中，
f.将在步骤e中得到的输入的条带信息与使用算法针对每个病原体计算机（insilico）得到的条带图案进行比较，其中所述数据库存储针对真菌性病原体的标准条带图案。
g.鉴别样品中存在的真菌性病原体。
在本发明的又另一个实施方式中，提供了用于鉴别苹果真菌性病原体的方法。
在本发明的又另一个实施方式中，提供了用于检测真菌性病原体的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
a.具有Seq.ID1和Seq.ID2的引物组，
b.适合用于PCR的试剂，
c.适当的限制性酶，
d.PathDec工具，
e.指导手册（操作手册）。
具体实施方式
已经设计了多种基于PCR的方法用来检测植物和动物的各种真菌性病原体。这些方法大多数已经被开发用于检测一种特定的病原菌或有限数量的病原体。我们创新性地设计通用引物用于PCR扩增真菌rDNA序列的高度多态性区域，用HinFI酶限制性消化PCR产物并且通过PathDec工具分析这些限制性片段，该工具将得到的RFLP条带图案与通过计算机（insilico）分析得到的预先存储的病原体特异性条带图案进行比较使得甚至在可见地出现病症之前在小于6小时内可以鉴别和检测几乎所有苹果真菌性病原体。由于本研究中设计的引物在本质上是通用的，因此，可以预期的是该方法将能够检查和区别其他植物/动物种类的真菌性病原体。然而，必须鉴别出可能产生多态性的适当的限制酶并且需要升级针对其他植物/动物病原体的PathDec数据库。
本发明中涉及的多个处理步骤如下：DNA分离：通过下面常用的CTAB方法（DoyleJJ,DoyleJL（1987）ArapidDNAisolationprocedureforsmallquantitiesoffreshleaftissue.PhytochemBull19:11-15）或使用任何商品化的DNA分离试剂盒来分离来自苹果组织和真菌菌丝体的DNA。设计通用PCR引物：所有可供使用的苹果真菌性病原体的rDNA序列都是从NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载的。使用CLUSTALW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）进行多序列比对用来寻找这些序列中的保守区。5.8SrDNA区中的一个保守序列段（conservedstretch）用于设计正向引物（ITRRF1；5'CGATGAAGAACGCAGCGAAAT）同时以这样一种方式由第二保守序列段来设计反向引物（ITRRR1:TATGCTTAAGTTCAGCGGGTATC），即这些引物结合位点位于真菌rDNA序列ITS2区的侧翼。计算机（insilico）限制性消化分析用来鉴别苹果真菌性病原体间的多态性：在下载的苹果真菌性病原体rDNA序列中区别rDNA序列的PCR可扩增区。使用在线工具（NEBcutterV2.0（http://tools.neb.com/NEBcutter2））对这些区域的序列进行计算机（insilico）限制性消化分析。使用几种常用的限制性酶（RsaI、EcoRI、HindIII、HaeII、HinFI、PhoI、MspI、TaqI）（表1）对这些序列的每一个进行常规消化。此外，HinFI消化可以显示19种苹果真菌性病原体中13种的条带图案的多态性（它们的序列可在NCBI中得到（表1））。然而，由于rDNA序列的高度保守特性，链格孢（Alternariaalternata），贝伦格葡萄座腔菌（Botryosphaeriaberengeriana）和苹果盘二孢菌（Marssoninamali）（具有类似的RFLP图案：150、116、53、8）以及还有富克葡萄孢盘菌（Bottyotiniafiickeliana），果产链核盘菌（Moniliniafructicola)和核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）(具有类似的RFLP图案：165、89、53、8）不能通过本发明中开发的方法区分开。
为了证实株特异性变异未改变特定病原体的RFLP图案，从NCBI下载相应于这些病原体每一种的不同菌株的至少4-5种rDNA序列，区分出PCR可扩增区并且进行计算机（insilico）限制性消化分析。分析显示在所有特定病原体菌株中条带图案是相同的并且未检测出株特异性变异。通过设计的通用引物PCR扩增：使用ITRRFl以及ITRRRl引物对由按照上述方法分离的从MTCC，Chandigarh（印度）得到的来自四种不同苹果真菌性病原体培养物的DNA（表2）进行PCR扩增。通过混合5μl10×PCR缓冲液，5μl10×MgCl2，4μldNTP混合物，0.4μlTaq酶（5U/μ1）以及ITRRF1和ITRRRl引物各1μl（3pm），通过添加高压灭菌去离子水来调节最终体积，来建立50μlPCR反应。在95℃下初始变性5分钟之后，样品进行94℃1分钟，54℃30秒以及72℃30秒的35个热循环。最后的延伸在72℃下进行持续10分钟。图1说明了在所有这些实例中都产生了约320bp的PCR扩增子。PCR产物的RFLP分析：通过按照制造商的说明书用1μg快速消化HinFI（FermentasInternationalInc,Ontario,Canada）在37°C下消化15分钟对从上述不同苹果真菌性病原体得到的1μgPCR产物进行RFLP分析。在3%琼脂糖凝胶上通过在60V下运行90分钟通过凝胶电泳来分辨消化的条带，并且通过GelDocumentation系统来成像（图2）。发现条带图案与通过计算机（insilico）限制性分析得到的图案相类似。此外，我们对本发明是否能够区别以混合物形式一起提供的多种病原体进行了评估。为了对此进行分析，制造了相同比例的三和四种不同病原体的基因组DNA混合物并且进行上述的PCR-RFLP分析。如图3和图4中所示，PCR-RFLP可以区别所有这些病原体。此外为了检查甚至在出现可见症状之前本发明检测病原体的效率，按照本发明中提供的方法对用10μ1链格孢（Alternariaalternata）分生孢子感染的苹果叶片进行监测。如图5中所示，本发明方法可以在无可见症状的样品中检测出病原体的存在。通过PathDec工具来解释RFLP条带图案：可以通过使用基于PERL的工具，PathDec来解释RFLP图案用来检测和区别样品中存在的多种病原体。一旦将得到的PCR-RFLP条带尺寸（如图4中所示）作为输入提供给PathDec工具，该工具可以成功地区别苹果真菌性病原体的混合物。
用于区别病原体的RFLP条带分析是劳动量大的，尤其是当样品中存在大量病原体时。在本发明中已经开发出基于PERL的软件PathDec用来解释PCR-RFLP条带图案并且用来帮助使用者鉴别样品中存在的真菌性病原体。本研究中开发的整个检测系统已经成功地验证能够区别单个形式或混合物形式的几种苹果病原体。
流程图
输入PCR-RFLP条带信息
↓
算法将输入的条带信息与针对每种病原体计算机（insilico）得到的条带图案进行比较。
↓
提供病原体名称连同它们在样品中存在的百分比概率一起。
通过举例说明方式给出下面实施例，并且因此不应解释为限制本发明的范围。
实施例-1
培养本研究中使用的真菌性病原体：下面是用于培养苹果真菌性病原体的生长条件。
链格孢（Alternariaalternata）
生长培养基-PDA（马铃薯葡萄糖琼脂；Himedia）；生长条件-需氧
温度：28℃；培养时间：5天
围小丛壳菌（Glomerellacingulata）
生长培养基-PDA（马铃薯葡萄糖琼脂；Himedia）；生长条件-需氧
温度：25℃；培养时间：5天
尖锐刺盘孢（Colletotrichumacutatum）
生长培养基-PDA（马铃薯葡萄糖琼脂；Himedia）；生长条件-需氧
温度：25℃；培养时间：5天
灰葡萄孢（Botrytiscinerea）
生长培养基-PDA（马铃薯葡萄糖琼脂；Himedia）；生长条件-需氧
温度：25℃；培养时间：5天
苹果黑星病菌（Venturiainaequalis）
生长培养基-M-98（麦芽汁l0gm/L；蛋白胨3gm/L以及琼脂15gm/L；Himedia）；生长条件-需氧；温度20℃；培养时间：14天
实施例-2
设计通用的真菌特异性引物：从NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载各种苹果真菌性病原体的rDNA序列。为了取得这些序列中的保守区，使用CLUSTALW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html）进行多序列比对。由真菌rDNA序列的ITS2区侧翼的保守区来设计正向引物（ITRRF1：5'CGATGAAGAACGCAGCGAAAT）以及反向引物（ITRRRI：TATGCTTAAGTTCAGCGGGTATC）两者。
实施例-3
分析所设计引物的通用性：为了发现本研究中设计的引物是否能够扩增其他真菌的rDNA序列，我们下载了多种随机选择的真菌的rDNA序列[汉逊德巴利酵母菌（Debaryomyceshansenii）株W4682（GQ913348）；内生真菌（Fungalendophyte）分离物5724（DQ979775）；枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）株STE-U（AY251074）；枝状枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）分离物GG6（EF104249）；Atheliabombacina分离物AFTOL-ID347（DQ449026）；球毛壳菌（Chaetomiumglobosum）分离物B221（GQ365152）；小球壳孢菌（Microsphaeropsissp.）HLS303（FJ770074；小球壳孢菌arundinis（Microsphaeropsisarundinis）株PMBMDF049（FJ798603）；座囊菌（Dothideomycetessp.）11313（GQ153229）；黄曲霉菌（Aspergillusflavus）株ATCC11497（GU256760）；土曲霉菌（Aspergillusterreus）株ATCC20542（GU256759）；黑曲霉菌（Aspergillusniger）株ATCC64973（GU256750）；杂色曲霉菌（Aspergillusversicolor）株ATCC26644（GU256744）；汉逊德巴利酵母菌（Debaryomyceshansenii）株W4682（GQ913348）；粗糙链孢霉菌（Neurosporacrassa）株ATCCMYA-4619（GU327635）；链孢霉菌discreta（Neurosporadiscreta）株ATCCMYA-4616（GU327632）；四孢链孢菌（Neurosporatetrasperma）株ATCCMYA-4615（GU327631）；好食链孢霉菌（Neurosporasitophila）（GU192459）；粗糙链孢霉菌（Neurosporacrassa）株ATCCMYA-4614（GU327630）；青霉菌（Penicilliumsp.）GG-2009a（GQ418173）；稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）株ATCCMYA-4617（GU327633）；葡萄座腔菌obtusa（Botryosphaeriaobtusa）株SDAU07159（FJ171717）；扩展青霉菌（Penicilliumexpansum）株NRRL6069（DQ339562）；草本支孢霉菌（Cladosporiumherbarum）分离物wb317（AF455479）；仁果裂盾菌（Schizothyriumpomi）（FJ425206）；球腔菌pyri（Mycosphaerellapyri）株CBS100.86（EU167606）；梨黑星病菌（Venturiapirina）株ICMP（AF333439）；白叉丝单囊壳菌（Podosphaeraleucotricha）voucherBPI878262（EU148597）]，并且寻找正向和反向引物结合位点的存在。引物结合位点存在于所有这些序列中表明这些引物的真菌特异性通用性。
实施例-4
用于辨别各种真菌性病原体的计算机（Insilico）方法：从NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载所有可供使用的苹果真菌性病原体的rDNA序列。使用在线工具进行计算机（Insilico）限制性消化分析；使用NEBcutterV2.0（http://tools.neb.corn/NEBcutter2）来研究苹果真菌性病原体间的多态性。在下载的苹果真菌性病原体的rDNA序列中区别rDNA序列的PCR可扩增区并且使用几种常用限制性酶（RsaI、EcoRI、HindIII、HaeII、HinFI、PhoI、MspI、TaqI）进行常规消化分析。分析显示在不同的苹果病原体的PCR扩增子中HinFI消化可以提供长度多态性（表1）。
表1表示使用HinFI酶消化的苹果真菌性病原体的可扩增的rDNA序列的ITRRFl和ITRRRl引物的计算机（Insilico）限制性分析。
*：在可在NCBI得到的序列中不存在反向引物结合位点。
1：这些病原体不能通过本方法区别。
2：两者都是失真的（anamorphic）。
实施例-5
从真菌菌丝体和植物组织中分离基因组DNA：按照CTABDNA分离实验方案（DoyleJJ,DoyleJL（1987）ArapidDNAisolationprocedureforsmallquantitiesoffreshleaftissue.PhytochemBull19:11-15）使用l00mg组织（菌丝体、叶片、果实等）用于DNA分离。
实施例-6
在琼脂糖凝胶上进行PCR-RFLP分析用来显示真菌性病原体间的多态性：通过混合5μl10×PCR缓冲液，5μl10×MgCl2，4μldNTP混合物，0.4μlTaq酶（5U/μl）以及ITRRF1和ITRRRl引物各1μl（3pm），通过加入高压灭菌去离子水来调节最终体积，从而建立50μlPCR反应。在95℃初始变性5分钟之后，样品进行94℃1分钟，54℃30秒以及72℃30秒的35个热循环。最终的延伸在72℃下进行持续10分钟。按照制造商的说明书通过用1μl快速消化HinFI（FermentasInternationalInc，Ontario，Canada）在37℃下消化15分钟对1μgPCR产物（图1）进行RFLP分析。在3%琼脂糖凝胶上通过60V下运行90分钟通过凝胶电泳来分辨消化的条带并且通过GelDocumentation系统进行成像（图2）。
实施例-7
区别在实验室培养基上培养的不同苹果真菌性病原体：对不同真菌性病原体（表2）分离的DNA进行PCR并且紧接着按照实施例5的琼脂糖凝胶
电泳进行RFLP分析。分析显示本方法可以区别所有这些苹果真菌性病原体（图2）。
表2：用于证实本研究中开发的方法有效性的真菌性病原体
实施例-8
区别混合物中存在的真菌性病原体：制造等比例的三或四种不同苹果真菌性病原体基因组DNA的混合物并且进行如实施例5所述的PCR-RFLP分析。如图3和4中所示，PCR-RFLP可以区别所有这些病原体。
实施例-9
使用工具来分析PCR-RFPL条带图案：分析PCRRFLP图案分析是工作量大的，尤其是当必须分析多个条带时。基于PERL的工具PathDec已经用于这个目的（版权被保护）然而应用不限于PathDec。一旦将所述得到的PCR-RFLP条带尺寸作为输入提供给PathDec工具，该工具可以成功地区别苹果真菌性病原体的混合物。
实施例-10
甚至在可见症状出现之前检测真菌性病原体：按照实施例5中所述方法对用10μ1链格孢（Alternariaalternata）分生孢子感染的苹果叶片进行监测。图5显示我们的方法可以在无可见症状的样品中检测病原体的存在。
观测的推论/结果/总结
本发明说明了用来检测多种植物真菌性病原体的基于PCR的方法。我们创造性地设计用于PCR扩增真菌rDNA序列的通用引物，用HinFI酶限制性消化PCR产物并且通过PathDec工具来分析得到的限制性片段，导致在小于6小时内甚至在病症可见地出现之前可以鉴别和检测大部分苹果（但不限于苹果）的真菌性病原体。
本发明的主要优点是：
1.设计用于扩增真菌rDNA序列的通用引物对。
2.使用工具来分析和解释PCR-RDLP数据用来鉴别和区别真菌性病原体。
3.简单、稳健并且单一的实验方案用于在小于6小时时间内在混合物中检测和区别大多数真菌性病原体。
4.简单、稳健并且单一的实验方案用于甚至在病症可见地出现之前在小于6小时时间内检测和区别样品中存在的大多数真菌性病原体。
5.简单、稳健并且单一的实验方案用于甚至在病症可见地出现之前在小于6小时时间内检测和区别样品中存在的大多数苹果真菌性病原体。
Claims (6)
1.一种用于检测苹果真菌性病原体的通用引物组，由SeqIDNo.1以及SeqIDNo.2组成。
2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物具有以下特征：
i.所述正向引物的长度为21链节，并且反向引物为23链节，
ii.G+C含量在43-48％的范围内，
iii.Tm在53℃的范围内，
iv.退火温度在50-60℃的范围内。
3.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物具有以下特征：
i.所述正向引物的长度为21链节，并且反向引物为23链节，
ii.G+C含量在43-48％的范围内，
iii.Tm在53℃的范围内，
iv.退火温度为54℃。
4.根据权利要求1所述的引物用于鉴别苹果真菌性病原体的应用。
5.一种用于鉴别苹果真菌性病原体的方法，包括以下步骤：
a.设计由SeqIDNo.1以及SeqIDNo.2组成的通用引物，
b.通过使用在步骤a中得到的引物来PCR扩增真菌rDNA，
c.使用限制性酶HinFI来限制性消化在步骤b中得到的PCR产物从而产生限制性片段长度多态性，
d.通过凝胶电泳来分辨在步骤c中得到的条带，
e.将在步骤d中得到的PCR-RFLP条带信息输入到PathDec工具中，
f.提供具有针对真菌性病原体存储的标准条带图案的数据库，
g.将在步骤e中得到的输入条带信息与在步骤f中得到的计算机得到的条带图案进行比较，
h.鉴别样品中存在的真菌性病原体。
6.一种用于检测苹果真菌性病原体的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
a.由Seq.ID1以及2组成的引物组，
b.适合用于PCR的试剂，
c.限制性酶HinFI，
d.PathDec工具，
e.指导手册。
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