CN102965393B - 人诱导多能干细胞的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤靶向显像技术领域的人诱导多能干细胞的制备方法及其用途，所述制备方法包括如下步骤：将慢病毒转染人成纤维细胞，得到人诱导多能干细胞。本发明还涉及所述人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的用途。本发明的人诱导多能干细胞能够靶向体内肿瘤病灶，人诱导多能干细胞通过标记荧光磁性纳米探针后，能够通过静脉注射后特异性富集于肿瘤病灶部位，同时还具有分子影像功能，示踪细胞在活体状态下在体内的分布。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤靶向显像技术领域，具体涉及一种人诱导多能干细胞的制备方法及其用途。
背景技术
肿瘤被认为是目前最难治愈的疾病之一，基因治疗是治疗肿瘤的一种有前景的手段。已经有研究报道间充质干细胞（MSCs）可以作为基因载体实现肿瘤治疗，MSCs一般是从骨髓、脂肪、真皮等组织中分离得到，从这些组织中分离MSCs需要选择合适的供体并进行侵入性操作。而且从单个供体中取得MSCs是有限的，并且不能进行长期的增殖，这些都影响了MSCs作为载体进行基因治疗的可操作性。胚胎干细胞是一种来自于囊胚的内细胞团的全能干细胞，能够在体外无限增值而不丧失其分化的潜能，并且胚胎干细胞（ESCs）相对于其他细胞，易于进行基因改造，更适合作为基因载体，但是胚胎干细胞具有来源受限、伦理道德及操作技术等因素的限制，发展较为缓慢，而诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是使体细胞重编程获得的具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞，现在iPSCs已经可以取代ESCs，从而克服了ESCs来源受限、伦理道德限制等问题，因此应用iPSCs作为“载体”细胞将为肿瘤研究带来了治疗希望。
到目前为止，经对现有技术的文献检索，发现Hannon等在《Nature》（自然）杂志2004年第431卷第7006期371-378页上发表文章“Unlocking the potential of thehuman genome with RNA interference”，该文报道了通过转基因技术，向人类胚胎干细胞中添加了一个基因，该基因可以控制干细胞表达一种名为TRAIL的抗癌分子，当将这种转基因干细胞注入长有脑瘤的老鼠体内时，转基因干细胞便附着到脑瘤细胞上，并释放出TRAIL分子。实验结束后，这些老鼠脑瘤的体积平均缩小了50％，最多的甚至缩小了70％。2012年崔大祥等人又在《Theranostics》（诊疗）杂志第2卷第6期618-628页发表了文章“DiR-labeled Embryonic Stem Cells for Targeted Imaging of in vivoGastric Cancer Cells”，该文报道了小鼠胚胎干细胞具有主动靶向识别体内胃癌细胞的作用，并且这种迁移作用可能是由于体内趋化因子CXCL12与CXCR4配对作用所导致。以上研究都发现了ESCs具有靶向识别与治疗肿瘤的效果，但是，至今为止，还没有关于iPSCs靶向识别体内肿瘤细胞方面的报道。实际上iPSCs具有来源方便、实现个体化治疗、抗免疫排斥性、提高患者自身免疫力等优点，在肿瘤的早期预警与治疗方面具有很好的应用前景，是一种有应用前景的干细胞基治疗肿瘤的工具。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种人诱导多能干细胞的制备方法及其用途。本发明的人诱导多能干细胞能够靶向体内肿瘤病灶，人诱导多能干细胞通过标记荧光磁性纳米探针后，能够通过静脉注射后特异性富集于肿瘤病灶部位，同时还具有分子影像功能，示踪细胞在活体状态下在体内的分布。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个目的在于提供一种人诱导多能干细胞的制备方法，包括如下步骤：将慢病毒转染人成纤维细胞，得到人诱导多能干细胞。
优选地，所述人成纤维细胞为人真皮成纤维细胞或人包皮成纤维细胞。
优选地，所述慢病毒为携带有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子的慢病毒。
优选地，所述人成纤维细胞是通过原代培养的方法从肿瘤病人体内获得的人成纤维细胞。
本发明的第二个目的在于提供前述人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的用途。
优选地，所述用途包括如下步骤：将人诱导多能干细胞的制剂注射入人体，人诱导多能干细胞能够主动识别体内肿瘤病灶。
优选地，所述肿瘤为胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌或脑胶质瘤。
优选地，所述用途包括如下步骤：通过荧光标记人诱导多能干细胞，注射入人体，体内示踪，显示人诱导多能干细胞在体内的分布，进而显示体内肿瘤病灶的位置。
优选地，所述荧光标记使用的材料为无机荧光纳米材料。
优选地，所述无机荧光纳米材料为量子点、荧光磁性纳米粒子、二氧化硅包覆的荧光纳米粒子或上转换材料。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供了一种人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的用途，本发明的人诱导多能干细胞能够靶向体内肿瘤病灶，人诱导多能干细胞通过标记荧光磁性纳米探针后，能够通过静脉注射后特异性富集于肿瘤病灶部位，同时还具有分子影像功能，示踪细胞在活体状态下在体内的分布。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中的人iPSCs的碱性磷酸酶染色图；
图2为实施例1中的人iPSCs的免疫荧光染色图；
图3为实施例1中悬浮培养形成类胚体（EB）的形态图（A）和RT-PCR定量分析人iPSCs和EB中各胚层特异性基因的表达（B）；
图4为实施例2中未标记的人iPSCs细胞（A）和荧光磁性纳米粒子标记的人iPSCs细胞（B）的可见光与荧光成像复合图；
图5为实施例2中未标记的人iPSCs细胞（A）和荧光磁性纳米粒子标记的人iPSCs细胞（B）的普鲁士蓝-核固红复染照片图；
图6为实施例2中FMNPs（A）和FMNPs标记的iPSCs（B）在尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内之后1h和6h时间点小鼠活体荧光成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、人iPSCs的制备
本实施例涉及一种人iPSCs的制备，包括如下步骤：
步骤一，细胞制备
小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast，MEF）购自上海斯丹赛生物技术有限公司，传代培养至第三～五代的MEF细胞作为滋养层细胞；
原代培养人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts，HDF）：无菌条件下取患者腹部2～3cm2的皮肤，去除皮下组织和表皮层，用胶原酶消化真皮层，保持温度为37℃，时间为2个小时，然后挤压消化过的皮肤，并用单层纱布过滤，培养液用DMEM培养基添加10%胎牛血清放在培养箱中培养，一周后原代细胞建立，采用原代培养的方法制备HDF细胞，将原代培养至第三～五代的HDF细胞用于病毒转染制备iPSCs；
步骤二，人iPSCs的建立
将第4代HDF细胞接种在直径为10cm的培养皿中，培养24小时后当细胞达到50%左右的汇合度时，更换无抗生素培养基；
将包装48小时后的20mL新鲜的携带有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子的慢病毒液（四种转录因子病毒液各5ml），此慢病毒液可以通过病毒包装得到，或者从公开的市售渠道购买，加入培养基内，同时加入终浓度为8μg/ml的polybrene，转导HDF细胞；
24小时后弃掉培养液，根据同样的方法用收集包装72小时后的新鲜病毒混合液再次转导HDF细胞。24小时后更换为正常培养液，继续培养72小时。72小时后用含有筛选剂Puromycin(10μg/mL)的人胚胎干细胞培养基进行筛选，以后每天更换一次培养液，直至出现初始化的iPSCs克隆；
步骤三，人iPSCs的扩增培养
显微镜下用机械法剔除边缘弥散的细胞克隆，将中间致密的胚胎干细胞样克隆分割为小块接种在经丝裂霉素C处理过的MEF细胞上，用添加Y-27632(10μmol/L，Rho激酶抑制剂)的人胚胎干细胞培养基培养，每天更换人胚胎干细胞培养基培养，密切观察其形态变化，经过5～7天的培养可进行第二次传代；
步骤四，人iPSCs的生物学特性和多潜能性鉴定
碱性磷酸酶表达鉴定：将第三代iPSCs细胞用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定20min，PBS再洗涤2次，25mM Tris-Cl(pH9.0)漂洗1次，加入新鲜配制的坚牢红AP染色液，室温放置约15-30分钟后阳性细胞即呈现红色，PBS漂洗以终止反应，显微镜下观察，如图1所示。
免疫荧光法鉴定iPSCs表面标志物的表达：iPSCs用PBS洗3次，再用4%多聚甲醛固定20分钟，PBS洗涤2次，每次3～5分钟；0.2%Triton X-100透化5分钟，PBS洗三次，5%BSA室温封闭30分钟，用1%BSA稀释四种一抗（SSEA-3、SSEA4、Tra-1-60、Tra-1-81），将稀释好的一抗分别滴加到细胞上，不加一抗的作为实验对照，放在4℃过夜，PBS洗三次，加二抗（用1%BSA稀释）避光孵育2小时，PBS洗3次，DAPI复染核，置于荧光显微镜下观察，如图2所示。
类胚体的形成鉴定：细胞用IV胶原酶消化，37℃孵育40min以上，待细胞克隆脱落后，收集细胞团，自然沉降，去上清。换成人类胚胎体（EB）培养基，在无饲养层的低贴附板中悬浮培养7天。培养7天后将形成的EB转入0.1％明胶处理的培养皿内贴壁培养2周，借助RT-PCR检测EB表达各胚层的标志性基因:从EB中提取总RNA，采用TIANGEN公TIANScript RT Kit合成cDNA，然后以cDNA为模板利用如下表1所示的RT-PCR检测各胚层标志性基因表达的引物序列，扩增各胚层的标志性基因，各胚层的标志性基因在人iPSCs中的表达作为阴性对照。结果如图3所示。
表1
实施例2、荧光磁性纳米粒子（FMNPs）标记的人iPSCs细胞的制备
本实施例涉及荧光磁性纳米粒子（FMNPs）标记的人iPSCs细胞的制备，包括如下步骤：
步骤一，取对数生长期的iPSCs细胞，将FMNPs以50μg/mL的浓度加入人胚胎干细胞培养基，不加FMNPs的iPSCs为阴性对照组，5％的CO2，37℃培养2小时，吸弃培养基，PBS洗3遍；
步骤二，用2.5%戊二醛溶液固定FMNPs标记的人iPSCs细胞30分钟，将细胞分为两组，一组在荧光显微镜下观察被FMNPs标记的人iPSCs的荧光发光情况，结果如图4所示；另外一组细胞做普鲁士蓝-核固红复染，先用200g/L的亚铁氰化钾溶液37℃孵育细胞30分钟，之后用去离子水洗涤细胞3次，再用2g/L核固红硫酸铝溶液复染细胞10～15分钟，去离子水洗涤细胞3次，在显微镜下观察被FMNPs标记的人iPSCs细胞的普鲁士蓝铁染色的情况，结果如图5所示。
步骤三，用1mg/mL的IV型胶原酶消化FMNPs标记的人iPSCs细胞30～40分钟，之后收集细胞克隆，并用PBS缓冲液重悬，用1mL的枪头反复吹打细胞团块至细胞为单细胞悬液，静置2分钟后，分离未分散的细胞团块，收集上层单细胞悬液，放置待用。
效果验证：FMNPs标记的人iPSCs靶向、示踪体内胃癌的活体荧光成像，首先建立胃癌皮下荷瘤小鼠模型，选用4-5周龄的雄性裸鼠6只、体重20-22g，其中裸鼠均购于上海斯莱克实验动物有限公司，每只裸鼠皮下注射1×106人胃癌细胞（MGC803），SPF级环境饲养4-5周，控制肿瘤直径在0.5cm左右。胃癌皮下荷瘤小鼠分为两组，A组尾静脉注射荧光染料FMNPs；B组尾静脉注射5×106FMNPs标记的人iPSCs；A组和B组分别注射3只荷瘤小鼠，所有裸鼠均在注射后的1小时和2小时以侧卧位接受小动物活体荧光成像扫描分析iPSCs靶向胃癌的能力和在体内分布的情况，荧光成像的条件为激发波长460nm，发射波长630nm，结果如图6所示，A组小鼠在尾静脉注射荧光染料FMNPs2小时后肿瘤部位没有荧光信号，B组小鼠在尾静脉注射FMNPs标记的人iPSCs 1小时后肿瘤部位有荧光信号，并且随着注射时间的增加，肿瘤部位的荧光信号逐渐增加，注射后2小时肿瘤部位的荧光信号明显强于注射后1小时的荧光信号，这说明iPSCs具有靶向体内肿瘤病灶的效果。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (3)
1.一种人诱导多能干细胞在制备靶向体内肿瘤病灶制剂中的用途；所述人诱导多能干细胞的制备方法包括如下步骤：将慢病毒转染人成纤维细胞，得到人诱导多能干细胞；
所述人成纤维细胞是通过原代培养的方法从肿瘤病人体内获得的人成纤维细胞；所述人成纤维细胞为人真皮成纤维细胞；
所述慢病毒为携带有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子的慢病毒；
所述肿瘤为胃癌。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步骤：通过荧光标记人诱导多能干细胞，注射入人体，体内示踪，显示人诱导多能干细胞在体内的分布，进而显示体内肿瘤病灶的位置；
所述荧光标记使用的材料为无机荧光纳米材料。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述无机荧光纳米材料为荧光磁性纳米粒子。
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