CN102964340B - 一类治疗阿尔茨海默病的选择性多巴胺d1受体激动剂 - Google Patents
一类治疗阿尔茨海默病的选择性多巴胺d1受体激动剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一类具有多巴胺D1受体激动活性的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。此类化合物有很强的体外激动多巴胺D1受体的活性，EC50可达到nM水平，其中活性最强的化合物的EC50为7.56±0.45，可作为Aβ抑制剂，用于治疗阿尔茨海默病。
Description
技术领域
本发明涉及一类先导化合物选择性多巴胺D1受体激动活性的及其治疗阿尔茨海默病的用途。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种以认知记忆障碍为主要特征的退化性神经系统疾病，在发达国家已经成为仅次于心血管病、肿瘤和中风而位居第四位的致死原因。目前全球有AD患者约2430万人，预计到2040年全球将共有AD患者8100万。AD的病因至今尚不明确，可能是多种因素共同参与的结果。围绕着AD的发生，存在包括基因突变学说、胆碱能学说、淀粉样蛋白(Aβ)级联学说、tau蛋白异常修饰学说、免疫与炎症学说以及氧化应激学说在内的各种学说。其中Aβ级联学说占据主导地位。该学说认为Aβ是AD发病的中心环节，Aβ的聚集和沉积促发炎症级联反应、神经元纤维缠结、轴突损伤和突触丢失，最终导致神经元凋亡和痴呆。
目前治疗AD的药物主要是针对AD不同的发病机理而产生的，主要包括作用于胆碱能系统的药物、雌激素、神经营养因子、非甾体抗炎药、抗氧化剂、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂、抗Aβ药物、改善脑代谢的药物等，但只有抗Aβ药物是针对疾病的中心环节的治疗措施。因此抗Aβ药物治疗被认为是AD最有希望的治疗方法。
AD患者Aβ蛋白逐渐在细胞内外通过成核作用形成毒素斑点，导致神经元缺失，变性，产生认知和记忆障碍。因此减少Aβ的产生对改善AD的认知和记忆障碍有理论依据。目前美国犹他州盐湖城的一家生物制药公司MyriadGenetic(Nasdaq：NYGN)正在进行特异性减少毒性多肽淀粉样Aβ42药的II期临床，但临床上尚无此类药物出现。
多巴胺受体按照不同受体亚型与激动剂结合后信号转导机制的差异，可分为两类：D1类和D2类受体。D1类受体与Gs蛋白偶联，受到刺激后是腺苷酸环化酶活性升高，这类受体包括D1和D5两种亚型。D2类受体与Gi蛋白偶联，受刺激后不改变腺苷酸环化酶的活性或使其活性降低，它包括D2，D3，D4三种亚型。在中枢神经系统(CNS)中D1受体是分布最广泛的DA受体，以尾状壳核，横核，黑质网状部和嗅球表达最多，外周D1受体主要分布在心脏和肾脏。
近几年研究发现D1与阿尔兹海默症发病机制有关联，有望成为AD的防治新靶点。研究表明激动D1受体能保护神经元免受Aβ低聚物导致的突触功能障碍，且多巴胺在体外具有分解Aβ纤维蛋白的作用，另外脑内注射D1受体激动剂能改善东莨菪碱造成的痴呆状况，这些都提示D1受体激动剂能够用于AD的防治。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默病的化合物，该化合物是多巴胺D1受体激动剂，对阿尔茨海默病有预防或者治疗作用。本发明所述的化合物包括含治疗有效量的化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。本发明采用高通量筛选技术，建立了多巴胺D1受体激动剂高通量筛选模型并应用于化合物大规模筛选，通过筛选一批从CHEMDIV公司购买的化合物并进行功能性验证寻找到了具有化学式(I)的多巴胺D1受体激动剂。本发明的技术方案为：在中国仓鼠卵巢癌细胞(CHO)内稳定转染多巴胺D1受体，建立D1受体激动剂高通量筛选模型，进行初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具有抗AD作用的候选药物。具体步骤如下：
步骤一：建立及培养稳定转染D1受体的CHO细胞株。
步骤二：标准曲线的测定及最佳细胞数确定。
步骤三：阳性药验证。
步骤四：采用稳转细胞株和摸索的最佳检测条件对化合物进行D1受体激动剂的高通量筛选，得到有明显量效关系的化合物。
附图说明
图1：标准曲线及最佳细胞数曲线
图2：阳性药氢溴酸盐(SKF81297)量效曲线
图3：化合物1-5的量效曲线
图4：化合物6-11的量效曲线
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式
1.建立及培养稳定转染多巴胺D1受体的CHO细胞株。
应用重组酶介导的盒交换技术(Recombinase-Mediated Cassette Exchange，RMCE)批量构建G蛋白偶联受体细胞株，并使其稳定转染多巴胺D1受体，培养CHO-D1细胞使其达到稳定生长状态。
2.标准曲线的测定及最佳细胞数确定。
为验证实验体系的正确性以及能筛选出可靠的多巴胺D1受体激动剂，在建立模型时需要测定标准曲线并确定最佳细胞数。待CHO-D1细胞生长到80％的时用0.5mM EDTA的PBS消化细胞，离心去除上层液体，最后将细胞用刺激缓冲液重悬用于确定最佳细胞数。使用PerkinElmer公司的LANCETM cAMP 384Kit试剂盒，配制标准环磷酸腺苷(cAMP)梯度稀释液及腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)梯度稀释液。标准曲线测定方法：将cAMP的标准溶液50μmol/L(cAMP检测试剂盒自带)，用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，cAMP与抗体溶液各5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液，孵育一个小时后检测；最佳细胞数检测方法：将50mM的forskolin母液用刺激缓冲液逐级稀释为终浓度4倍的工作浓度，forskolin与含有细胞的抗体溶液各5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液，孵育一个小时后在EnVision微孔板测读仪上检测。根据forskolin量效曲线窗口(性噪比S/B)及曲线与cAMP标准曲线斜率相近的细胞浓度作为最佳细胞数。标准曲线及最佳细胞数确定见图1。
3.选用多巴胺D1受体激动剂的阳性药SKF81297对所建立的多巴胺D1活性筛选模型进行验证并且根据量效曲线计算其的EC50。
阳性药测定方法：将100mM的SKF81297母液，用刺激缓冲逐级稀释为终浓度2倍的工作浓度，阳性药SKF812975μl与含有最佳细胞数的抗体溶液5μl加入384孔板中共同孵育45分钟，加入10μl终止液再孵育一个小时后用EnVision微孔板测读仪检测，阳性药量效曲线见图2。
4.在上述的最佳检测条件下进行多巴胺D1受体激动剂的的初筛和复筛。
初筛与复筛过程相同，初筛只选用一个浓度对8万个化合物进行初步筛选，再选择初筛有效的化合物梯度稀释8个浓度进行复筛，过程如下：用Janus全自动加样工作站稀释化合物并吸取5μl转移到384孔板中，再用Multidrop自动加样仪将含有最佳细胞数的抗体溶液5μl加入384孔板中，两者共同孵育45分钟后，Multidrop自动加样仪将10μl终止液加入384孔板中，再次孵育一个小时，用EnVision微孔板测读仪检测。复筛得到一系列具有D1受体激动作用的化合物，各个化合物的EC50结果见图3，图4.
复筛实验结果
表1复筛得到的对D1受体有激动作用的一类化合物母核，结构式及EC50
Claims (2)
1.式(I)化合物或其药学上可以接受的盐用于制备具有多巴胺D1受体激动剂药理作用的药物制剂的用途；
其中式(I)化合物为以下的具体化合物：
化合物1，R1为＊-CH3，R2为＊-CH2CH3，R3为
化合物2，R1为＊-H，R2为＊-CH3，R3为
化合物3，R1为＊-CH3，R2为＊-CH3，R3为
化合物4，R1为＊-CH3，R2为＊-CH2CH3，R3为
化合物5，R1为＊-H，R2为＊-CH3，R3为
化合物6，R1为＊-H，R2为＊-CH2CH3，R3为
化合物7，R1为＊-H，R2为＊-H，R3为
化合物8，R1为＊-H，R2为＊-H，R3为
化合物9，R1为＊-H，R2为＊-H，R3为
化合物10，R1为＊-H，R2为＊-H，R3为
化合物11，R1为＊-CH3，R2为＊-H，R3为
2.根据权利要求1所述药物制剂的用途，具有作为多巴胺D1受体激动剂药理作用的药物制剂用于治疗阿尔茨海默病的用途。
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