CN102952768B - 一种芽孢杆菌及其菌剂和制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（ Bacillusamyloliquefaciens ）WY11，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2012年10月11日，保藏编号：CGMCCNo.6663；所述芽孢杆菌为活性成分的菌剂，是以所述解淀粉芽孢杆菌经斜面培养、种子培养、发酵并添加活性剂后制成的菌剂；所述芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，包括斜面培养、种子培养、发酵、液体菌剂制备、固体菌剂制备步骤；所述芽孢杆菌为活性成分的菌剂在制备毒杀植物根结线虫药物中的应用。本发明所述解淀粉芽孢杆菌和菌剂对植物根结线虫均有显著的毒杀作用，使用方便，对人畜无毒害作用，同时还能调节植物微生物生态区系，促进植物生长。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌及其菌剂和制备方法与应用。
背景技术
植物寄生线虫是植物的主要病原物之一，每年造成约1000亿美元的损失。其在全世界广泛分布，寄主范围广泛，它能使细菌和真菌更易于侵染植物，是诱发植物病害的重要原因之一。烟草根结线虫是两种严重危害烟草的病害，随着烟草生产的发展，连作面积的增加，危害日趋严重，线虫病害是许多国家烟草生产的主要限制因素之一，在我国各大烟区造成了严重危害，仅根结线虫病在云南省的年发病面积达2~3万公顷，病株造成烟叶减产30%-50%。烟草线虫病害的防治目前多采用化学防治、轮作及抗病品种，但效果均不太理想，且存在诸多弊端。如目前使用的化学杀线虫剂多为剧毒或高毒、高残留农药，对土壤微生物、植物、水源和大气层带来严重污染或破坏，同时线虫抗药性问题也日益突出，而且药物在植物体内残留会间接对人类造成危害。因此急需开发对环境友好，对人畜无毒的防治线虫病害的微生物制剂。
植物寄生线虫生防细菌的研究是利用植株上附生的拮抗细菌来防治植物病虫害的有效途径，也是最近几年兴起的新的研究热点，而筛选高效和活性稳定的拮抗菌株则是保证生物防治获得成功的先决条件。目前主要研究的生防细菌有植物根围促生细菌（PGPR）、穿刺巴氏杆菌（Pasteuria penetrans）、假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。这些植物内生细菌能够定殖在植物组织间，生存环境稳定，不易受到外界环境的影响，且对人畜无毒害，对环境友好，是重要的植物病害生防细菌资源。但是据可查资料，源于植物内生的解淀粉芽孢杆菌及其制剂的制备和利用该制剂对植物根结线虫进行防治的研究一直未见报道。
发明内容
本发明第一目的在于提供一种芽孢杆菌，第二目的在于提供一种以所述芽孢杆菌作为活性成分的菌剂，第三目的在于提供所述以芽孢杆菌作为活性成分的菌剂制备方法，第四目的在于提供所述菌剂在制备毒杀植物根结线虫药物中的应用。
本发明第一目的是这样实现的，所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2012年10月11日，保藏编号：CGMCC No.6663。所述解淀粉芽孢杆菌属于真细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
——解淀粉芽孢杆菌WY11的获得与鉴定
（1）解淀粉芽孢杆菌WY11的获得与鉴定
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌，是从烟草叶片中分离得到。烟草样品采自云南省玉溪市研和镇，采集长势良好无病烟株旺长期叶片，洗净后随即称取叶片0.4g，在70%酒精中振荡浸泡1min，再用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液振荡浸泡1min后，用无菌水冲洗4次。消毒后的组织与灭菌钢珠一并放入2ml灭菌离心管，加入600ul无菌水，用QIAGEN高通量组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。研磨后的母液采用梯度稀释法稀释后涂布平板，各单操作分别重复四次，在28℃下黑暗培养48h。挑取单菌落，重新于平板上划线纯化保存，其中长势旺盛者，定名为WY11菌株。
所用培养基配方：酵母浸出汁3.0g，牛肉浸膏1.0g，大豆蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂17.0g，蒸馏水1000mL，pH：7.0。
对上述分离的菌株WY11，通过生物学特性观察，进行进一步的形态鉴定，方法如下：
观察菌落的形态、大小、凹凸度、边缘，革兰氏染色，生理生化特征测试具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》。该菌16S rDNA序列扩增引物采用F27/R1492，扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
以上实验结果记录如下：
A、形态特征：菌体形状为杆状，菌体平均大小为0.5~1.5um×1.6~2.5um，革兰氏染色为阳性。内生芽孢，无鞭毛。
B、培养特征：在NA培养基上菌落呈白色，褶皱凸起，边缘不整齐。
C、生理生化特性：好氧生长，葡萄糖发酵阳性，淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，V.P试验阳性，接触酶反应阳性，甲基红反应阳性，硝酸盐还原试验阳性，柠檬酸盐利用阳性。
表1 菌株WY11的生理生化特征
| 生理生化特征 | WY11菌株 | ||
| D－葡萄糖 | ＋ | D－甘露糖 | ＋ |
| 淀粉水解 | ＋ | 酪氨酸水解 | - |
| 明胶水解 | ＋ | V-P反应 | ＋ |
| 接触酶 | ＋ | 甲基红 | ＋ |
| 硝酸还原 | ＋ | 2％ NaCl | + |
| 柠檬酸盐利用 | ＋ | 5% NaCl | - |
注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。
D、菌株的稳定性：该菌生长温度范围在12~48℃，最适宜生长温度为28~34℃，生长pH值在6.5~8，最适宜pH值为7。
E、16S rDNA序列分析：对该菌株进行16S rDNA序列测定，GenBank注册号：JQ936682.1，WY11菌株16S rDNA序列与假单胞菌属的菌株相似性达到99％。通过序列比对和生理生化特性将WY11菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
本发明所述的WY11菌株其16S rDNA序列见GenBank: JQ936682.1。
（2）解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株WY11为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的一个株系，命名为WY11，于2012年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100080），其保藏编号为CGMCC No.6663。
本发明第二目的是这样实现的，以所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11经斜面培养、种子培养、发酵并添加活性剂后制成的菌剂。
本发明第三目的是这样实现的，包括斜面培养、种子培养、发酵、液体菌剂制备、固体菌剂制备步骤，具体包括：
A、斜面培养：将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11接种到斜面培养基上，在温度为28~30℃下培养48h，得斜面菌种；
B、种子培养：将斜面菌种接种到液体培养基中，在温度为28~34℃下培养18~24h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按培养基体积3~5%的量接种入发酵罐，在28~34℃下培养36~48h，搅拌速度为120~150rpm，通气量5~10%，得到解淀粉芽孢杆菌WY11发酵液；
D、液体菌剂制备：在发酵液中添加0.16~0.6%的活性剂充分混匀，得到目标液体菌剂；
E、固体菌剂制备：在目标液体菌剂中加入吸附剂吸附经风干至水分含量重量比小于13%得到目标固体菌剂。
本发明第四目的是这样实现的，所述菌剂在制备毒杀植物根结线虫药物中的应用。
除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌和以所述解淀粉芽孢杆菌为活性成分的制剂可应用于植物根结线虫的防治，具有以下优点：
1、本发明所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11是一种高效生防细菌，以所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11为活性成分的制剂对植物根结线虫具有显著的毒杀作用，其液体制剂100倍稀释液对根结线虫的毒杀死亡率为100%。
2、本发明所述以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11为活性成分的制剂的制备方法简单易行，合理有效，成本低廉，有利于该制剂的工业化生产和应用普及。
3、本发明所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11及以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11为活性成分的制剂对人畜无毒，并且具有很强的环境适应性和环境友好性。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2012年10月11日，保藏编号：CGMCC No.6663。所述解淀粉芽孢杆菌属于真细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
本发明所述的芽孢杆菌为活性成分的菌剂，是以所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11经斜面培养、种子培养、发酵并添加活性剂后制成的菌剂。
所述的菌剂包括固体菌剂和液体菌剂。
本发明所述的芽孢杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，包括斜面培养、种子培养、发酵、液体菌剂制备、固体菌剂制备步骤，具体包括：
A、斜面培养：将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11接种到斜面培养基上，在温度为28~30℃下培养48h，得斜面菌种；
B、种子培养：将斜面菌种接种到液体培养基中，在温度为28~34℃下培养18~24h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按培养基体积3~5%的量接种入发酵罐，在28~34℃下培养36~48h，搅拌速度为120~150rpm，通气量5~10%，得到解淀粉芽孢杆菌WY11发酵液；
D、液体菌剂制备：在发酵液中添加0.16~0.6%的活性剂充分混匀，得到目标液体菌剂；
E、固体菌剂制备：在目标液体菌剂中加入吸附剂吸附经风干至水分含量重量比小于13%得到目标固体菌剂。
所述的斜面培养步骤中斜面培养基为营养琼脂培养基。
所述的种子培养步骤中液体培养基为体积百分比牛肉浸膏2~4%、蛋白胨0.4~0.6%、氯化钠0.4~0.6%，其余为水，pH值为6.5~8.0。
所述的发酵步骤中培养基为重量体积比豆饼粉1~2%、可溶性淀粉1~2%、牛肉浸膏0.5~0.8%、NaCNO30.02~0.04%、CaCO30.1~0.3%，其余为水。
所述的活性剂为体积比0.05~0.2%腐植酸钠、0.01~0.1%壳聚糖或0.1~0.3%几丁质中的一种或几种。
所述的固体菌剂制备步骤中吸附剂为硅藻土、草炭或活性炭的一种或几种。
本发明所述的芽孢杆菌为活性成分的菌剂的应用为所述菌剂在制备毒杀植物根结线虫药物中的应用。
解淀粉芽孢杆菌菌剂制备：
a. 斜面培养：培养基为营养琼脂培养基，28～30℃保温培养48ｈ。
b. 摇瓶种子培养：将解淀粉芽孢杆菌WY11斜面菌种接种到配方（体积百分比）为牛肉膏3%、蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%、其余为自来水、pH 6.5-8.0的摇瓶培养液中，在 28－34℃温度、摇瓶转速为150rpm的条件下培养18－24h，获得液体发酵种子。
c. 液体发酵工艺：将发酵种子接种到装有液体培养基配方(g/L)：豆饼粉10-20、可溶性淀粉10-20、牛肉浸膏5-8、NaCNO3 0.2-0.4、CaCO3 1-3，发酵温度28～34℃、接种量3～5％，发酵罐搅拌速度120～150 rpm，通气量5～10％，发酵时间为36～48h的条件下得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；上述接种量和通气量的百分比为体积百分比。
d. 液体制剂制备：液体发酵后，发酵液中添加0.05-0.2％腐植酸钠，0.01-0.1％壳聚糖和0.1-0.3％几丁质而制成解淀粉芽孢杆菌WY11液体制剂。液体制剂中的腐植酸钠可以促进植物的生长，壳聚糖和几丁质有利于促进植物根际微生物菌群的繁殖，提高植物本身的抗性。
e. 固体制剂制备：上述液体制剂中添加等比例的草炭、硅藻土，然后进行风干，至水分含量小于13％（w/w）即成解淀粉芽孢杆菌WY11固体制剂。
本发明的解淀粉芽孢杆菌菌剂作为微生物农药毒杀植物根结线虫。
本发明的优点在于：1.本发明所用菌种为芽孢杆菌，芽孢耐高温和干燥等不利环境条件，利于菌剂的加工、运输和储存。2.发酵周期短，制备成本低，节约能源。3.具有良好的毒杀植物根结线虫功能，改善植物根微生态环境，促进植物生长。
下面通过实施例加以说明：
实施例1
——以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的制剂的制备
A、斜面培养：将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11接种到琼脂培养基上，在30℃下培养48h，获得斜面菌种。
B、种子培养：将上述斜面菌种接入种子培养液中，30℃下培养24h，摇瓶转速为150rpm，得到液体发酵种子。种子培养液成分：牛肉浸膏3%，、蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%，其余为水，pH值为7。
C、液体发酵培养：按5%的接种量，将上述液体发酵种子接种到装有液体发酵体系的发酵罐中，在32℃下培养48h，搅拌速度为150rpm，通气量8%，得到解淀粉芽孢杆菌WY11发酵液，发酵悬浮液的活菌含量为1.3×109个/ml。发酵培养基成分：豆饼粉1.5%、可溶性淀粉1.5%、牛肉浸膏0.7%、NaCNO30.03%、CaCO30.2%，其余为水。
D、制剂制备：取上述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11添加体积比0.05~0.2%腐植酸钠、0.01~0.1%壳聚糖和0.1~0.3%几丁质充分混匀，制成液体制剂。
实施例2
——以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的制剂的制备
与实施例1基本相同，不同之处在于：A、斜面培养的温度为28℃。B、种子培养的温度为28℃，时间为18h，摇瓶转速为120rpm。种子培养液pH值为6.5。C、液体发酵培养按3%接种，温度为28℃，时间为36h，搅拌速度为120rpm，通气量5%。发酵培养基成分为：豆饼粉1%、可溶性淀粉1%、牛肉浸膏0.5%、NaCNO30.02%、CaCO30.1%。
实施例3
——以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的制剂的制备
与实施例1基本相同，不同之处在于：A、斜面培养的温度为28℃。B、种子培养的温度为34℃，时间为18h，摇瓶转速为130rpm。种子培养液pH值为8。C、液体发酵培养按4%接种，温度为34℃，时间为40h，搅拌速度为130rpm，通气量10%。发酵培养基成分为：豆饼粉2%、可溶性淀粉2%、牛肉浸膏0.8%、NaCNO30.04%、CaCO30.3%。
实施例4
——以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的制剂的制备
与实施例2基本相同，不同之处在于：将实施例2中的液体制剂进一步混入草炭1份，风干至含水率为12%，制成固体制剂。
实施例5
——以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的制剂的制备
与实施例2基本相同，不同之处在于：将实施例2中的液体制剂进一步混入硅藻土1份，风干至含水率为9%，制成固体制剂。
实施例6
——以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的液体制剂对植物根结线虫的毒杀实验
以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的液体制剂的制备同实施例2。
根结线虫的分离采用贝曼漏斗法进行，获得根结线虫的二龄幼虫。将分离的根结线虫添加到解淀粉芽孢杆菌液体制剂的100倍稀释液中，以等量的水为对照，室温放置1h观测线虫存活和死亡数量，结果见表2。结果表明，在对照中，根结线虫二龄幼虫的死亡率是4.41％，而解淀粉芽孢杆菌液体制剂的100倍稀释液的处理根结线虫二龄幼虫的死亡率达到了100％，由此可见，以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的液体制剂对根结线虫二龄幼虫具有强烈的毒杀效果。
表2解淀粉芽孢杆菌液体制剂对根结线虫的毒杀效果
| 处理液 | 活虫数（条） | 死虫数（条） | 死亡率（％） |
| 水 | 65 | 3 | 4.41 |
| WY11液体制剂 | 1 | 85 | 100 |
实施例7
——以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的液体制剂对植物根结线虫的毒杀实验
以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的液体制剂的制备同实施例5。
烤烟品种为红花大金元，根结线虫接种方式为病土接种，烤烟移栽时每株烟施用解淀粉芽孢杆菌固体制剂2g，以不施用制剂为对照。移栽后60天挖根调查烟草根结线虫病的病情指数，结果见表3。经过解淀粉芽孢杆菌固体制剂处理的烟草根结线虫病情指数为23.2％，而没有施用该制剂的空白对照病情指数达到了65.3％，由此可见，以解淀粉芽孢杆菌WY11为活性成分的固体制剂对烟草根结线虫病的防治效果为64.5％。
表3 解淀粉芽孢杆菌固体制剂对根结线虫的防治效果
| 处理 | 病情指数 | 防治效果（％） |
| CK | 65.3 | － |
| WY11固体制剂 | 23.2 | 64.5 |
Claims (9)
1. 一种以芽孢杆菌为活性成分的菌剂，其特征在于所述的芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2012年10月11日，保藏编号：CGMCC No. 6663；所述解淀粉芽孢杆菌属于真细菌界，后壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属；所述的菌剂是以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11经斜面培养、种子培养、发酵并添加活性剂后制成的菌剂。
2. 根据权利要求1所述的以芽孢杆菌为活性成分的菌剂，其特征在于所述的菌剂包括固体菌剂和液体菌剂。
3. 一种权利要求1所述的以芽孢杆菌为活性成分菌剂的制备方法，其特征在于包括斜面培养、种子培养、发酵、液体菌剂制备、固体菌剂制备步骤：
A、斜面培养：将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）WY11接种到斜面培养基上，在温度为28~30℃下培养48h，得斜面菌种；
B、种子培养：将斜面菌种接种到液体培养基中，在温度为28~34℃下培养18~24h，得液体发酵种子；
C、发酵：将液体发酵种子按培养基体积3~5%的量接种入发酵罐，在28~34℃下培养36~48h，搅拌速度为120~150rpm，通气量5~10%，得到解淀粉芽孢杆菌WY11发酵液；
D、液体菌剂制备：在发酵液中添加0.16~0.6%的活性剂充分混匀，得到目标液体菌剂；
E、固体菌剂制备：在目标液体菌剂中加入吸附剂吸附，经风干至水分含量重量比小于13%得到目标固体菌剂。
4. 根据权利要求3所述的以芽孢杆菌为活性成分菌剂的制备方法，其特征在于所述的A步骤中斜面培养基为营养琼脂培养基。
5. 根据权利要求3所述的以芽孢杆菌为活性成分菌剂的制备方法，其特征在于所述的B步骤中液体培养基为体积百分比牛肉浸膏2~4%、蛋白胨0.4~0.6%、氯化钠0.4~0.6%，其余为水，pH值为6.5~8.0。
6. 根据权利要求3所述的以芽孢杆菌为活性成分菌剂的制备方法，其特征在于所述的C步骤中培养基为重量体积比豆饼粉1~2%、可溶性淀粉1~2%、牛肉浸膏0.5~0.8%、NaNO3 0.02~0.04%、CaCO3 0.1~0.3%，其余为水。
7. 根据权利要求1或3所述的以芽孢杆菌为活性成分菌剂的制备方法，其特征在于所述的活性剂为体积比0.05~0.2%腐植酸钠、0.01~0.1%壳聚糖或0.1~0.3%几丁质中的一种或几种。
8. 根据权利要求1所述的以芽孢杆菌为活性成分菌剂的制备方法，其特征在于所述的E步骤中吸附剂为硅藻土、草炭或活性炭的一种或几种。
9. 一种权利要求1或2所述的以芽孢杆菌为活性成分菌剂的应用，其特征在于所述菌剂在制备毒杀植物根结线虫药物中的应用。
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