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CN102883740B - 用于使hiv失活并阻断hiv的双功能分子 - Google Patents

用于使hiv失活并阻断hiv的双功能分子 Download PDF

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CN102883740B CN201180022594.0A CN201180022594A CN102883740B CN 102883740 B CN102883740 B CN 102883740B CN 201180022594 A CN201180022594 A CN 201180022594A CN 102883740 B CN102883740 B CN 102883740B
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Abstract

本文中公开了双功能分子，其甚至能在病毒攻击靶细胞之前使人类免疫缺陷病毒(HIV)失活并抑制HIV进入靶细胞。还公开了用于治疗被HIV感染的患者的新颖抗-HIV疗法。还公开了用于对HIV预防和对HIV感染治疗的方法。

Description

用于使HIV失活并阻断HIV的双功能分子
与相关申请的交叉引用
本申请基于35 USC§119(e)要求于2011年5月3日提交的美国临时专利申请61/330,787的权益，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于治疗人类免疫缺陷病毒-相关的疾病的肽化合物。
发明背景
截至2007年底，全世界约3320万人受到人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，超过2500万人死于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。因而，迫切需要发现和开发针对HIV感染的新治疗策略。目前，美国食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration of the United States)批准了28种抗-HIV药物来治疗感染HIV的人们，所述药物包括15种逆转录酶抑制剂(RTI)、10种蛋白酶抑制剂(PI)、一种整合酶抑制剂(II)和两种进入抑制剂(EI)。所有的RTI，PI和II在病毒进入宿主细胞后抑制HIV复制。两种EI可阻断HIV进入宿主细胞，但它们不能在HIV附在靶标细胞上之前使病毒失活。
EI之一是基于HIV包膜蛋白(Env)跨膜亚基gp41C-末端七肽重复(CHR)区域的序列设计的合成肽，命名为T20(恩夫韦肽，)，其通过靶向gp41抑制HIV与宿主细胞融合。T20通过靶向HIV包膜蛋白(Env)gp41抑制HIV进入，所述HIV包膜蛋白(Env)gp41由融合肽(FP)以及N-末端七肽重复和C-末端七肽重复(NHR和CHR)组成(图1)。在天然状态下，gp41是难以接近的，因为其埋在HIV包膜蛋白gp120的下面。HIV感染过程开始时，gp120与靶细胞上的CD4结合，引起gp41改变构象：(1)FP插入靶细胞膜；(2)NHR联合形成NHR-三聚物和(3)CHR与NHR-三聚物相互作用以形成发夹样六-螺旋束(6-HB)，其使病毒和细胞膜达到对于融合而言必要的密切接近。T20和另一种CHR肽(CP)C34可与病毒gp41NHR-三聚物结合并阻断6-HB形成，导致HIV融合的抑制。但是，T20不能在病毒附在靶细胞上之前使在血液中循环的HIV失活，因为T20仅能在病毒开始与靶细胞上的CD4的接触之后与HIV相互作用。因为这些间题，T20肽必须在HIV/AIDS患者的血液中以恒定的高浓度保持。因而，T20不得不以90mg/剂量每天注射两次而被施用，导致大多数患者注射部位的疼痛反应和对患者而言高的花费(＞$20,000/年/患者)。因而，T20在发展中国家使用是过于昂贵的。因而，需要用于治疗HIV感染和AIDS的改进的药物。
附图简述
图1描绘了gp41功能结构域的示意性图。残基数目对应于其在HIV-1HXB2 gp160中的位置。FP，融合肽；TR，色氨酸富集区；TM，跨膜结构域；CP，细胞质结构域。
图2描绘了在gp41的N-末端七肽重复(NHR)和C-末端七肽重复(CHR)之间以及在N-肽和C-肽之间的相互作用。在NHR和CHR之间的虚线表示在位于NHR的e和g位置的残基和位于CHR中a和d位置的残基之间的相互作用。
图3描绘了gp41-介导的HIV融合和NHR-结合蛋白(NBP)和双功能分子——2D-NBP的作用机制的模型。NBP(例如，C46、C34、T1144和T20)与gp41 NHR结合，导致HIV与靶细胞融合的抑制(iii)。2D-NBP通过其2D结构域与gp120结合，并通过NBP结构域与gp41 NHR相互作用，导致不可逆的HIV失活(i)。像NBP一样，2D-NBP也可抑制病毒与靶细胞融合(ii)。
图4描绘了gp41-介导的HIV融合和CHR-结合蛋白(CBP)与双功能分子——2D-CBP的作用机制的模型。CBP(例如，N46和N36)与gp41 CHR结合，导致HIV与靶细胞融合的抑制(iii)。2D-CBP通过其2D结构域与gp120结合，并通过CBP结构域与gp41 CHR相互作用，导致不可逆的HIV失活(i)。像CBP一样，2D-CBP也可抑制病毒与靶细胞融合(ii)。
图5描绘了gp41-介导的HIV融合和FP-结合蛋白(FBP)与双功能分子——2D-FBP的作用机制的模型。FBP(例如，VIRIP-1)与gp41 FP结合，导致HIV与靶细胞融合的抑制(iii)。2D-FBP通过其2D结构域与gp120结合，并通过FBP结构域与gp41 NHR相互作用，导致不可逆的HIV失活(i)。像FBP一样，2D-FBP也可抑制病毒与靶细胞融合(ii)。
图6描绘了经纯化的2D和2D-NBP8的SDS-PAGE(图6A)和Western印迹(图6B和6C)分析。
图7描绘了2D(sCD4的D1D2结构域)的生物学特征。针对CD4的多克隆抗体(T4-4)、构象-依赖型Sim.4单克隆抗体和针对NBP8的多克隆抗体用来检测结合的重组体2D分子。
图8描绘了2D-NBP8的生物学特征。针对CD4的多克隆抗体(T4-4)、构象-依赖型Sim.4单克隆抗体和针对NBP8的多克隆抗体用来检测结合的重组体2D-NBP8分子。
图9描绘了2D和2D-NBP8与重组体gp120的结合活性。
图10描绘了2D和2D-NBP8与5-螺旋的结合活性。
图11描绘了2D和2D-NBP8的功能活性。如通过流式细胞计量分析检测的，2D(图11B和11F)和2D-NBP8(图11C和11G)都具有在表面CHO-WT上与野生型gp120/gp41结合的能力(图11E-H)。包括了作为对照的不表达gp120/gp41的CHO-EE(图.11A-D)。图11A和11E描绘了sCD4对照并且图11D和11H描绘了NBP8对照。
图12描绘了通过表面等离子体共振(SPR)分析的2D和2D-NBP8的结合亲和性。图12A：2D与gp120结合。图12B：2D-NBP8与gp120结合。图12C：NBP8与gp120结合。
图13描绘了在ELISA检验中2D-NBP8对6-HB形成的抑制作用。
图14描绘了在荧光非变性-PAGE检验(FN-PAGE)中2D-NBP8对6-HB形成的抑制作用。图14A和14C：FN-PAGE分析。图14B和14D：FN-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色。
图15描绘了如通过p24检验测定的，MT-2细胞中，2D和2D-NBP8对经实验室适应的HIV-1IIIB毒株(亚型B，X4)的感染的抑制。
图16描绘了如通过荧光素酶检验测定的，M7细胞中，2D和2D-NBP8对HIV-1 Bal毒株(亚型B，R5)的感染的抑制。
图17描绘了如通过p24检验测定的，MT-2细胞中，通过实验适应的HIV-1IIIB毒株(亚型B，X4)的2D、2D-NBP8、NBP8和T20的病毒失活活性。
图18描绘了如通过荧光素酶检验测定的，M7细胞中，通过HIV-1Bal毒株(亚型B，R5)的2D、2D-NBP8、NBP8和T20的病毒失活活性。
图19描绘了在4℃(图19A)下和25℃下(图19B)，通过与暴露的N-HR结构域相互作用，2D-活化的包膜糖蛋白中间产物的通过2D-NBP8的去稳定性作用。
图20描绘了通过2D活化的结合细胞的病毒的感染性的抑制。
发明内容
本文中公开的双功能分子(命名为2D-CP)含有：(i)可溶的CD4(sCD4)或sCD4的D1D2结构域(2D)，其可与gp120结合以触发gp41中的构象改变，导致NHR、CHR和FP暴露；(ii)可分别与gp41NHR、CHR或FP相互作用的NHR-结合肽、CHR-结合肽或FP-结合肽(CP)；(iii)由10至40个氨基酸((GGGGS)n，其中n＝2-8)组成的柔性连接物以连接2D和CP，使得这两个功能结构域可自由移动以结合HIV或HIV-感染的细胞上的对应靶蛋白。
这些双功能分子甚至能在病毒攻击靶细胞之前使HIV失活并抑制HIV进入靶细胞。这些分子还可被开发作为新颖抗-HIV疗法，所述疗法通过不同于当前抗-HIV药物的作用机制用于治疗感染HIV(包括非-B和多种药物抗性毒株)的患者。
在本文公开的一种实施方式中，提供了包含下述多肽的药物组合物，所述多肽包含第一结构域，其包含可溶的CD4或可溶的CD4的一部分；第二结构域，其包含从由N-末端七肽重复(NHR)-结合肽、C-末端七肽重复(CHR)-结合肽和融合肽(FP)-结合肽组成的组中选择的人类免疫缺陷病毒(HIV)gp41功能结构域-结合序列；和连接第一结构域的氨基酸序列和第二结构域的氨基酸序列的柔性连接物，其中连接物包含氨基酸序列(GGGGS)n，其中n是在2和8之间的整数。
在另一种实施方式中，可溶CD4的一部分包含sCD4的D1D2结构域。在另一种实施方式中，NHR-结合肽从由C46、C38、C36、C34、C28、C51、西夫韦肽、T1144、CP621-652、CP32M、T1249、PBD-4HR、CBD1和T20组成的组中选择；CHR-结合肽从由N46、N36、N34、N51、DP107、N17和N28组成的组中选择；FP-结合肽从由VIRIP164、VIRIP165、VIRIP353和VIRIP576组成的组中选择。
还在另一种实施方式中，多肽包含从由SEQ ID NOs：37-62组成的组中选择的氨基酸序列。
还在另一种实施方式中，组合物还包括至少一种药学上可接受的赋形剂。
在本文中公开的一种实施方式中，提供了治疗病毒感染的方法，其包括给暴露于HIV感染的个体施用有效剂量的公开的药物组合物；使HIV失活并阻断HIV进入靶细胞，从而治疗病毒感染。在另一种实施方式中，药物组合物包含下述多肽，所述多肽包含从由SEQ ID NOs：37-62组成的组中选择的氨基酸序列。
在本文公开的一种实施方式中，提供了预防病毒感染的方法，其包括给已暴露于HIV或将暴露于HIV的个体施用有效剂量的公开的药物组合物；使HIV失活并阻断HIV进入靶细胞，从而预防病毒感染。在另一种实施方式中，药物组合物被局部施用，以预防HIV的性传播。还在另一种实施方式中，药物组合物包含下述多肽，所述多肽包含从由SEQ IDNOs：37-62组成的组中选择的氨基酸序列。
发明详述
本文中公开的双功能分子(命名为2D-CP)含有：(i)包含可溶的CD4(sCD4)或sCD4的D1D2结构域(2D)的第一结构域，其可与gp120结合以触发gp41的构象改变，导致gp41N-末端七肽重复(NHR)、C-末端七肽重复(CHR)或融合肽(FP)暴露；(ii)包含NHR-结合肽、CHR-结合肽或FP-结合肽(CP)的第二结构域，其可分别与gp41 NHR-、CHR-或FP相互作用；(iii)和由10至40个氨基酸((GGGGS)n，其中n＝2-8)组成的柔性连接物，以连接第一结构域(2D)和第二结构域(CP)，使得这两个功能结构域可自由移动以结合在人类免疫缺陷病毒(HIV)或HIV-感染的细胞上的对应靶蛋白。这种设计的分子在E.coli或293T细胞中表达，通过色谱纯化并在HIV-介导的细胞-细胞融合和HIV复制上测试其抑制活性，以及测试其使无细胞的HIV和伴随细胞的HIV失活的能力。
本文中公开了一系列双功能分子，命名为D1D2-NHR-结合肽(2D-NBP)、D1D2-CHR-结合肽(2D-CBP)和D1D2-FP-结合肽(2D-FBP)，其通过经由2D(可溶的CD4的D1D2结构域)和NBP、CBP或FBP，分别与gp120和gp41NHR、CHR或FP结合使HIV失活，和/或通过经由其NHR、CHR或FP结构域与gp41前发夹中间结构相互作用来抑制HIV融合并进入靶细胞。这些杂交分子可作为双重保护，因为1)它们在病毒开始与靶细胞接触之前杀死HIV；和2)万一病毒逃脱分子的第一次攻击的话，它们在病毒附着在细胞上之后阻断HIV进入靶细胞。
公开的双功能分子具有将被开发为在发展中国家和发达国家都可使用的新颖抗-HIV疗法的大的潜力。对比当前的抗-HIV药物，2D-CP具有唯一作用机制，即使HIV失活。因为它们的作用机制不同于临床使用中的其他抗-HIV药物的作用机制，2D-CP被期望对具有多种药物抗性的HIV分离物有效。2D-CP与其他抗-HIV药物的组合可具有协同抗-HIV作用。对比T20肽，2D-CP具有更高的体内功效，因为它们可在任何给定时间下使在血液中循环的HIV失活并还可抑制HIV融合和进入。作为对比，T20仅可在短暂的时间窗(＜20分钟)期间，即在由gp120与CD4+靶细胞结合触发的从天然至中间状态的gp41的构象改变期间抑制HIV融合。因此，可需要比T20更低剂量且较不频繁注射的2D-CP来消除血液中的HIV或减少病毒载量。因而，对患者而言，2D-CP较不昂贵并且使得他们更少地遭受注射部位反应。而且，作为重组蛋白的2D-CP可比合成肽T20具有更低的生产成本(因为它们可大规模表达)和更高的稳定性和半衰期(因为其较大的分子大小)并因而期望对发展中国家而言是更为负担得起的。
示例性的CP包括但不限于，C46(SEQ ID NO：6)、C38(SEQ IDNO：7)、C36(SEQ ID NO：8)、C34(SEQ ID NO：4)、C28(SEQ ID NO：9)、C51(SEQ ID NO：10)、西夫韦肽(SEQ ID NO：11)、T1144(SEQ IDNO：12)、C35-EK(SEQ ID NO：63)、CP621-652(SEQ ID NO：13)、CP32M(SEQ ID NO：14)、T1249(SEQ ID NO：15)、PBD-4HR(SEQ ID NO：16)、CBD1(SEQ ID NO：17)、T20(SEQ ID NO：5)、N46(SEQ ID NO：18)、N36(SEQ ID NO：1)、N34(SEQ ID NO：19)、N51(SEQ ID NO：20)、DP107(SEQID NO：21)、N17(SEQ ID NO：22)、N28(SEQ ID NO：2)、VIRIP164(SEQ IDNO：23)、VIRIP165(SEQ ID NO：24)、VIRIP353(SEQ ID NO：25)和VIRIP576(SEQ ID NO：26)。
另外，本文公开了药物组合物，其与SEQ ID NOs：37-62的氨基酸序列具有85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。关于此类序列的同一性或同源性在本文中被定义为：在比对序列且如果必要的话引入缺口以实现最大百分比同源性之后，并且不将任何保守置换考虑为序列同一性的一部分，候选序列中的氨基酸残基与SEQ ID NOs：37-62等同的百分比。融合蛋白或N-末端、C-末端或内部延伸、缺失或插入肽序列不应解释为影响同源性。
因此，本文中公开的蛋白包括具有SEQ ID NOs：37-62的氨基酸序列的分子；氨基酸序列变体，其中一个或多个氨基酸残基已插入至公开的编码序列的N-或C-末端或公开的编码序列内；已被置换至少一个残基的所公开序列的氨基酸序列变体或如上文定义的其片段。此类片段还称为肽或多肽，可含有抗原区域、经鉴定作为对应于已知蛋白结构域的氨基酸序列区域的蛋白功能区域以及明显的亲水性区域。通过使用商购的蛋白序列分析软件比如MacVector(Oxford Molecular)，所述区域都是可容易鉴定的。
本文中使用时，将肽中的氨基酸残基指定为在括弧中的氨基酸之间有斜杠的超过一种氨基酸(使用常用的单字母的氨基酸代码)，表示任何指出的氨基酸或其模拟物(除非特别声明除去)可占据所述残基。例如，(I/L/V)(T/S/A/V/C)表示第一残基可以是异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸之任一，且第二残基可以是苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸或半胱氨酸或模拟物之任一。
公开的肽的氨基酸残基包括保守氨基酸置换。例如，可制造保守氨基酸改变，其尽管改变蛋白或肽的初级序列，但通常不会改变其功能。保守氨基酸置换典型地包括在下述组内的置换：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。
本发明还涉及药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的可抑制HIV进入靶细胞的上述双功能肽。
公开的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可取决于预期的具体用途而改变。适当剂量或施用途径的测定完全在普通技术人员的能力范围内。动物实验提供了用于测定人疗法有效剂量的可靠指南。有效剂量的物种间按比例换算(interspecies scaling)可以按照Mardenti，J.和Chappell，W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”，Toxicokinetics and NewDrug Development，Yacobi et al，Eds.，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96规定的原则进行。本文中使用的术语“治疗上有效的”量是指进行疾病例如感染性疾病的具体治疗所需的量。“治疗”既包括指治疗性治疗也包括预防性手段，其中目的是预防或减缓(减轻)目标病理学状况或疾病。需要治疗的个体包括已经患有疾病的个体，以及易于患病的个体，或要预防疾病的个体。在一个实施方式中，疾病是存在的。在另一实施方式中，由于本文所述的方法，细胞或个体的寿命被延长。
2D-CP具有被开发作为用于治疗被HIV(包括非-B和多种药物抗性毒株)感染的患者的新颖抗-HIV疗法、作为HIV感染的暴露前和暴露后预防的预防性用药、作为预防HIV性传播的杀微生物剂的潜能。
不需要过多的实验就可以将上述化合物用于施用给哺乳动物(包括人)，以适合具体的应用。另外，使用标准的剂量-应答方案，不需要过多的实验就可以确定组合物的适当剂量。
因此，通过本领域公知的手段，例如使用惰性稀释剂或药物可接受的载体，不需要过多的实验就可制造被设计用于口、鼻、舌、舌下、颊、颊内、静脉内、皮下、肌内和肺施用的组合物。组合物可被封装在明胶胶囊中或压缩成片剂。就口服治疗施用的目的而言，药物组合物可与赋形剂掺合，并以片剂、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄饼(wafers)、口香糖等等形式使用。“药学上可接受的载体”表示任何标准的药物载体。合适载体的例子是本领域公知的，可包括但不限于任何标准的药物载体，如磷酸盐缓冲的盐溶液、含有Polysorb 80的磷酸盐缓冲的盐水、水、乳液如油/水乳液，和多种类型的湿润剂。其它载体也可包括无菌溶液、片剂、有涂层的片剂和胶囊。典型地，此类载体含有赋形剂如淀粉、奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或硬脂酸盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或植物油、胶质、二醇或其它已知的赋形剂。此类载体也可以包含香料和着色添加剂或其它成分。包含此类载体的组合物通过公知的常规方法配制。
片剂、丸剂、胶囊、糖锭等等也可含有粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜化剂和调味剂。粘合剂的一些例子包括微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶。赋形剂的例子包括淀粉或乳糖。崩解剂的一些例子包括褐藻酸、玉米淀粉等等。润滑剂的例子包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。助流剂的例子是胶体二氧化硅。甜味剂的一些例子包括蔗糖、糖精等等。调味剂的例子包括薄荷、水杨酸甲酯、橙味香料等等。制备这些多种组合物中使用的材料应当是药物纯的，并且在使用的用量下无毒。
可以便利地肠胃外施用化合物，例如通过静脉内、肌肉、鞘内或皮下注射。可以通过将化合物掺入溶液或悬浮液中，来完成肠胃外施用。此类溶液或悬浮液也可以包括无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。肠胃外配制物也可以包含抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，和螯合剂如EDTA。也可以添加缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管中。
直肠施用包括向直肠或大肠内施用药物组合物中的化合物。这可以使用栓剂、灌肠剂、凝胶、霜剂、片剂等等来完成。可以通过本领域已知的方法容易地制造栓剂配制物。类似地，可以配制阴道施用形式，包括栓剂、凝胶、灌肠剂、霜剂、片剂、环等等。组合物可以旨在以例如栓剂的形式用于直肠或阴道施用，所述栓剂会在直肠中融化并释放药物。用于直肠或阴道施用的组合物可含有油脂性的基质作为合适的非刺激性的赋形剂。此类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。对栓剂的制备而言低熔点蜡是优选的，其中脂肪酸甘油酯和/或可可脂的混合物是合适的蜡。可以将蜡融化，并通过搅拌将环己胺化合物均匀地分散在其中。然后将熔融的均匀混合物倒入便利的一定尺寸的模具中，使其冷却从而固化。
旨在用于局部施用的公开的组合物可以适当地包括溶液、乳液、软膏剂、霜剂或凝胶基质。基质可例如包括以下一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和醇，和乳化剂与稳定剂。增稠剂可存在于用于局部施用的药物组合物中。
经皮施用包括组合物通过皮肤的经皮吸收。经皮配制物包括贴片、离子电渗装置、软膏剂、霜剂、凝胶、油膏剂(salves)等等。
组合物可包括修饰固体或液体剂量单位的物理形式的多种材料。例如，组合物可包括在活性成分周围形成涂层的材料。形成涂层壳的材料可典型地是惰性的，并且可以选自例如糖、紫胶和其他肠涂层试剂。或者，活性成分可以被包装在明胶胶囊或扁胶囊中。
实施例
实施例1
双功能分子2D-NBP8的表达和纯化
为了产生表达质粒p2D-NBP8-PDI，通过三步重叠PCR，将编码2D、35-mer连接物(GGGGS)7(SEQ ID NO：34)和NBP8(SEQ NO：12)的DNA片段连接在一起。第一，使用如在表1中描绘的对应的引物对，通过重叠PCR产生2D(具有6-his标签)、L35和NBP8 DNA片段。第二，用引物FL35和RNBP8，通过重叠PCR将编码L35和NBP8的DNA片段连接。第三，用DNA片段2D以及引物F2Dhis和RNBP8，通过重叠PCR，将编码2D和L35-NBP8的两条DNA片段连接。最后，通过BamHI和EcoRI消化编码NBP8-L35-T20的扩增的DNA片段并插入表达载体pGEX-6p-1中以产生p2D-NBP8质粒。为了防止在E.coli中形成包涵体，将在N末端具有精确蛋白酶位点(称为pp酶位点)的蛋白二硫键异构酶(PDI)DNA序列(aa18-508)插入位于质粒p2D-NBP8中的His-2D-NBP8基因的C末端处的EcoR I和Xho I位点中，以延伸GST-his-2D-NBP8阅读框并导致嵌合的GST-his-2D-NBP8-ppase-PDI的产生。该质粒被称为p2D-NBP8-PDI。通过DNA测序证实这些序列。
表1.用于构建表达载体，pTLT-1的引物
*加下划线的序列是用于将基因克隆进载体pGEX-6p-1的限制性酶位点。
为了表达2D-NBP8融合蛋白，用p2D-NBP8-PDI转化E.coli菌株Rosetta 2(DE3)pLysS(Novagen)，并在37℃下培养至OD600＝0.4，然后在16-22℃下诱导8-12hr。收获细胞并在蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的存在下通过超声裂解。离心之后，收集含有GST-his-2D-NBP8-PDI融合蛋白的上清液。然后用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲和柱纯化蛋白并用PreScissionTM蛋白酶(GE Healthcare)切割来从GST和PDI中释放双功能蛋白。然后通过His-结合纯化试剂盒(Novagen)和快速蛋白液相色谱(FPLC)纯化双功能蛋白并通过SDS-PAGE分析。
最初设计的双功能蛋白由185-mer的2D(KKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLAFQKASSI；SEQ ID NO：33)、35-mer的连接物[(GGGGS)7；SEQ ID NO：34)]和38-mer的NBP8(TTWEAWDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL；SEQ ID NO：12)组成。对得到的载体测序表明在N-末端具有十一个额外的氨基酸残基(GPLGSHHHHHH；SEQ ID NO：35)且在C-末端具有八个额外的氨基酸残基(EFLEVLFQ；SEQ ID NO：36)。通过SDS-PAGE，纯化的双功能蛋白具有约30kD的分子量(图6)。
实施例2
双功能分子2D-NBP8的表征
如先前所述的(Papanikolopoulou K，et al.J.Biol.Chem.279：8991-8998，2004)，通过SDS-PAGE和western印迹来分析重组体双功能蛋白2D-NBP8。简而言之，将5μl/孔的100μM 2D或2D-NBP8与4×SDS样品缓冲液(Novagen)混合。样品煮沸5min或保持在室温(RT)下，之后装载到10-20％Tricine-甘氨酸凝胶(Invitrogen)上。在4℃下在有125V恒压的SDS-PAGE运行缓冲液中进行电泳。用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen)对凝胶染色。在western印迹中，使用了抗-人CD4多克隆抗体(Immuno#7301)和抗-NBP8多克隆抗体。如所期望的，结果显示了2D-NBP8具有约30KD的分子量并且可被两种特异性抗体检测到。(图6)
如先前所述的，通过ELISA分析重组体双功能蛋白2D-NBP8(Jiang S，et al.J.Virol.72：10213-10217，1998)。简而言之，将2D和2D-NBP8涂覆至96-孔聚苯乙烯平板(Costar)(在0.1M Tris-Hcl中10μg/ml，pH 8.8)并用在PBS中的2％无脂乳封闭。然后用针对CD4的多克隆抗体(T4-4)、针对CD4的构象-依赖型单克隆抗体(Sim.4)和抗-NBP8多克隆抗体孵育60分钟，并添加辣根过氧化物酶(HRP)第二抗体(ZYMED Laboratories)。用洗涤缓冲液(含有0.01％Tween 20的PBS)对平板洗涤五次。连续添加底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma)。使用ELISA检测仪(Ultra 384，Tecan)在450nm(A450)下测量吸光度。如所期望的，结果显示可溶的2D-NBP8可被所有的特异性抗体检测到。(图7-8)
实施例3
如通过ELISA显示的2D-NBP8与gp120和NHR的结合
通过先前所述的ELISA(Huang JH et al.2006.FEBS Letter.580：4807-14)，检测2D-NBP8与gp120和NHR的结合。简而言之，将测试的蛋白涂覆在96-孔聚苯乙烯平板(0.1M Tris-Hcl中10μg/ml，pH 8.8)上并用在PBS中的2％无脂乳封闭。然后用生物素标记的gp120或5-螺旋(在PBS中为2μg/ml)在37℃下孵育平板30min。将平板用洗涤缓冲液(含有0.01％Tween 20的PBS)洗涤五次。然后，用标记链霉亲和素的辣根过氧化物酶(HRP)(SA-HRP)(ZYMED Laboratories)孵育平板并将平板洗涤五次。然后添加底物TMB并使用ELISA检测仪在450nm(A450)下测量吸光度。如图9-10中所示的，检测2D-NBP8和gp120之间以及2D-NBP8和5-螺旋(模拟NHR分子)之间的功能性结合。
实施例4
如通过流式细胞计量检测的在细胞表面上2D-NBP8与天然gp120/gp41的 结合
如先前所述的(Jiang S.et al.)，通过流式细胞计量检测在细胞表面上的2D-NBP8与天然gp120/gp41的结合。简而言之，将CHO-EE(无包膜蛋白)和CHO-WT(具有包膜蛋白)分离并用洗涤缓冲液(含有5％GBS的PBS)洗涤三次。然后将它们用测试蛋白在4℃下孵育1hr。洗涤三次后，在4℃下将抗-人CD4多克隆抗体(Immuno #7301)和抗-NBP8多克隆抗体添加达1hr。洗涤三次后，添加FITC-轭合的抗-兔或鼠抗体并在4℃下孵育1hr。至少洗涤三次后，通过流式细胞计量检查细胞并通过FACSCalibur(Becton Dickinson)记录荧光强度。如图11中所示的，2D-NBP8可如sCD4一样与在效应细胞上表达的天然HIV Env功能性结合。
实施例5
如通过SPR测量的D-NBP8与gp120的结合亲和性
遵循如先前所述的生物分子相互作用分析(BIA)技术手册(Lu，L et al.Journal of Biological Chemistry 283：16723-16731)，使用BIAcore3000系统(Pharmacia)，通过表面等离子体共振(SPR)，测量2D-NBP8与gp 120的结合亲和性。简而言之，通过氨基酸耦合，将gp120(100μg/ml)固定在CM5传感器芯片上，并用乙醇胺封闭未反应的位点。在5μl/min的流速下通过注射35μl蛋白样品，起始缔合反应。通过用运行缓冲液(10mM HEPESpH7.4，含有0.15M NaCl、3.4mM EDTA和0.005％v/v表面活性剂)洗涤至少2分钟，完成缔合反应。如图12和表2中所示的，重组体2D-NBP8蛋白对gp120具有高的亲和性(KD 1.9e10-8)。
表2
实施例6
2D-NBP8抑制6-螺旋束形成
如先前所述的(Liu SW et al.2005 JBC 280：12，11259-11273)，使用荧光C34-FAM探针，通过ELISA和FN-PAGE测定2D-NBP8预防6-HB形成的能力。简而言之，将测试的肽用等量的N36在37℃下预孵育30min，随后添加C34-生物素(0.5μM)。将混合物添加至涂覆有mAb NC-1 IgG(在0.1M Tris中为2μg/ml，pH 8.8)的96-孔聚苯乙烯平板并用在PBS中的2％无脂乳封闭。然后将平板孵育30min并添加SA-HRP。将平板用洗涤缓冲液(含有0.01％Tween 20的PBS)洗涤六次以去除任何未结合的肽。添加底物TMB并使用ELISA检测仪在450nm(A450)下测量吸光度。使用CalcuSyn软件计算6-HB形成的抑制百分比以及IC50值。
在FN-PAGE检验中，用等量的N36将测试的肽在37℃下预孵育30min，随后在37℃下添加C34-FAM达30min。然后将混合物添加至Tris-甘氨酸天然样品缓冲液(Invitrogen)中。然后将样品(20μl)装载在Tris-甘氨酸凝胶(18％)上，在120V恒压下在室温下运行1hrs。使用在520nm下具有激发波长的透视UV光源，用FluorChem 8800显像系统(Alpha InnotechCorp.)，可视地对凝胶染色，然后用考马斯亮蓝染色。
如图13中所示的，2D-NBP8可以像T1144一样强烈抑制N36/C34 6-HB形成，而2D在阻断6-HB形成中是无效的。在FN-PAGE检验中进一步证实了该结果。随着浓度增加(从1μM至10μM)，2D-NBP8能完全预防C34-FAM/N36 6-HB形成(图14)。
实施例7
2D-NBP8对HIV-1-介导的细胞-细胞融合以及HIV-1复制的抑制活性
使用Calcein AM-标记的HIV-1IIIB慢性感染的H9(H9/HIV-1 IIIB)细胞作为效应细胞和MT-2细胞作为靶细胞，通过染印检验(Lu H et al.J VirolMethods 107：155-161，2003)，测定HIV-1-介导的细胞-细胞融合。计算通过嵌合体的细胞-细胞融合的抑制百分比，并使用CalcuSyn软件，计算50％抑制浓度(IC50)。如在表3中所示的，2D-NBP8在抑制HIV-1-介导的细胞-细胞融合中是高度有效的，具有低nM水平下的IC50(19.03nM)。
针对p24产生，通过ELISA(Jiang S et al.J Exp Med 174：1557-1563，1991)测定双功能分子对HIV-1 IIIB感染的抑制活性。简而言之，在存在或不存在抗原特异性抗血清或IgG抗体的情况下，在一系列二倍稀释浓度下，用在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中的100 TCID50(50％组织培养感染剂量)下的HIV-1IIIB在37℃下过夜感染MT-2细胞。然后去除培养上清液并添加新鲜培养基。感染后4天时，收集培养上清液并与等体积的5％Triton X-100混合用于在p24蛋白ELISA中的检测。2D-NBP8在抑制HIV-1 IIIB感染中也是高度有效的，具有在5.64nM下的IC50，比T20好三倍多(图15和表3)。
对于通过M-嗜性HIV-1毒株Bal(亚型B，R5)感染的抑制，将100μl的TZM-bl细胞(1×105/ml)过夜预培养并在存在或不存在测试肽的情况下用100 TCID50下的Bal感染细胞。收获细胞并用50μl的裂解试剂在感染后第四天时裂解细胞。根据制造商说明书，使用荧光素酶试剂盒(Promega)和光度计(Ultra 386，Tecan)，分析荧光素酶活性。计算荧光素酶活性的抑制百分比。如在图16和表3中所示的，2D-NBP8在抑制HIV-1IIIB感染中也是高度有效的，具有在10.78nM下的IC50，比T20好得多。
测定双功能分子对通过初级HIV-1分离物——92US657(B，R5)、94UG103(A，X4R5)、93MW959(C，R5)、RU570(G，R5)和92TH009(E/A，R5)的感染的抑制活性(Jiang S et al.Antimicrob Agents Chemother48：4349-4359，2004)。简而言之，使用标准密度梯度(Histopaque-1077，Sigma)离心，从健康供体分离末梢血单核细胞(PBMCs)。在37℃下孵育2hr后，收集非粘连细胞并在含有10％FBS、5μg的植物血球凝集素(PHA)/ml和100U的IL-2/ml的RPMI 1640培养基中以5×105/ml再悬浮，随后在37℃下孵育3天。在不存在或存在抗血清的情况下，在一系列二倍稀释浓度下，以0.01的感染复数(MOI)，用相应的初级HIV-1分离物感染PHA-刺激的细胞。收集感染后7天的上清液并如上所述的通过ELISA针对p24抗原测试。如上所述的使用CalcuSyn软件计算IC50。如在表3中所示的，2D-NBP8显著抑制通过所有初级HIV-1分离物的感染，具有在低nM水平下的IC50。
表3.肽和重组体蛋白对HIV-1-介导的细胞-细胞融合和HIV-1复制的抑制活性
*初级HIV-1分离物
实施例8
通过2D-NBP8使HIV分离物失活
通过针对p24产生的ELISA或荧光素酶试剂盒，测定通过2D-NBP8病毒失活。简而言之，将HIV-1分离物(500TCID50/ml)添加至100μl的具有不同浓度的样品并在4℃下孵育1小时。然后，添加PEG 6000至3％的终浓度并在微量离心机上以15,000rpm离心30min。去除上清液并用PBS洗涤球团并再悬浮至100μl。以100μl/孔添加MT-2或TZM-bl细胞(1x105/ml)并在37℃下培养3天。根据试剂盒制造商的说明书，测定MT-2中的p24产生或荧光素酶活性。图17-18中所示的结果表示2D-NBP8以剂量-依赖型方式快速使HIV-1 IIIB、X4病毒和HIV-1Bal、R5病毒失活。相反地，在T20和T1144组中，在测试的浓度范围内对病毒没有显著作用。
实施例9
2D-NBP1和2D-FBP1对HIV-1-介导的细胞-细胞融合和HIV-1复制2D- NBP8的抑制活性
如上所述的，测定2D-NBP1和2D-FBP1对通过HIV-1毒株Bal和IIIB的HIV-1-介导的细胞-细胞融合和感染的抑制活性。如在表4中所示的，2D-NBP1和2D-FBP1二者都在抑制HIV-1-介导的细胞-细胞融合和HIV-1复制中是有效的，这表明与2D或CD4分子连接的NHR-结合肽和融合肽-结合肽保留了其抗-HIV-1活性。
表4.重组体蛋白对HIV-1-介导的细胞-细胞融合和HIV-1复制的抑制活性
实施例10
通过2D-NBP1和2D-FBP1使HIV分离物失活
如上所述的，检测通过2D-NBP1和2D-FBP1使无细胞HIV-1毒株Bal和IIIB失活。如在表5中所示的，2D-NBP1和2D-FBP1二者可显著使病毒失活，具有在80-300nM的范围内的EC50，这证实了，由融合有NHR-结合肽的2D或CD4和与分子连接的融合肽-结合肽组成的重组体蛋白是有效的HIV-1灭活剂。
表5.无细胞的HIV-1R5和X4毒株的失活
实施例11
通过2D-NBP8抑制病毒的可能机制
通过与暴露的N-HR结构域相互作用，2D-NBP8可使2D-活化的包膜糖蛋白中间产物不稳定并失活。为了测量2D-NBP8对HIV-1包膜糖蛋白的作用，如先前所述的(Haim H et al.Plos pathogens.5：4，1-13，2009)，使用了利用活细胞作为平台用于表达膜-结合的三聚物包膜糖蛋白复合物的基于ELISA的系统。简而言之，将稳定表达HIV-1Env的CHO-WT细胞在96-孔平板(每孔5×104)中接种并在37℃下培养。两天后，用阻断缓冲液(35mg/ml BSA、10mg/ml无脂干乳、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、25mMTris，pH 7.5和140mM NaCl)洗涤细胞两次。对于脉冲活化实验，用悬浮在阻断缓冲液中的2D(2.5μM)或2D-NBP8(2.5μM)对细胞孵育三分钟，用阻断缓冲液洗涤三次并用C34-生物素孵育不同的时间(2μM下30分钟)。为了研究HR1凹槽暴露的温度依赖性，在规定的温度下对2D-脉冲的细胞孵育不同的时间长度；随后将细胞返回至室温用于用C34-生物素的孵育。然后用阻断缓冲液洗涤细胞四次并用洗涤缓冲液(140mM NaCl，1.8mMCaCl2，1mM MgCl2和20mM Tris，pH 7.5)洗涤四次。然后在室温下用样品孵育SA-HRP 45分钟。用阻断缓冲液洗涤细胞5次并用洗涤缓冲液洗涤五次。每孔添加补充有150mM NaCl的33μl的Western Lightning氧化和发光试剂(Perkin Elmer Life Sciences)的1∶1混合物之后，测定HRP酶活性。测量光发射。
使用上述方法，Haim等人(PLoS.Pathog.5：e1000360，2009)发现sCD4和CD4-模拟化合物显著增强了C34与HIV-1包膜糖蛋白的结合，这表明，sCD4脉冲之后在Env上的NHR凹槽(C34结合位点)暴露。并且重要地，其结果显示了，通过sCD4活化之后，sCD4-活化的NHR暴露的中间产物的稳定性与HIV-1感染性密切相关，特别是与在sCD4和CD4-模拟化合物之后可被增强的CD4-/CCR5+细胞的HIV-1感染密切相关。如在图19中所示的，通过与经2D诱导的NHR槽相互作用，2D-NBP8可显著使2D-活化的Env融合中间产物不稳定并失活。
实施例12
2D-NBP8可显著降低关于CD4 - /CCR5 + 细胞的HIV-1感染的CD4-相关的增 强作用
已显示可溶的sCD4适当地增强CD4-/CCR5+细胞的HIV-1感染(HaimH等人)。鉴于2D-NBP8含有sCD4的D1D2结构域，使用如Haim等人所述的相同方法，研究2D-NBP8是否也增强CD4-/CCR5+细胞的HIV-1感染是必要地。简而言之，在不同浓度的2D和2D-NBP8存在下，将在培养基中的Cf2Th-CCR5细胞(NIH ARRRP CN4662)(每孔6×105细胞)和病毒(HIV-1Bal)混合并且三天后测量感染性。结果显示2D在一些浓度范围内增强病毒感染，而2D-NBP8不会增强反而相当显著地抑制，关于CD4-/CCR5+的HIV-1感染的CD4相关的增强作用(图20)。
表6.双功能HIV进入抑制剂的组分的序列
除非另有说明，用于说明书和权利要求书中的表达成分数量、如分子量的性质、反应条件的所有数字等应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非指出反例，以下说明书和附加的权利要求书中阐释的数量参数是近似值，其可根据本发明想要获得的所需性质而变化。至少，并不企图限制将等同原则应用于权利要求书的范围，每个数量参数至少应按照经报导的有效数字的位数并通过应用常规约数技术解释。尽管阐释本发明广大范围的数量范围和参数为约数，而特定实施例中阐释的数量值则是尽可能精确地报导的。然而，任何数量值固有地包含误差，这是从它们各自检测测量中发现的标准差必然地产生的。
除非在本文另有说明或同上下文明显抵触，描述本发明的上下文中(特别是在以下的权利要求书上下文中)使用的术语“一个”(″a″，″an″)和“该”(″the″)和类似的指代被解释为包括单数和复数。对本文数值范围的叙述仅意图用作为引用落入该范围的每个单独的值的速记方法(shorthand method)。除非本文另有说明，每个单独的值都被并入说明书，就像其被单独地并入本文一样。除非在本文另有说明或与上下文明显抵触，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文所提供的任何和所有实例或举例文字(例如“例如”)的使用仅意欲用来更好地阐述本发明，而非对本发明所要求保护的范围设定限制。说明书中的文字不应被理解为表示任何不要求保护的元素对本发明的实践而言是必需的。
本文公开的备选元素或实施方式的分组不应解释为限制。各组成员可被单独提到或要求保护，或与本文发现的组的其它成员或其它元素任意组合。应当理解，由于便利和/或专利的原因，一组的一个或多个成员可以被包括进一组中或从该组删除。当任何这类包括或删除发生时，本说明书被认为含有经改写的组，以满足对附加的权利要求书中所用的所有马库什组的书面描述。
本文描述了根据本发明的某些实施方式，包括本发明的发明人已知的实现本发明的最佳模式。当然，本领域常规技术人员阅读上述描述后会明白这些实施方式的变更。本发明人预期熟练的技术人员能适当地采用这类变更，且本发明者意欲使得本发明以与本文特定描述不同的方式应用。因此，至少可适用的法律允许，本发明包括附加的权利要求书中所述的主体内容的所有修饰和等价物。另外，除非本文另有说明或与上下文明显抵触，在其所有可能变化中，上述元件的任何组合由本发明所包括。
另外，在说明书通篇中，引用了大量专利和印刷出版物作为参考文献。上述各参考文献和印刷出版物通过引用其整体并入本文。
最后，应理解本文公开的本发明的实施方式仅用于阐述本发明的原则。其它可使用的修饰也在本发明的范围内。因此，通过示例而非限制的方式，可根据本文的教导利用本发明的备选形式。因此，本发明并非被限制为如本文精确地阐释和描述的。

Claims (5)

1.包含多肽的药物组合物，所述多肽由以下组成：
第一结构域，其由SEQ ID NO:33所示的可溶的CD4的D1D2结构域组成；
第二结构域，其由以下组成：从由N-末端七肽重复(NHR)-结合肽和融合肽(FP)-结合肽组成的组中选择的人类免疫缺陷病毒(HIV)gp41功能结构域-结合序列，所述N-末端七肽重复(NHR)-结合肽和融合肽(FP)-结合肽选自SEQ ID NO:37的第221至266位氨基酸所示的NBP1、SEQID NO:12所示的NBP8和SEQ ID NO:59的第221至240位氨基酸所示的FBP1；和
连接所述第一结构域的氨基酸序列和所述第二结构域的氨基酸序列的柔性连接物，其中所述连接物由SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列(GGGGS)n组成，其中n是7。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述多肽是从由SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:59组成的组中选择的氨基酸序列。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述组合物还包括至少一种药学上可接受的赋形剂。
4.权利要求1所述的药物组合物用于制造治疗病毒感染的药物的用途，其中：
给暴露于HIV感染的个体施用有效剂量的权利要求1的药物组合物；
使所述HIV失活并
阻断所述HIV进入靶细胞，从而治疗所述病毒感染。
5.根据权利要求4的用途，其中所述药物组合物包含下述多肽，所述多肽选自由SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:59组成的组。
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