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CN102861322A - 一种血红蛋白类携氧载体及其制备方法 - Google Patents

一种血红蛋白类携氧载体及其制备方法 Download PDF

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CN102861322A
CN102861322A CN2012103556354A CN201210355635A CN102861322A CN 102861322 A CN102861322 A CN 102861322A CN 2012103556354 A CN2012103556354 A CN 2012103556354A CN 201210355635 A CN201210355635 A CN 201210355635A CN 102861322 A CN102861322 A CN 102861322A
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CN
China
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hemoglobin
oxygen
carrier
taken
hoptoglobin
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CN2012103556354A
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李涛
杨倩
吴畏
李茜
刘进
陈艳芳
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West China Hospital of Sichuan University
Original Assignee
West China Hospital of Sichuan University
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Abstract

本发明公开了一种血红蛋白类携氧载体，包含血红蛋白、结合珠蛋白和聚乙二醇－聚酯纳米粒，血红蛋白通过结合珠蛋白连接在聚乙二醇－聚酯纳米粒表面。本发明血红蛋白类携氧载体对细胞无明显毒性，输注后血浆中无明显游离血红蛋白，无高血压反应，可克服传统血红蛋白类携氧载体副作用强的缺陷，具有良好的应用前景和经济效益。

Description

一种血红蛋白类携氧载体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种血红蛋白类携氧载体。
背景技术
输血在现代医疗中发挥了重要作用，是临床手术、抗灾和战场救治不可缺少的医疗手段。但是，传统输血有很多弊端，如，血源单一，主要靠献血，而且人类血型复杂，需要进行严格的配型后才能使用，限制了其对急重症病人的救治和在紧急突发事件环境下的应用。更为严重的是血液易于受到肝炎，艾滋病等病毒的污染，以及现在越来越关注的新旧血问题，使得输血安全受到威胁。随着医疗技术的发展，血液的需求量不断增高，而安全有效的血源却日益紧缺。人体血液由血浆、红细胞、白细胞和血小板组成，成分非常复杂，要制造出一种可完全代替血液的溶液非常困难，或者说几乎不可能；但研制一种临时替代品，在急需情况下短时间内代替血液中某种组分的作用却具有可行性。
作为血液的重要组成部分，血红蛋白（Hemoglobin，Hb）位于红细胞内，是机体运输氧的主要媒介。但是，单纯的血红蛋白溶液并不能直接输注，因为脱离红细胞的血红蛋白失去2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG）的调节，氧亲和力急剧升高，不能向组织有效供氧，且游离血红蛋白在各种酶的作用下也会迅速解聚为二聚体和单体，经肾排泄或堵塞肾小管，产生强烈的肾毒性。为了克服前述缺陷，对血红蛋白进行必要的修饰或处理，调整血红蛋白的有效分子半径，对黏滞度和携氧释氧能力等进行优化，以减少上述血红蛋白的不良反应，增加氧输送效果和在血浆中的存留时间，产生的一类制品统称为血红蛋白类携氧载体（HBOCs）。
近几十年，HBOCs一直是血液代用品研发的重点。HBOCs的研发过程主要分为三代。第一代是用小分子修饰血红蛋白或用交联剂聚合血红蛋白。第二代为血红蛋白分子与抗氧化酶如超氧化物岐化酶、过氧化氢酶等交联形成多聚物。用于前两代HBOCs较为成熟的化学修饰和交联方法包括，聚乙二醇（PEG）修饰，开环棉籽糖交联，双阿司匹林交联，戊二醛（GDA）交联等，产品包括HemAssist，Polyheme，HemoLink，Hemopure(HBOC-201)，Hemospan(MP4)，Gelenpol，HemoTech，Hemoximer等。前两代产品在临床实践中，都出现了很多问题：HemAssist属第1代产品，因在III期临床试验中发现受试者死亡率明显增加而放弃；Polyheme也因为临床试验中出现严重心脏毒性而终止研究；美国Biopure公司研发的Hemopure（戊二醛交联的聚合牛血红蛋白）是目前唯一已经获准在临床应用的产品，仅限于在南非上市，但因为III期临床研究中暴露出心血管方面的安全性问题，也停止了进一步的研发。2008年，等在医学杂志《JAMA》公开了1篇有关HBOC临床试验的Meta分析，指出其增加了患者的死亡率并有潜在的引起心肌梗死的风险，同时指出在明确HBOC制品潜在毒副作用及其机理之前，不应再开展进一步的临床试验。该杂志的结论，间接导致2009年美国FDA拒绝了Northfield公司HBOC产品（PolyHeme）的上市请求，影响了整个HBOC行业。关于HBOCs制品输注后的毒副反应，普遍认为是其由于HBOC中存在游离/未聚合的血红蛋白，其会透过内皮屏障，消耗内皮舒张因子一氧化氮（NO），同时，血红蛋白本身的氧化还原反应生成的氧自由基造成机体氧化应激反应。
为了解决HBOC中存在游离/未聚合的血红蛋白的问题，第三代HBOCs血红蛋白外面用膜或高分子材料包裹，使之更加接近红细胞的实际结构，称作包裹血红蛋白。加拿大的TMS Chang报道了使用聚乙二醇-聚乳酸胶囊包裹的血红蛋白，胶囊粒径100nm左右。日本的Tsuchida Eishun制备了细胞型血红蛋白（Hemoglobin Vehicle，HbV），粒径250nm左右。中国也有类似报道，申请号：200810051615.1，发明名称：可生物降解的载有血红蛋白的聚肽囊泡及其制备方法的发明专利申请，公开了一种可生物降解载有血红蛋白的两亲性嵌段聚肽囊泡，该囊泡的内部水相中含有CO保护的血红蛋白，囊泡的壁由可生物降解的聚赖氨酸-聚苯丙氨酸两嵌段共聚肽构成；申请号：200810050914.3，发明名称：一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子及制法的发明专利申请，公开了一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子，其是模拟红血球的细胞结构，用乳酸类嵌段共聚物做血红蛋白的载体，构筑聚合物/血红蛋白纳米胶束或胶囊；申请号：201010246051.4，发明名称：一种人工纳米红细胞的专利申请公开了一种人工纳米红细胞，其是在血红蛋白外面通过纳米自组装包裹具有双亲性的改性淀粉，形成粒径为200~300nm的微囊化的人工纳米红细胞。但是，这类制品仍有缺陷，如包材，尤其是磷脂价格昂贵且不稳定，物理包裹后的血红蛋白可能突释，仍然难以避免游离/未聚合的血红蛋白的副作用，有潜在的输注风险。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的血红蛋白类携氧载体。
本发明血红蛋白类携氧载体，包含血红蛋白、结合珠蛋白和聚乙二醇－聚酯纳米粒，血红蛋白通过结合珠蛋白连接在聚乙二醇－聚酯纳米粒表面。
其粒径为80~400nm。优选地，其粒径为200~300nm。
所述聚乙二醇－聚酯纳米粒为聚乙二醇-聚己内酯纳米粒或者聚乙二醇-聚乳酸纳米粒。
其中，血红蛋白的含量为6~12%（w/w），血红蛋白与珠蛋白的摩尔比为1：1。
所述聚乙二醇－聚酯纳米粒与结合珠蛋白通过硫醚键或酰胺键连接。
所述血红蛋白类携氧载体，氧亲和力P50值为10~36mmHg，Hill系数为1.30~2.90，pH值为7.2~7.5。
所述血红蛋白类携氧载体还包括抗氧化剂，抗氧化剂包裹于聚乙二醇－聚酯纳米粒中。所述抗氧化剂为抗坏血酸、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、维生素E、谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、N-乙酰半胱氨酸中的一种或一种以上的组合。
本发明还提供了上述血红蛋白类携氧载体的制备方法，它包括如下步骤：
a、取结合珠蛋白、巯基化结合珠蛋白或者羧基活化的结合珠蛋白，以及带有官能团的聚乙二醇－聚酯纳米粒溶于磷酸盐缓冲液中，结合珠蛋白与纳米粒的重量比为1:5~10，4℃震荡18~30小时，磷酸盐缓冲液洗涤，10000~14000g离心，得沉淀；
b、将步骤a所得沉淀溶于磷酸盐缓冲液中，加入血红蛋白，血红蛋白与结合珠蛋白的重量比为（2~4）：（1~3），4℃避光反应2~6小时，分离纯化，浓缩冻干，即得血红蛋白类携氧载体。
步骤a所述官能团为单马来酰亚胺、羧基或者氨基。
其中，步骤a所述聚酯是聚乳酸或聚己内酯。
其中，步骤a所述纳米粒中包裹抗氧化剂。
其中，所述步骤a中，结合珠蛋白和纳米粒重量比为1:5或者1:10；震荡24小时；12000g离心。
其中，所述步骤b中，血红蛋白与结合珠蛋白的重量比为3：2；避光反应2小时；分离纯化方法为：离心或凝胶色谱柱分离纯化，至上清液或洗脱液在400-600nm无明显吸收峰为止，收集沉淀或者洗脱液。
带有官能团的聚乙二醇－聚酯纳米粒是由带有官能团聚乙二醇－聚酯两嵌段共聚物自组装，或者其与聚乙二醇单甲醚－聚酯两嵌段共聚物的混合物自组装得到。自组装采用的方法是有机溶剂法、透析法、乳化分散法或者复乳法。A，有机溶剂法：将带官能团的聚乙二醇－聚酯两嵌段共聚物与聚乙二醇单甲醚－聚酯两嵌段共聚物，质量比1:0-40，与抗氧剂（抗氧化剂：总共聚物质量比＝0-1：10）共溶于乙酸乙酯，经旋蒸去除有机溶剂后，加入40～70℃热水中，振荡分散，冷却至室温，冻干即得带官能团且包裹抗氧化剂的纳米粒。B，透析法：将带官能团的聚乙二醇－聚酯两嵌段共聚物与聚乙二醇单甲醚-聚酯两嵌段共聚物，质量比1:0-40，与抗氧剂（抗氧化剂：总共聚物质量比＝0-1：10）溶解在可与水混溶的有机溶剂DMSO中，然后加入到透析袋中，并在水中进行透析。透析过程中，两嵌段共聚物自组装成纳米粒并将抗氧剂包在其内部，同时去除了其中的有机溶剂，不需要使用表面活性剂和高速搅拌，将透析后的溶液冻干即得带官能团且包裹抗氧化剂的纳米粒。C，乳化分散法：以含乳化剂的水溶液作为水相，先在乳化分散机上乳化，然后以一定速度滴加含有带官能团的聚乙二醇－聚酯两嵌段共聚物与聚乙二醇单甲醚－聚酯两嵌段共聚物和抗氧剂的有机相，滴加完后继续在乳化分散机上乳化10分钟，旋转蒸发仪抽去有机溶剂即得带官能团的纳米粒。D,复乳法（W/O/W法）：先将抗氧剂（抗氧化剂：总共聚物质量比＝0-1：10）溶于水溶液形成内水相，在超声乳化的条件下，逐滴加入到带官能团的聚乙二醇－聚酯两嵌段共聚物与聚乙二醇单甲醚－聚酯两嵌段共聚物（质量比1:0-40）的有机相中，先形成W/O初乳，再将初乳在机械搅拌的条件下缓缓加入含有乳化剂的外水相中，形成W/O/W的复乳，挥去有机溶剂后冻干即得带官能团的纳米粒。
本发明血红蛋白类携氧载体中，血红蛋白可与结合珠蛋白形成稳定的复合物，即使纳米粒分解之后，也不会产生游离血红蛋白，无高血压反应，且结合珠蛋白/血红蛋白复合物经网状内皮系统清除，可大大减轻经肾脏排泄可能造成的肾损伤，克服HBOCs类制品长期存在的缺陷。并且，本发明的HBOCs表面带有数量可控的活性官能团，可实现血红蛋白定点定量结合，得到质量稳定的终产物，具有极良好的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明所涉新型血红蛋白类携氧纳米粒的示意图
图2为实施例3中Mal-PEG-PCL共聚物的1H-NMR图谱
图3为实施例3中MPEG-PCL共聚物的1H-NMR图谱
图4为实施例3所制备的血红蛋白类携氧载体的透射电镜（TEM）图
图5为实施例3所制备的血红蛋白类携氧载体采用MALVERN粒径仪检测出的结果
图6为实施例3所制备的血红蛋白类携氧载体采用MTT法测定的细胞毒性结果
图7为实施例4所制备的血红蛋白类携氧载体的透射电镜（TEM）图
图8为实施例4所制备的血红蛋白类携氧载体采用MALVERN粒径仪检测出的结果
图9为实施例4所制备的血红蛋白类携氧载体采用MTT法测定的细胞毒性结果
图10为实施例3和实施例4所制备的血红蛋白类携氧载体的冻干粉
图11为实施例3和实施例4所制备的血红蛋白类携氧载体对小鼠血管活性的检测结果
具体实施方式
主要仪器及试剂：
核磁共振仪：Varian 400，Varian公司，USA；
马尔文激光衍射粒度仪：Nano-ZS,Malvern Instrument，UK；
凝胶渗透色谱仪：Agilent 110，Agilent公司，USA；
透射电镜：Hitachi H-6009IV，Hitachi公司，Japan；
血气分析仪：ABL 800FLEX，Radiometer公司；BC-3000PLUS，迈瑞公司，中国；
HEMOXTM分析仪：TCS Scientific，USA；
pH电极：Mettler Toledo公司，USA；
无创血压检测系统：BP-2000，Visitech Systems公司，USA；
聚乙二醇单甲醚（MPEG），购自美国Aldrich公司，分析纯；
单马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG），单氨基聚乙二醇（NH2-PEG）和单羧基聚乙二醇（COOH-PEG）均购自北京键凯公司，分析纯；
己内酯（Caprolactone，CL）、丙交酯（D,L-lactide）、辛酸亚锡（Stannousoctoate，Sn(oct)2），二甲基亚砜（DMSO），购自美国Sigma公司，分析纯；
巯基化试剂Traut’s（2-Iminothiolane·HCl），购自美国ThermoScientific-Pierce公司；丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、乳酸、磷酸缓冲液（PBS，pH7.4）均购于成都科龙化学试剂公司；
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）购自美国Sigma公司；
细胞培养基DMEM培养基购自Gibico BRL公司；
人胚肾细胞（HEK293）来自四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室；
实施例1本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）Mal-PEG-PCL和MPEG-PCL的制备
分别将5.0g己内酯与5.0g分子量2000的单马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG2000）或5.0g分子量2000的聚乙二醇单甲醚（MPEG2000）按质量比1：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在140℃油浴中反应4小时；
待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到Mal-PEG-PCL和MPEG-PCL。
（2）含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉的制备
然后，分别取1mg Mal-PEG-PCL和40mg MPEG-PCL溶于5ml乙酸乙酯，用旋转蒸发仪抽去乙酸乙酯，然后加入10ml蒸馏水，于60度水浴加热搅拌，即得到含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒水溶液，冻干即得含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL的纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
结合珠蛋白与巯基化试剂Traut’s，按照摩尔比1：40，通高纯氮条件下避光搅拌反应2小时，葡聚糖凝胶柱分离得到巯基化结合珠蛋白；
将5mg巯基化的人结合珠蛋白溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入50mg含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉，4℃避光振荡10小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入8mg人脐带血血红蛋白，4℃避光搅拌反应2小时，反应液在12000g下离心分离，用磷酸盐缓冲液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止，即得本发明血红蛋白类携氧载体。
2、理化性质检测
检测方法：
共聚物的化学结构和组成采用红外光谱，核磁共振波谱鉴定和计算；
共聚物的分子量和分子量分布使用凝胶渗透色谱装置测定；
纳米粒子大小和分布使用MALVERN粒径仪测定；
纳米粒子的形态采用透射电镜来观察和记录；
血红蛋白的浓度（载药率）通过Radiometer公司的ABL 800FLEX血气分析仪和迈瑞公司的BC-3000PLUS分析仪测定；
载有血红蛋白的纳米粒子的P50值和Hill系数值由TCS Scientific公司的HEMOXTM分析仪测定；
血红蛋白载药率（％）通过终产品中血红蛋白质量占纳米粒冻干粉总质量的百分比表示；
pH值由Mettler Toledo公司的pH电极测定；
细胞毒性检测方法：将100μL（1×105个/mL）HEK293细胞接种到96孔板中，培养基为DMEM，待细胞生长至融合状态时，加入不同浓度上述实施例得到的纳米粒的生理盐水溶液（终浓度分别为50、100、200、400、600、800和1000ug/ml），每个浓度设6个复孔，在37℃、含5%CO2的孵育培养箱中培养24h。然后，向培养基中加入MTT，使终质量浓度为0.5g/L，于37℃、含5%CO2的孵育培养箱中培养4h，弃上清，加入DMSO(100μL/孔)，混匀10min，用酶标仪检测(测定波长570nm，参比波长630nm)吸光度(A)，以生理盐水作为空白对照组。计算公式如下：细胞活性（Cell Viability）＝A不同浓度纳米 粒处理组/A空白对照组×100％。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为80nm，透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形，血红蛋白载药率8％，氧亲和力P50值18mmHg，Hill系数1.47，pH值7.2，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性。
实施例2本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）Mal-PEG-PCL制备
分别将8.89g己内酯与1.11g分子量3500的单马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG3500）按质量比8：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在137℃油浴中反应6小时；
待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到Mal-PEG-PCL。
（2）含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉的制备
取5mg Mal-PEG-PCL溶于2ml二氯甲烷中，再加入到5ml含有十二烷基磺酸钠（SDS）的水溶液中（SDS浓度为0.2mg/ml），在10000rpm转速下高速搅拌10～15分钟，将所得纳米粒水乳液旋蒸除去有机溶剂，再冻干即得含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
结合珠蛋白与巯基化试剂Traut’s，按照摩尔比1：40，通高纯氮、常温常压条件下搅拌反应2小时，超滤浓缩分离得到巯基化结合珠蛋白；
将10mg巯基化的人结合珠蛋白溶于20ml磷酸盐缓冲液中，加入50mg含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉，4℃避光振荡10小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入15mg牛血红蛋白，4℃避光搅拌反应2小时，反应液在12000g下离心分离，用磷酸盐缓冲液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止。
2、理化性质检测
检测方法同实施例1。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为180nm，透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形，血红蛋白载药率12％，氧亲和力P50值21mmHg，Hill系数2.35，pH值7.5，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性。
实施例3本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）Mal-PEG-PCL和MPEG-PCL的制备
分别将8.33g己内酯与1.67g分子量5000的单马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG5000）或1.67g分子量5000的聚乙二醇单甲醚（MPEG5000）按质量比5：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在137℃油浴中反应6小时；
待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到Mal-PEG-PCL（如图2）和MPEG-PCL（如图3）。
（2）含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉的制备
将5mg超氧化物岐化酶SOD，5mg过氧化氢酶CAT，溶于2ml PBS(pH7.4)，以每分钟0.5ml的速度在超声振荡下滴入5ml含5mg Mal-PEG-PCL和95mg MPEG-PCL的二氯甲烷溶液，滴加完后将制得的初乳迅速倒入20ml0.1%的PVA溶液中，在乳化分散机上乳化5分钟，然后加入100ml 0.1%的PVA溶液中稀释搅拌30分钟，于旋转蒸发仪上挥去有机溶剂，冻干即得包裹超氧化物岐化酶和过氧化氢酶的含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
结合珠蛋白与巯基化试剂Traut’s，按照摩尔比1：40，通高纯氮条件下搅拌反应2小时，葡聚糖凝胶柱分离得到巯基化结合珠蛋白；
将10mg人结合珠蛋白溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入100mg含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉，4℃避光振荡24小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入15mg人脐带血血红蛋白，4℃避光搅拌反应2小时，反应液经凝胶色谱柱纯化，收集在400-600nm区域有血红蛋白特征吸收的洗脱液，经超滤浓缩后冻干。
2、理化性质检测
检测方法同实施例1。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为224nm（如图4），透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形（如图5），血红蛋白载药率8％，氧亲和力P50值36mmHg，Hill系数2.90，pH值7.3，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性（如图6）。
实施例4本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）Mal-PEG-PCL和MPEG-PCL的制备
分别将8g己内酯与2g分子量5000的单马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG5000）或2g分子量5000的聚乙二醇单甲醚（MPEG5000）按质量比4：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在137℃油浴中反应6小时；
待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到Mal-PEG-PCL和MPEG-PCL。
（2）含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL的纳米粒冻干粉的制备
将5mg超氧化物岐化酶SOD，5mg过氧化氢酶CAT，5mg过氧化物酶溶于2ml PBS(PH 7.4)，以每分钟0.5ml的速度在超声振荡下滴入20ml含20mgMal-PEG-PCL和180mg MPEG-PCL的二氯甲烷溶液，在乳化分散机上乳化5分钟形成初乳，然后将初乳加入200ml 0.1％的PVA水溶液中搅拌过夜挥干有机溶剂，冻干即得含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
结合珠蛋白与巯基化试剂Traut’s，按照摩尔比1：40，通高纯氮条件下避光搅拌反应2小时，葡聚糖凝胶柱分离得到巯基化结合珠蛋白；
将10mg人结合珠蛋白溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入50mg含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉，4℃振荡24小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入15mg人脐带血血红蛋白，4℃避光搅拌反应6小时，反应液经凝胶色谱柱纯化，收集在400-600nm区域有血红蛋白特征吸收的洗脱液，经超滤浓缩后冻干。
2、理化性质检测
检测方法同实施例1。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为254nm（如图5），透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形（如图8），血红蛋白载药率9％，氧亲和力P50值10mmHg，Hill系数1.30，pH值7.4，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性（如图9）。
实施例5本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）Mal-PEG-PCL和MPEG-PCL的制备
分别将8.33g己内酯与1.67g分子量3500的单马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG3500）或1.67g分子量3000的聚乙二醇单甲醚（MPEG3000）按质量比5：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在90℃油浴中反应24小时。然后将温度升至180℃，并将反应体系抽至真空。20分钟后，终止反应，待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到Mal-PEG-PCL和MPEG-PCL。
（2）含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL的纳米粒冻干粉的制备
将10mg抗坏血酸溶于2ml PBS(PH 7.4)，以每分钟0.5ml的速度在超声振荡下滴入20ml含8mg Mal-PEG-PCL和192mg MPEG-PCL的二氯甲烷溶液，在乳化分散机上乳化5分钟形成初乳，然后将初乳加入200ml 0.1％的PVA水溶液中搅拌过夜挥干有机溶剂，冻干即得含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
结合珠蛋白与巯基化试剂Traut’s，按照摩尔比1：40，通高纯氮条件下避光搅拌反应2小时，葡聚糖凝胶柱分离得到巯基化结合珠蛋白；
将10mg人结合珠蛋白溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入50mg含有马来酰亚胺官能团的PEG-PCL纳米粒冻干粉，4℃振荡24小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入15mg人脐带血血红蛋白，4℃避光搅拌反应6小时，反应液经凝胶色谱柱纯化，收集在400-600nm区域有血红蛋白特征吸收的洗脱液，经超滤浓缩后冻干。
2、理化性质检测
检测方法同实施例1。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为320nm，透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形，血红蛋白载药率6％，氧亲和力P50值23mmHg，Hill系数2.41，pH值7.3，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性。
实施例6本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）Mal-PEG-PLA和MPEG-PLA的制备
5g丙交酯（D,L-lactide）与5g分子量5000的单马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG5000）或5g分子量5000的聚乙二醇单甲醚（MPEG5000）按质量比1：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在135℃油浴中反应10小时，将温度升至180℃，并将反应体系抽至真空；
30分钟后，终止反应，待反应体系温度降到室温后，加入二氯甲烷溶解，再用冷石油醚沉淀洗涤2次。将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到Mal-PEG-PLA和MPEG-PLA。
（2）含有马来酰亚胺官能团的PEG-PLA的纳米粒冻干粉的制备
分别取5mg Mal-PEG-PLA和150mg MPEG-PLA溶于5ml丙酮，用旋转蒸发仪抽去丙酮，然后加入10ml蒸馏水，于60度水浴加热搅拌，即得到含有马来酰亚胺官能团的PEG-PLA粒水溶液，冻干即得含有马来酰亚胺官能团的PEG-PLA的纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
结合珠蛋白与巯基化试剂Traut’s，按照摩尔比1：40，通高纯氮条件下避光搅拌反应2小时，葡聚糖凝胶柱分离得到巯基化结合珠蛋白；
将10mg巯基化的人结合珠蛋白溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入100mg含有马来酰亚胺官能团的PEG-PLA纳米粒冻干粉，4℃避光振荡10小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入15mg人脐带血血红蛋白，4℃避光搅拌反应2小时，反应液在12000g下离心分离，用磷酸盐缓冲液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止。
（2）理化性质检测
检测方法同实施例1。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为120nm，透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形，血红蛋白载药率10％，氧亲和力P50值27mmHg，Hill系数2.58，pH值7.2，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性。
实施例7本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）NH2-PEG-PCL和MPEG-PCL的制备
分别将8.89g己内酯与1.11g分子量3500的单氨基聚乙二醇（NH2-PEG3500）或1.11g分子量3000的聚乙二醇单甲醚（MPEG3000）按质量比8：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在100℃油浴中反应12小时。然后将温度升至130℃，并将反应体系抽至真空；
30分钟后，终止反应，待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到NH2-PEG-PCL和MPEG-PCL。
（2）含有氨基官能团的PEG-PCL的纳米粒冻干粉的制备
以1%的PVA水溶液作为水相，先在乳化分散机上乳化2分钟，然后以每分钟0.5ml的速度滴加5ml含有10mg NH2-PEG-PCL和90mg MPEG-PCL的二氯甲烷溶液，滴加完后在乳化分散机上乳化10分钟，旋转蒸发仪抽去二氯甲烷，冻干即得含有氨基官能团的PEG-PCL的纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
取上述制备好的纳米粒冻干粉100mg，溶于10ml PBS缓冲液中；
再将10mg人结合珠蛋白溶于10ml PBS缓冲液（PH 7.4），加入EDC和NHS到溶液，活化蛋白的羧基。在室温反应2h后，在搅拌的条件下将该溶液滴加到纳米粒的水溶液中，4℃避光振荡24小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒子，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入15mg人脐带血血红蛋白，4℃避光搅拌反应4小时，反应液在12000g下离心分离，用磷酸盐缓冲液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止。
2、理化性质检测
检测方法同实施例1。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为400nm，透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形，血红蛋白载药率7％，氧亲和力P50值19mmHg，Hill系数1.52，pH值7.4，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性。
实施例8本发明血红蛋白类携氧载体的制备
1、制备方法
（1）COOH-PEG-PCL和MPEG-PCL的制备
分别将8.89g己内酯与1.11g分子量2000的单羧基聚乙二醇（COOH-PEG2000）或1.11g分子量2000的聚乙二醇单甲醚（MPEG2000）按质量比8：1置于三口烧瓶中，加入催化剂辛酸亚锡以及适量甲苯，在机械搅拌和氮气保护的条件下在100℃油浴中反应12小时。然后将温度升至130℃，并将反应体系抽至真空；
30分钟后，终止反应，待反应体系温度降到室温后，将聚合物倒入冷石油醚中沉淀，将沉淀过滤，并把沉淀放在通风橱中使溶剂挥发至聚合物固化，产物真空干燥后经透析纯化，再冻干即可得到COOH-PEG-PCL和MPEG-PCL。
（2）含有羧基官能团的PEG-PCL的纳米粒冻干粉的制备
然后，以1%的PVA水溶液作为水相，先在乳化分散机上乳化2分钟，然后以每分钟0.5ml的速度滴加5ml含有10mg COOH-PEG-PCL和90mgMPEG-PCL的二氯甲烷溶液，滴加完后在乳化分散机上乳化10分钟，旋转蒸发仪抽去二氯甲烷，冻干即得含有氨基官能团的PEG-PCL的纳米粒冻干粉。
（3）血红蛋白类携氧载体的制备
取上述制备好的纳米粒冻干粉100mg，溶于10ml PBS缓冲液中，加入EDC和NHS到溶液，室温反应2h后活化纳米粒表面的羧基；
再将10mg人结合珠蛋白溶于10ml PBS缓冲液（PH 7.4），滴加到上述纳米粒的反应液中，4℃避光振荡24小时，PBS溶液洗涤并在12000g下离心分离；
收集下层纳米粒子，溶于5ml磷酸盐缓冲液，加入15mg人脐带血血红蛋白，4℃避光搅拌反应4小时，反应液在12000g下离心分离，用磷酸盐缓冲液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止。
2、理化性质检测
检测方法同实施例1。
检测结果：本发明血红蛋白类携氧载体的粒径约为320nm，透射电镜观察纳米粒形态较规则且呈球形，血红蛋白载药率8％，氧亲和力P50值21mmHg，Hill系数2.29，pH值7.5，MTT法检测结果表明该纳米粒对HEK293细胞无明显毒性。
实验例1本发明血红蛋白类携氧载体的血管活性检测
1、按照实施例3和实施例4分别制备得到携氧载体1和2（如图10）。
2、血管活性检测：雄性昆明小鼠9只，22-25g，随机分为纯化人脐带血血红蛋白组，携氧载体1组，携氧载体2组，每组3只。清醒动物称重后，置于BP-2000无创血压检测系统，尾部测压，测定得到基础血压，然后按照分组分别从尾静脉推注16％血容量（理论最大耐受量，约0.3ml/25g小鼠）的人脐带血血红蛋白溶液，携氧载体1溶液和携氧载体2溶液，检测每组推注后60分钟内血压的变化情况。推注前，分别用生理盐水将人脐带血血红蛋白，携氧载体1冻干粉和携氧载体2冻干粉稀释到终浓度8g/dl。结果以均数±标准差表示，＊P<0.05，＊＊P<0.01vs基础血压。
检测结果如图11所示：纯化人脐带血血红蛋白输注后，会引起动物血压明显提高，表明有显著的血管收缩活性；而推注两种血红蛋白类携氧载体后，均未发现动物血压的明显变化，与基础状态基本一致，表明本发明的血红蛋白类携氧载体无明显血管副作用。
实验结果说明，本发明血红蛋白类携氧载体注入体内后无高血压反应，证明其是安全的，不会产生游离的血红蛋白。
综上，本发明血红蛋白类携氧载体在体内不会产生游离血红蛋白，克服了HBOCs类制品固有的缺陷，并且，其表面带有数量可控的活性官能团，可定量结合血红蛋白，得到的产物质量稳定，安全性和可控性都显著提高，具有极其良好的临床应用前景。

Claims (15)

1.一种血红蛋白类携氧载体，其特征在于：包含血红蛋白、结合珠蛋白和聚乙二醇－聚酯纳米粒，血红蛋白通过结合珠蛋白连接在聚乙二醇－聚酯纳米粒表面。
2.根据权利要求1所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：其粒径为80~400nm。
3.根据权利要求2所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：其粒径为200~300nm。
4.根据权利要求1所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：血红蛋白的含量为6~12%（w/w），血红蛋白与结合珠蛋白的摩尔比为1：1。
5.根据权利要求1所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：所述聚乙二醇－聚酯纳米粒为聚乙二醇-聚己内酯纳米粒或者聚乙二醇-聚乳酸纳米粒。
6.根据权利要求1所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：所述聚乙二醇－聚酯纳米粒与结合珠蛋白通过硫醚键或酰胺键连接。
7.根据权利要求1所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：所述血红蛋白类携氧载体氧亲和力P50值为10~36mmHg，Hill系数为1.30~2.90，pH值为7.2~7.5。
8.根据权利要求1所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：它还包括抗氧化剂，抗氧化剂包裹于聚乙二醇－聚酯纳米粒中。
9.根据权利要求8所述的血红蛋白类携氧载体，其特征在于：所述抗氧化剂为抗坏血酸、超氧化物岐化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、维生素E、谷胱甘肽、连二亚硫酸钠、N-乙酰半胱氨酸中的一种或一种以上的组合。
10.权利要求1所述血红蛋白类携氧载体的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a、取结合珠蛋白、巯基化结合珠蛋白或者羧基活化的结合珠蛋白，以及带有官能团的聚乙二醇－聚酯纳米粒溶于磷酸盐缓冲液中，结合珠蛋白与纳米粒的重量比为1:5~10，4℃震荡18~30小时，磷酸盐缓冲液洗涤，10000~14000g离心，得沉淀；
b、将步骤a所得沉淀溶于磷酸盐缓冲液中，加入血红蛋白，血红蛋白与结合珠蛋白的重量比为（2~4）：（1~3），4℃避光反应2~6小时，分离纯化，浓缩冻干，即得血红蛋白类携氧载体。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：步骤a所述官能团为单马来酰亚胺、羧基或者氨基。
12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：步骤a所述聚酯是聚乳酸或聚己内酯。
13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：步骤a所述纳米粒中包裹抗氧化剂。
14.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，结合珠蛋白和纳米粒重量比为1:5或者1:10；震荡24小时；12000g离心。
15.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，血红蛋白与结合珠蛋白的重量比为3：2；避光反应2小时；分离纯化方法为：离心或凝胶色谱柱分离纯化，至上清液或洗脱液在400-600nm无明显吸收峰为止，收集沉淀或者洗脱液。
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