CN102869768B - 生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程 - Google Patents

Abstract

本发明的一些方面涉及用于使用经改造微生物将碳源转化为生物燃料或生物燃料前体的方法。本发明的一些方面涉及发现微生物中脂质代谢的关键调节因子。本发明的一些方面涉及用于生产生物燃料或生物燃料前体的经改造微生物。

Description

生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程

相关申请

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2010年3月2日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/309,782的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明至少部分地涉及采用经改造的细胞或微生物将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体(例如脂肪酸或脂肪酸衍生物，如三酰甘油)的领域。

联邦政府资助研究

导致本文所公开发明的某些方面的研究(至少部分)由能源部资助69106899支持。美国政府享有本发明的某些权利。

背景技术

可持续生产的生物燃料是化石燃料的替代品，并且可以有助于缓解对易于得到的化石燃料储备的消耗，同时避免与化石燃料相关的污染和温室气体排放，从而以可持续的方式满足对负担得起的能源的日益增长的需求。然而，现有生产方法的若干缺点妨碍了广泛实施生物燃料生产，例如生产生物燃料的植物与粮食作物竞争有农业价值的土地面积，或者使用仅有限供应的工业物质作为碳源。

发明内容

对化石燃料之可持续性和可再生性的日益增加的关注使得开发了不同来源的多种替代性生物燃料，包括由微生物(如细菌或酵母)从可再生资源合成的脂质。可用作生物燃料或生物燃料前体的脂质包括例如脂肪酸及其衍生物(例如，三酰甘油)。

微生物合成的生物燃料或生物燃料前体的经济可行性依赖于使用具有包括多个有利特性之组合的表型的适合微生物，所述有利特性例如允许将碳有效转化为生物燃料或生物燃料前体的代谢、高的生物质形成率、生物燃料或生物燃料前体的高产率、生物燃料或生物燃料前体的高水平细胞内积累或分泌、对原料(碳源和相关物质)和所合成产物(例如，脂肪酸或三酰甘油)的良好耐受以及生物燃料或生物燃料前体的稳定性(例如在低碳源浓度下)。转化产率(每克底物(例如葡萄糖)所产生的油的克数)尤为重要。通常用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物不符合足够允许以工业规模经济地生产生物燃料的所需表型。

本发明的一些方面涉及在微生物中改造所需特性以生产生物燃料或生物燃料前体。虽然自二十世纪三十年代和二十世纪四十年代起，已研究了微生物中的脂质和脂肪酸代谢(参见，例如Woodbine，M.1959，Microbial fat：Microorganisms as potential fatproducers.Prog.Ind.Microbiol.1：181)，但是，尽管在遗传改造微生物或优化生产过程的条件方面作出了诸多努力，在微生物中改造与生物燃料生产相关的期望表型方面的进展仍然很小。到目前为止，遗传改造工作主要集中在操作脂肪酸合成通路上游或其中的基因靶标和优化发酵或培养条件(例如，通过用脂肪酸补充生长培养基)。

遗传改造微生物的一个主要障碍是缺少靶微生物中(例如产油(oleaginous)酵母中)关键代谢通路调节因子的基因组信息和注释。因此，在用于生产生物燃料的微生物中仍然缺少控制将碳水化合物向脂质转化的关键调节因子的功能鉴定和注释。

本发明的一些方面涉及将产油酵母解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)鉴定为用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。本发明的一些方面涉及发现微生物中脂肪酸代谢的关键调节因子。本发明的一些方面涉及发现硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)作为微生物中碳水化合物向脂质转化的关键调节因子。本发明的一些方面涉及编码微生物中脂肪酸代谢的关键调节因子的分离的核酸。本发明的一些方面提供了编码产油微生物的脂肪酸代谢之关键调节因子(例如，SCD基因产物)的分离的核酸。

本发明的一些方面涉及操作脂肪酸代谢调节因子的活性(例如，通过遗传操作)来改造用于生产生物燃料的微生物。本发明的一些方面涉及改造用于生产生物燃料或生物燃料前体的分离的微生物。本发明的一些方面涉及针对将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体进行优化的分 离的微生物，例如，包含活性增加的SCD基因产物的产油微生物。本发明的一些方面涉及改造用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物培养物。本发明的一些方面涉及使用改造用于生产生物燃料的微生物将碳水化合物源转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的方法。本发明的一些方面涉及使用改造用于生产生物燃料的微生物将碳水化合物转化为脂肪酸或脂肪酸衍生物的生物反应器。本发明的一些方面提供了使用经改造微生物至少部分地将碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体的方法。

本发明的一些方面涉及分离的产油细胞，其包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶(malic enzyme)、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低选自JNK2和Δ-12去饱和酶的基因的表达的遗传修饰。在一些实施方案中，分离的产油细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含：(a)包含在合适的同源或异源启动子的控制下编码基因产物的核酸的表达盒；(b)包含在异源启动子的控制下编码靶向基因产物的干扰RNA的核酸的表达盒；和/或(c)插入细胞基因组的核酸构建体，所述构建体包含提高或降低基因产物表达的核酸序列。在一些实施方案中，异源启动子是诱导型或组成型启动子。在一些实施方案中，核酸构建体抑制或破坏(disrupt)编码基因产物的天然基因的天然调节，导致天然基因的过表达。在一些实施方案中，核酸构建体抑制或消除天然基因的表达。在一些实施方案中，由缺失、破坏、突变和/或替换调节基因表达的调节区或调节区的一部分来介导天然基因的天然调节的抑制或破坏，或者由缺失、破坏、突变和/或替换天然基因的编码序列或调节天然基因表达的调节区或调节区的一部分来介导天然基因表达的抑制或消除。在一些实施方案中，由组成型或诱导型表达靶向JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因产物且抑制所述基因表达的核酸来介导JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因表达的降低。在一些实施方案中，靶向JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因转录本的核酸通过RNAi途径抑制转录本的表达。在一些实施方案中，靶向JNK2和/或Δ-12去饱和酶转录本的核酸是siRNA、shRNA或microRNA。在一些实施方案中，通过在微生物中敲除野生型基因(例如，通过核酸构建体(如靶向性载体)与基因组JNK2或Δ-12去饱和酶基因座的同源重组)从而破坏野生型基因的表达来降低JNK2和/或Δ-12去饱和酶的表达。在一些实施方案中，将核酸构建体插入细胞的基因组中。在一些实施方案中，基因产物表达的提高的或降低赋予细胞将碳水化合物源转化为脂肪酸、脂肪酸衍生和/或TAG的 有利表型。在一些实施方案中，有利表型是改变的脂肪酸谱、改变的三酰甘油谱、增加的脂肪酸和/或三酰甘油合成率、增加的转化产率、细胞中增加的三酰甘油积累和增强的对渗透压的耐受、增加的增殖速率、增加的细胞体积和/或细胞对浓度为致死和/或抑制其相同类型细胞的未经修饰细胞之增殖的物质增强的耐受。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少2.5倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少5倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的改变的脂肪酸谱或改变的三酰甘油谱表现出C18脂肪酸与C16脂肪酸的比率增加为至少6.5倍。在一些实施方案中，细胞在对未经修饰细胞致死的渗透压条件下存活。在一些实施方案中，细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受之最高水平的200％的条件下存活。在一些实施方案中，细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受的最高水平的300％的条件下存活。在一些实施方案中，细胞在渗透压水平为未经修饰细胞所耐受的最高水平的400％的条件下存活。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞增殖速率增加为至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少25倍或至少30倍。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的体积增加为至少2倍。在一些实施方案中，细胞耐受浓度为致死和/或抑制相同细胞类型的未经修饰细胞增殖的物质。在一些实施方案中，所述物质是可发酵糖，所述浓度为至少80g/l、至少100g/l、至少150g/l、至少200g/l、至少300g/l。在一些实施方案中，与相同细胞类型的未经修饰细胞相比，细胞的脂肪酸或三酰甘油的合成率增加为至少5倍或至少10倍。在一些实施方案中，细胞以至少约20g/g、至少约25g/g或至少约30g/g的转化率将碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是产油酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是解脂耶氏酵母细胞。

本发明的一些方面涉及培养物，其包含分离的产油细胞和碳水化合物源，所述产油细胞包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、 酰基辅酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因的一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因产物的表达的遗传修饰。在一些实施方案中，分离的产油细胞是本文所提供的经改造微生物。在一些实施方案中，所述碳水化合物源是可发酵糖。在一些实施方案中，所述碳水化合物源是单糖(monomericsugar)。在一些实施方案中，所述碳水化合物源是葡萄糖和甘油。在一些实施方案中，所述碳水化合物源未经灭菌。在一些实施方案中，所述培养物保持在未灭菌条件下。在一些实施方案中，所述培养物不包含对分离的产油细胞有选择性的抗生素或抗增殖剂。在一些实施方案中，所述碳水化合物源来自植物或藻类生物质。在一些实施方案中，所述碳水化合物源来自纤维素、半纤维素、淀粉、甘油或其衍生物。在一些实施方案中，所述的培养物还包含纤维素或半纤维素水解酶。在一些实施方案中，生物质或纤维素或半纤维素在热水或稀酸或氨纤维膨胀处理中预处理，利用水解酶预处理，蒸汽预处理和/或石灰预处理。在一些实施方案中，所述培养物包含浓度为对未经修饰野生型、与分离的产油细胞细胞类型相同的未经修饰细胞致死的物质。在一些实施方案中，所述物质是在预处理碳水化合物源(如乙酸类(acetate)、糠醛或芳族化合物)期间产生的有毒物质。在一些实施方案中，所述物质是碳水化合物源。在一些实施方案中，所述物质是可发酵糖。在一些实施方案中，所述物质是单糖。在一些实施方案中，所述培养物包含浓度为至少80g/l、至少100g/l、至少150g/l、至少200g/l、至少250g/l或至少300g/l的可发酵糖。

本发明的一些方面涉及一种方法，其包括使碳水化合物源与分离的产油细胞接触，以及在适于使细胞至少部分地将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油的条件下孵育与所述细胞接触的碳水化合物源，所述细胞包含提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS、酰基辅酶A合成酶、丙酮酸羧化酶和AMPK基因产物的一种或更多种基因的表达的遗传修饰，和/或降低JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因表达的遗传修饰。在一些实施方案中，所述分离的产油细胞是本文所提供的经改造微生物。在一些实施方案中，所述碳水化合物源是糖(如葡萄糖、木糖等)或来自植物或藻类生物质的淀粉。在一些实施方案中，所述碳水化合物源来自纤维素或半纤维素。在一些实施方案中，在纤维素或半纤维素水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所述细胞接触。在一些实施方案中，在55℃于每克生物质约15IU纤维素或半纤维水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所 述细胞接触48小时。在一些实施方案中，用热水或稀释酸或氨纤维膨胀处理和/或水解酶预处理生物质或纤维素或半纤维素。在一些实施方案中，与分离的产油细胞接触的碳水化合物源包含浓度对与所述分离的产油细胞细胞类型相同的未经修饰细胞为致死浓度的物质。在一些实施方案中，所述物质是在预处理碳水化合物源(例如乙酸类)期间产生的有毒物质。在一些实施方案中，所述物质是所述碳水化合物源。在一些实施方案中，碳水化合物源是可发酵糖，与产油细胞接触之后所述可发酵糖的浓度为至少80g/l、至少100g/l、至少200g/l或至少300g/l。在一些实施方案中，在未灭菌条件下使碳水化合物源与分离的产油细胞接触。在一些实施方案中，在非灭菌条件下孵育与分离的产油细胞接触的碳水化合物源。在一些实施方案中，在开放反应器中孵育与分离的产油细胞接触的碳水化合物源。在一些实施方案中，在补料分批过程(fed batch process)中使碳水化合物源与分离的产油细胞接触并孵育以将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，在连续过程中使碳水化合物源与分离的产油细胞接触并孵育以将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，通过溶剂萃取从与分离的产油细胞接触的碳水化合物源萃取脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，所述溶剂萃取是溶剂己烷萃取。在一些实施方案中，将脂肪酸或三酰甘油从与分离的产油细胞接触的碳水化合物源中分离，然后通过酯交换反应(transesterification)精炼。

本发明的一些方面涉及一种方法，其包括通过提高选自血红蛋白、细胞色素、GLUT、苹果酸酶、ACC、SCD、FAA1、ACS、ACS2、FAT1、FAT2、PCS60、ACLY、FAS和AMPK基因产物的一种或更多种基因产物的表达，和/或降低JNK2和/或Δ-12去饱和酶基因的表达来改变脂肪酸谱、三酰甘油谱、脂肪酸合成率(fatty acid synthesis rate)、三酰甘油合成率、细胞中脂肪酸衍生物积累的程度、脂肪酸衍生物的分泌率(rate of fatty acid derivativesecretion)、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的有效产率、对渗透压的耐受、增殖速率、细胞体积或细胞对用于碳水化合物源向脂肪酸或三酰甘油的转化中的有毒物质的耐受。在一些实施方案中，改变所述脂肪酸谱、所述三酰甘油谱、所述脂肪酸合成率、所述三酰甘油合成率、细胞中脂肪酸衍生物积累程度或细胞的脂肪酸衍生物分泌率是增加由细胞合成、积累或分泌的脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的量。在一些实施方案中，改变细胞的碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物转化的效率是将转化效 率增加为至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍。在一些实施方案中，脂肪酸衍生物是三酰甘油。在一些实施方案中，改变细胞对渗透压的耐受或对有毒物质的耐受是赋予对相同细胞类型的未经修饰细胞为致死水平的渗透压或有毒物质的耐受。在一些实施方案中，改变增殖速率是将所述增殖速率增加为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少30倍。在一些实施方案中，改变所述细胞体积是将所述细胞体积增加为至少2倍。在一些实施方案中，所述细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，所述酵母是产油酵母。在一些实施方案中，所述产油酵母是解脂耶氏酵母。

本发明的一些方面涉及分离的核酸分子，其包含：a)编码SEQ ID NO：1(解脂耶氏酵母SCD)的核苷酸序列，或b)与a)的核苷酸序列有至少85％的同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列是SEQ ID NO：2。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少85％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少90％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ IDNO：2的核苷酸序列有至少95％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少97.5％的同一性。在一些实施方案中，核苷酸序列与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少99％的同一性。在一些实施方案中，提供了核酸构建体，其包含如本文所述的分离的核酸分子(例如本段所述的分离的核酸分子)和异源的分离的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，所述组成型启动子是翻译延伸因子(Translation Elongation Factor，TEF)启动子。在一些实施方案中，所述诱导型启动子是药物诱导型启动子。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含经修饰SCD启动子。在一些实施方案中，修饰是完全或部分缺失和/或突变野生型SCD启动子序列，导致对应答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的所述SCD启动子的反馈抑制的破坏。在一些实施方案中，所述修饰是将异源序列插入野生型SCD启动子区，任选地结合完全或部分缺失和/或突变野生型SCD启动子序列，导致对应答于高水平脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油的所述SCD启动子的反馈抑制的破坏。

本发明的一些方面涉及载体，其包含表达盒，例如本文中所提到的任意表达盒。本发明的一些方面涉及包含如本文所述的表达盒或如本文所述载体的至少一部分的细胞。

在一些情况下，本申请的主题可以涉及相关产物、特定问题的可替选解决方案和/或单个系统或制品的多种不同的用途。

本发明的其它优点、特征和用途将通过本发明非限制性实施方案的以下详述并结合附图而变得明显。在本说明书与通过引用并入的文件包含相矛盾的公开内容的情况下，应当以本说明书为准。

附图说明

图1：解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的脂肪酸谱。A)在摇瓶实验中，使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定培养于基本培养基中的解脂耶氏酵母对数期培养物的总游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)。B)在稳定生长期期间，在相同条件下测定相同培养物中的总FFA。C)在稳定期期间，测定相同培养物中的总脂质(FFA和酯化脂肪酸)。

图2：分析解脂耶氏酵母的总脂质。A)在基本培养基中培养野生型解脂耶氏酵母菌株直至72小时稳定期培养物，并在摇瓶实验中使用GC-MS测定总脂质。B)测定培养至稳定期(72小时)且在半组成型启动子控制下过表达SCD(天然Δ9去饱和酶)的突变菌株中的总脂质。C)用尼罗红对培养至稳定期的野生型菌株进行染色的共聚焦显微镜观察。D)用尼罗红对培养至稳定期的突变菌株进行染色并用共聚焦显微镜进行分析。

图3：在摇瓶中，解脂耶氏酵母突变体-1(过表达细胞色素B、血红蛋白、Glut1和Δ9-去饱和酶(SCD)，(D9，■))和野生型(LS，◆)对纯葡萄糖的葡萄糖消耗。与野生型解脂耶氏酵母相比，解脂耶氏酵母突变体-1表现出更快的葡萄糖消耗特性和与野生型中所观察到的不完全消耗相比的完全葡萄糖消耗。

图4：A)在72小时内，玉米秸秆水解产物(Hz)中解脂耶氏酵母突变体1(过表达细胞色素B、血红蛋白、Glut1和Δ9-去饱和酶(SCD))和突变体2(过表达细胞色素B、血红蛋白和Glut1)的糖消耗。B)在数小时内，玉米秸秆Hz中突变体1和突变体2的油的产生。

图5：比较野生型和经改造微生物的生长特性。YL-eng：过表达Δ9-去饱和酶(SCD)的突变解脂耶氏酵母。YL-wild：野生型解脂耶氏酵母。在含有浓度为250g/l的糖的基本培养基中培养细胞。野生型细胞不能在这些条件下生长，而突变细胞能够耐受高水平的糖并生长良好，表明在使 用突变菌株的方法中可以获得较高的生物燃料或生物燃料前体生产率。Y轴：OD值。X轴：以小时表示的时间。

图6：过表达Δ9-去饱和酶(SCD)的解脂耶氏酵母突变体的糖消耗和生长特性。在含有160g/l糖的培养基中培养细胞，监测培养物的OD和糖消耗。突变细胞在48小时内消耗了所供应的糖，并在分批补充糖之后继续生长。该图示出用于补料分批操作和半连续生物燃料生产方法的一个实施方案。

图7：经改造解脂耶氏酵母(过表达Δ9-去饱和酶(SCD)、细胞色素B和血红蛋白)的脂质产生。

图8：培养72小时后，突变菌株(过表达Δ9-去饱和酶(SCD)、细胞色素B和血红蛋白；每组中左侧的柱)和野生型解脂耶氏酵母菌株(每组中右侧的柱)的脂肪酸谱。

图9：与野生型解脂耶氏酵母相比的不同突变解脂耶氏酵母菌株的生长动力学。CB：细胞色素B过表达体；D9：SCD过表达体。

图10：在不同葡萄糖水平下，与野生型解脂耶氏酵母相比的不同突变解脂耶氏酵母菌株的生长动力学。Wild：野生型解脂耶氏酵母；C18：过表达Δ9-去饱和酶(SCD)的突变解脂耶氏酵母。

图11：突变(过表达Δ9-去饱和酶(SCD))和野生型解脂耶氏酵母的生长和脂质生产动力学。

图12：pYLEX1，用于解脂耶氏酵母中转基因表达的表达载体(A)。为本领域技术人员所公知的该载体可以包含选择标记或来自解脂耶氏酵母URA3基因的缺陷型URA3标记，其允许互补尿嘧啶营养缺陷型，如由LE DALL等，Curr.Genet.，26，38-44(1994)所述的URA3d标记。用于调控表达的序列如在耶氏酵母中有活性的启动子和终止子序列。在一些实施方案中，该载体包含诱导型或组成型启动子。在一些实施方案中，可以在微生物中从pYLEX1过表达基因，例如，通过将目的构建体(如在启动子的控制下的SCD cDNA)克隆入pYLEX1。显示了在TEF启动子控制下的细胞色素B和血红蛋白cDNA的示例性克隆(B，C)。

图13：在藻类生物质上培养经改造微生物。获得干燥的藻类并进行高压处理以裂解细胞和使淀粉胶化。用α-淀粉酶酶促处理经高压处理的细胞以释放葡萄糖。用我们的含有Δ9-去饱和酶和细胞色素、Glut1以及血红蛋白的突变酵母细胞接种所得培养基。图中示出耶氏酵母突变体在没 有任何添加物的发酵培养基中的强生长。细胞在4-5天内达到OD43。这表明突变酵母的生长没有被抑制。

图14：培养于藻类水解产物中的酵母细胞的显微镜观察。在图13所述条件下培养细胞。收获细胞并用尼罗红染色以鉴定油。酵母细胞内的微滴表示油。

图15：培养于粗制甘油中的酵母细胞的显微镜观察。收获细胞并用尼罗红染色以鉴定油。酵母细胞内的微滴表示油。

图16：用于产生Δ12-去饱和酶敲除菌株的包含Δ12-去饱和酶基因侧翼区域和抗生素抗性序列的Δ12-去饱和酶敲除构建体的示意结构。

图17：经改造微生物在3％乙酸类(84小时时添加2％甘油)中的生长。

详述

介绍

鉴于化石燃料资源的减少，大量研究工作致力于开发可再生的替代品。一种有前景的方法是改造微生物以从可再生碳源生产生物燃料(例如生物柴油或生物柴油前体如三酰甘油)，例如通过使用产生脂肪酸或脂肪酸衍生物的微生物Microalgae as a rawmaterial for biofuels production(Gouveia L，Oliveira ΔC.J Ind MicrobiolBiotechnol.2009Feb；36(2)：269-74)。虽然该发明的一些方面涉及使用光合微生物(如藻类)生产生物燃料或生物燃料前体，但光合微生物的使用产生了一系列技术挑战(CadoretJP，Bernard O.J Lipid biofuel production with microalgae：potential andchallenges Soc Biol.2008；202(3)：201-11)。研究工作的焦点转向改造微生物以在暗发酵过程中将可再生碳源(如来自生物质的可发酵糖(例如葡萄糖或来自玉米或甘蔗的糖)或者不可发酵碳水化合物聚合物(例如纤维素或半纤维素))转化为生物燃料或生物燃料前体。

经济上可行地生产生物燃料需要：(i)鉴定合适的微生物，和(ii)在微生物中改造出需要和/或期望的表型，该表型可包含多种特性。这种表型中的此类需要和/或期望的特性的实例包括但不限于快速且有效的生物质生产，超出不期望微生物的生长优势，有效地、理想地接近理论地碳水化合物到油的转化率，和对底物及终产物的高耐受。这些特性中的一些是以工业规模经济上可行地生产基于微生物的生物燃料的先决条件。理想地， 经改造微生物应当表现出有利特性的组合，其赋予允许以可规模化的、成本节约的方式将丰富的碳源有效转化为生物燃料或生物燃料前体的表型。生物燃料或生物燃料前体的微生物生产

本发明的一些方面涉及微生物介导的生物燃料或生物燃料前体的生产。术语“生物燃料”是指来自生物来源(如活细胞、微生物、真菌或植物)的燃料。该术语包括例如直接从生物来源得到的燃料(例如通过常规提取、蒸馏或精炼方法)和通过加工得自生物来源的生物燃料前体产生的燃料(例如通过化学修饰如酯交换方法)。可直接得到的生物燃料的例子是醇(如乙醇、丙醇和丁醇)、脂肪以及油。通过加工生物燃料前体(例如，脂质)得到的生物燃料的例子是生物柴油(例如，通过脂质的酯交换反应产生)和绿色柴油/经修饰的油燃料(例如，通过油的氢化产生)。生物柴油也称为脂肪酸甲(或乙)酯，它是目前经济上最重要的生物燃料之一，并且可以通过脂质的酯交换反应以工业规模生产，在酯交换反应中，氢氧化钠和甲醇(或乙醇)与脂质(例如三酰甘油)反应以产生生物柴油和甘油。用于以工业规模生产生物柴油的原料包括动物脂肪、植物油、棕榈油、大麻、大豆、油菜籽、亚麻、向日葵和含油藻类。在另一些方法中，微生物将生物质转化为生物燃料前体如脂质，然后其被提取并进一步加工以产生生物燃料。术语“生物质”是指由活细胞或生物(如微生物)生长和/或繁殖产生的物质。生物质可以包括细胞、微生物和/或细胞内内含物(例如细胞脂肪酸和TAG)以及细胞外物质。细胞外物质包括但不限于由细胞分泌的化合物例如分泌的脂肪酸或TAG。用于生产生物燃料的生物质的重要类型是藻类生物质和来自植物的生物质，例如玉米秸秆和木纤维。在一些实施方案中，用于生产生物燃料或生物燃料前体的生物质可以包括来自植物的糖，例如来自甘蔗或玉米的糖。

本发明的一些方面涉及鉴定、改造和开发用于经济上可行地工业规模生物柴油生产的脂质的微生物源，这些在之前均未被报道过。术语“脂质”是指脂肪酸及其衍生物。因此，脂质的例子包括脂肪酸(FA，饱和和未饱和两者)；甘油酯或甘油脂质，也称为酰基甘油如甘油单酯(单酰甘油)、甘油二酯(二酰甘油)、甘油三酯(三酰甘油、TAG或天然脂肪)；磷酸甘油酯(甘油磷脂)；非甘油酯(鞘脂、固醇脂，包括胆固醇和类固醇激素、孕戊烯醇脂包括萜类、脂肪醇、蜡和聚酮)；以及复合脂质衍生物(连接糖的脂质或糖脂和连接蛋白质的脂质)。脂质是活细胞和微生物质膜的 重要部分。一些细胞和微生物还产生脂质以储存能量，例如以脂质微滴中的三酰甘油的形式。

本发明的一些方面涉及根据微生物的合适脂质代谢鉴定用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。术语“脂质代谢”是指涉及脂质的产生或降解的分子过程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去饱和、TAG合成、TAG储存和TAG降解是作为细胞脂质代谢的一部分的过程的例子。因此，术语“脂肪酸代谢”是指涉及脂肪酸的合成、产生、转化或降解的所有细胞或有机过程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、TAG合成及TAG降解是作为细胞脂肪酸代谢的一部分的过程的例子。

术语“三酰甘油”(TAG，有时也称为甘油三酯)是指这样的分子：其包含通过酯键与三个脂肪酸分子(脂肪族一元羧酸)共价连接的一分子甘油，每个脂肪酸连接于甘油分子的三个羟基(OH)之一。由于三酰甘油的还原、无水性质，所以它是代谢能量的高浓缩储存形式，并且是适合用于生物柴油生产的原料。

许多细胞和生物以脂肪酸和脂肪酸衍生物(如TAG)的形式储存代谢能量。脂肪酸及其衍生物(如TAG)提供了储存代谢能量的理想形式。包含于C-C键中的能量可以通过β-氧化有效地释放，β-氧化是形式上相当于脂肪酸生物合成的逆转的反应，但是其由构成不同分子途径的不同酶介导和调节。微生物可以从外部供应，内源转化和从头合成来产生脂肪酸。本发明的一些方面涉及根据微生物从外部供给的碳源有效合成并储存脂肪酸或脂肪酸衍生物的能力来鉴定用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。

一种用于生物燃料生产的微生物

本发明的一些方面涉及鉴定用于生产生物燃料或生物燃料前体的以工业规模将碳水化合物转化为脂质的适合微生物。迄今为止尚未鉴定允许以工业规模经济上可行地从碳水化合物源生产生物燃料或生物燃料前体的微生物。本发明的一些方面涉及根据解脂耶氏酵母有利的碱代谢(base metabolism)来将产油酵母解脂耶氏酵母鉴定为生产生物燃料或生物燃料前体的生物。

解脂耶氏酵母是非致病性产油酵母，其可以利用多种碳源包括有机酸、烃和多种脂肪和油。术语“产油”是指可以积累其细胞干重的多于20％ 的脂质的微生物(参见C.Ratledge等，Microbial routes to lipids.Biochem Soc Trans.1989Dec；17(6)：1139-41)。根据本发明的一些方面，解脂耶氏酵母是用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物，因为解脂耶氏酵母是能够同化碳水化合物(例如葡萄糖)或甘油作为唯一碳源的专性需氧微生物，并且与其它酵母菌株相比，解脂耶氏酵母中葡萄糖至脂肪酸和三酰甘油(TAG)的转化较高且脂质储存能力较高。参见例如Beopoulos A，Cescut J，Haddouche R，Uribelarrea JL，Molina-Jouve C，Nicaud JM，Yarrowia lipolytica as a model forbio-oil production.Prog Lipid Res.2009Nov；48(6)：375-87。此外，解脂耶氏酵母是研究更为深入的“非常规”酵母物种之一，并且最近完成了解脂耶氏酵母的基因组测序，包括线粒体DNA测序。Kerscher S，Durstewitz G,Casaregola S，Gaillardin C，Brandt U.，The complete mitoch ondrial genome of Yarrowia lipolytica.Comp FunctGenomics.2001；2(2)：80-90。即使尚未完成基因组序列的功能注释，基因组序列数据的可得性也更方便了遗传操作。参见，例如Sokolova L，Wittig I，B arth HD，Schigger H，Brutschy B，Brandt U.，LILBID-mass spectrometry of protein complexes from blue-nativegels，a sensitive top-down proteomic approach.Proteomics.网上公开2010Feb 1,PMID：20127694。

在野生型解脂耶氏酵母中，在稳定生长期启动从碳源的脂肪酸和TAG合成，表明存在控制脂质代谢的严密调节机制。该调节机制控制可以被合成和储存的脂质的量，其显著限制了原料到脂质的转化产率。因此，野生型解脂耶氏酵母的代谢参数不适于经济上可行地以工业规模生产生物燃料或生物燃料前体。

一种微生物脂肪酸代谢的关键调节因子

本发明的一些方面涉及出乎意料地发现：(i)饱和脂肪酸通过反馈回路抑制脂肪酸的从头合成和TAG储存，和(ii)在适于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物(例如解脂耶氏酵母)中过表达SCD、Δ9-去饱和酶足以克制脂肪酸合成和TAG储存的该反馈抑制，引起脂肪酸和/或TAG合成、储存的显著增加。

本发明的一些方面涉及出乎意料的发现，除使脂肪酸和/或TAG的合成和储存增加以外，在微生物中过表达SCD还赋予微生物(例如，解脂耶氏酵母)生产生物燃料或生物燃料前体的有利表型，其包括但不限于： (i)TAG储存途径的超活化，(ii)生长优势，(iii)持续的油生产，(iv)对培养基中碳水化合物源物质(例如，葡萄糖和另一些糖)的耐受增强，(v)脂肪酸谱改变，例如，利于生物燃料或生物燃料前体生产的饱和与不饱和脂肪酸的比率变化。

本发明的SCD是产油微生物中脂肪酸代谢和TAG合成的关键调节因子的发现对于旨在借助经改造细胞将可再生碳源转化成生物燃料或生物燃料前体的方法具有重要意义。基于本发明的一些方面，现在可以改变微生物(例如产油酵母如解脂耶氏酵母)的脂肪酸和/或TAG谱，该改变赋予以工业规模将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的极理想表型，如显著增加脂肪酸合成、TAG合成、脂肪酸和TAG、生物质产量以及增强对培养基中高浓度底物、产物和/或毒素的耐受。

根据本发明的一些方面，根据本文所提供的方法改变微生物中的脂质或脂肪酸代谢(例如通过单独过表达SCD或与本文所提供的其它遗传或非遗传修饰组合)允许产生针对生物燃料或生物燃料前体生产过程进行了优化的微生物。本发明的一些方面涉及经改造微生物中的脂肪酸代谢，引起微生物中脂肪酸和脂肪酸衍生物合成速率和积累增加。

天然脂肪酸分子通常具有4至28个碳原子的无分支的脂肪族链或尾。如果脂肪族链的所有碳原子均通过C-C单键连接，则脂肪酸被称为“饱和的”，或者如果两个或更多个碳原子通过C-C双键连接，则脂肪酸被称为“不饱和的”。不饱和脂肪酸在膜流动性、细胞活性、代谢、控制基因转录的核事件的调节中扮演重要角色。

酵母中脂肪酸谱主要由C16和C18脂肪酸(例如棕榈酸(C16)、棕榈油酸(C16)、硬脂酸(C18)和油酸(C18))组成。棕榈酸是具有16个碳原子的脂肪族链的无支链饱和脂肪酸(碳原子/不饱和键：16.0)。硬脂酸是具有18个碳原子的脂肪族链的无支链饱和脂肪酸(18.0)。棕榈油酸是16个碳原子的脂肪族链的单不饱和脂肪酸(16.1)。油酸是18个碳原子的脂肪族链的单不饱和脂肪酸(18.1)。酵母中少数脂肪酸种类包括C14和C26脂肪酸，它们在蛋白质修饰中有重要功能或分别作为鞘脂和GPI锚的组分。

脂肪酸的从头合成使用大量代谢物、乙酰基辅酶A、ATP和NADPH，从而与依赖于这些化合物的其它细胞过程有竞争。NADPH为脂肪酸延长循环中的两个还原步骤所需，这将脂肪酸合成与细胞的代谢状态关联，导致脂肪酸合成被限制到细胞有高能量负荷的条件(由增加的ATP/AMP比 率、升高的还原当量和升高的乙酰基辅酶A储备指示)下。脂肪酸代谢中涉及几乎所有亚细胞器，表明需要在多个水平进行调节以维持脂肪酸稳态。

大多数生物(包括酵母)能够从多种碳源从头合成脂肪酸。在起始步骤中，通过由乙酰辅酶A羧化酶(ACC；在酵母中的由ACC1和HFA1编码)向丙二酰辅酶A添加CO₂来羧化乙酰辅酶A。生物素是该反应中的重要辅因子，并通过生物素：载脂蛋白连接酶(在酵母中由BPL1/ACC2编码)与ACC载脂蛋白(apoprotein)共价连接。ACC是三功能酶，带有生物素羧基载体蛋白(BCCP)结构域、生物素羧化酶(BC)结构域和羧基转移酶(CT)结构域。在大多数细菌中，这些结构域表达为单独的多肽并装配成异复合物。相反，真核ACC(包括线粒体ACC变体(酵母中的Hfa1))在单个多肽上带有这些功能。由ACC产生的丙二酰辅酶A在由脂肪酸合酶、FAS和延长酶催化的循环系列反应中作为两个碳的供体。

在酵母中，胞浆脂肪酸合成中所涉及的单独功能分别表现为一个或两个不同多肽链上的分离结构域。酵母胞浆脂肪酸合酶(FAS)是由两个亚基Fas1(β亚基)和Fas2(α亚基)构成的复合物，其组织为六聚α6β6复合物。Fas1带有乙酰基转移酶、烯酰基还原酶、脱水酶和丙二酰基棕榈酰转移酶活性。Fas2包含酰基载体蛋白、3-酮基还原酶、3-酮基合酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶活性。

酵母线粒体的脂肪酸合成通过类型II FAS系统进行，其在不同多肽上带有单独的酶促活性：Acp1，携带磷酸泛酰巯基乙胺基团辅基(prosthetic phosphopantetheinegroup)的酰基载体蛋白；Cem1，β-酮酰基-ACP合酶；Oar1，3-氧代酰基-[酰基载体蛋白质]还原酶；Htd2，3-羟基酰基-硫酯脱水酶；Etr1，烯酰基-ACP还原酶。Ppt2的功能是磷酸泛酰巯基乙胺：蛋白质转移酶，其催化磷酸泛酰巯基乙胺辅基与apoACP的连接。

脂肪酸从头合成的直接产物是饱和脂肪酸。已知在真核生物(包括酵母)中，饱和脂肪酸是不饱和脂肪酸的前体。不饱和脂肪酸一般由特异性酶(称为去饱和酶)通过饱和脂肪酸中C-C单键的去饱和而产生。控制饱和脂肪酸转化为不饱和脂肪酸的调控机制尚未完全理解。在真核生物中，不饱和脂肪酸在膜流动性、细胞活性、代谢和控制基因转录的核事件的调节中扮演重要角色。通常，约80％的酵母脂肪酸是单不饱和的，意 指它们在其脂肪族链中包含一个不饱和键。

单不饱和脂肪酸生物合成中的一个至关重要的步骤是在Δ9位(碳9和10之间)引入第一顺式双键。由硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD，也称为Δ9-去饱和酶)催化该氧化反应。虽然双键的插入发生于几种不同的其中具有亚甲基的脂肪酰辅酶A底物，但是优选的SCD的底物是分别转化为棕榈油酰(16.1)辅酶A和油酰(18.1)辅酶A的棕榈酰(16.0)辅酶A和硬脂酰(18.0)辅酶A(Ntambi，J.Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。

在1990年于酿酒酵母(S.cerevisiae)中将硬脂酰辅酶A去饱和酶基因鉴定为Ole1(Stukey JE等，J Biol Chem.，1990，265(33)：20144-9)。在1994年，通过从人脂肪组织分离0.76kb的部分cDNA部分地表征了人硬脂酰辅酶A去饱和酶基因(Li等，Int.J.Cancer，1994，57，50348-352)。在1999年该基因被完全表征，并且发现多腺苷酸化位点的替选使用产生3.9kb和5.2kb的两种转录本(Zhang等，Biochem.J.，1999，340，255-264)。在酿酒酵母中，由内质网(ER)驻留和基本Δ9-去饱和酶Olel催化脂肪酸的单去饱和(Martin CE，Oh CS，Jiang Y，Regulation of long chain unsaturated fatty acid syntnesis inyeast..Biochim Biophys Acta.2007Mar；1771(3)：271-85.Epub 2006 Jul 13)。

本发明的一些方面(至少部分)涉及鉴定本文所述的解脂耶氏酵母中酿酒酵母Ole1的同系物SCD。

以下示出解脂耶氏酵母SCD的代表性序列的非限制性例子：

＞gi|0548053|ref|XP_501496.1|YALl0C05951p[解脂耶氏酵母]

MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGAYDDKGRHISEQPFTWANWHQHINWLNFILV

IALPLSSFAAAPFVSFNWKTAAFAVGYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGGAVEG

SIRWWASSHRVHHRWTDSNKDpYDARKGFWFSHFGNMLLVpNpKNKGRTDISDLNNDWVVRLQHKYYV

YVLVFMAIVLpTLVCGFGWGDWKGGLVYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQpFDDRRTPRDHALT

ALVTFGEGYHNFHHEFpSDYRNALIWYQYDpTKWLIWTLKQVGLAWDLQTFSQNAIEQGLVQQRQKKL

DKWRNNLNWGIPIEQLpVIEFEEFQEQAKTRDLVLISGIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAV

FNGGVYRHSNAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIVSDESGNRIHRAGLQATRVENPG

MSGMAA (SEQ ID NO：1)

＞gi|50548052|ref|XM_501496.1|解脂耶氏酵母YALI0C05951p(YALI0C05951g)

mRNA，完整cds

ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAA

CTACAAGGTCAAGTACACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCACA

TTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCACCAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTG

ATTGCGCTGCCTCTGTCGTCCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAGACCGCCGCGTT

TGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGTATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATC

GAGCCTACAAGGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCTTGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCGAGGGC

TCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCACCGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTA

CGACGCCCGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCCAACCCCAAGAACA

AGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTT

TACGTTCTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTGGCTGGGGCGACTGGAA

GGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACT

CCCTTGCCCACTGGATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCACGCTCTTACC

GCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGGCTACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGC

CCTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGTGGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCT

GGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCGAGCAGGGTCTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTG

GACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCCTGTCATTGAGTTTGAGGA

GTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGCCT

TTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTC

TTCAACGGAGGTGTCTACCGACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGT

CATTCGAGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCCCAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTG

TCTCCGATGAGAGTGGAAACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAACCCCGGT

ATGTCTGGCATGGCTGCTTAG (SEQ ID NO：2)

硬脂酰辅酶A去饱和酶或SCD在其由辅酶A酯化的脂肪酸底物的A9-C处引入双键。该活性影响饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸(例如硬脂酸与油酸)的比率。硬脂酸是SCD的主要底物，但是其它链长度脂肪酸也可以由SCD加工。认为人体中的硬脂酰辅酶A去饱和酶是脂肪生成酶，这不仅是由于它在单不饱和脂肪酸的生物合成中的重要角色，还由于其通过膳食和胰岛素进行调节的模式(Ntambi，Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。因此，硬脂酰辅酶A去饱和酶的调节在生理上相当重要并且其活性对饮食变化、激素失调、发育过程、温度变化、金属、醇、过氧化物酶体增殖子和酚类化合物敏感(Ntambi，Lipid Res.，1999，40，1549-1558)。

动物模型在通过多聚不饱和脂肪酸(PUFA)调节硬脂酰辅酶A去饱和酶的研究中非常有用。例如，在清瘦和肥胖Zucker大鼠(Jones等)的脂肪组织中观察到，当对两组均饲喂与对照膳食相比PUFA含量高的膳 食时，硬脂酰辅酶A去饱和酶mRNA减少了75％(Jones等，Am.J.Physiol.，1996，271，E44-49)。用组织培养系统获得了类似的结果。在鼠3T3-L1脂肪细胞系中，花生四烯酸、亚麻油酸、亚麻酸和二十碳五烯酸以剂量依赖的方式使硬脂酰辅酶A去饱和酶的表达降低(Sessler等，J.Biol.Chem.，1996，271，29854-29858)。

对不同组织中PUFA调节硬脂酰辅酶A去饱和酶基因表达的分子机制仍了解很少。目前对调节机制的理解涉及PUFA与推定的PUFA结合蛋白相结合，然后，通过PUFA结合蛋白与硬脂酰辅酶A去饱和酶基因的顺式作用PUFA应答元件(SREBP)的结合发生转录抑制(Ntambi，Lipid Res.，1999，40，1549-1558；Zhang等，Biochem.J.，2001，357，183-193)。

虽然，已经在不同生物中研究了SCD基因催化活性的调节，但SCD基因的表达和调节对脂质代谢的意义本身仍未成为深入研究的对象。已提出SCD影响饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸(例如硬脂酸与油酸)的比率。

本发明的一些方面涉及出乎意料地发现SCD还作为微生物中(例如解脂耶氏酵母中)脂肪酸和TAG代谢的关键调节因子发挥作用。本发明的一些方面涉及出乎意料地发现单独过表达SCD基因产物不仅改变受影响细胞中的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比率，而且足以引起脂肪酸和/或TAG合成速率和/或储存的显著且出乎意料地增加。单独操作去饱和酶表达为以工业规模将碳水化合物转化为脂质的微生物(例如产油酵母细胞)赋予极理想表型的该出乎意料的发现对通过微生物介导的发酵过程从可再生碳源有效生产生物燃料或生物燃料前体具有深远意义。通过在微生物中过表达SCD克制脂肪酸合成和储存的下调不仅赋予微生物增加的脂肪酸合成率和积累，还克服了培养中FA/TAG合成限于微生物的稳定期的限制。出乎意料地，微生物(例如用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物)中SCD的过表达还赋予微生物对高浓度底物(例如可发酵糖)和与底物相关的有毒物质(例如底物预处理过程的副产物)的耐受。由SCD过表达赋予的表型(例如上述耐受提高表型)允许在将糖转化为脂质的工业发酵过程中的获得高浓度的脂质(参见图11的通过SCD过表达克服FA合成负调节)。

根据本发明的一些方面，操作其它基因可有助于通过微生物发酵从碳源大规模生产生物燃料或生物燃料前体。例如，影响含碳底物(例如糖)转向脂肪酸合成的基因。因此，本发明的一些方面提供了操作调节碳流入或流出脂质合成途径所涉及之基因的表达以实现脂质生产参数的改善的 方法。

本发明的一些方面提供了对调节生产生物燃料或生物燃料前体之微生物的脂质代谢的其它基因产物的表达和/或活性进行操作的方法。本发明一些方面的操作旨在增加碳水化合物向脂肪酸和/或TAG的转化以针对从碳水化合物源大规模生产脂质对所操作生物进行优化。本发明一些方面提供的操作例如特定基因产物的过表达、敲除、敲低、活化和/或抑制可以单独或组合，和/或与本领域技术人员已知的其它操作组合实施。术语“操作”是指遗传操作(例如特定基因产物的过表达、敲除、敲低、活化和/或抑制)和非遗传操作(例如培养基、底物、底物预处理、pH、温度、转化方法等的操作)二者。

基因表达操作(在本文中也称为基因表达的调控)可以是对给定基因表达的天然调节的破坏或抑制，过表达，表达的抑制或表达的完全消除。在天然基因序列(例如天然SCD基因序列)上游插入异源启动子或在启动子中缺失调节序列(例如介导SCD基因通过饱和脂肪酸的反馈抑制的调节序列)是破坏或抑制表达的天然调节的例子。调控基因表达的策略可以包括遗传改变(例如通过重组技术如基因靶向或病毒转导)，或者非遗传改变(例如已知引起基因表达上调或下调的环境改变，或者调控因子的瞬时递送例如将药物或小RNA分子瞬时递送至靶细胞)。遗传和非遗传改变微生物的方法为本领域技术人员所公知并且描述于例如：J.Sambrook和D.Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press；第3版(January 15，2001)；David C.Amberg，DanielJ.Burke；和Jeffrey N.Strathern，Methods in Yeast Genetics：A Cold Spring HarborLaboratory Course Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(April 2005)；JohnN.Abelson，Melvin I.Simon，Christine Guthrie和Gerald R.Fink，Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Part A，Volume 194(Methods in EnzymologySeries，194)，Academic Press(March 11，2004)；Christine Guthrie和Gerald R.Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology，Part B，第350卷(Methodsin Enzymology，第350卷)，Academic Press；第1版(July2，2002)；Christine Guthrie andGerald R.Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology，Part C，第351卷，Academic Press；第1版(July 9，2002)；Gregory N.Stephanopoulos，AristosA.Aristidou和Jens Nielsen，Metabolic Engineering：Principles and Methodologies，Academic Press；第1版(October 16，1998)；以及Christina Smolke，The MetabolicPathway Engineering Handbook：Fundamentals，CRC Press；第1版(July28，2009)，其全部通过引用并入本文。

本文所使用的术语“过表达”是指与参照细胞(例如相同细胞类型的野生型细胞或相同细胞类型但缺少特定修饰例如遗传修饰的细胞)相比，给定细胞、细胞类型或细胞状态中给定基因表达水平的增加。在表现出会抑制野生型细胞中SCD基因表达之饱和脂肪酸浓度的解脂耶氏酵母细胞中强制地持续表达SCD基因是基因过表达的一个例子。

本文所使用的术语“敲除”是指对基因产物(例如RNA或蛋白质)的表达的功能性破坏。其通常通过用靶向性构建体靶向各基因组区引起来自重组基因的基因产物(例如mRNA或蛋白质)表达的完全抑制，所述靶向性构建体与所述基因组区的特定部分重组并且缺失所述区的一部分和/或插入异源核苷酸或核苷酸序列。在二倍体中，这样的同源重组事件通常只影响两个等位基因中的一个。纯合性可以通过多种策略获得，例如通过繁殖杂合体和筛选子代。在二倍体生物(例如酵母)中，术语“敲除菌株”一般是指非功能性等位基因纯合的菌株。

本文所使用的术语“敲低”是指部分抑制基因产物(例如mRNA或蛋白质)的表达。本领域已知多种基因敲低策略可用于抑制基因表达(例如抑制或将资源转移出脂质合成途径的基因的表达，如产油酵母例如解脂耶氏酵母中的ACS2、FAT1、PCS60和/或AMPK)。例如，可以采用利用RNA干扰(RNAi)和/或micro RNA(miRNA)途径(包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、双链RNA(dsRNA)、miRNA和本领域已知的其它基于核酸的小干扰分子)的基因敲低策略。在一个实施方案中，使用基于载体的RNAi模式(例如shRNA或shRNA-mir表达构建体)降低细胞中(例如产油酵母细胞如解脂耶氏酵母细胞中)基因(例如抑制或将资源转移出脂质合成途径的基因，如ACS2、FAT1、PCS60和/或AMPK)的表达。根据本发明一些方面的分离的质粒可以包含与编码小干扰核酸(例如shRNA)的基因有效连接的启动子。在一些实施方案中，可以使用分离的质粒载体产生能够感染细胞(例如酵母细胞或细菌细胞)的病毒颗粒(例如逆转录病毒或噬菌体)。示例性病毒包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、噬菌体和本领域已知以及本文中公开的其它病毒。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)活性的方法。SCD是在与辅 酶A偶联的硬脂酸的C9和C10之间插入双键的Δ9去饱和酶，如在本文中其它处所详述的，该插入步骤是产生去饱和的脂肪酸及其衍生物的关键步骤。在一些实施方案中，该操作是过表达。在一些实施方案中，操作通过使生产生物燃料或生物燃料前体的微生物与有效连接异源启动子(例如，组成型或诱导型启动子)的包含SCD基因产物(例如SCD蛋白)编码核酸的表达构建体接触来进行。在一些实施方案中，编码SCD基因产物的核酸包含SEQ ID NO：2的编码序列。在一些实施方案中，SCD是解脂耶氏酵母SCD，例如包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的解脂耶氏酵母SCD。在一些实施方案中，微生物是解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，在微生物中进行对SCD活性的操作以赋予用于大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物的增强的耐受。硬脂酰辅酶A去饱和酶基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：852825入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作c-Jun N-末端激酶2(JNK2)的活性的方法。JNK2位于细胞质中并在饥饿过程中催化脂肪酸分解用于产生能量和碳屏蔽(carbonblock)。JNK2为能量稳态所需并在应答于细胞低糖水平的脂肪酶活化中扮演着重要角色。参见Grimard V，Massier J，Richter D，Schwudke D，Kalaidzidis Y，Fava E，Hermetter A，Thiele C.，siRNA screening revealsJNK2 as anevolutionary conserved regulator of triglyceride homeostasis.JLipidRes.2008Nov；49(11)：2427-40.Epub 2008 Jul 8。在一些实施方案中，消除或降低生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中的JNK2活性，例如分别通过敲除或敲低。在一些实施方案中，降低生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中的JNK2活性以增加产物稳定性和/或减少产物分解代谢。在一些实施方案中，使用了条件性抑制系统，并在碳水化合物源(例如可发酵糖)很少的生产过程期间抑制JNK2活性。在一些实施方案中，在微生物中对JNK2基因产物的活性进行操作以赋予用于大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。JNK2基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：5601入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作Δ-12去饱和酶基因产物的活性的方法。Δ-12去饱和酶参与将含油酸的脂质转化为高级链脂质。在一些实施方案中，例如考虑到所得生物燃料的冷流特性，期望避免长链脂肪酸的生产或使其最小化以生产生物燃料。在一些实施方案中，消除或降低生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中Δ-12去饱和酶的活性，例如分别通过完全(例如，敲除)或部分基因缺失或敲低。在一些实施方案中，降低用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中的Δ-12去饱和酶活性以增加产物稳定性、在微生物中获得期望的TAG谱和/或降低产物的分解代谢。在一些实施方案中，使用条件性抑制系统抑制Δ-12去饱和酶活性。在一些实施方案中，在微生物中对Δ-12去饱和酶基因产物的活性进行操作以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率，增加的碳水化合物向脂质转化的效率，增加的脂质储存，增加的C18脂肪酸的含量，增加的微生物的总脂肪酸储积中C18脂肪酸的百分数，所产生的脂质、油或TAG的增加的冷流特性，增加的生长速率，对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。Δ-12去饱和酶基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：2909806入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作血红蛋白基因产物的活性的方法。对于血红蛋白基因产物(包括用于本发明一些实施方案的血红蛋白基因产物)的概述，参见Frey AD，Kallio PT.Bacterial hemoglobins andflavoh emoglobins：versatile proteinsand their impactonmicrobiology andbiotechnology.FEMS MicrobiolRev.2003Oct；27(4)：525-45。在一些实施方案中，例如通过过表达编码血红蛋白蛋白质的核酸来增加微生物中血红蛋白基因产物(例如血红蛋白蛋白质)的活性。在一些实施方案中，微生物中血红蛋白的过表达引起微生物中氧传递增加。在一些实施方案中，由于增加的氧流入需要高氧的合成途径(例如脂肪酸合成途径)，所以增加的血红蛋白活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作血红蛋白基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。血红蛋白基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：7738539(Deide12990)入口下可见 示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作细胞色素基因产物的活性的方法，所述细胞色素基因产物例如细胞色素B基因产物，更特别地为细胞色素B5基因产物。在一些实施方案中，通过例如过表达编码细胞色素蛋白的核酸来增加微生物中细胞色素基因产物(例如细胞色素蛋白)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达细胞色素引起微生物中的氧传递增加。在一些实施方案中，由于增加的氧流入需要高氧的合成途径(例如脂肪酸合成途径)，所以增加的细胞色素活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作细胞色素基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物的增强的耐受。细胞色素基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：1528入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作葡萄糖转运蛋白(GLUT)基因产物(例如Glut 1基因产物)的活性的方法。在一些实施方案中，通过例如过表达编码GLUT蛋白质的核酸来增加微生物中GLUT基因产物(例如GLUT蛋白质)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达编码GLUT蛋白质的核酸引起微生物的葡萄糖摄取增加。在一些实施方案中，由于葡萄糖的摄取增加，所以增加的GLUT活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作GLUT基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。GLUT基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：38109入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作丙酮酸羧化酶(PC)基因产物的活性的方法。在一些实施方案中，通过例如过表达编码PC蛋白质的核酸来增加微生物中PC基因产物(例如PC蛋白质)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达编码PC蛋白质的核酸引起微生物的葡萄糖摄取增加。在一些实施方案中， 由于葡萄糖的摄取增加，所以增加的PC活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作PC基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。PC基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：5091入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作苹果酸酶(ME)基因产物的活性的方法。ME催化(S)-苹果酸氧化脱羧成丙酮酸，同时伴随二氧化碳的释放和NADP+到NADPH的转化。在一些实施方案中，通过例如过表达编码ME蛋白质的核酸来增加微生物中ME基因产物(例如ME蛋白质)的活性。在一些实施方案中，在微生物中过表达编码ME蛋白质的核酸引起微生物中NADPH水平增加，导致充足水平的还原性代谢物(例如NADPH)用于增加脂肪酸合成。在一些实施方案中，由于NADPH水平增加，所以增加的ME活性导致生物燃料或生物燃料前体合成增加。在一些实施方案中，在微生物中操作ME基因产物的活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。ME基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：17436入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中(例如解脂耶氏酵母中)操作乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因产物的方法。ACC基因产物介导乙酰辅酶A(脂肪酸合成中的主要C2前体)转化为丙二酰辅酶A，该转化被认为是脂肪酸合成中的第一关键步骤并且还被认为是脂肪酸合成中的限速步骤(参见Cao Y，Yang J，Xian M，Xu X，LiuW.Increasing unsaturated fatty acid contents in Esch erich ia coli bycoexpression of three different genes.Appl Microbiol Biotechnol.2010)。在一些实施方案中，ACC活性操作是ACC过表达。在一些实施方案中，微生物中ACC过表达增加脂肪酸合成率和/或赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存、增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的 耐受。ACC基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：855750入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作酰基辅酶A合成酶(ACS)的活性的方法。ACS是催化具有辅酶A的脂肪酸的硫酯化以形成活化中间体的酶家族(参见Lu X，Vora H，Khosla C.，Ov erproduction of free fatty acidsin E.coli：implications for biodiesel production Metab Eng.2008 Nov；10(6)：333-9)。这些中间体是磷脂、脂肪酸胆固醇酯或脂肪酸醇酯(如TAG)的前体。解脂耶氏酵母包含两种已知的和两种预测的酰基辅酶A合成酶。在本发明的一些实施方案中，在产生脂质的生物中过表达ACS酶以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存和/或分泌、增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。ACS基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：851245入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作酰基辅酶A合成酶2(ACS2)的活性的方法，ACS2是位于过氧化物酶体中的酶并且参与脂肪酸的降解。在一些实施方案中，抑制ACS2阻止或抑制脂肪酸通过酵母分解代谢降解，并且在一些实施方案中，这种抑制补充FAA1基因产物活性的增加以使增加的脂肪酸分泌入培养基中。解脂耶氏酵母包含ACS2乙酰基辅酶A合成酶(参见Beopoulos A，Cescut J，HaddoucheR，Uribelarrea JL，Molina-Jouve C，Nicaud JM.，Yarrowia lipolytica as a model forbio-oil production.Prog Lipid Res.2009Nov；48(6)：375-87)。在一些实施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制ACS2基因产物表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。ACS2基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：850846入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微 生物中操作FAA1基因产物的活性的方法。FAA1基因产物催化具有辅酶A的长链脂肪酸的细胞质硫酯化以产生活化的中间体。解脂耶氏酵母FAA1是酿酒酵母P30624FAA1长链脂肪酸辅酶A连接酶的同系物。该酶参与游离脂肪酸储积的产生以及脂肪酸的分泌。在一些实施方案中，在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中过表达FAA1基因产物以赋予大规模地将碳水化合物转化为脂质的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对浓度升高的碳源或脂质产物增强的耐受。FAA1基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：854495入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中操作非常长链脂肪酸辅酶A合成酶(FAT1)活性的方法。认为FAT1控制具有辅酶A的非常长链脂肪酸的脂肪酸转运和硫酯化。解脂耶氏酵母包含FAT1非常长链脂肪酸辅酶A合成酶。在一些实施方案中，通过例如遗传操作来抑制FAT1活性以阻止非常长脂肪酸衍生物的合成和/或增加游离脂肪酸的储积。在一些实施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制FAT1基因产物的表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。FAT1基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：852329入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了操作PCS60的方法，PCS60也称为FAT2、AMP结合蛋白酰基辅酶A合成酶或过氧化物酶体辅酶A合成酶，它是具有未确定底物特异性的过氧化物酶体酰基辅酶A合成酶。解脂耶氏酵母包含酿酒酵母PCS 60同系物。抑制PCS60将阻止非常长脂肪酸衍生物的合成并增加游离脂肪酸的储积。在本发明的一些实施方案中，在微生物中敲除、敲低和/或抑制PCS60基因产物的表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。FAT2基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：852523入口下可见示 例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了在用于大规模生产生物燃料或生物燃料前体的微生物(例如解脂耶氏酵母)中过表达ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)的方法。适于以工业规模生产生物燃料或生物燃料前体的一些微生物(包括解脂耶氏酵母)通常产生大量柠檬酸。ACLY介导柠檬酸转化为辅酶A，根据本发明的一些方面，该反应可以通过ACLY表达促进(参见Holz M， A，Mauersberger S，Barth G，Aconitase overexpression changes theproductratio of citric acidproduction by Yarrowia lipolytica.Appl MicrobiolBiotechnol.2009Jan；81(6)：1087-96)。在一些实施方案中，ACLY过表达降低不期望的柠檬酸产生和/或提供其它来源的乙酰辅酶A用于合成生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方案中，在用于生产生物燃料或生物燃料前体的微生物(包括解脂耶氏酵母)中抑制柠檬酸的过量产生。在一些实施方案中，微生物中(例如解脂耶氏酵母中)ACLY过表达增加脂肪酸合成率和/或赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存以及增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度的增强的耐受。也参见Lasserre JP，Nicaud JM，Pagot Y，Joubert-Caron R，Caron M，HardouinJ.Talanta.First complexomic study of alkane-binding protein complexes in theyeast Yarrowia lipolytica. 2010 Feb 15；80(4)：1576-85。ACLY基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：108728入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了过表达脂肪酸合酶复合物(FAS)的方法。虽然ACC可能是脂肪酸合成中的限速酶，但是也已提出其它步骤对该途径进行控制，最值得注意的是FAS(参见Schweizer E， H，Regler R，Rottner G.J，Genetic control of Yarrowialipolytica fatty acid synthetase biosynthesis and function.BasicMicrobiol.1988；28(5)：283-92)。该复合物是在整个脂质合成途径中底物最强(mostsubstrate-intensive)的过程中延伸脂肪酸链的多功能多肽。在一些实施方案中，微生物中(例如解脂耶氏酵母中)ACLY过表达增加了脂肪酸合成率和/或赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存和/或分泌、增加的生长速率、对物质(例如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度增强的耐受。FAS基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。 NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：853653和GeneID：855845入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

本发明的一些方面提供了抑制AMP活化蛋白激酶(AMPK)的方法。AMPK是通过应答于细胞AMP：ADP比率通过磷酸化来调节其它蛋白质的活性的调节酶(参见Lee-Young RS，Palmer MJ，Linden KC，LePlastrier K，Canny BJ，Hargreaves M，Wadley GD，Kemp BE，McConell GK.Carbohydrate ingestion does not alter skeletal muscle AMPKsignaling during exercise in humans.Am J Physiol Endocrinol Metab.2006Sep；291(3)：E566-73)。在酵母中，AMPK表现出靶向ACC和INO 1，INO1是脂质生物合成早期步骤所需的基因。在AMPK敲除突变体中缺少ACC磷酸化导致超活化的ACC和脂肪酸的过量产生。在一些实施方案中，在微生物中抑制AMPK引起脂质合成的超活化。在一些实施方案中，通过例如敲除AMPK基因完全消除微生物中的AMPK活性。在一些实施方案中，通过例如遗传或非遗传操作抑制微生物中AMPK的活性。AMPK活性的抑制(与完全消除不同)可避免对由AMPK调节的其它细胞过程的负作用。在一些实施方案中，在微生物(例如解脂耶氏酵母)中敲除、敲低和/或抑制AMPK基因产物的表达或活性以赋予大规模地将碳水化合物转化为生物燃料或生物燃料前体的有利表型，例如增加的脂质合成率、增加的碳水化合物向脂质转化的效率、增加的脂质储存和/或分泌、增加的生长速率、对物质(如碳源、生物燃料或生物燃料前体或有毒物质)浓度增强的耐受。AMPK基因和基因产物序列为本领域技术人员所公知。NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中GeneID：100145903入口下可见示例性的代表性基因和基因产物序列。

分离的核酸

本发明的一些方面提供了为微生物(例如解脂耶氏酵母)赋予生产生物燃料或生物燃料前体的需要和/或期望表型之基因产物的编码核酸。在一些实施方案中，该核酸是来自解脂耶氏酵母的核酸。在一些实施方案中，该核酸编码去饱和酶，例如Δ9去饱和酶。在一些实施方案中，该核酸编码解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶。在一些实施方案中，该核酸包含SEQID NO：1。在一些实施方案中，该核酸是SEQ ID NO：1。在一些方案中，该核酸编码基因产物，例如由SEQ ID NO：1编码的蛋白质。

本发明的一些方面提供了基因产物(例如蛋白质)，其为微生物(例 如解脂耶氏酵母)赋予生产生物燃料或生物燃料前体的需要和/或期望表型。在一些实施方案中，该蛋白质是来自解脂耶氏酵母的蛋白质。在一些实施方案中，该蛋白质是去饱和酶，例如Δ9去饱和酶。在一些实施方案中，该蛋白质是解脂耶氏酵母Δ9去饱和酶。在一些实施方案中，该蛋白质的氨基酸序列是提供于SEQ ID NO：2中的氨基酸序列。

术语“核酸”是指包含多个连接的核苷酸的分子。“核酸”和“核酸分子”互换使用并且意指寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷酸。该术语还涵盖多核苷(即多核苷酸除去磷酸)和包含核酸的任意其它有机碱。有机碱包括腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和肌苷。核酸可以是单链的或双链的。核酸可以天然或非天然的。核酸可以从天然来源获得或者可以使用核酸合成仪合成(即合成的)。本领域中常规地进行核酸的分离并且合适的方法可见标准分子生物学教科书。(参见，例如Maniatis’Handbook of Molecular Biology。)如本文所述，核酸可以是DNA或RNA，如基因组DNA、线粒体DNA、mRNA、cDNA、rRNA、miRNA、PNA或LNA或者其组合。根据本发明的一些方面也可使用非天然核酸如细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。

本发明的一些方面涉及使用核酸衍生物。如将在本文中描述的，使用某些核酸衍生物可以通过防止本发明核酸的消化来增加其稳定性，特别是当它们暴露于可能包含核酸酶的生物样本时。本文中所使用的核酸衍生物是非天然核酸或其单元。核酸衍生物可以包含非天然元件如非天然核苷酸和非天然骨架连接。根据本发明一些方面的核酸衍生物可以包含骨架修饰例如但并不限于硫代磷酸酯连接、磷酸二酯修饰的核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸的组合、磷酸甲酯、磷酸烷基酯、磷酸酯、硫代磷酸烷基酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯(acetamidate)、羧甲基酯、硫代磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、对乙氧基及其组合。核酸的骨架组成可以是同源的或异源的。

根据本发明的一些方面的核酸衍生物可以包含糖和/或碱中的替换或修饰。例如，一些核酸衍生物可以包括具有骨架糖的核酸，骨架糖共价连接除3′位处的羟基外的和除5′位处的磷酸基外的低分子量有机基团(例如2′-O-烷基化核糖基团)。核酸衍生物可以包括非核糖糖阿拉伯糖。核酸衍生物可以包含取代的嘌呤和嘧啶如C-5丙炔修饰碱基、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、2-硫脲嘧啶和假异胞嘧啶。

在一些实施方案中，核酸可以包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、DNA、RNA或上述的联合核酸(co-nucleic acid)如DNA-LNA联合核酸。

本文所使用的术语“分离的核酸分子”是指不在其天然环境中的核酸，例如，(i)通过本领域已知方法从细胞或微生物(例如细菌或酵母)中提取和或/纯化的核酸，所述本领域已知方法例如碱性裂解宿主细胞然后例如通过氧化硅吸附法纯化核酸；(ii)通过例如聚合酶链反应(PCR)体外扩增的核酸；(iii)通过克隆(例如将核酸克隆入表达载体)重组产生的核酸；(iv)通过例如体外酶消化或通过剪切然后胶分离的片段化和大小分离的核酸；或者(v)通过例如化学合成而合成的核酸。在一些实施方案中，通过本领域公知的重组DNA技术易于操作分离的核酸。因此，认为克隆入载体的核酸或递送到宿主细胞并整合入宿主基因组的核酸是分离的，但在其天然宿主中的天然状态下(例如在宿主的基因组中)的核酸则不是。分离的核酸可以是基本纯化的，但不需要如此。例如，克隆或表达载体中的分离的核酸不是纯的，其可仅包含小百分比的其所处细胞中的物质。但是本文所使用的术语中这种核酸是分离的。

本发明的一些方面涉及赋予生产生物燃料或生物燃料前体的微生物所需或期望表型的基因产物的编码核酸，其与启动子或其它转录活化元件相连接。在一些实施方案中，编码基因产物且与启动子连接的核酸包含于表达载体或表达构建体中。本文所使用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指用一系列允许特定核酸在宿主微生物(例如产油酵母)中转录的特定核酸元件重组或合成产生的核酸构建体。在一些实施方案中，表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。在一些实施方案中，表达载体包含与启动子有效连接的待转录的编码核酸。启动子是促进待转录核酸进行转录的核酸元件。启动子通常位于相同链和其所控制转录的核酸序列的上游(或5’)。在一些实施方案中，表达载体包含与异源启动子有效连接的待转录的编码核酸。异源启动子是非天然地与给定核酸序列有效连接的启动子。例如，解脂耶氏酵母中的SCD基因天然地与解脂耶氏酵母SCD基因启动子有效连接。因此，除野生型解脂耶氏酵母SCD基因启动子以外的与SCD基因或其部分有效连接的任意启动子(例如表达构建体中)是异源启动子。

在一些实施方案中，表达载体包含有效连接组成型启动子的编码核酸，例如编码SCD基因产物的核酸。术语“组成型启动子”是指允许其相关联的基因持续转录的启动子。在一些实施方案中，表达载体包含有效连 接诱导型启动子的编码核酸，例如，编码SCD基因产物的核酸。在本文中与术语“条件性启动子”替换使用的术语“诱导型启动子”是指仅在存在或不存在生物或非生物因子时允许其相关联基因转录的启动子。本领域公知的诱导型启动子的例子是药物诱导型启动子(例如四环素/强力霉素诱导型启动子、他莫昔芬诱导型启动子)以及依赖于重组事件活化的启动子(例如crc-介导的loxP位点的重组)。

本领域技术人员公知将表达载体或表达构建体递送到微生物(例如酵母细胞)中的方法。可以通过生物相关领域技术人员公知的多种方法将核酸(包括表达载体)递送到原核微生物或真核微生物。根据本发明的一些方面的将核酸递送到微生物中的方法包括但不限于不同的化学、电化学和生物方法，例如，热休克转化、电穿孔、转染(例如脂质体介导的转染、DEAE-Dextran介导的转染或磷酸钙转染)。在一些实施方案中，使用用于转移遗传物质的载剂或载体将核酸构建体(例如SCD表达构建体)引入宿主微生物中。用于将遗传物质转移到微生物中的载体为本领域技术人员所公知，包括例如质粒、人工染色体和病毒载体。用于构建核酸构建体(包括包含组成型或诱导型异源启动子的表达构建体、敲除或敲低构建体)的方法以及用于将核酸或核酸构建体递送到微生物中的方法和载体为本领域技术人员所公知，并描述于例如以下中：J.Sambrook和D.Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；第3版(January 15，2001)；David C.Amberg，Daniel J.Burke和Jeffrey N.Strathern，Methods in Yeast Genetics：ACold Spring Harbor Laboratory Course Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(April 2005)；John N.Abelson，Melvin I.Simon，Christine Guthrie和GeraldR.Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Part A，第194卷(Methodsin Enzymology Series，194)，Academic Press(March 11，2004)；Christine Guthrie和Gerald R. Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology，Part B，第350卷(Methods in Enzymology，第350卷)，Academic Press；第1版(July 2，2002)；Christine Guthrie and

Gerald R, Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular and CellBiology，Part C，第351卷，Academic Press；第1版(July 9，2002)；GregoryN.Stephanopoulos，Aristos A.Aristidou和Jens Nielsen，Metabolic Engineering：Principles and Methodologies，Academic Press；第1版(October 16，1998)；以及Christina Smolke，The Metabolic Pathway Engineering Handbook：Fundamentals，CRCPress；第1版(July 28， 2009)，其全部通过引用并入本文。

在一些实施方案中，在微生物中对赋予微生物所需或期望表型之基因产物的编码基因的天然启动子(例如天然SCD启动子)进行修饰以改变其转录活性的调节。在一些实施方案中，与未经修饰的对应物相比，经修饰启动子表现出增加的转录活性。本文所使用的术语“经修饰启动子”是指其核苷酸序列已被人工改变的启动子。这样的人工改变的例子是单独的或组合的核苷酸缺失、插入或突变。可以以靶向的方式进行人工启动子改变，例如通过同源重组方法，如基因靶向、敲除、敲低、定点突变或人工锌指核酸酶介导的策略。或者，可以通过随机或半随机事件如照射或非靶向的核苷酸整合后续选择来进行这样的改变。一般进行启动子修饰以调控各启动子的转录活化特性。例如，破坏或缺失介导应答于胞内脂肪酸水平升高来抑制SCD启动子的调节元件将引起SCD基因的持续转录活化，即使在胞内脂肪酸水平升高的条件下也是如此。类似地，将组成型活化的转录活化元件插入条件性启动子区可以使各基因在正常抑制性条件下过表达。本领域技术人员公知在微生物中靶向破坏(例如引起转录速率增加的靶向破坏)天然启动子(例如天然SCD启动子)的方法。

在一些实施方案中，提供核酸构建体用于在生产生物燃料或生物燃料前体的微生物中敲除Δ-12去饱和酶基因。在一些实施方案中，敲除构建体包含微生物Δ-12去饱和酶基因的基因组序列，其侧翼的核苷酸序列在插入Δ-12去饱和酶基因时破坏Δ-12去饱和酶基因产物的表达。在一些实施方案中，破坏Δ-12去饱和酶基因产物表达的核酸是抗生素抗性标记物，例如腐草霉素抗性基因。在一些实施方案中，Δ-12去饱和酶敲除载体包含SEQIDNO：28所提供的序列。将敲除载体递送到微生物中的方法为本领域技术人员所公知，在微生物中(例如酵母中)进行同源重组的方法为本领域技术人员所公知。本发明并不限于该方面。

微生物改造方法

本发明的一些方面涉及经改造微生物(例如解脂耶氏酵母)以表现出以大规模生产生物燃料或生物燃料前体的所需和/或期望表型。本发明的一些方面涉及代谢改造SCD途径以得到针对生产生物燃料进行了优化的微生物。本发明的一些方面涉及代谢改造调节碳流入或流出脂肪酸合成途径的基因以得到针对生产生物燃料进行了优化的微生物。

本发明的一些方面提供了通过调节解脂耶氏酵母的天然脂代谢大大增加解脂耶氏酵母介导的碳源向脂质的转化效率的方法。本发明的一些方面涉及这样的发现：过表达增加脂肪酸或三酰甘油积累的基因(如SClD)不仅引起脂质积累增加，而且引起脂质合成率、脂质含量和/或生长速率增加。显著地和出乎意料地，根据由本发明提供的一些方法的脂质代谢调节还赋予另一些有利性质，例如对原料物质(包括高浓度底物(例如葡萄糖))和/或通常污染原料(例如经预处理的原料)的有毒物质的耐受增强。这样的污染物质的一些非限制性例子是糠醛、5-羟甲基糠醛和乙酸类。预处理后产生污染的有毒物质的原料物质的非限制例子是来自木材的原料、玉米秸秆和甘蔗渣。

本发明的一些方面涉及在解脂耶氏酵母中通过克制脂质代谢的关键调节因子的转录抑制(例如通过克制SCD的转录抑制)来改造出所需和/或期望表型。还考虑了在产生生物燃料的另一些微生物(例如酵母、细菌、真菌或藻类)中操作脂质代谢的关键调节因子(例如，SCD)。

为了改造用于以工业规模生产生物燃料的生物(例如产油酵母)，重要的是详细理解各生物中调控脂肪酸和脂质代谢的分子机制。直至本发明，用于生物燃料生产的产生油的微生物(例如产油酵母)中的脂肪酸和脂质代谢调节因子的鉴定和功能注释仍未解决。本发明的一些方面提供了产油酵母解脂耶氏酵母中的关键调节因子基因SCD的鉴定和功能注释。还提供了分离的SCD核酸和蛋白质分子。

本发明的一些方面涉及通过遗传改造在微生物中改造出用于生产生物燃料或生物燃料前体的期望表型。本发明的一些方面涉及在微生物中操作参与生产生物燃料或生物燃料前体(例如脂肪酸或三酰甘油)的基因。本发明的一些方面涉及在微生物中平行地操作参与生产生物燃料或生物燃料前体的多个基因。

在一些实施方案中，通过本发明的一些方面提供的方法操作单个基因来改造微生物用于生产生物燃料或生物燃料前体，所述基因例如Δ9去饱和酶(例如，SCD)、GLUT(例如，Glut1)、血红蛋白、细胞色素(例如，细胞色素B5)、苹果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAA1、FAT1、FAT2、ACLY、FAS、AMPK、JNK2或Δ-12去饱和酶。在一些实施方案中，通过本发明的一些方面提供的方法操作多个基因来改造微生物用于生产生物燃料或生物燃料前体，所述基因例如Δ9去饱和酶(例如，SCD)、GLUT(例如，Glut1)、血红蛋白、细胞色素(例如，细胞色素B5)、苹果酸酶、 ACC、ACS、ACS2、FAA1、FAT1、FAT2、ACLY、EAS、JNK2、Δ-12去饱和酶和/或AMPK中两个或更多个的任意组合。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因产物和另外的基因产物表达的其它操作(例如遗传操作)，所述另外的基因产物例如GLUT(例如，Glut1)、血红蛋白、细胞色素(例如，细胞色素B5)、苹果酸酶、ACC、ACS、ACS2、FAA1、FAT1、FAT2、ACLY、FAS、JNK2、Δ-12去饱和酶或AMPK基因产物。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因产物和血红蛋白基因产物。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因产物和GLUT基因产物(例如Glut1基因产物)。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因产物、GLUT基因产物(例如Glut1基因产物)以及血红蛋白和/或细胞色素基因产物。在一些实施方案中，改造微生物以包含增加水平的SCD基因产物和Glut1、血红蛋白以及细胞色素b5和任选的Δ12去饱和酶敲除。在一些实施方案中，微生物是解脂耶氏酵母。

用于生产生物燃料的经改造微生物

本发明的一些方面涉及针对大规模生产生物燃料或生物燃料前体进行了改造和/或优化的微生物。在一些实施方案中，提供了通过由本发明的一些方面提供的方法或者使用由本发明的一些方面提供的核酸或蛋白质进行了操作的经改造微生物。在一些实施方案中，提供了过表达根据本发明的一些方面为微生物赋予生产生物燃料或生物燃料前体所需和/或期望之表型的基因产物的经改造微生物。在一些实施方案中，提供了包含增加的SCD基因产物活性的微生物。在一些实施方案中，微生物表现出增加的脂肪酸合成率、增加的TAG储存和/或其它所需或期望性状。

在一些实施方案中，经改造微生物是产油酵母，例如解脂耶氏酵母。在一些实施方案中，由本发明提供的经改造酵母表现出一个或更多个极理想和出乎意料的表型特性，例如：增加的碳至油的转化(例如以接近理论值的比率)、强生长、持续的油生产、显著的生物质生产以及对碳源和相关物质增强的耐受。

在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物(例如，经改造酵母)表现出约0.02g/g(所产生的油、脂质或TAG的克数/所消耗的葡萄糖的克数)至约0.3g/g的碳至油转化率。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物(例如经改造酵母)表现出以下碳 至油转化率：约0.010g/g(所产生TAG的克数/所消耗的葡萄糖的克数)、约0.02g/g，约0.025g/g，约0.03g/g，约0.04g/g，约0.05g/g，约0.06g/g，约0.07g/g，约0.075g/g，约0.08g/g，约0.09g/g，约0.1g/g，约0.11g/g，约0.12g/g，约0.13g/g，约0.14g/g，约0.15g/g，约0.16g/g，约0.17g/g，约0.18g/g，约0.19g/g，约0.2g/g，约0.21g/g，约0.22g/g，约0.23g/g，约0.24g/g，约0.25g/g，约0.26g/g，约0.27g/g，约0.28g/g，约0.29g/g或约0.3g/g或者接近理论值。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物(例如经改造酵母)表现出以下碳至油转化率：至少约0.010g/g(所产生的TAG克数/所消耗的葡萄糖克数)、至少约0.02g/g、至少约0.025g/g、至少约0.03g/g、至少约0.04g/g、至少约0.05g/g、至少约0.06g/g、至少约0.07g/g、至少约0.075g/g、至少约0.08g/g、至少约0.09g/g、至少约0.1g/g、至少约0.11g/g、至少约0.12g/g、至少约0.13g/g、至少约0.14g/g、至少约0.15g/g、至少约0.16g/g、至少约0.17g/g、至少约0.18g/g、至少约0.19g/g、至少约0.2g/g、至少约0.21g/g、至少约0.22g/g、至少约0.23g/g、至少约0.24g/g、至少约0.25g/g、至少约0.26g/g、至少约0.27g/g、至少约0.28g/g、至少约0.29g/g或至少约0.3g/g或接近理论值。

在一些实施方案中，与野生型酵母相比，由本发明的一些方面提供的经改造酵母表现出增加为以下的生物质产生：约2倍、约2.5倍、约5倍、约7.5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约32倍、约35倍或约40倍。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造酵母表现出对碳源和/或相关物质浓度的耐受为由野生型酵母所耐受的最高浓度的多至约150％、多至约175％、多至约200％、多至约225％、多至约250％、多至约275％、多至约300％、多至约325％、多至约350％、多至约375％、多至约400％或多至约500％。碳源相关物质的非限制性例子包括污染碳源的有毒物质，例如在预处理碳源期间产生或使用的物质(例如，酸性物质如乙酸类或氨)。

本文中所示出的数据确定了产油酵母中脂质积累的一个新的限速步骤，改造其使得经操作的微生物大大改进就从碳水化合物源(例如葡萄糖)生产生物燃料而言的特性。因此，由本发明提供的方法和生产是使用微生物(例如酵母)发酵从可再生碳水化合物源替代性地生成生物燃料的重大进步。

用于生产生物燃料的微生物培养物

本发明的一些方面涉及本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分离的核酸或蛋白质的微生物培养物。

在一些实施方案中，培养物包含本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含来自本文列出的分离的核酸或蛋白质的微生物，以及培养基(例如液体培养基)。

在一些实施方案中，培养物包含本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分离的核酸或蛋白质的微生物，以及碳水化合物源。

在一些实施方案中，培养物包含本文中所提供的或者根据本发明的一些方面改造的或者包含本文中所提供的分离的核酸或蛋白质的微生物，以及建立顺应微生物的存活、生长和或微生物中碳水化合物向生物燃料或生物燃料前体转化的盐度、渗透压和pH条件的盐和/或缓冲液。

在一些实施方案中，培养物包含其它组分，例如添加剂。添加剂的非限制性实例是营养物、酶、氨基酸、白蛋白、生长因子、酶抑制剂(例如蛋白酶抑制剂)、脂肪酸、脂质、激素(例如地塞米松和赤霉素)、微量元素、无机化合物(例如还原剂如锰)、氧化还原调节剂(例如抗氧化剂)、稳定剂(例如二甲亚砜)、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、抗生素(例如布雷菲德菌素A)、盐(例如NaCl)、螯合剂(例如EDTA、EGTA)和酶(例如纤维素酶、分散酶(dispase)、透明质酸酶或DNA酶)。在一些实施方案中，培养物可以包含诱导或抑制从条件性或诱导型启动子转录的药物，例如多西环素、四环素、他莫昔芬、IPTG、激素或金属离子。

尽管具体培养条件(例如碳源的浓度)取决于各待培养的经改造微生物，但用于产生微生物培养物的一般方法和培养条件为本领域技术人员已知，并描述于例如以下中：J.Sambrook和D.Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press；第3版(January 15，2001)；David C.Amberg，Daniel J.Burke和Jeffrey N.Strathern，Methods in Yeast Genetics：A Cold Spring Harbor LaboratoryCourse Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(April 2005)；John N.Abelson，Melvin I.Simon，Christine Guthrie和Gerald R.Fink，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology，Part A，第194卷(Methods in Enzymology Series，194)，AcademicPress(March 11，2004)；Christine Guthrie和Gerald R. Fink，Guide to YeastGenetics and Molecular and CEll Biology，Part B，第350卷(Methods in Enzymology，Vol 350)，Academic Press；第1板(July 2，2002)；以及Christine Guthrie和GeraldR.Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Part C，第351善，Academic Press；第1版(July 9，2002)，其全部通过引用并入本文。如本领域公知的，对于油生产，在适于油积累的条件下培养本文所述的经改造微生物培养物。

在一些实施方案中，提供了显示超出相同类型的野生型微生物和/或超出其它微生物(例如通常见于在碳源向生物燃料或生物燃料前体转化中污染微生物培养物的微生物)的生长优势的经改造微生物。例如，在一些实施方案中，提供了与相同类型的野生型微生物或其它微生物相比表现出增加的增殖速率和/或在对相同种类的野生型微生物和/或其它微生物有毒或限制生长或繁殖的条件下的增强的耐受或存活力。在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的经改造微生物的生长和/或增殖优势转化成使用未灭菌培养和发酵条件来生产生物燃料或生物燃料前体的可能性，因为这样缓解或完全取消了由污染微生物引起的培养物过度生长问题。在一些实施方案中，在未灭菌条件下培养由本发明的一些方面提供的经改造微生物以生产生物燃料或生物燃料前体。例如，在一些实施方案中，使用未灭菌原料、未灭菌培养基、未灭菌添加物或未灭菌生物反应器(例如未灭菌条件下的开放反应器)生产生物燃料或生物燃料前体。

用于生产生物燃料的方法/原料/生物反应器

本发明的一些方面涉及使用本发明的经修饰微生物生产生物燃料或生物燃料前体的方法。在一些实施方案中，提供了以工业规模生产生物燃料或生物燃料前体的方法。

使用由本发明的一些方面提供的方法可以将多种碳源转化为生物燃料或生物燃料前体。糖、淀粉和纤维是适用于由本发明的一些方面提供的转化方法的碳水化合物源的非限制性例子。根据本发明的一些方面，碳水化合物源可以包含精炼和/或未精炼的糖、淀粉和/或纤维或者其任意组合。糖的非限制性例子是可发酵糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和乳糖。淀粉的非限制性例子是淀粉酶和支链淀粉。纤维的非限制性例子是植物纤维，如纤维素、半纤维素和木质纤维。本发明的一些方面涉及使用工业副产品、中间产物或废品(例如粗植物提取物、糖蜜、秸秆或污水)作为碳源。在一些实施方案中，碳源来自藻类。在一些实施方案中，特意产生藻 类生物质以在微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产中用作碳源。

在一些实施方案中，提供了用于生产生物燃料或生物燃料前体的方法，其包括使用廉价的、丰富的和易于得到的碳源原料作为碳源。在一些实施方案中，使用纤维素或半纤维作为碳源。在一些实施方案中，纤维素或半纤维素来自工业副产品或废品。在一些实施方案中，纤维素或半纤维素直接地来自植物或藻类生物质。植物或藻类生物质是最丰富的原料之一，并且包括大量不可发酵糖和纤维，例如纤维素和半纤维素。在一些实施方案中，预处理生物质原料以将不可发酵糖或纤维转化成可发酵糖，从而使其可用于微生物生长和微生物介导的生物燃料或生物燃料前体生产。在一些实施方案中，生物质原料的预处理包括使用本领域技术人员公知的预处理方法将纤维素和/或半纤维素组分解聚为单糖，所述预处理方法例如稀酸或氨纤维膨胀(AFEX)法(参见，例如Yang B，Wyman CE.Dilute acid andautohydrolysis pretreatment.Methods Mol Biol.2009；581：103-14；Balan V，Bals B，Chundawat SP，Marshall D，Dale BE，Lignocellulosic biomasspretreatment usingAFEXMethods Mol Biol.2009；581：61-77)。用于将生物质聚合物解聚为单糖的其它方法为本领域技术人员公知并考虑用于本发明的一些实施方案中。

在一些实施方案中，使用稀酸法预处理包含不可发酵糖的生物质原料以将不可发酵糖解聚为可发酵单糖。在一些实施方案中，在适度温和的温度下用稀硫酸以确定的时间处理生物质。例如，在一些实施方案中，用约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％或约6％的硫酸处理生物质。在一些实施方案中，在约30℃、约37℃、约40℃、约50℃、约60℃、约70℃、约80℃、约90℃、约100℃、约110℃、约120℃、约130℃、约140℃、约150℃、约175℃、约200℃或多于约200℃下处理生物质。

在一些实施方案中，所得水解产物包含不溶性木质素和可溶性纤维素聚合物和半纤维素聚合物。可以通过本领域技术人员公知的方法(例如通过用纤维素酶或其它水解酶)处理来进一步处理后面的产物以产生己糖和戊糖如葡萄糖和木糖单体。在一些实施方案中，用稀酸预处理不可发酵糖导致产生包含有毒化合物的副产物，根据本发明的一些方面，其抑制未改造微生物的生长、降低其活力和/或抑制其生物燃料或生物燃料前体的生产。在一些实施方案中，洗涤经预处理的原料，补充支持微生物生长和生物燃料或生物燃料前体生产的培养基和/或加过量石灰以解毒。

在一些实施方案中，使用AFEX法预处理包含不可发酵糖的生物质 原料以使不可发酵糖解聚为可发酵单糖。在一些实施方案中，在高温和高压下用液氨以确定的时间处理生物质。在一些实施方案中，处理生物质约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟或更长。在一些实施方案中，在约30℃、约37℃、约40℃、约50℃、约60℃、约70℃、约80℃、约90℃、约100℃、约110℃、约120℃、约130℃、约140℃、约150℃、约175℃、约200℃或多于约200℃下处理生物质。在一些实施方案中，AFEX预处理导致包含于原料中的结晶纤维素转化为非定形的可发酵形式。在一些实施方案中，经AFEX预处理的生物质原料不包含大量抑制微生物生长和/或生物燃料或生物燃料前体生产的有毒副产物，并且使用之前无需为生产生物燃料或生物燃料前体而解毒。

在一些实施方案中，用水解或解聚糖聚合物的酶(例如用纤维素酶或半纤维素酶)处理经预处理或未经预处理的生物质原料。在一些实施方案中，使原料与酶在液相中接触，并在使得酶催化解聚或水解反应的温度下孵育足以水解或解聚生物质原料中的显著量不可发酵糖或纤维的一段时间。在一些实施方案中，孵育以水解和解聚之后，通过例如离心将与酶接触的原料的液相(包含可溶性可发酵糖级分)与包含不可发酵糖和纤维的固相分离。在一些实施方案中，随后使原料的液体级分与用于转化为生物燃料或生物燃料前体的微生物(例如由本发明的一些方面提供的)接触。在一些实施方案中，不可发酵糖或纤维的酶促转化发生于联合的生物过程中，例如与所产生的可发酵糖向生物燃料或生物燃料前体的微生物转化在相同时间和/或相同反应器中。在一些实施方案中，先进行酶促转化，然后使与酶接触的原料与生产生物燃料或生物燃料前体的微生物接触。在一些实施方案中，在相同时间和在相同反应器中进行酶促和微生物转化。

在一些实施方案中，以乙酸类作为主要碳源来培养本文中提供的经改造微生物，例如过表达SCD基因且任选地携带本文所述的其它修饰的解脂耶氏酵母。例如，在一些实施方案中，在浓度为以下的乙酸类溶液中培养微生物：约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在一些实施方案中，乙酸类浓度为约3％～10％。在一些实施方案中，以乙酸类作为主要碳源培养的包含如本文所提供的经改造微生物的细胞培养物与甘油接触或被掺入甘油。在一些实施方案中，使微生物与甘油间歇地接触。在一些实施方案中，使微生物与甘油连续地或半连续地接触。在一些实施方案中，微生物与浓度为约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％或约5％的甘油接触。使本文所提供的经改造微生 物与甘油接触为产生TAG提供了更需要代谢物，并且从碳水化合物生产脂肪酸所需的还原部分。在一些实施方案中，在使用除乙酸类以外的碳源(例如本文所述的任意碳源)进行生物燃料或生物燃料前体生产方法中掺入甘油。

在一些实施方案中，大规模的微生物介导的碳水化合物向脂质转化的发酵过程可以在生物反应器中进行。本文中替换使用的术语“生物反应器”和“发酵器”是指其中发生生物和/或化学反应(其至少部分涉及活生物或者活生物的部分)的封闭物(enclosure)或部分封闭物。“大规模生物反应器”或“工业规模生物反应器”是用于以商业或半商业规模生产产物(例如生物燃料或生物燃料前体例如脂肪酸和/或TAG)的生物反应器。大规模生物反应器的体积范围通常在数升、数百升、数千升或更大。

根据本发明一些方面的生物反应器可以包含微生物或微生物培养物。在一些实施方案中，生物反应器可以包含例如由本发明的一些方面提供的任意分离的微生物的芽孢和/或任意种类的休眠细胞类型，例如呈干燥状态的。在一些实施方案中，向这样的生物反应器中添加合适的碳水化合物源可以引起休眠细胞的活化，例如酵母孢子的萌发和随后至少部分碳水化合物源转化为生物燃料或生物燃料前体。

根据本发明一些方面的一些生物反应器可以包含细胞培养系统，其中微生物与移动液体和/或气泡接触。根据本发明的一些方面的微生物或微生物培养物可以在悬液中或者附着到固相载体上培养。载体系统的非限制性例子包括微载体(例如可以是多孔的或非多孔的聚合物球体、微珠和微盘)、具有特定化学基团(例如叔胺基)的交联珠(例如葡聚糖)、包含捕获于无孔聚合物纤维的细胞的2D微载体、3D微载体(例如，可以包含多孔纤维的载体纤维、空心纤维、多筒反应器和半渗透膜)、具有降低的离子交换能力的微载体、包封的细胞、毛细管和聚集体。载体可以由材料如葡聚糖、明胶、玻璃和纤维素制成。

可以以连续、半连续或非连续模式进行根据本发明一些方面的工业规模的碳水化合物向脂质的转化过程。根据本发明的操作模式的非限制性例子是分批、补料分批、延伸分批(extended batch)、重复分批、抽/填、旋转壁、旋转瓶和/或灌注模式的操作。

在一些实施方案中，可以使用允许从生物反应器连续或半连续补给底物原料(例如碳水化合物源)和/或连续或半连续分离产物(例如分泌脂质、包含脂质的有机相、和/或表现出所需脂质含量的细胞)的生物反应 器。

本发明生物反应器的非限制性例子是搅拌式发酵罐、通过旋转混合装置进行搅拌的生物反应器、恒化器、通过振摇装置进行搅拌的生物反应器、气升式发酵器、填充床反应器、固定床反应器、流化床生物反应器、利用波诱导型搅拌的生物反应器、离心式生物反应器、辊瓶和空心纤维生物反应器、辊装置(例如台式的、车载的和/自动种类的)、垂直堆叠盘、转瓶、搅拌或摇动瓶、振荡式多孔板、MD瓶、T瓶、Roux瓶、多表面组织培养培育器、改进的发酵器和包被的珠(例如，用血清蛋白、硝化纤维素或羧甲基纤维素包被以防止细胞粘附的珠)。

根据本发明一些方面的生物反应器和发酵器可以任选地包含传感器和/或控制系统以测量和/或调节反应参数。反应参数的非限制性例子是：生物参数例如生长速率、细胞大小、细胞数目、细胞密度、细胞类型或细胞状态；化学参数例如pH、氧化还原电位、反应底物和/或产物的浓度、溶解气体的浓度例如氧浓度和CO₂浓度、营养物浓度、代谢物浓度、葡萄糖浓度、谷氨酰胺浓度、丙酮酸浓度、磷灰石浓度、寡聚肽浓度、氨基酸浓度、维生素浓度、激素浓度、添加剂浓度、血清浓度、离子强度、离子浓度、相对湿度、摩尔浓度、渗透压、其它化学品(例如缓冲剂、佐剂或反应副产物)的浓度；物理/化学参数，例如密度、传导率、搅拌程度、压力和流速、剪切应力、剪切速率、粘度、颜色、浊度、光吸收、混合速率、转化率以及热动力学参数，例如温度、光强/光质等。

能够测量本文所述的参数的传感器为力学和电学相关领域的技术人员所公知。基于从本文所述的传感器输入能够调节生物反应器中参数的控制系统为生物反应器工程领域的技术人员所公知。

可以在合适的生物反应器中培养本发明一些方面所提供的多种不同微生物以根据本发明的一些方面进行大规模的碳水化合物向生物燃料或生物燃料前体转化，例如来自多种酵母(如产油酵母)、细菌、藻类和真菌源的微生物。

酵母细胞的非限制性例子是来自以下的细胞：解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、克鲁氏乳酸酵母(S.K.lactis)、Waltomyceslipofer.Mortierella alpine、Mortierella isabellina、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneu)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、 淀粉酶酵母(Saccharomyces diastasicus)、许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

细菌的非限制性例子是枯草杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链霉菌(Streptomyces)、荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单孢菌属(Pseudomonas sp)、红球菌属(Rhodococcus sp)、链霉菌属(Streptomvces sp)和产碱菌属(Alcaligenes sp.)。

可以从例如以下物种培养真菌细胞：曲霉菌西肉萨米(Aspergillusshirousamii)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。

藻类细胞的非限制性例子是来自以下的细胞：富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)、对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)、微藻属(Nannochloropsis sp)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、小球藻(Chlorella vulgaris)、浮水小球藻(Chlorellaemersonii)和极大螺旋藻(Spirulina maxima)。

根据本发明一些方面转化为生物燃料或生物燃料前体的碳水化合物源的类型取决于所使用的特定微生物。由本发明的一些方面提供的一些微生物可以用于有效地转化特定碳水化合物源，而不同的碳水化合物源可能不能被相同的微生物高效处理或者根本不能处理。根据本发明的一些方面，产油酵母解脂耶氏酵母可以有效地将糖(如葡萄糖、果糖、蔗糖和/或乳糖)和糖含量较高的碳水化合物源(例如糖蜜)和植物纤维转化为脂肪酸及其衍生物。

在一些实施方案中，由本发明的一些方面提供的微生物(例如产油酵母如解脂耶氏酵母)至少部分地分泌产生自碳源原料的生物燃料或生物燃料前体，例如脂肪酸或三酰甘油。在一些实施方案中，使本发明一些方面提供的微生物与碳水化合物源在反应器中的水性溶液中接触，并且所分泌的生物燃料或生物燃料前体形成可以与水相分离的有机相。本文所使用的术语有机相是指包含非极性有机化合物(例如脂肪酸、TAG和/或其它非极性脂质)的液相。本发明的有机相可以进一步包含微生物、碳水化合物或见于各生物反应器中其它相中的其它化合物。用于工业规模的相分离的方法为本领域技术人员所公知。在一些实施方案中，有机相被连续地或半 连续地吸除。在一些实施方案中，使用包含连续地或半连续地提取有机相的分离器的生物反应器。

在一些实施方案中，生物燃料或生物燃料前体在根据本发明一些方面的细胞中积累。在一些实施方案中，通过例如离心、沉降或过滤从生物反应器中连续地或半连续地分离积累了期望量的生物燃料或生物燃料前体的细胞。可以例如基于细胞物理特性(如细胞大小或密度)的变化通过本领域技术人员公知的方法进一步进行的细胞分离。然后，可以使用本领域技术人员公知标准萃取方法(例如溶剂己烷萃取)从各细胞中萃取所积累的生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方案中，收集微生物细胞并用3倍所收集细胞体积的己烷进行萃取。在一些实施方案中，进一步精炼所萃取的生物燃料或生物燃料前体。在一些实施方案中，使用本领域技术人员公知的方法(例如酯交换方法)将生物燃料前体(例如三酰甘油)转化为生物燃料(例如生物柴油)。

本发明的这些和其它实施方案的功能和优点将从下列实施例变得更完全地理解。以下实施例意在解释本发明的益处，但并不代表本发明的全部范围。

实施例

材料和方法

基因构建体：将各基因(例如，GLUT1、血红蛋白、细胞色素、丙酮酸羧化酶、SCD等)克隆入质粒YLEX(图12)的位点Pm1I和Kpn之间。所使用的限制性位点是Pm1I和KpnI。对所有cDNA进行测序并在基因组数据库中比对(mapped)。比对的所克隆cDNA的示例性有代表性的序列数据库条目包括GLUT1：基因ID：6513；血红蛋白：粪透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)细菌血红蛋白基因，ACCESSION L77863；细胞色素：基因ID：1528，CYB5A细胞色素b5A型；丙酮酸羧化酶：基因ID：5091；SCD硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)：基因ID：710155。

可用于产生过表达微生物的代表性序列(例如编码序列)为，例如：血红蛋白(细菌)

ATGTTAGACCAACAAACCGTAGACACCAGCAAAGCCACTGTTCCTGTATTGAAAGAGCATGGCGTGACCATTACCACGACGTT

TTACCAAAATTTGTTTGCCAAACATCCTGAAGTACGACCTTTGTTTGACATGGGTCGCCAAGCATCTTTGGAACAGCCTAAGG

CTTTGGCGATGACGGTTGGGGCGGCGGCACAAAACATTGAAAATTTACCTGCAATTTTGCCTGCAGTACAAAAAATTGCCGTC

AAACATTGTCAAGCAGGCGTGGCGGCACGACATTATCCGATTGTGGGTCAAGAATTGTTGGGTGCGATTAAAGAATTATTGGG

TGATGCGGCGACCGATGATATTTTGGATGCGTGGGGCAAGGCTTATGGCGTGATTGCCGATGTTTTTATTCAAGTGGAAGCGG

ATTTGTACGCTCAAGACGCTGAATAA (SEQ ID NO：3)

细胞色素B(耶氏酵母)

ATGATCATCAACGGCAAGGTCTACGACATCTCCAGCTTCGTTGACGAGCATCCCGGTGGAGAGGAGGTTCTTCTTGATGCCGG

TGGAACTGAGGCCACCAACGCTTTCGACGACGTTGGACACTCTGAGGACGCTTACGGCATCCTTAACGACCTCTATGTCGGTG

AGGTTGACCCCAGCGAGGACGTTATCCGAAAGACTCACACTGTCAAGACTTCTTACGAGGACGGCGAGTCTGTTGGTGATGAC

CACGGATCTTCTTCCATGATCTTCCTCATTGTTGCTGCTGCTGTTGCCGCCGCTGCTTTCTTCTACCTCCAGGGTCAGAAATAA(SEQ ID NO：4)

GLUT(大鼠)

ATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGGTGACGGGCCGCCTTATGTTGGCCGTGGGAGGGGCAGTGCTCGGATCCCTGCAGTTCGGCTA

TAACACCGGTGTCATCAACGCCCCCCAGAAGGTAATTGAGGAGTTCTACAATCAAACATGGAACCACCGCTATGGAGAGTCCA

TCCCATCCACCACACTCACCACACTCTGGTCTCTCTCCGTGGCCATCTTCTCTGTCGGGGGCATGATTGGTTCCTTCTCTGTG

GGCCTCTTTGTTAATCGCTTTGGCAGGCGGAACTCCATGCTGATGATGAACCTGTTGGCCTTTGTGTCTGCCGTGCTTATGGG

TTTCTCCAAACTGGGCAAGTCCTTTGAGATGCTGATCCTGGGCCGCTTCATCATTGGAGTGTACTGTGGCCTGACCACCGGCT

TTGTGCCCATGTATGTGGGGGAGGTGTCACCCACAGCTCTTCGTGGAGCCCTGGGCACCCTGCACCAGCTGGGCATCGTCGTT

GGGATCCTTATTGCCCAGGTGTTCGGCTTAGACTCCATCATGGGCAATGCAGACTTGTGGCCTCTACTGCTCAGTGTCATCTT

CATCCCAGCCCTGCTACAGTGTATCCTGTTGCCCTTCTGCCCTGAGAGCCCCCGCTTCCTGCTCATCAATCGTAACGAGGAGA

ACCGGGCCAAGAGTGTGCTGAAAAAGCTTCGAGGGACAGCCGATGTGACCCGAGACCTGCAGGAGATGAAAGAAGAGGGTCGG

CAGATGATGCGGGAGAAGAAGGTCACCATCTTGGAGCTGTTCCGCTCACCCGCCTACCGCCAGCCCATCCTCATCGCCGTGGT

GCTGCAGCTGTCCCAGCAGCTGTCGGGCATCAATGCTGTGTTCTACTACTCAACGAGCATCTTCGAGAAGGCAGGTGTGCAGC

AGCCTGTGTATGCCACCATCGGCTCGGGTATCGTCAACACGGCCTTCACTGTGGTGTCGCTGTTCGTCGTGGAGCGAGCTGGC

CGTCGGACCCTGCACCTCATTGGTCTGGCTGGCATGGCGGGCTGTGCTGTGCTCATGACCATCGCCCTGGCCCTGCTGGAGCA

GCTGCCCTGGATGTCCTATCTGAGTATCGTGGCCATCTTTGGCTTTGTGGCCTTCTTTGAAGTAGGCCCTGGTCCTATTCCAT

GGTTCATTGTGGCCGAGCTGTTCAGCCAGGGGCCCCGACCTGCTGCTGTTGCTGTGGCTGGCTTCTCTAACTGGACCTCAAAC

TTCATCGTGGGCATGTGCTTCCAATATGTGGAGCAACTGTGTGGCCCCTACGTCTTCATCATCTTCACGGTGCTGCTGGTACT

CTTCTTCATCTTCACCTACTTCAAAGTTCCTGAGACCAAAGGCCGGACCTTCGATGAGATCGCTTCCGGCTTCCGGCAGGGGG

GTGCCAGCCAGAGCGACAAGACACCTGAGGAGCTCTTCCACCCTCTGGGGGCTGACTCCCAAGTGTGA(SEQ ID NO：5)

苹果酸酶(耶氏酵母)

ATGTTACGACTACGAACCATGCGACCCACACAGACCAGCGTCAGGGCGGCGCTTGGGCCCACCGCCGCGGCCCGAAACATGTC

CTCCTCCAGCCCCTCCAGCTTCGAATACTCGTCCTACGTCAAGGGCACGCGGGAAATCGGCCACCGAAAGGCGCCCACAACCC

GTCTGTCGGTTGAGGGCCCCATCTACGTGGGCTTCGACGGCATTCGTCTTCTCAACCTGCCGCATCTCAACAAGGGCTCGGGA

TTCCCCCTCAACGAGCGACGGGAATTCAGACTCAGTGGTCTTCTGCCCTCTGCCGAAGCCACCCTGGAGGAACAGGTCGACCG

AGCATACCAACAATTCAAAAAGTGTGGCACTCCCTTAGCCAAAAACGGGTTCTGCACCTCGCTCAAGTTCCAAAACGAGGTGC

TCTACTACGCCCTGCTGCTCAAGCACGTTAAGGAGGTCTTCCCCATCATCTATACACCGACTCAGGGAGAAGCCATTGAACAG

TACTCGCGGCTGTTCCGGCGGCCCGAAGGCTGCTTCCTCGACATCACCAGTCCCTACGACGTGGAGGAGCGTCTGGGAGCGTT

TGGAGACCATGACGACATTGACTACATTGTCGTGACTGACTCCGAGGGTATTCTCGGAATTGGAGACCAAGGAGTGGGCGGTA

TTGGTATTTCCATCGCCAAGCTGGCTCTCATGACTCTATGTGCTGGAGTCAACCCCTCACGAGTCATTCCTGTGGTTCTGGAT

ACGGGAACCAACAACCAGGAGCTGCTGCACGACCCCCTGTATCTCGGCCGACGAATGCCCCGAGTGCGAGGAAAGCAGTACGA

CGACTTCATCGACAACTTTGTGCAGTCTGCCCGAAGGCTGTATCCCAAGGCGGTGATCCATTTCGAGGACTTTGGGCTCGCTA

ACGCACACAAGATCCTCGACAAGTATCGACCGGAGATCCCCTGCTTCAACGACGACATCCAGGGCACTGGAGCCGTCACTTTG

GCCTCCATCACGGCCGCTCTCAAGGTGCTGGGCAAAAATATCACAGATACTCGAATTCTCGTGTACGGAGCTGGTTCGGCCGG

CATGGGTATTGCTGAACAGGTCTATGATAACCTGGTTGCCCAGGGTCTCGACGACAAGACTGCGCGACAAAACATCTTTCTCA

TGGACCGACCGGGTCTACTGACCACCGCACTTACCGACGAGCAGATGAGCGACGTGCAGAAGCCGTTTGCCAAGGACAAGGCC

AATTACGAGGGAGTGGACACCAAGACTCTGGAGCACGTGGTTGCTGCCGTCAAGCCCCATATTCTCATTGGATGTTCCACTCA

GCCCGGCGCCTTTAACGAGAAGGTCGTCAAGGAGATGCTCAAACACACCCCTCGACCCATCATTCTCCCTCTTTCCAACCCCA

CACGTCTTCATGAGGCTGTCCCTGCAGATCTGTACAAGTGGACCGACGGCAAGGCTCTGGTTGCCACCGGCTCGCCCTTTGAC

CCAGTCAACGGCAAGGAGACGTCTGAGAACAATAACTGCTTTGTTTTCCCCGGAATCGGGCTGGGAGCCATTCTGTCTCGATC

AAAGCTCATCACCAACACCATGATTGCTGCTGCCATCGAGTGCCTCGCCGAACAGGCCCCCATTCTCAAGAACCACGACGAGG

GAGTACTTCCCGACGTAGCTCTCATCCAGATCATTTCGGCCCGGGTGGCCACTGCCGTGGTTCTTCAGGCCAAGGCTGAGGGC

CTAGCCACTGTCGAGGAAGAGCTCAAGCCCGGCACCAAGGAACATGTGCAGATTCCCGACAACTTTGACGAGTGTCTCGCCTG

GGTCGAGACTCAGATGTGGCGGCCCGTCTACCGGCCTCTCATCCATGTGCGGGATTACGACTAG (SEQID NO：6)

耶氏酵母Δ(9)去饱和酶(硬脂酰辅酶A去饱和酶)

ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAACTACAAGGTCAAGTA

CACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCACATTTCCGAGCAGCCCTTCACCTGGGCCAACT

GGCACCAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCTCTGTCGTCCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCC

TTCAACTGGAAGACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGTCTCGGTATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTG

GGCCCATCGAGCCTACAAGGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCTTGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCGAGGGCTCCATCC

GATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCACCGATGGACCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCCCGAAAGGGATTCTGG

TTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCCAACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTG

GGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTACGTTTACGTTCTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTG

GCTGGGGCGACTGGAAGGGAGGTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAAC

TCCCTTGCCCACTGGATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTT

TGGAGAGGGCTACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCCCTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCA

AGTGGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCGAGCAGGGTCTC

GTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTGGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCCTGTCATTGA

GTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACGTGTCTGCCTTTGTCG

AGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTCTTCAACGGAGGTGTCTACCGA

CACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGTCATTCGAGGCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGAC

TGCCCAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGAAACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCC

GGGTCGAGAACCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG (SEQ ID NO：7)

丙酮酸羧化酶(人)

ATGCTGAAGTTCCGAACAGTCCATGGGGGCCTGAGGCTCCTGGGAATCCGCCGAACCTCCACCGCCCCCGCTGCCTCCCCAAA

TGTCCGGCGCCTGGAGTATAAGCCCATCAAGAAAGTCATGGTGGCCAACAGAGGTGAGATTGCCATCCGTGTGTTCCGGGCCT

GCACGGAGCTGGGCATCCGCACCGTAGCCATCTACTCTGAGCAGGACACGGGCCAGATGCACCGGCAGAAAGCAGATGAAGCC

TATCTCATCGGCCGCGGCCTGGCCCCCGTGCAGGCCTACCTGCACATCCCAGACATCATCAAGGTGGCCAAGGAGAACAACGT

AGATGCAGTGCACCCTGGCTACGGGTTCCTCTCTGAGCGAGCGGACTTCGCCCAGGCCTGCCAGGATGCAGGGGTCCGGTTTA

TTGGGCCAAGCCCAGAAGTGGTCCGCAAGATGGGAGACAAGGTGGAGGCCCGGGCCATCGCCATTGCTGCGGGTGTTCCCGTT

GTCCCTGGCACAGATGCCCCCATCACGTCCCTGCATGAGGCCCACGAGTTCTCCAACACCTACGGCTTCCCCATCATCTTCAA

GGCGGCCTATGGGGGTGGAGGGCGTGGCATGAGGGTGGTGCACAGCTACGAGGAGCTGGAGGAGAATTACACCCGGGCCTACT

CAGAGGCTCTGGCCGCCTTTGGGAATGGGGCGCTGTTTGTGGAGAAGTTCATCGAGAAGCCACGGCACATCGAGGTGCAGATC

TTGGGGGACCAGTATGGGAACATCCTGCACCTGTACGAGCGAGACTGCTCCATCCAGCGGCGGCACCAGAAGGTGGTCGAGAT

TGCCCCCGCCGCCCACCTGGACCCGCAGCTTCGGACTCGGCTCACCAGCGACTCTGTGAAACTCGCTAAACAGGTGGGCTACG

AGAACGCAGGCACCGTGGAGTTCCTGGTGGACAGGCACGGCAAGCACTACTTCATCGAGGTCAACTCCCGCCTGCAGGTGGAG

CACACGGTCACAGAGGAGATCACCGACGTAGACCTGGTCCATGCTCAGATCCACGTGGCTGAGGGCAGGAGCCTACCCGACCT

GGGCCTGCGGCAGGAGAACATCCGCATCAACGGGTGTGCCATCCAGTGCCGGGTCACCACCGAGGACCCCGCGCGCAGCTTCC

AGCCGGACACCGGCCGCATTGAGGTGTTCCGGAGCGGAGAGGGCATGGGCATCCGCCTGGATAATGCTTCCGCCTTCCAAGGA

GCCGTCATCTCGCCCCACTACGACTCCCTGCTGGTCAAAGTCATTGCCCACGGCAAAGACCACCCCACGGCCGCCACCAAGAT

GAGCAGGGCCCTTGCGGAGTTCCGCGTCCGAGGTGTGAAGACCAACATCGCCTTCCTGCAGAATGTGCTCAACAACCAGCAGT

TCCTGGCAGGCACTGTGGACACCCAGTTCATCGACGAGAACCCAGAGCTGTTCCAGCTGCGGCCTGCACAGAACCGGGCCCAA

AAGCTGTTGCACTACCTCGGCCATGTCATGGTAAACGGTCCAACCACCCCGATTCCCGTCAAGGCCAGCCCCAGCCCCACGGA

CCCCGTTGTCCCTGCAGTGCCCATAGGCCCGCCCCCGGCTGGTTTCAGAGACATCCTGCTGCGAGAGGGGCCTGAGGGCTTTG

CTCGAGCTGTGCGGAACCACCCGGGGCTGCTGCTGATGGACACGACCTTCAGGGACGCCCACCAGTCACTGCTGGCCACTCGT

GTGCGCACCCACGATCTCAAAAAGATCGCCCCCTATGTTGCCCACAACTTCAGCAAGCTCTTCAGCATGGAGAACTGGGGAGG

AGCCACGTTTGACGTCGCCATGCGCTTCCTGTATGAGTGCCCCTGGCGGCGGCTGCAGGAGCTCCGGGAGCTCATCCCCAACA

TCCCTTTCCAGATGCTGCTGCGGGGGGCCAATGCTGTGGGCTACACCAACTACCCAGACAACGTGGTCTTCAAGTTCTGTGAA

GTGGCCAAAGAGAATGGCATGGATGTCTTCCGTGTGTTTGACTCCCTCAACTACTTGCCCAACATGCTGCTGGGCATGGAGGC

GGCAGGAAGTGCCGGAGGCGTGGTGGAGGCTGCCATCTCATACACGGGCGACGTGGCCGACCCCAGCCGCACCAAGTACTCAC

TGCAGTACTACATGGGCTTGGCCGAAGAGCTGGTGCGAGCTGGCACCCACATCCTGTGCATCAAGGACATGGCCGGGCTGCTG

AAGCCCACGGCCTGCACCATGCTGGTCAGCTCCCTCCGGGACCGCTTCCCCGACCTCCCACTGCACATCCACACCCACGACAC

GTCAGGGGCAGGCGTGGCAGCCATGCTGGCCTGTGCCCAGGCTGGAGCTGATGTGGTGGATGTGGCAGCTGATTCCATGTCTG

GGATGACTTCACAGCCCAGCATGGGGGCCCTGGTGGCCTGTACCAGAGGGACTCCCCTGGACACAGAGGTGCCCATGGAGCGC

GTGTTTGACTACAGTGAGTACTGGGAGGGGGCTCGGGGACTGTACGCGGCCTTCGACTGCACGGCCACCATGAAGTCTGGCAA

CTCGGACGTGTATGAAAATGAGATCCCAGGGGGCCAGTACACCAACCTGCACTTCCAGGCCCACAGCATGGGGCTTGGCTCCA

AGTTCAAGGAGGTCAAGAAGGCCTATGTGGAGGCCAACCAGATGCTGGGCGATCTCATCAAGGTGACGCCCTCCTCCAAGATC

GTGGGGGACCTGGCCCAGTTTATGGTGCAGAATGGATTGAGCCGGGCAGAGGCCGAAGCTCAGGCGGAAGAGCTGTCCTTTCC

CCGCTCCGTGGTGGAGTTCCTGCAGGGCTACATCGGTGTCCCCCATGGGGGGTTCCCCGAACCCTTTCGCTCTAAGGTACTGA

AGGACCTGCCAAGGGTGGAGGGGCGGCCTGGAGCCTCCCTCCCTCCCCTGGATCTGCAGGCACTGGAGAAGGAGCTGGTAGAC

CGGCATGGGGAGGAGGTGACGCCGGAAGATGTGCTCTCAGCAGCTATGTACCCCGATGTGTTTGCCCACTTCAAGGACTTCAC

TGCCACCTTTGGCCCCCTGGATAGCCTGAATACTCGCCTCTTCCTGCAGGGACCCAAGATCGCAGAGGAGTTTGAGGTGGAGC

TGGAGCGGGGCAAGACGCTGCACATCAAAGCCCTGGCCGTGAGCGACCTGAACCGGGCCGGCCAGAGGCAGGTCTTCTTTGAG

CTCAATGGGCAGCTGCGGTCCATCTTGGTCAAGGACACCCAGGCCATGAAGGAGATGCACTTCCACCCCAAGGCCCTAAAGGA

CGTGAAGGGCCAGATCGGGGCGCCCATGCCTGGGAAGGTGATAGACATCAAAGTGGTGGCAGGGGCCAAGGTGGCCAAGGGCC

AGCCCCTGTGTGTGCTCAGTGCCATGAAGATGGAGACTGTGGTGACCTCACCCATGGAGGGTACTGTCCGCAAGGTTCATGTG

ACCAAGGACATGACACTGGAAGGTGACGACCTCATCCTGGAGATCGAGTGA (SEQ ID NO：8)

ACC(酿酒酵母)

TTATTTCAAAGTCTTCAACAATTTTTCTTTATCATCGGTAGATAACATCTTGATAACTTCAGATAATCCATCAATAGCATTGT

CATGGTCGCTTCTGATCTTTTTAGCTAAGTCTTGAGCGAATGACTCTAATTTCAAACCCTTTAGTTTATCGTCCAAAGTTTTG

TAGTTTTCTTCAATCCATGTTGCGACTTGCCTATCATCTTCATGGTCCACTGAAGCAGGGTACCACGATCTAATTCTTGCGAT

CTTTTCTAATCTTGATGCTTCGCCTACCTGATGGCTCAACCTTTTAATCAAATATTCTTCGTTCAATCTTCTTCTCAATCTCC

AGAAGAAGAAACGACGTGCCTCGGTCCATTCCAGTTCCTTAGAAATAACACCCTTGGCCACCATACGTGAAGACCTATCGTGC

AAATCAGCAAATTGAAGACTGATTTGTCCGTAAATTGGCAATAGTTCTCTCTCACGATCAGCTAATTGCTTGGATATTTGCTG

ATGTACTTCTGGAGCCAAACTCTTGTTGGATAATTGAGATCTCAATTCTCTGTACTTGTCATCCAATCTGTTCATGGTGTCCA

GCAATTTTTCTCTACGGAACTTGATACCAACCATACCTTGTGGTTCCAAAACACCAGCTCTAGCGTTGACGTCGGCATACATT

TCCATTTGGTCAGCGTTGATAGTTGGATCGACAACAACCCATGAACCACCTCTTAGTTCACCGGTAGGTGGGATATAGATAAT

AATTGGTTGTTTGTAATCCACCAATGCGTCAACAATAAACGAACCATACTTCAAGACTTCGTTGAACATATCACGTTGACCAC

CAGAGAAACCTCTCCAGTTGGCCAAAATCATCATTGGCAATTGTTCACCGTTGTTAAAGTCATTGATAGCTTGAGCAGTCTTG

AAGGCGGAGTTTGGATGCCAAACTTGACCAGGTTCTTGAATTAATGTTTCAGCACTATTTGGATTAGCTGGATCAGCAGGAAT

CAAGTTCTCGACAGTTCTTGTTTCAACACCAATAACACCCAGTGGAATACCACCAAGACGGGCTCTACCAACGACAACACCTT

TGGCCCATCCTGACAAAGTTTCAAAGAAAGACCCTTTATCAAACAAACCATATTCAAATCCACTTTCAGTCTCACGACCTTCA

ATCATCCATCTTACATCGTAAGTTTCATCATTAGTTGGAGTGAAATCAACTGGTCTATCCCATGTGTCTTTAGTTTCCAAGAT

AGGAACTGGCATATTACGCTTGGCTGGAACATAAGACATCCATTCAACAATCTTCTCTACACCAGCTAAATCGTCAACAGCAG

TCAAATGTGAAACACCGTTGTTATACATGATTTGAGTACCACCCAATTGTAAGTTAGAAGTATAAACTTCTCTACCCAGCATT

TTGTTGATTGCAGGAGCACCAGTTAAAATAATTGGCTGGCCTTCGACCTGAATAGCTCTTTGACCCAAACGAACCAAATAAGC

ACCGATACCGACGGATCTACAAGTGACTAAGGTGATAGTGAAGATATCGTGGTAAGCCCTTGACGTTGCACCAGCAATTAAAC

CAGATCCACGTAGACATTCGACACCTAACCCATCTTCAGAACCAATAATTGTCTTGATGACAAATCTTTCTTCACCGTTTATA

ACAGTACGTTCAGTGAGAACAGAATTTTCTTTGTCAAATTTCTTTAAAGTTTCCATACCTTCACTTGTTAAGTATAAGTATTG

GAAGCCCTTGTCCGGATTGGCAGCATCATTCCATGCAACTTGAAATAGTGGAACAATCTCTTCAGCCATACCAATTCTGGCAC

CTGAGTTTGCAGCCAAGTAAATTCTTGGGATACCACGCTTTCTAGCATATTCAGTAACCTTATTGAAGAATTCGTCTTCTTGT

GGACCAAAGGAACCGATCTTGAATGTGATATCGTTAGCAACAACAACAAATTGACGGCCTCTTGGATATTCAGGAGTCTTTAC

AGTAATCTTAAAGGCAACCATACCAATAGCGTTGGCACCAGGTTCTCTTTCCACCTCAGTTAATTCGCCGTTTTCATCTTCAA

TCAACTCGTTGGAAATAAAGAAATCATCTGTTAACTTAACATCTGCAGAGAAATTTTTCCATTGGGATGACGATGCTTGGCGG

AATAATTCTGGGAAGTCATAGACATATGTGGTACCCATCAAGTGTGCCTTATAACGTTTTGGTTGCAACCATTCCTTAACAGG

GTAAGGAGTAGCAATAGGTCTTAAATGCATGGATCCAGGTTTACCCAAAGACTTAAATACCCATTCACCTTTTGCGTTCTTGA

CTTCGGTGTACATTTCTGTTTTGATAACATAACCAGAAACGTTATTGATCAAGGCACGCAATGGTACTGGGGCACCTGTTTGA

GGATCTTTGATGATGATTCTAATTTCGGCAGAAGAAACACGCAATCTCAACAATCTCTTACCAAATCTTTCTAAGAAACCACC

GAAGGCGGCTTCGACATCTTCTGGAGAGATATCAAACACCGCAATGAAGTTGATGAAGATATGATTCAAATCAGAATTTGAAG

TGTCGGTGACTTCTAAATTATCCAATATATCACTCATCAATCTGTTAGCTTCAGAAGTCAGATATTCTTGAATAGAAATGTCA

TCACGGATATGACCCGTTCTAATAATACCTCTTGTAAAGAATCTCTTATCCAATGGAGAAGTCTTACTAACAGCTTCGTAGAC

ATGGATGTTTCTATTATCAGTGAAAATTGGTTTAATGTTGAAGTTGGACAATCTTCCTAATTCCAGTTGGAAGGCCAAAGCCG

GCTCAATGTGACGAATTGTTTCATTTTCGTTATAATTTGGACCGTTAAAAGTATAATACTTTGGATAAGACCCATCTTTAAAA

CCGAACATAAATGTGATACGACGGATAGAAGCATTGATTAATTCCTGCTTATTCAAATCCAAAATTTCTCTCAACCTTACCAA

AATTTCCTCTTCAGATTCGAAACCTTCTGTAGAAGCAACACAAACATTAGCAACATTACTCAACGATGCGGAGCTACCAGAAC

GATCAGGAGCAGGTCCGTTAGAAGAAGATTGGTGACGAGGAATAACTTCCAAACTTTGTGACAAAATTTCATCAACATCATCT

AAATGATCCACAGCCATCAAAATACCTTCTCTTAACGGAGATGACTGACTGTTTGCAACATATGACAAATCTGAAACAGAAAC

AGCCCTGTTCATACCCATTTTAGATTTAACAGTTGGAAAGGTGGAGAACGCAGCTGAAGGTAGTTGGAATTTCCATTCAACAA

TTGGAACTGTGACACCTTCGTGAACTCTAATATCTCCTATGGTGTAAGCACGATAAGCACGACGAATATAGACTTGAGCAGCT

GCAGCAGTCACAACTGGGTCTTGATGGGTTAGGAATTGAAGTAAAACATCGAACACAACGTAATTAGAATCGATCAAGTCCTT

CAAGATATTCAAATCTGGTTCAGAGCGCTTTGGATTGGATGAGCCATAGGCAACCTTCACAACAGAGGATTTTAAGATATGTT

CAATTTGTTCAGTTCTTTCCTTGACCGAAGGTAAAGCGCCTTGAATCAAAATTTCTCTTGCTTGTAGAGCGACCTTAGCGGTA

GCCTTAGATTCTAGTTCAACAATATGTTGTAGAGGAGTAGAGAAAATGGCAGAAACTTTAGAAGATAACTTGCACAATGGTTG

ATAATGTTTCAAGATAGCTAGGATCAGGTTATTCTTCGCTGAAACTTTCGAATGAGACAAAACAGTTAGCGCAACTTTATCTA

GATCTTTAGGGTTTTCATCACGCAATTTCAGAATGATATTTTCCTCACGAACATTTGGACCATTGAATAACTTTTCAACTTCG

TAATATTCTTCCAAGAAATGGACAAATATAGAATGTTCATGGGCTTCTAACCCGTTAGAGTACTTATGAGCAATATCCGCCAA

TGGTTCCACGACGGCGCCCAGCAATTTGTCGGGGTTGTATTCAGGATTCTTCACGGCCATATCAATCAATTTACTTAATTGTC

TAGCTGGGAAAACAGCACCACGTCTCAAAGAACGTGCAACTAACTCTTCCATTTGTTCATCTAGCTTAGCAGGCAATCTTGAA

TGTAAAGCAGAGATGTGTAGTTTCCATTCTGAGTAAGGCAGTTTTGGATTTCTCAAAACCTCTATCAATTGTTGCAAGGAAGC

GTTCATAATAACTTGGTTGTCATAACCCTTCAAAATGTTTTCCAAAGTAGACACTAATGACTTGAATTTATAGGCAGGTTTGG

TTCCTTCGATAACTGGAGAACCAAAATCTGGCAGCATACCTTCAAATGGTAGAGCGTGCTTGACCTTGGATGGATCGTCAAGA

GTCATAATAGCCATGATATCACCTGCAACAATGGTAGAACCAGGTTGCTTTAATAACTGGACGATACCATTTTCTTGAGAAAC

CAAAGGCATTTGCATTTTCATAACTTCAATTTCTGCATATGGTTGGCCCTTGATAATGTGTTCACCATTTTCCACCAAGAATT

TAACCAATTTACCAGGGGATGGAGTACGCAACTGGGTTGGATCGTTTTCAACTTCCAACAAAGTAGTCATAGAGTCAACGGAT

AATCTTGTAGCAGCAACTTCTTCTTTCCAATAGATGGTATGCGATTTACCGCCTATGGCAATCAAAAGACCACCATCAGATAG

TTGACGCAGTATGATATCACATTTAGAACCATTGATAAATAATGTGTAACGGTCATTACCGGATTTAGCTACGGTGAACTTGT

ATCTTTTACCCTCATGGATAAAATCTACAGGGAACATAGTTTGCAGTAGGTCTTTAGATAGAACTTGTCCCTTTTGTAAGGAT

TCGATATACTTGTGGCGGGCTTCTTCAGATGCTAAGAAAGCCTTTGTAGCGGCACCGCAAATGACGGCAAGAGTTGGATCAGG

CTTTTCAGCGGTCATTTTATGAGTAATCAAATCGTCCAACCAACCGGTGGTAATAGTGTTATCCTCGAAATCTTCAGTTTCCA

AAAGTTTGATCAAGTATTCCACAGTAGTTCTGAAATCACCCCTAATGGACAATTCCTTCAGGGCAACAACCATGTGTTTCCTG

GAAGCTTGTCTATTTTCACCAAAAGCAAAAATATGGCCGAACTGAGAGTCCGAAAAGGAGTGAATATTACCATTGTTACCCAC

GGAGAAGTAACCCCAAACATTAGAGGAAGAACGGAAGTTTAGTTCATGCAAAGTACCACCCGATGGCTTGAATCCATCGTTTG

GATCTTCTGATGTGATACGACAAGCGGTACAATGACCCTTTGGAATAGGTCTTCTTTGTTTCTTGGTGGCATCTTGAGTTTTG

AATTCGAAATCGATTTCTGAGGCAGAATGAGGATTCATACCATATAAAGTTCTAATGTCACTTATTCTATGCATAGGGATACC

CATAGCGATTTGTAATTGAGCTGCAGGTAAGTTAACACCGGAGACCATTTCCGTTGTTGGATGCTCGACTTGTAATCTTGGGT

TCAATTCTAAAAAGTAGAATTTTCCATCATCATGAGAATATAGATACTCCACGGTACCGGCAGAGACATAACCGACTAGTTTC

CCCAGTCTGACGGCAGCCTTTTCCATCTCGTGAAATGTTTCAGCCTTGGCAATTGTAACTGGTGCTTCTTCGATAATTTTTTG

ATGACGTCTCTGAACGGAACAGTCTCTACCGAACAAGGAAATATTTGTACCGTACTGATCTGCTAGCAGTTGAACTTCCAAGT

GACGCGCTCTACCGGCCAACTTCATGATGAAAATGGGGGAGCCTGGAATTTCGTTGGCTGCCTGGTGGTATAAAGCGATGAAA

TCTTCTTCACGTTCAACTTGTCTGATACCTTTACCACCACCACCTTCGGATGCCTTAATCATGACAGGAAAACCAATACGCTT

GGCCTTTTGTAAACCATCTTCAGGAGAGGTACAACAACCCTTTTGATAGATGTCATCGTCGACAGAGACCAGACCGGTTTTCT

CGTCCACGTGAACGGTGTCAACACCGGTACCAGACCATGGAATACATGGGACTTTAGCACTTTGAGCGACAATGGTAGAGGAG

ATTTTATCACCTAAAGACCTCATGGCGTTACCTGGAGGCCCAATAAAGATGACTTTCCTCTTAGACTGGGACAATTTTTCAGG

CAATAGTGGATTCTCGGAGGCGTGACCCCAGCCAGCCCATACGGCGTCTACGTCTGCTCTTTCGGCGATGTCTACGATCAAGT

CTACGTTAGCGTAGTTGTTATTATTAGTACCACCTGGCACTTCAATGTATTGATCGGCCATACGGATATATTCTGCGTTGGCC

TCCAGATCTTCTGGGGTGGCCATGGCGACGAATTGGACGGTTCTGTCATCGCCGAACGTCTCGTATGCCCATTTTCTGACGGA

TCTAATTTCTTTCACGGCGGCAATACCATTATTTGCTATCAGGATCTTGGATATGACCGTGTGACCACCGTGACTCTTAACAA

AGTCCCTTAACGGGGACTCCTCTAGTTTATCTACTGTATTGAGGCCAATGAAATGACCTGGAAGTTCTGTATGTCTTTCTGAG

TAGTTTGTAATTTCGTACTCCATCTTCTGTGGAGAAGACTCGAATAAGCTTTCTTCGCTCAT (SEQID NO：9)

FAA(酿酒酵母)

ATGGTTGCTCAATATACCGTTCCAGTTGGGAAAGCCGCCAATGAGCATGAAACTGCTCCAAGAAGAAATTATCAATGCCGCGA

GAAGCCGCTCGTCAGACCGCCTAACACAAAGTGTTCCACTGTTTATGAGTTTGTTCTAGAGTGCTTTCAGAAGAACAAAAATT

CAAATGCTATGGGTTGGAGGGATGTTAAGGAAATTCATGAAGAATCCAAATCGGTTATGAAAAAAGTTGATGGCAAGGAGACT

TCAGTGGAAAAGAAATGGATGTATTATGAACTATCGCATTATCATTATAATTCATTTGACCAATTGACCGATATCATGCATGA

AATTGGTCGTGGGTTGGTGAAAATAGGATTAAAGCCTAATGATGATGACAAATTACATCTTTACGCAGCCACTTCTCACAAGT

GGATGAAGATGTTCTTAGGAGCGCAGTCTCAAGGTATTCCTGTCGTCACTGCCTACGATACTTTGGGAGAGAAAGGGCTAATT

CATTCTTTGGTGCAAACGGGGTCTAAGGCCATTTTTACCGATAACTCTTTATTACCATCCTTGATCAAACCAGTGCAAGCCGC

TCAAGACGTAAAATACATAATTCATTTCGATTCCATCAGTTCTGAGGACAGGAGGCAAAGTGGTAAGATCTATCAATCTGCTC

ATGATGCCATCAACAGAATTAAAGAAGTTAGACCTGATATCAAGACCTTTAGCTTTGACGACATCTTGAAGCTAGGTAAAGAA

TCCTGTAACGAAATCGATGTTCATCCACCTGGCAAGGATGATCTTTGTTGCATCATGTATACGTCTGGTTCTACAGGTGAGCC

AAAGGGTGTTGTCTTGAAACATTCAAATGTTGTCGCAGGTGTTGGTGGTGCAAGTTTGAATGTTTTGAAGTTTGTGGGCAATA

CCGACCGTGTTATCTGTTTTTTGCCACTAGCTCATATTTTTGAATTGGTTTTCGAACTATTGTCCTTTTATTGGGGGGCCTGC

ATTGGTTATGCCACCGTAAAAACTTTAACTAGCAGCTCTGTGAGAAATTGTCAAGGTGATTTGCAAGAATTCAAGCCCACAAT

CATGGTTGGTGTCGCCGCTGTTTGGGAAACAGTGAGAAAAGGGATCTTAAACCAAATTGATAATTTGCCCTTCCTCACCAAGA

AAATCTTCTGGACCGCGTATAATACCAAGTTGAACATGCAACGTCTCCACATCCCTGGTGGCGGCGCCTTAGGAAACTTGGTT

TTCAAAAAAATCAGAACTGCCACAGGTGGCCAATTAAGATATTTGTTAAACGGTGGTTCTCCAATCAGTCGGGATGCTCAGGA

ATTCATCACAAATTTAATCTGCCCTATGCTTATTGGTTACGGTTTAACCGAGACATGCGCTAGTACCACCATCTTGGATCCTG

CTAATTTTGAACTCGGCGTCGCTGGTGACCTAACAGGTTGTGTTACCGTCAAACTAGTTGATGTTGAAGAATTAGGTTATTTT

GCTAAAAACAACCAAGGTGAAGTTTGGATCACAGGTGCCAATGTCACGCCTGAATATTATAAGAATGAGGAAGAAACTTCTCA

AGCTTTAACAAGCGATGGTTGGTTCAAGACCGGTGACATCGGTGAATGGGAAGCAAATGGCCATTTGAAAATAATTGACAGGA

AGAAAAACTTGGTCAAAACAATGAACGGTGAATATATCGCACTCGAGAAATTAGAGTCCGTTTACAGATCTAACGAATATGTT

GCTAACATTTGTGTTTATGCCGACCAATCTAAGACTAAGCCAGTTGGTATTATTGTACCAAATCATGCTCCATTAACGAAGCT

TGCTAAAAAGTTGGGAATTATGGAACAAAAAGACAGTTCAATTAATATCGAAAATTATTTGGAGGATGCAAAATTGATTAAAG

CTGTTTATTCTGATCTTTTGAAGACAGGTAAAGACCAAGGTTTGGTTGGCATTGAATTACTAGCAGGCATAGTGTTCTTTGAC

GGCGAATGGACTCCACAAAACGGTTTTGTTACGTCCGCTCAGAAATTGAAAAGAAAAGACATTTTGAATGCTGTCAAAGATAA

AGTTGACGCCGTTTATAGTTCGTCTTAA (SEQID NO：10)

酰基辅酶A合成酶

ATGACTGTTACCCCACAGCACCAAGTCGTCCACGAGGCCAACGGTGTCACCCCAAGACCCACTCCTAAGGAGTTTTTTGACAA

ACAGCCCCGTCCTGGCCATATCACCTCCATCGAACAGTACCAGGAATTATACCAGAAGTCCATCGCCGACCCTGAAGGATTCT

TTGGTCCTATGGCCAAGGAGTTGTTGTCGTGGGACAGAGACTTCGACAAGGTCAAGTCCGGTTCTTTGAAGGACGGTGACGTT

GCCTGGTTCATTGGCGGCCAGTTGAACGCTTCCTACAACTGTGTAGACAGATGGGCCTATGCGACTCCAGACAAGACTGCCAT

CATCTACGAAGCTGACGAAGAAAAGGACTCGTACAAGTTGACCTACGCCGAGTTGTTGAGAGAAGTCTCCAAGGTAGCTGGTG

TGTTGAAGAGCTGGGGCATCAAAAAGGGTGATACTGTTGCTATCTACTTGCCAATGACTCCTCAAGCTGTTATTGCTATGCTC

GCTGTAGCCAGATTAGGTGCCATCCACTCGGTTATCTTTGCAGGTTTCTCTTCTGGTTCCATCAGAGACAGAGTCAACGATGC

TTCTTGTAAGGCTCTTATTACCTGTGACGAAGGTAGAAGAGGTGGTAAGACCGTTAACATCAAGAAATTGTGCGACGAAGCCT

TGAAGAGCTGTCCTACTGTAGAAAAGGTGCTTGTTTTCAAGAGAACCGGAAACGAAAATATTGAATTGGAAGAGGGTAGAGAT

TTCTGGTGGGATGAAGAAACCGCCAAGTTCTCGGGTTACTTGCCACCTGTTCCAGTCAATTCTGAAGACCCATTGTTCTTGTT

GTATACATCTGGTTCCACTGGTACTCCTAAGGGTGTTGTCCACACCACTGGGGGCTACCTCTTAGGTGCTGCCATGACCACCA

AGTACATTTTCGACGTCCACCCAGAAGACATCTTGTTCACTGCCGGTGATGTCGGTTGGATTACTGGTCACACCTATGCTTTG

TACGGACCTTTGGCTCTCGGTATCCCAACAATCGTTTTTGAAGGTACTCCAGCCTACCCAGACTTTGGTAGATTCTGGCAAAT

TGTCGAAAAGCACAAGGCTACCCACTTCTACGTAGCTCCTACTGCCCTCAGATTGTTGAGAAAGAGTGGCGAGCAAGAGATTC

CAAAGTACGACTTGTCTTCTTTGAGAACATTGGGCTCTGTTGGTGAACCTATCTCCCCTGATATCTGGGAATGGTACAACGAG

CACGTTGGACAAGGCAGATGCCACATCTCCGACACCTACTGGCAAACTGAGTCTGGTTCTCACTTCATTGCTCCAATTGCCGG

TGTCACTCCAAACAAACCTGGTTCAGCCTCTTTGCCATTCTTTGGTATCGAGACCGCTCTTATTGATCCAGTTTCCGGCCACG

AACTCGAAGGTAACGACATCGAAGGTGTTCTTGCCATCAAGAGCACCTGGCCATCTATGGCTAGATCTGTCTGGAACAACCAC

ACCAAGTACATGGACACATACTTGAACCCATACCCAGGCTACTACTTTACCGGCGACGGTGCTGCCAGAGATCACGACGGCTA

CTACTGGATTAGAGGTAGAGTCGATGATGTCGTCAATGTGTCTGGTCACAGATTGTCTACTGCTGAAATAGAAGCTGCCCTCA

TCGAACACAACGGTGTTTCTGAAGCTGCTGTGGTTGGTATTACCGACGACTTAACTGGTCAAGCCGTAGTTGCCTACGTTGCT

CTCAAGAACGAATACGTCGACAAGATCGCCGGCAAGGAAACCAGCGACGAAGCCTTTGCCTTGAGAAAGGAATTGATCATGAC

CGTCAGAAAGGAAATCGGACCTTTCGCAGCTCCAAAGAGCGTCATCATTGTCGCCGACTTGCCAAAGACCAGATCTGGTAAGA

TCATGAGAAGAATCTTGAGAAAGATCTCTGCCAACGAAGCAGACCAATTGGGTGACATCACCACTTTGTCCAACCCTCAGTCT

GTCGTTGGTATAATCGACTCCTTTGCTGCTCAATTTGCTAAGAAATAA (SEQ ID NO：11)

FAT

ATGGGGAGACACTTGGCCTTGCTTCTGCTTCTGCTCTTCTTCCTCCAGCATTTTGGAGATGGTGATGGAAGCCAAAGACTTGA

ACCGACCCCTTCCCTCCAGTTTACACACGTCCAGTACAATGTCACTGTGCACGAAAACTCGGCCGCAAAGACCTATGTCGGCC

ACCCTAGAAAAATGGGCATCTACATCTTAGACCCCTCGTGGGAAATAAGGTACAAAATCATCTCAGGAGACAACGAAAACCTA

TTCAAAGCGGAAGAGTATGTTCTCGGAGACTTTTGCTTTCTAAGGATAAGAACCAAGGGAGGGAATACTGCCATCCTGAACCG

AGAAGTGAGAGACCATTACACACTGGTAATCAAAGCAGTTGAAAAAGTCACAGATGCCGAGGCCCGAGCCAAGGTCAGGGTGC

AAGTGCTGGATACAAACGACTTACGGCCGTTGTTCTCACCCACGTCCTACAGCGTTTCTCTGCCGGAAAACACAGCCATAAGG

ACCAGTATCGCAAGAGTCAGTGCCACGGATGCGGACATTGGAACCAACGGCGAATTTTACTACAGCTTTAAAGACAGAACGGA

CATGTTTGCCATCCACCCAACCAGTGGTGTGGTTGTTTTGACTGGCAGGCTTGATGTCCTGGAGACCCAGCGCTATGAGCTGG

AGATCTTGGCTGTGGACCGGGGAATGAAGCTGTACGGTAGCAGTGGGGTCAGCAGTCTGGCCAAGCTGACGGTTCACGTGGAG

CAGGCTAACGAGTGTGCACCCGGGATAACCGCCGTGACGTTATCACCATCTGAGCTGGACAAGGACCCAACGTACGCCATTAT

CACTGTGGAGGACTGCGATCAGGGTGCCAACGGGGAGATAGCATCTTTGAGCATTGTGGCTGGCGACCTCCTTCAGCAGTTTA

AAACGGTGAGGTCTTTCCCAGGGAGTAAAGCATTCAAAGTGAAAGCCGTCGGGGGCGTCGACTGGGACAGCCATCCTTATGGC

TACAACCTGACAGTGCAGGCTAAAGACAAAGGAACTCCTCCGCAGTTTTCCCCTGTGAAAGTCATTCACGTCATTTCTCCTCA

GTTCAGAGCTGGCCCGGTCAAGTTTGAAATGGATGTTTACAGAGCTGAGATCAGTGAGTTTGCCCCTCCACATACACCCGTGG

TCCTGGTCAAGGCTATTCCTAGTTATTCCCATTTGAGGTACGTTTTTAAAAGCACTCCTGGAAAACCCAAATTCGGTTTAAAT

CACAACACGGGTCTCATTTCCATTTTAGAACCAATTAAAAGGCAGCACACATCCCATTTTGAGCTTGAGGTGACAACAAGTGA

CAGACGAGCCTCCACCAAAGTCGTGGTCAAAGTTGTAGGTACAAACAGCAACCCCCCGGAGTTTACACAGACCTCGTACAAAG

CATCCTTTGATGAGAATGCACCCGTCGGTACCCCGGTCATGAGGGTGAGCGCGGTTGACCCTGACGAGGGGGAGAATGGCTAC

GTGACTTACAGTATTGCAAACTTAAATCACGTGCCATTTGTCATCGACCACTTTACGGGTGCTGTGAGTACCTCTGAGAATCT

GGACTATGAACTGATGCCTCGAGTCTACACGCTGAGGATTCGTGCTTCCGACTGGGGCTTACCGTACCGCCGGGAAGTTGAAG

TCCTTGCCACAATTACTCTGAATAACCTGAATGACAACACCCCCCTGTTTGAGAAGACAAACTGTGAAGGGACAATTCCCCGA

GACCTGGGTGTAGGGGAGCAGATAACCACGGTTTCTGCCATTGACGCTGATGAGCTGCAGTTGGTCCGGTACCAGATTGAAGC

TGGAAATGAGTTGGATTTGTTTGGCTTAAACCCCAGCTCTGGTGTGCTGTCATTGAAGCACTCGCTCATGGACGGCTTGGGTG

CAAAGGTTTCCTTTCACAGCTTGAGAATCACAGCTACAGACGGAGAAAATTTTGCCACACCATTATATATCAACCTAACGGTG

GCTGCCAGTCGCAAGCCAGTAAACTTGCGGTGTGAGGAGACCGGTGTTGCCAAAATGCTGGCAGAGAAACTCCTGCAGGCGAA

TAAATTACACCATCAGGGGGACGCGGAGGATATTTTCTTTGATTCTCACTCCGTCAACGCCCATGCCCCACAGTTTAGGGGTT

CTCTTCCAACAGGAATTGAGGTAAAGGAGGACCTCCCAGTGGGCGCCAGTATACTATTCATGAATGCTACTGACCTTGACTCT

GGCTTCAATGGGAAACTGGTCTATGCTATCTCTGGAGGGAATGATGACAGTTGCTTTACTGTTGACATGGAAACAGGAATGCT

GAAAGTCCTCTCTCCACTTGACCGAGAAGTAACGGACAAATACACACTGAACATTACCGTGTATGACCTTGGTATACCCCAGA

GGGCTGCCTGGCGCCTTCTGGATGTCACCGTCCTGGATGCCAATGACAACGCGCCCGAGTTTTTACAGGAGAGCTATTTTGTC

GAAGTGAGCGAAGACAAGGAGATAAACAGTGAAATCATCCAGGTAGAGGCCACCGATAAAGACCTGGGCCCCAGCGGACACGT

GACATACGCCATCCTCACGGACACAGAGAAGTTTGCGATCGACAGGGTGACCGGTGTGGTGAAAATTATCCAGCCTTTGGATC

GTGAAGTGCAGCGTGTACATTACCTGAAGATCGAGGCCAGGGACCAAGCCACAGAGGAACCCTGGCTGTCCTCCACTGTGCTT

CTGAAAGTGTCACTCGATGATGTTAATGACAACCCACCTAGGTTCATTCCACCCAGTTACTCCGTGAAGGTTCGAGAAGACCT

ACCGGAAGGAACCATCATCATGTGGTTAGAAGCCCATGACCCTGATGTAGGTCAGTCCAGTCAGGTGAGATACAGCCTCCTGG

ACCACGGAGAAGGCCACTTCGATGTGGATAAACTCAGCGGGGCAGTGAGAATTGTCCAGCAGCTGGACTTTGAGAAGAAGCAA

CTGTATAATCTCACCGTGAGGGCCAAAGACAAAGGGAAGCCGGCGTCTCTGTCTTCCACTGGCTACGTGGAAGTGGAGGTCGT

GGACGTGAATGAGAACTTACACGCGCCAGTGTTCTCCAGCTTCGTGGAGAAGGGCACAGTGAAAGAAGACGTCCCTATGGGCT

CATCAGTAATGACCGTGTCAGCTCACGATGAGGACACCGGGAGAGATGGAGAGATCCGGTATTCCATCAGAGATGGCTCTGGT

GTTGGTGTTTTCAGGATAGATGAAGAAACAGGTGTCATAGAGACCTCAGATCGACTGGACCGAGAGTCGACTTCCCACTACTG

GCTCACCGTCTACGCCACAGATCAGGGTGTGGTGCCTCTGTCATCCTTCATAGAGGTCTACATAGAGGTTGAGGATGTCAATG

ACAACGCACCACAGACATCAGAGCCTGTGTATTATCCTGAAATAATGGAGAATTCACCCAAGGATGTATCTGTGGTCCAGATT

GAGGCATTTGACCCGGATTCCAGCTCCAGTGACAAGCTGACGTACAGAATTACAAGTGGAAATCCCCAAGGGTTCTTCTCAAT

ACACCCTAAAACAGGTCTCATCACAACCACATCGAGGAAGCTGGACCGAGAGCAGCAGGATGAACACATTCTGGAAGTTACTG

TGACAGACAATGGTGTACCTCCCAGATCCACCATTGCCAGGGTCATTGTGAAAATCCTGGATGAGAACGACAACAGGCCTCAG

TTCCTTCAGAAGTTTTATAAAATCAGGCTCCCGGAGCGAGAAAAAGCTGATGGAGACCGGAGCGCGAAGCGCGAGCCTCTCTA

CCGAGTCATAGCCGCAGATAAGGATGAAGGGCCCAATGCCGAGCTCTCCTACAGCATCGAGGAAGGGAACGAGCACGGCCGGT

TTTCCATTGAACCCAAGACAGGAGTGGTCTCATCCAAAAAGTTCTCTGCGGCTGGAGAATACGACATTCTTTCTATTAAGGCA

ATTGACAATGGGCGCCCCCAGAAGTCATCGACCACCAGACTCCATATTGAATGGATCTCCAAACCCAAGCCGTCCTTGGAGCC

GATTTCGTTTGAGGAATCGGTTTTCTCGTTTACTGTAATGGAGAGTGATCCGGTGGCTCACATGATCGGCGTGATCTCCGTTG

AGCCTCCTGGCATGCCTCTGTGGTTTGACATCATCGGGGGCAACTATGACAGTCACTTTGATGTGGACAAGGGCACTGGAACC

ATCATTGTGGCCAAGCCCCTTGACGCAGAGCAGAAGTCCAGCTATAACCTCACAGTGGAGGCGACAGACGGGACCTCCACTAT

CCTCACCCAGGTACTCATCAAAGTAATAGATACCAATGACCACCGCCCTCAGTTTTCTACCTCGAAATACGAAGTCTCTGTTC

CCGAAGACACAGAGCCAGAAACAGAGATTCTGCAAATCAGCGCCGTAGACAGGGACGAGAAAAACAAACTGATCTACACCCTC

CAGAGCAGCATAGATCCAGCAAGTCTCAAGAAATTCCGCCTCGATCCTGCAACAGGCGCTCTCTACACATCTGAGAAGCTCGA

TCACGAAGCCATTCACCAGCACGTCCTCACAGTCATGGTCCGGGATCAGGATGTCCCTGTGAAACGCAACTTTGCCAGAATCA

TTGTGAATGTCAGTGACATGAATGACCACTCTCCGTGGTTCACCAGTTCGTCCTATGAAGGGCGGGTTTATGAGTCGGCAGCC

GTGGGCTCGGTCGTGCTACAGGTTACAGCTCTGGACAGAGACAAAGGGAGAAATGCTGAAGTGCTCTACTCCATCGAGTCAGG

AAACATTGGAAATTCCTTTACAATCGACCCCATCTTGGGCTCTATAAAAACTGCCAGAGAATTGGATCGAAGTCACCAAGTAG

ACTATGATTTAATGGTAAAAGCTACAGACAAAGGGGAGCCACCAATGAGCGAAATGACCTCCGTGCGGATCTCTGTCACCGTC

GCCGACAATGCCTCTCCTAAGTTCACATCCAAGGAGTACTCGGCTGAGATTAGTGAAGCCATCAGGATTGGGAGTTTTGTTGG

AATGGTCTCTGCTCACAGTCAGTCATCAGTGATGTATGAAGTAAAAGATGGAAATATAGGCGATGCATTTAATATCAATCCAC

ATTCAGGAAGCATCGTCACTCAGAGAGCCTTGGATTTTGAGACACTGCCCATTTATACATTGACAGTACAAGGGACCAACATG

GCCGGCTTGTCCACCAATACAACGGTGGTAGTGCACATACAGGATGAGAATGACAACCCTCCAGCTTTCACACGGGCGGAATA

TTCAGGATTCATTAGTGAATCAGCCTCAGTCAACAGCGTGGTGCTAACGGATAAGAATGTTCCGCTCGTGATCCGAGCCACCG

ACGCTGATCGGGAATCCAATGCTCTGCTCGTCTATCAAATTGTCGAGCCATCTGTGCACAACTATTTTGCCATTGATCCCACC

ACCGGTGCCATCCATACCGTACTGAGTCTGGACTATGAAGAGACACGTGTCTTTCACTTCACCGTCCAAGTGCATGACATGGG

GACGCCTCGTCTGTTTGCTGAGTATGCAGCAAATGTGACCGTGCATGTGATTGACATCAATGACTGCCCCCCTGTCTTCTCTA

AGTCACTGTACGAAGCATCCCTCCTATTGCCGACGTACAAAGGCGTGAACGTCATCACAGTGAATGCCACAGATGCCGACTCC

AGGGCGTTCTCCCAGTTAATATACTCCATCACCAAAGGCAACATTGGGGAGAAGTTCTCCATGGACCACAAGACTGGCACCAT

AGCAATTCAGAACACAACCCAGTTACGGAGCCGCTATGAGCTGACCGTCCGCGCCTCCGATGGCCGGTTTACAAGCGTGGCCT

CCGTGAGAATCAACGTGAAGGAAAGCAGAGAGAGTCCTCTCAAGTTTACCCAAGATGCCTACTCTGCGGTGGTGAAGGAGAAC

TCCACCGAAGCCAAAACCTTAGCTGTCATTACCGCGATAGGGAACCCGATTAACGAGCCTTTGTTTTACCGTATCCTCAACCC

AGACCGCAGATTTAAAATCAGCCACACCTCAGGCGTGTTGTCAACCACTGGGATACCATTTGATCGGGAGCAACAGGAGACGT

TTGTTGTGGTGGTAGAGGTGACTAAAGAACGGGAGCCGTCGGCCGTGGCCCACGTTGTGGTGAAGGTCACCGTGGAAGACCAG

AATGATAATGCACCCGTGTTTGTCAACCTTCCCTACTATGCTGTGGTGAAGGTGGATGCTGAGGTGGGCCATGTCATCCGCCA

CGTCACTGCCATTGACAGAGACAGTGGCAGAAACGGTGACGTTCACTACTACCTTAAGGAGCATCATGACCACTTTGAGATTG

GACCCTCTGGTGACATTTCTCTGAAAAAGCAATTTGAGCACGACACCTTGAATAAAGAATACCTTGTCACAGTGGTTGCGAAG

GACGGGGGGAACCCAGCTTTCTCCGCAGAAGTTCTAGTTCCCATCACCGTCATGAACAAAGCCATGCCCGTGTTTGAAAAGGC

TTTCTACAGTGCAGAGATTCCCGAGAACGTCCAGACGCACAGCCCAGTGGTCCACGTCCAAGCCAACAGCCCAGAAGGGTTGA

AAGTGTTCTACAGTATCACAGACGGGGACCCTTTTAGTCAGTTTACTATCAACTTCAACACTGGGGTGATAAACGTCATCGCA

CCGCTGGACTTTGAGTCCCACCCAGCCTATAAGCTAAGCATACGGGCCACTGACTCCCTGACTGGCGCCCACGCTGAAGTGTT

TGTTGACATCGTAGTAGAAGACATCAATGACAACCCTCCCGTGTTTGTGCAACAGTCTTACTCGACAACCCTGTCTGAAGCAT

CTGTCATCGGAGCGCCTATCCTTCAAGTTAGAGCCACCGACTCTGACTCGGAACCAAATAGAGGGATTTCCTACCAGCTGATT

GGAAATCACAGCAAAAGCCACGATCACTTTCACATAGATAGTCACACTGGGCTGATTTCACTGGTGAGGGCTTTGGATTACGA

ACAGTTCCAGCAGCACAAGCTGCTCGTAAGGGCTGTTGATGGAGGAATGCCGCCACTGAGCAGCGATGTGGTCGTCACTGTGG

ATGTCACCGACCTCAACGATAACCCGCCTCTGTTTGAACAACAGGTTTACGAAGCTAGGATCAGTGAGCACGCTGCCCACGGG

CATTTTGTGATGTGCGTAAAGGCCTGTGATGCAGATCGCTCAGACCTAGACAGGCTGGAGTACTCCATTCTGTCCGGCAATGA

TCACAAGAGCTTTGTCATTGACGGGGAGACAGGAATCATCACGCTCTCCAACCCGCGCCGCCACACCTTGAAGCCGTTCTATA

GTCTCAACGTTTCTGTGTCTGATGGGGTTTTCCGAAGCTCGGCTCGGGTGAATGTCACCGTGATGGGAGGGAATTTGCACAGC

CCTGTCTTTCACCAGAATGAGTATGAGGTAGAGCTGGCTGAAAACGCCCCCTTGCACACCCTGGTGGTCCAAGTGAAGGCTAC

TGACAGAGATTCCGGTATCTACGGCCACCTGACTTACCACCTTGTAAATGACTTTGCCAAAGACAGGTTTTACGTGAACGACG

GAGGGCAGGTCTTCACTCTGGAGAGACTTGATCGAGAGGCTCCAGCAGAGAAAGTGATCTCAGTCCGTTTAATGGCTAAGGAT

GCTGGGGGGAAGGTCGCCTTCTGCACTGTCAACGTCATCCTCACGGACGACAATGACAACGCACCACAGTTTCGCTCAACCAA

GTACGAGGTGAACGTGGGGTCCAGCGCCGCCAAAGGGACGTCGGTCGTCAAGGTCTTCGCGAGTGATGCCGATGAGGGGTCGA

ATGCTGACGTCACCTACGCCATCGAGGCAGATTCGGAAAGTGTCGAGGAGAACTTGGAAATCAACCAACTGACCGGCCTCATT

ACTACAAAGGAAAGCTTAATAGGTTTAGAGAATGAATTCTTCACTTTCTTCGTTAGAGCTGTGGATAACGGGTCTCCGCCCAA

AGAGTCTGTTGTTCCTGTCTATGTTAAAATACTTCCCCCGGAAGTGCAGCTTCCTAGGTTCTCAGAGCCCTTTTATACCTATT

CCATTTCAGAAGACATGCCTATTGGCACAGAGATTGACCTCATCCGGGTAGAGCATAGCGGGACTGTTCTCTACACCCTGGTC

AAAGGCAATACTCCCGAGAGTAACAGGGACGAGTTCTTTGTGATTGACCGGCAGAGTGGGAGACTGAAGCTGGAGAAGAGCCT

TGACCACGAGACCACTAAGTGGTATCAGTTTTCCATCCTGGCCAGGTGTACTCTGGATGACTACGAGGTGGTGGCTTCTATAG

ATGTCAGTATCCAGGTGAAAGACGCTAATGATAACAGCCCAGTTTTGGAGTCCAATCCATACGAGGCATTTATTGTCGAAAAC

CTGCCAGCAGGGAGTAGGGTCATCCAGGTCAGAGCATCTGACCTAGACTCAGGAGTCAACGGCCAAGTCATGTACAGTCTAGA

TCAGTCCCAAGATGCAGACATCATCGAGTCTTTTGCCATTAACATGGAAACAGGCTGGATTACAACCCTCAAGGAGCTTGACC

ATGAAGAGAGAGCCAGTTACCAGATTAAAGTGGTTGCCTCAGACCATGGTGAAAAGGTGCAGCTGTCTTCCACCGCCATTGTG

GATGTCACCGTCACTGACGTCAACGACAGCCCGCCTCGATTCACAGCTGAGATTTATAAAGGGACAGTGAGTGAGGATGACCC

CCCAGGGGGTGTGATCGCCATCTTGAGCACCACTGACGCCGACTCTGAAGAGATTAACCGACAAGTGTCGTACTTCATAACAG

GAGGGGATGCATTGGGACAGTTTGCTGTGGAAAATATGCAGAATGACTGGAGGGTGTACGTGAAGAAACCTCTCGACAGGGAA

CAAAAGGACAGTTACCTTCTGACCGTCACTGCAACAGATGGGACCTTCTCTTCCAAAGCTAGAGTTGAAGTCAAGGTTCTCGA

TGCCAATGATAACAGTCCAGTGTGTGAGAGGACCGCATATTCTGATGCCATTCCCGAAGACGCTCTTCCGGGGAAGCTGGTCA

TGCAGGTCTCTGCCACAGATGCAGATATCCGGTCCAACGCGGAGATCACTTACACTTTATTTGGCTCAGGTGCAGAAAAGTTT

AAACTGAATCCAGACACAGGTGAACTGAGAACATTAGCCCTCCTTGATCGTGAGGAGCAAGCAGTTTATCATCTTCTGGTCAA

GGCCACAGACGGAGGGGGCAGATCCTGTCAGGCAACTATTGTGCTCACGTTAGAAGATGTAAATGACAACACCCCCGAGTTCA

CCGCGGATCCATACGCCATCACGGTATTTGAAAACACAGAGCCTGGGACACCGTTGACCAGAGTGCAGGCCACCGATGCAGAC

GCAGGGTTGAATCGGAAGATTTCCTACTCACTGCTTGACTCTGCTGACGGGCAGTTCTCCATTAACGAGCAGTCCGGAATTCT

TCAGTTGGAAAAGCATTTGGACAGGGAACTACAGGCAGTCTATACTCTCACTTTGAAAGCAGCGGACCAAGGATTGCCAAGGA

AATTGACAGCCACTGGCACGGTGGTTGTGTCTGTTTTGGATATAAATGACAACCCACCTGTGTTTGAGTACCGTGAATATGGT

GCCACCGTGTCAGAGGACATTGTCATCGGGACCGAAGTTCTCCAGGTGTACGCAGCCAGTCGGGATATCGAGGCGAATGCAGA

AATCACATACGCAATCATAAGTGGGAACGAACACGGAAAATTCAGCATCGATTCTAAGACAGGGGCCATATTTATCATTGAGA

ACCTGGATTATGAAAGCTCCCATGGCTATTACCTGACTGTGGAAGCCACTGATGGAGGCACGCCCTCGTTGAGTGACGTGGCG

ACCGTGAACATCAACATCACAGATATTAACGATAACAGCCCAGTGTTCAGCCAGGACAGCTACACCACAGTGGTCAGCGAAGA

CGCGGCCCTGGAGCAGCCCGTCATTACAATTATGGCTGATGATGCTGATGGCCCTTCAAACAGCCACATCCTCTACTCCATTA

TAGAGGGTAACCAAGGAAGTCCATTCACAATCGACCCTGTCAGAGGAGAAATCAAAGTAACGAAGCCCCTAGACCGCGAAACG

ATCTCAGGTTATACGCTCACGGTGCAGGCTGCCGACAACGGCAATCCACCCAGAGTCAACACCACCACAGTGAACATCGATGT

CTCCGATGTCAACGACAATGCTCCCCTCTTCTCCAGAGACAACTACAGTGTCATCATCCAGGAAAACAAGCCCGTGGGTTTCA

GCGTCCTGAAGCTAGTAGTGACAGACAAGGACTCGTCCCACAACGGCCCCCCTTTCTCCTTTGCTATTGTGAGTGGAAATGAT

GACAACATGTTTGAGGTGAACCAGCACGGGGTCCTCCTGACAGCGGCAACAGTCAAGAGGAAAGTGAAGGACCATTACCTTCT

GCACGTTAAGGTGGCTGACAATGGAAAGCCTCAGCTGTCTTCGTTGACACACATTGACATCAGGGTTATTGAGGAGAGCATCC

ACCCTCCTGCCATTTTGCCACTGGAGATTTTCATCACTGCTTCTGGAGAGGAATACTCAGGCGGGGTCATAGGAAAGATCCAT

GCCACAGACCAGGATGTGTATGACACCTTGACGTACAGTCTGGATCCCCACATGGATGGCCTGTTCTCTGTTTCCAGCACGGG

GGGTAAACTGATTGCACACAGAAAGCTGGATATAGGCCAGTACCTTCTTAATGTCAGCGTGACAGACGGGAAGTTTACAACGG

TGGCTGACATCACCGTGCACATCCAGCAAGTGACCCAGGAGATGCTGAACCACACCATCGCTATCCGATTTGCAAATCTCACC

CCGGAAGAGTTTGTCGGCGACTACTGGCGCAACTTCCAGCGAGCTTTACGCAACATCCTGGGCATCCGGAAGAACGACATACA

GATTGTCAGCTTGCAGCCCTCCGAACCCCACTCCCACCTTGACGTCTTACTCTTTGTAGAGAAATCAGGGGGCACCCAGATCT

CAACGAAACAACTTCTGCACAAGATCAATTCTTCCGTCACGGACATCGAGGAAATCATTGGCGTGAGGATACTGGATGTGTTC

CAGAAACTCTGTGCAGGGCTGGATTGCCCGTGGAAATTCTGTGATGAGAAGGTTTCTGTGGATGAAAACATTATGTCAACTCA

TAGCACAGCCAGACTGAGTTTTGTGACTCCCCGGCACCATAGAACAGCCGTGTGTCTCTGCAAAGATGGGACATGCCCGCCTG

TCCACCAAGGGTGCGAAGATAACCCCTGTCCTGCAGGATCCGAATGTGTCGCTGATCCCCGAGAAGAGAAGTACAGCTGTGTG

TGTCCTGGTGGCGGGTTCGCCAAATGTCCAGGGAGTTCATCCATAACTTTTACCGGCAGCAGCTTTGTGAAATATCGTCTGAT

GGAAAATGAAAACCGACTGGAGATGAAGTTGACCATGCGCCTGAGAACCTACTCTTCCCACGCGGTTGTGATGTACGCTCGAG

GAACTGACTACAGTATCCTGGAGATTCATACTGGGAGACTGCAGTACAAATTTGACTGTGGAAGTGGCCCTGGGATCGTCTCT

GTTCAGAGCATTCAAGTCAACGATGGGCAGTGGCATGCAGTGTCCCTGGAAGTGGAGGGGAATTATGCAAAATTGGTTCTAGA

TGAAGTCCACACTGCCTCGGGCACAGCCCCAGGAGCTCTGAAAACCCTCAACCTGGATAACTACGTAATTTTTGGTGGCCACC

TCCGCCAGCAAGGGACAAAACATGGACGAAACACCCAGGTGGCCAATGGTTTCAGGGGCTGCATGGACTCTATTTATTTGAAT

GGGCAGGAGCTACCTTTGAACAACAAACCAAGAGCCTATGCACACATCGAAGAATGGGTGGACCTAGCTCATGGGTGCTTGTT

AACTGCCACCGAAGACTGTTCCAGCAACCCTTGTCAGAATGGAGGCGTCTGCAATCCCTCGCCCACTGGAGGTTATTACTGCA

AGTGCAGTGCATTGCACGCAGGGACGTACTGTGAGGTGAGCGTCAACCCGTGCTCCTCCAACCCCTGCCTCTACGGAGGAACG

TGCATGGTAGACAACGGAGGTTTTGTTTGCCAGTGCAGGGGGCTGTACACTGGCCAGAGATGTCAGCTTAGTCCGTACTGCAA

AGATGAACCCTGTAAAAATGGTGGAACGTGTTTTGACAGTTTGGATGGTGCTGTCTGTCAGTGTGACTCAGGCTTTAGGGGAG

AAAGATGTCAGAGTGACATTGACGAGTGTGCTGGGAACCCCTGTCGGAACGGGGCCCTTTGCGAGAACACGCATGGCTCCTAT

CACTGTAACTGCAGCCAGGAGTACAGAGGGAAGCACTGTGAGGATGCCACTCCCAACCACTACGTGTCCACCCCGTGGAACAT

CGGACTGGCCGAAGGAATCGGAATTATTGTGTTTATAGCCGGGATATTCTTACTGGTGGTGGTGTTTGTCCTCTGCCGAAAGA

TGATCAGTCGGAAGAAGAAACACCAGGCGGAACCTGAAGACAAGCGTTTGGGGCCAACCACGGCTTTCTTACAGAGACCTTAC

TTTGATTCCAAGCCGAGCAAGAACATTTACTCTGACATCCCGCCCCAGGTGCCCGTGCGTCCCATTTCCTACACTCCGAGCAT

TCCCAGTGACTCTAGAAACAATCTGGACCGGAACTCGTTTGAAGGCTCGGCAATCCCAGAGCACCCAGAATTCAGCACTTTTA

ACCCCGAGTCTATGCACGGACATCGGAAAGCCGTGGCTGTGTGCAGCGTGGCTCCAAACTTGCCTCCCCCACCCCCTTCCAAC

TCTCCCTCAGACAGCGACTCCATTCAGAAGCCCAGCTGGGACTTCGACTACGACGCTAAAGTGGTGGATCTTGACCCTTGTCT

TTCCAAGAAGCCCCTGGAGGAAAAACCCTCTCAGCCATACAGTGCCCGGGAGAGCCTGTCCGAGGTGCAGTCCCTTAGCTCCT

TCCAGTCAGAGTCCTGTGATGACAATGGGTACCACTGGGATACATCAGACTGGATGCCCAGTGTTCCTCTGCCAGACATACAA

GAGTTCCCCAATTACGAGGTTATCGATGAGCACACGCCCCTCTACTCAGCTGATCCAAATGCCATCGACACTGACTATTACCC

TGGGGGTTATGACATTGAAAGTGACTTTCCACCCCCACCAGAGGACTTCCCTGCACCCGATGAACTGCCACCATTGCCTCCAG

AATTCAGCGACCAGTTCGAGTCCATACACCCACCCAGAGACATGCCCGCAGCAGGTAGCTTGGGGTCTTCCTCCAGGAATCGT

CAGAGGTTCAACCTGAATCAGTACCTGCCCAATTTCTACCCCGTCGATATGTCTGAACCTCAGAAACAAGGCGCTGGTGAGAA

CAGTACCTGTAGAGAACCCTACACTCCCTACCCTCCAGGGTATCAAAGAAACTTCGAGGCGCCCACCATAGAAAACATGCCCA

TGTCTGTGTACACCTCTACGGCTTCCTGCTCCGATGTGTCAGCGTGCTGCGAAGTGGAGTCTGAGGTCATGATGAGTGACTAC

GAGAGCGGGGACGACGGCCACTTTGAAGAGGTGACCATTCCCCCGCTAGATTCCCAGCAGCATACGGAAGTGTGA(SEQ IDNO：12)

FAT

ATGAAGATTAAAAAATATGTAACTCCTGTAAAAAGAAAAGCTTTCACCATACTCCAATGGATTTCACTACTGTGTAGTCTATG

GTTGATCCCCACTGTACAAAGCAAGGCCGATGAGAAGCACACGGCGACCCTGGAGTATAGACTAGAGAACCAACTGCAAGATC

TATATAGGTTTAGCCATAGTGTATATAATGTTACCATACCAGAAAATAGTCTGGGCAAGACTTACGCCAAGGGAGTATTGCAT

GAAAGACTGGCCGGCCTGAGAGTTGGCTTGAACGCAGAGGTTAAGTATAGGATAATTAGTGGCGATAAGGAGAAGCTATTTAA

GGCCGAGGAGAAACTGGTCGGAGATTTTGCCTTCTTAGCGATTCGAACGCGGACAAATAACGTTGTGCTAAACAGAGAAAAAA

CTGAGGAATACGTTATAAGAGTGAAGGCACATGTACATTTGCACGACCGAAATGTATCAAGCTATGAAACGGAGGCGAATATC

CACATCAAAGTACTGGATCGCAATGACCTGAGTCCGCTGTTTTATCCGACCCAGTACACCGTTGTTATTCCGGAGGACACGCC

CAAATATCAAAGTATTTTAAAGGTCACAGCTGACGATGCTGACCTCGGCATCAATGGGGAAATCTACTACAGCCTCCTGATGG

ATAGTGAATACTTTGCTATCCATCCAACAACTGGCGAAATTACTCTCCTGCAGCAGCTTCAGTATGCGGAGAACTCGCACTTC

GAGCTCACGGTGGTGGCCTACGATCGGGGATCATGGGTGAACCATCAGAACCACCAGGCCAGCAAGACGAAGGTTAGTATTTC

GGTGAAACAGGTTAACTTTTACGCTCCAGAGATTTTCACGAAAACCTTCTCGAGCGTGACGCCAACATCAAACCCTTTGATTT

ATGGAATTGTACGAGTAAACGACAAAGACACTGGGATAAATGGCAACATAGGGCGATTGGAAATCGTCGATGGAAATCCGGAT

GGCACGTTTCTTCTGAAGGCGGCGGAGACCAAAGACGAGTACTACATCGAATTGAATCAGTTTGCCCATCTTAACCAGCAACA

TTTCATTTACAACTTAACCCTACTGGCGGAGGACCTCGGAACTCCCCGTCGATTCGCCTACAAATCCGTTCCGATTCAAATCA

AGCCCGAGAGCAAAAATATACCCATATTCACACAGGAGATTTACGAAGTATCCATTCCAGAAACGGCACCCATTAACATGCCT

GTGATAAGGCTCAAAGTAAGCGATCCAGATTTGGGCAAAAATGCATTGGTCTACTTGGAAATCGTGGGTGGAAATGAGGGCGA

CGAGTTCCGAATTAATCCCGATTCGGGAATGTTGTACACAGCAAAGCAACTGGATGCCGAAAAGAAGTCAAGTTATACCTTAA

CAGTCTCCGCCATTGATCAGGCAAATGTTGGGTCGCGGAAACAATCTTCAGCCAAGGTGAAAATCAGCGTACAGGATATGAAC

GACAATGATCCCATTTTTGAGAATGTCAATAAGGTCATTAGTATCAATGAGAACAACTTGGCTGGCTCGTTTGTTGTGAAGCT

TACTGCCAAGGACAGGGATTCTGGTGAAAATTCATACATATCGTATAGTATTGCCAATCTAAATGCGGTTCCATTTGAAATCG

ATCACTTTAGCGGTATAGTTAAGACCACATCACTGCTTGACTTTGAAACAATGAAGCGTAACTATGAGCTGATAATCCGTGCA

TCCGATTGGGGATTGCCGTACAGAAGACAGACGGAAATCAAACTGTCCATCGTCGTCAAGGATATCAACGATAATCGGCCGCA

GTTTGAACGTGTGAACTGCTATGGCAAAGTGACCAAATCGGCGCCGATGGGCACCGAGGTATTCGTTACCTCAGCCATTGACT

TTGATGCAGGCGATATAATATCCTATAGGTTGAGCGACGGCAACGAGGATGGCTGCTTTAACTTGGACCCCACATCGGGTTCC

CTGTCTATTTCCTGCGACCTGAAGAAAACAACCTTAACAAACCGTATTCTCAAAGTTTCCGCCACGGACGGCACCCACTTTTC

CGATGACTTGATCATCAATGTACACCTAATGCCCGAAGATTTGGGTGGAGATTCCAGTATTCTACATGGTTTTGGATCCTTTG

AGTGCCGGGAAACCGGCGTGGCCAGGAGATTGGCGGAAACATTATCGTTGGCCGAAAAAAACAATGTAAAGAGTGCATCGCCA

TCCGTTTTCAGTGACTTGTCTCTAACACCCAGTCGATATGGCCAAAATGTGCATAGACCAGAGTTCGTGAACTTCCCTCAGGA

GCTGTCCATTAACGAAAGTGTCCAATTGGGCGAAACAGTTGCTTGGATAGAGGCCAAAGATCGCGATTTGGGCTACAATGGAA

AGCTGGTATTTGCAATTTCAGACGGGGACTACGATTCGGTTTTTCGTATTGATCCAGACCGCGGTGAACTGCAGATTATTGGA

TATTTGGATAGAGAGCGTCAAAATGAATATGTTCTCAACATCACCGTCTACGATCTGGGTAACCCGACCAAATCGACGTCAAA

AATGTTGCCAATAACGATCCTCGACGTGAACGATAATCGCCCGGTTATTCAGAAGACGTTGGCCACCTTCCGGCTGACTGAGA

GCGCCAGGATAGGAACTGTGGTACACTGCCTTCATGCCACGGATGCGGATTCTGGAATCAATGCTCAGGTGACATATGCCCTG

TCGGTTGAGTGCAGCGATTTCACAGTAAATGCTACTACGGGATGTCTTCGTCTGAACAAACCACTGGATCGCGAGAAGCAGGA

TAACTACGCTCTTCACATAACTGCCAAGGATGGTGGCAGTCCCGTGCTATCCTCGGAGGCATTGGTTTACGTCCTGGTCGACG

ATGTCAACGACAACGCGCCCGTTTTCGGAGTGCAAGAGTACATATTTAAGGTGCGCGAAGATCTGCCCCGTGGAACAGTGTTG

GCCGTAATCGAGGCGGTGGACGAAGATATTGGACCCAATGCCGAGATCCAATTCTCTTTGAAAGAGGAGACCCAGGATGAGGA

ACTATTCAGAATCGATAAGCACACGGGTGCAATTAGGACTCAAGGATATCTGGACTATGAGAACAAACAAGTGCACAACCTTA

TTGTCAGTGCCATCGATGGCGGAGATCCCTCTCTAACTTCGGACATGTCCATCGTAATAATGATCATCGACGTCAACGAGAAC

CGATTTGCGCCCGAATTCGACGACTTTGTGTACGAGGGAAAGGTAAAGGAGAACAAGCCGAAGGGAACGTTCGTAATGAATGT

CACAGCACGGGATATGGACACGGTGGACCTGAACTCCAAGATCACGTACTCAATAACAGGTGGCGATGGACTGGGAATTTTTG

CGGTTAACGACCAAGGTTCAATAACTTCCTTGTCGCAACTCGATGCGGAGACGAAAAACTTTTACTGGCTGACGCTCTGTGCA

CAGGATTGCGCAATAGTTCCCCTCAGCAATTGTGTGGAAGTTTACATACAAGTCGAAAACGAAAACGATAACATTCCTCTTAC

GGACAAACCAGTGTACTACGTTAATGTCACGGAAGCCAGTGTGGAAAATGTGGAGATCATTACCCTAAAGGCTTTCGATCCCG

ATATAGATCCCACTCAGACTATAACATATAACATAGTTTCCGGAAATCTTGTCGGGTACTTTGAAATTGATTCGAAAACAGGA

GTGATTAAGACGACAGAACGCAAATTGGATAGAGAAAATCAAGCGGAACATATTTTGGAGGTGGCTATATCAGATAACGGATC

TCCAGTACTATCTTCTACATCGCGAATCGTTGTGTCAGTACTGGATATTAACGATAACAGCCCCGAGTTTGACCAAAGGGTCT

ACAAGGTGCAAGTTCCGTCTTCAGCCACAGTCAATCAATCTATTTTTCAGGTTCACGCTATCGACAGCGACAGTGGCGAAAAT

GGTCGAATTACCTACTCAATTAAGTCCGGAAAGGGTAAGAATAAATTTCGCATCGATAGCCAAAGGGGCCATATACATATAGC

AAAACCATTGGACTCCGACAATGAGTTTGAGATTCACATCAAGGCTGAGGACAACGGAATTCCTAAAAAGAGTCAAACTGCTA

GAGTTAATATTGTTGTAGTTCCTGTAAATCCTAATTCCCAAAATGCACCGTTGATAGTCAGAAAGACATCCGAAAATGTCGTT

GATCTTACGGAAAATGACAAGCCTGGATTTTTGGTCACTCAAATTTTAGCTGTCGATGATGACAACGACCAGCTGTGGTACAA

CATTTCCAATGGCAATGACGACAATACCTTTTACATTGGCCAAGACAACGGAAACATACTGCTTTCAAAATATTTGGACTACG

AGACCCAACAGTCCTATAATCTGACTATCAGCGTCACTGATGGCACATTCACAGCGTTTACTAATCTTTTGGTTCAAGTGATC

GATATTAATGACAACCCCCCTCAGTTCGCTAAAGATGTGTATCATGTCAATATATCCGAAAATATTGAAGAGGAATCAGTTAT

AATGCAACTCCACGCCACTGACAGAGATGAGGACAAGAAGCTATTCTATCACCTGCACGCAACTCAGGATCCGTCGTCGCTGG

CATTGTTCCGAATCGATTCCATAAGTGGAAATGTCATTGTCACTCAGAGATTGGATTTTGAAAAGACTGCGCAGCATATACTC

ATCGTTTTTGTTAAGGATCAAGGAGCGCCTGGAAAAAGAAACTATGCCAAGATAATTGTAAACGTGCATGACCACAACGACCA

TCATCCAGAATTTACTGCTAAAATAATTCAAAGTAAGGTTCCCGAAAGCGCAGCTATTGGCTCTAAGTTAGCCGAAGTGAGGG

CCATAGATAGAGATAGTGGTCACAATGCCGAGATCCAGTACTCGATTATCACGGGTAACGTGGGTAGTGTGTTTGAGATTGAT

CCGACTTTCGGTATAATCACATTGGCTGGCAACTTGAATATCAACAAGATCCAGGAGTACATGCTTCAAGTGAAGGCCGTAGA

TCTGGGAAATCCACCGCTGTCATCGCAGATTCCGGTACACATCATTGTCACCATGTCCGAGAACGATCCTCCGAAGTTCCCAA

CCAACAACATTGCCATTGAAATATTCGAAAACCTGCCCATCGGAACATTTGTTACTCAAGTCACCGCTCGGTCGTCGTCATCC

ATATTCTTCAATATTATTTCCGGCAACATCAACGAAAGCTTCCGCATTAACCCATCTACTGGAGTTATTGTTATCAATGGAAA

TATCGACTATGAATCCATCAAAGTATTCAACCTTACGGTTAAAGGAACCAATATGGCAGCCGAGTCATCCTGCCAAAATATAA

TTATACATATCCTAGATGCTAACGATAATATTCCGTATTTCGTTCAAAATGAATATGTTGGAGCATTACCCGAATCCGCCGCT

ATTGGATCTTACGTACTGAAAGTACACGACTCATCAAAAGATCATTTAACATTACAAGTTAAGGATGCGGATGTCGGAGTAAA

CGGAATGGTTGAATACCACATAGTTGACGATCTGGCAAAAAACTTTTTTAAAATAGATTCGACAACTGGCGCTATTGAACTGT

TACGACAATTGGACTATGAAACAAACGCTGGTTATACCTTTGACGTTACGGTTAGTGATATGGGAAAGCCCAAACTACATTCC

ACTACAACTGCACATGTGACGATTCGTGTCATAAATGTTAACGATTGTCCTCCAGTATTTAATGAGCGTGAACTCAATGTAAC

TTTGTTCCTTCCAACTTTTGAGAATGTGTTTGTAAGACAAGTTAGCGCAAAGGATGCTGATAACGATACCTTAAGGTTTGATA

TTGTGGATGGAAACACCAACGAATGTTTCCAGATCGAAAAATACACCGGAATAATTACAACACGAAATTTTGAAATACTAAAT

AACGAAAATGATCGGGACTATGCCTTGCACGTCCGTGCCTCCGACGGAATTTTCTCTGCAATTTTAATAGTTAAAATTAAGGT

TTTGTCCGCCATCGATTCGAATTTCGCATTCCAACGTGAATCGTACAGATTTTCTGCATTTGAAAATAACACAAAGGTAGCTA

CCATTGGATTGGTGAACGTAATAGGAAACACACTGGACGAAAACGTTGAGTATCGCATCCTGAACCCAACACAATTGTTTGAT

ATTGGAATCAGTTCGGGAGCCCTAAAAACCACTGGAGTTATTTTCGATCGCGAAGTAAAGGATTTGTACAGACTCTTCGTGGA

AGCAAAGTCAATGCTATACGACGGCATGAATTCAAATGTTCGCAGAGCAGTAACGTCCATAGATATATCCGTCTTGGATGTGA

ACGACAATTGCCCCTTGTTTGTCAATATGCCCTATTATGCCACAGTCTCTATTGACGATCCAAAAGGAACGATTATTATGCAG

GTCAAGGCCATTGACTTGGACAGTGCAGAAAACGGCGAAGTTCGGTACGAACTTAAGAAGGGCAATGGGGAGTTGTTCAAACT

GGACCGCAAATCTGGGGAGTTATCCATAAAGCAGCATGTCGAAGGTCATAACCGAAACTATGAATTGACAGTGGCTGCCTATG

ATGGCGCCATAACACCATGCTCCTCGGAAGCTCCTCTGCAGGTTAAGGTTATAGATCGTTCGATGCCCGTTTTTGAAAAGCAG

TTTTATACTGTTAGCGTCAAGGAAGACGTGGAAATGTACTCAGCCCTTTCCGTATCCATTGAAGCAGAAAGTCCCCTGGGAAG

GAGTTTAATTTACACAATATCTTCCGAGAGTCAATCGTTTGAAATTGATTACAACACGGGATCAATTTTTGTCGTAAATGAAT

TGGATTACGAGAAAATAAGCTCACACGATGTTTCCATTCGAGCGACTGACAGTCTTTCTGGTGTTTATGCTGAAGTCGTTTTA

TCTGTTTCCATTATGGATGTCAATGACTGCTATCCAGAAATTGAGAGTGATATATACAACCTAACCATTCCGGAAAATGCATC

GTTTGGAACACAAATTCTGAAGATTAATGCAACTGATAACGACTCGGGAGCAAATGCAAAACTTTCCTATTACATTGAGTCCA

TTAATGGGCAAAATAATTCAGAACTGTTTTACATTGACGTCACAGACGGAAATCTGTATTTAAAGACTCCATTGGACTATGAA

CAAATCAAGTATCATCATATAGTCGTTAACGTAAAGGACCATGGATCGCCATCATTAAGTTCCCGATCAAACGTATTTATAAC

AGGTAGAATTCTATGTCGCTTTATCTCTTACAAACTAATTTATGATTCTATTATTCCAGTTAAAGACTTAAACGACAACGCTC

CATGTTTCGTTGAGCCGTCGTACTTCACCAAAGTGTCAGTGGCAGCTGTTCGTGGACAATTTGTTGCTTTACCTAAAGCATAC

GATAAGGATATTTCCGATACCGATTCTCTGGAATACAAAATTGTTTACGGAAATGAATTGCAAACCTATAGTATTGATAAGCT

AACAGGAGTGATTTCCCTTCAAAATATGTTAAATTTCACTGATAAAAGTAGCACAGTCTTGAATATTTCCGTCTCCGATGGAG

TTCATACGGCATATGCCCGGCTCAAAATATCCTTATTGCCAGAAAACGTTTACAGTCCACTGTTTGATCAAAGTACTTATGAG

GCTCAAGTACCTGAAAACTTGCTACACGGTCATAATATAATCACGGTAAAAGCATCGGATGGAGACTTTGGCACCTACGCCAA

TCTTTACTACGAAATAGTTTCGGAGGAAATGAAAAAAATCTTTCTCATCGACCAAACGACGGGTGTAATAACCTCAAAAGTAA

CTTTCGACCGTGAAAAAAAGGATGAGTACGTGGTGCTACTGAAGGTGTCCGACGGTGGCGGAAAATTCGGATTTGCCTCTCTC

AAGGTCATAGTCGTCGACGTGAACGATAACGTTCCTTACTTCCTATTGAAGGAATACAAAATGGTTGTTAGCACAACAGTGGA

AGCAAACCAAACTATCCTGACGGTCAAAGCCAAAGACGACGATATTGTTGATAATGGATCGGTGCATTTCCAAATTGTTCAAA

AATCCAACGATAAGGCAGTAAAGGATGTAATCGAAATCAACGAGAAAACTGGGGATATTGTGTTTAAAAGCAAGGCGGAATCT

TACGGAGTGAACTCATATCAGTTTTTCGTTCGCGCTTCCGATCGCGGTGAACCTCAATTTCATTCGGAAGTTCCAGTGTCAAT

CGAAATAATCGAGACTGATGCCAATATTCCCACTTTTGAGAAATCGTCAGTTCTACTAAAGATCATAGAGTCAACGCCACCAG

GAACCGTGCTAACGAAGCTACATATGATTGGAAACTATACGTTCAAATTCTCAATAGCAGCGGATCAGGATCACTTCATGATA

TCCGATAGTGGTGAACTGATCCTTCAGCAGACATTGGACAGGGAGCAGCAAGAGTCGCACAATTTGATTGTAGTGGCGGAAAC

TTCCACGGTTCCCGTTTTTTTCGCCTACGCTGATGTTTTGATTGACGTTAGGGACGAAAATGATAACTATCCCAAGTTTGACA

ACACATTCTACAGTGCCAGTGTTGCGGAAAACAGTGAAAAGGTGATATCCTTGGTGAAAGTATCGGCCACAGATGCGGACACT

GGGCCAAATGGCGACATTCGCTACTACTTGGAAAGTGATACTGAAAACATTCAAAATATTTTTGACATTGACATTTACTCTGG

CTGGATCACCTTGCTAACCTCCTTGGACAGAGAAGTTCAGTCCGAGTACAATTTCAAAGTAATTGCTGCCGATAATGGCCACC

CAAAGCATGATGCAAAAGTACCTGTAACTATCAAAATCGTAGACTATAATGATAACGCACCAGTATTTAAGTTGCCTATCGAA

GGGCTTTCTGTTTTCGAAAACGCGCTGCCTGGCACGGTTTTAATCAACTTACTCCTAATTGATCCCGATATCGAGAAACAGGA

AATGGATTTCTTTATCGTTTCTGGGGACAAGCAAGCCCAGTTTCAGATCGGTAAGAGCGGAGAGTTATTTATTGCCAAACCAT

TAGATCGCGAACAACTCATGTTCTACAACTTAAGCATAATAGCCACTGATGGAAAATTCACTGCCAAAGCCAATGTGGAAATA

GATGTAAAAGACATAAACGACAATACGCCTTACTGCCTAAAACCCCGCTATCATATCTCCACTAATGAATCAATCTCGATTGG

AACTACACTCGTTGAGGTCAAGGCGATTGACTTTGATTTTCAAAGCAAACTGCGCTTCTATCTTTCGGGCAAAGGTGCGGACG

ACTTCAGTATAGGAAAGGAAAGTGGCATCCTGAAGGTGGCAAGCGCACTGGATCGGGAGACAACCCCCAAGTACAAATTGGTC

GCACATGTACAGGATGGCAAGGACTTTACGCAAGAGTGTTTCTCGGAAATAATCATCACGGTCAATGACATAAATGACAATAT

GCCCATTTTCTCAATGGCTCAATATAGAGTGAGTGTACCCGAGGATGCACAACTGAACACATTGATCACGAAAGTGCACGCGA

TGGATAAGGATTTCGGGGTAAATAGACAAATCAAATACTCGCTAATGGGTGAAAACCATGATTATTTCAAAATATCAAAATCG

ACTGGTATCATAAGGCTGCACAAAAGTCTCGATCGTGAAACAATTTCATTGTTTAATCTCACTGTGAAGGCGGAGGACTGTGG

CGTTCCAAAACTACACTCCATTGCAACAGTTGCTGTGAACATATTGGACATTAATGACAATCCACCCGAGTTCAGTATGCGTC

AGTATTCGTGCAAAATTCTGGAAAACGCCACACACGGCACAGAAGTGTGCAAAGTTTATGCCACTTCGATAGATATTGGGGTA

AATGCGGATATTCACTACTTCATAATGAGTGGCAACGAGCAGGGGAAGTTCAAAATGGATTCCACGACGGGCGACTTGGTGCT

AAATGCAACCTTGGACTATGAAATGTCCAAGTTTTACTTCTTGACCATTCAAGCAATCGATGGCGGCACTCCACCGCTTAGCA

ACAATGCATATGTGAACATCTCTATTCTGGACATTAATGACAACAGTCCCACGTTTCTGCAAAACCTGTACCGCATTAATGTC

AATGAAGATATTTTCGTGGGCTCCAAGATTCTGGACGTCAAAGCCACGGACGAAGATTCAGATGTAAATGGTCTTGTAACTTA

CAACATTGAAAGAGGCGACAATATAGGCCAGTTTTCAATAGATCCGAAAAACGGAACAATTAGCGTTTCGAGGCCATTAGATC

GTGAGACTATTTCGCACTACACTCTTGAAATTCAAGCCTGTGATCAGGGAGATCCTCAGAGATGCAACAGTGTTCCAATCAAT

ATAAACATTTTGGACACTAACGATAATGCACCCATATTTTCCAGCTCTAACTACAGTGTAGTACTTCAAGAAAACCGACTTCT

GGGCTATGTATTCCTTACCTTCAAGATATCAGACGCAGACGAAACACCCAATACCACGCCATACACCTTCGATATTAGGTCTG

GAAATGAGGGTGGGCTTTTCCGGCTGGAGCAAGATGGTTCCTTGAGAACGGCCTCGCGATTTAATCACAATCTGCAGGACGAA

TTCGTGATTCAAGTTCGAGTTTTCGACAACGGCACACCTCCATTATATTCCGATGCCTGGGTGGTTGTGAAAATAATTGAAGA

AAGCCAATACCCGCCCATTGTCACACCCCTAGAAGTAACCATAAATTCATTCGAGGACGATTTTTCGGGCGCATTCATTGGCA

AAGTTCATGCCTCGGATCAGGACAAGTATGATGAATTGAACTTTAGTTTGGTGTCCGGTCCCGATGACATGTATCAGAGCTCG

AAGCTGTTCAACATTTCCAACAACACGGGAAAGATCTATGCCATATCCAACCTGGATATTGGTCTGTACAAGCTAAATGTGTC

CGTTTCGGATGGTAAATTTCATGTGTTCTCCATTGTCAAAATCAACGTGGAACTGGTAACCAATGATATGCTAAAAGAGTCGG

TTGTCATTCGATTCAGAAGGATTTCAGCATCTGAGTTTCTGCTGAGTCACAGGAAAACCTTTATGCGCTCCATTCGCAATATA

ATGCGATGTCGCCAAAAGGATGTAATTCTCATCACCCTTCAATCGGATTATCAAAAAGCATCACAACATGCTGTGGGTAATCG

ACGAGCCAGGTCCATTGACTCCGATTTGAACGTGGTGTTTGCAGTGCGAAAGCAGCAAATAATACCCGATTCCGATGAATTCT

TCACAAGTGATGAAATTCGGCAGACACTGATAGACAAGAAGAACGAGATTGAAAACGAAACCAACCTGGTGGTGGAGGATGTA

CTACCATCCACCTGTCAAAGCAACAAAAACGACTGCGTTCACGGGGAATGCAAACAGATATTACAGATCCTGAAGAACAACGT

TACCACCACCTTTACGGATGTGATTAGTTTTGCTGCTCCATCTTACATTCCGGTGAATACGTGTGTCTGTCGACCAGGATTCG

ATGGAAAGCACTGCAAAGAGACTGTGAATGCCTGCTCCACGGATCCATGTTCCCCGCAGAGGATCTGCATGCCGTCTGGCTCG

GCTTTGGGTTACCAATGTGTGTGTCCCAAGGGATTTTCAGGAACCTACTGCGAGCGGAAGTCTTCGAAGTGCAGCAATGAGTC

CTGTGACATGGGTCTATTCACTGCGGTGTCCTTTGGCGGAAAGAGCTATGCCCACTACAAGATCAACAAGGTGAAGGCGAAGT

TCACGCTGGAAAACGGGTTTTCCTACTCCCTGCAGATAAGAACTGTGCAACAAACTGGGACTCTGCTGTATGCCAGCGGCAAG

GTGGACTACAACATCCTGGAGATCATAAACGGAGCTGTTCAGTACAGATTCGATTTGGGCTCGGGCGAGGGAGTCATCAGTGT

GTCCAGCATTAACATCTCTGACGGCGAGTGGCATCAAATCAGCCTAGAGCGGTCCCTCAATAGTGCCAAAGTGATGGTGGACA

ACAAGCACGTCTCCCATGGCAGTGCTCCGGGTGTGAATGGCATCCTGAACATCCAGTCGAACGATATCTTTGTAGGCGCCGAG

GTTCGTCCGCATCCATCGATAATTGGCTACGAGGATATTCAGCGTGGCTTCATCGGTTGCATGGCAAACATCAAAATAGCCAA

AGAGTCGCTGCCATTGTACATTTCCGGTGGGAGTACCATTGCTGCCTTGAAACGTTTTACGAATGTCGAGTTCAAGTGCGATC

CGTCGAATGTTCTGGTGCGCCTGGGCATTTGCGCATCTCAGCCGTGTGCCAATAGTGGAATCTGCAAGGAACTCGATACGGAC

GTGTTTGAATGCGCCTGTCAGCCCCGATATTCCGGCAAGCATTGCGAGATTGATTTGGACCCTTGCTCATCGGGACCCTGCTT

GTTTGGCGGCAGGTGCGACTACCACGGACCGAACAACTACAGCTGCACGTGTCCCATCCACTTATCCGGAAAGAGGTGTGAGT

ACGGCAAGTTCTGCACGCCGAACCCGTGCAAAAACGGTGGCATTTGCGAGGAAGGCGATGGAATATCGCACTGCATGTGCCGC

GGCTACACGGGACCCACTTGTGAGATCGATGTGGATGAGTGCGAGAACCAGCCGTGCGGCAATGGAGCGACCTGCATCAATGA

ACCCGGAAGTTTCCGTTGCATTTGTCCATCTTATCTCACAGGAeCCAGCTGCGGCGATCCCCTGTATTCGAACTCTATTTCTA

CAAAGCTGAAGAACTTTTCTATAGAGCACATTAGCGGGATCATTTCCGGCGTGGCCGTGGTACTGGTCATCATCAGTTGTGTC

CTGTGTTGeGTGGTGTTGAAGAGGAGTTCCTCTTCAAAGCGAAGGAACCGACTAGAAAAGGACAAGAACAAGTCGTCGTACAA

GGAGGCGAACTTGAACTCACTGGTGGACAAGGACAATTACTGCAAACCAAACGTAAAGTTGAGTAACTTGGAGGTTAACCAGC

GTCCAATTAGCTACACAGCAGTTCCAAATGACAACCTAGTCCTGAGCAATAGGAATTTTGTAAATAACTTAGACATCTTGCGT

AGCTACGGTTCGGCCGGCGATGAACTGGAAAATGTGCCATTCGAGTACCAGAAGGTTAATCGAAACAAACAGCATGTGAACAT

AAACTCCTGCCATTCAACCGATGCAGATAATGCCTACAAACAAGAATGGTGCGAGCAAATGCATTTAAGAACCTTCAGTGAAA

ATAAACTGAACAATGAACTTAAACGGGATTTCGGACCATCTGTGAGTCGCTTTTCAACTGGGAAACTAATCCAAGTTGAAATG

CCCAACGTGTGCCACTCTTCCAGTGCGAATTTCGTTGATTATTCAGCTCTTGCCAATGGTCAGTATCATTGGGACTGTTCCGA

CTGGGTTCGCAAAAGCCATAATCCCTTGCCAGATATAACCGAAGTTCCTGGAGCAGAAATAGCTGATTCGTCGAGCTTACACA

GCAACGATAGCAACGAGTCCAAGTCGAAGAAAGCCTTTTTCGTGCACAGGGAAGACGGAGATGTTGATCCGACGAGGGATATA

GCCGCGTTGAATGAGGATATCGGATCGGAGTATTTGGACTCGGAGGCAGAGAGCTGCTTGGAGCCGTTTATGTTGCCAAGATC

AAGTAATCAGCCACTTTCAAGACTGAGTTCTTTTAATAATATCGAGAATGAAGACTATAAATCAAATACAGGCAAAGTATATT

TAAGACATCeTGATTCGTATTTACCGACGATGCATTTTCCAAGTGAGACCGATGGGGAAAGCTCTATGACCGAGGGGCCGATT

TCTAGGATGGAAATAAAAACCAGGAGGACGATAAGTGAAAATTCAGAGGAGGCATACCTATTTCCATGeACTGTCGGAGAAAT

TGGATCCAACAGCAACATTTCGGTTCGACTGTGTGAAATTGAAGATTCTGAGTTGGAGGAGTTTTTACCACAACAACAAACAA

ACAATTAA (SEQID NO：13)

PCS(酿酒酵母)

CTACAACTTACTCTTATTTCTGCTGCTCTTAGCAAAAGTTTCTGCGATAACTCTTCTCTGGATTTTACCTGTAGCGGTTTTTG

GTAGCTTATCAACAAAGTACACCTTGGTTGGAATTTTGAAAGAGGCTAGGTGCTTCTTTAAGAAGTTCACCAGTTCTTCGTAG

GTCATTTTTTCTCCCTTCTTCAAAACAATGGCGGCTTGAACTACTTGGCCGTACATATCGTCGGGAACACCAAATGCAACGGC

TTCATCGATCTTTGGATGCGATAGCATAATGCCGTeGAGCTCAATGGGTGAAATCTTTTCACCACCCCTGTTGATAAGCTCTT

TGATTCTGCCTGTAAGGACCAAAAACCCCTCAGGGTCGAAATAACCTTGGTCACCGGTTCTGAAATAGTTCTCTCTCTTGGTG

AAGTTCTCCTTGTTAGCTTTTGGATTATTAGCATACCCCAAAGTGACGTTTTCGCCTCTGATGGAAACTTCGCCGACTTTGCC

CGGGGGCAAGACATTGTCATTGTCATCTAGAATGACGACGGTGACTCCTTGTGGCTGGCCCACAGTACCAGGCTTTCTCTTTC

CTGGAGGCAGATTGTTTGAGGTCATTTGATGTGATGCTTCGGTCATCGCATAGGCCTCCAAGACAGGTGCATTGAATTCCTTC

TCCAGCTTATGGAACGTTGCTGGAGCCAAAGCAGAAGAACACGATCTGATGAATCTAATGTGTGGGAAAGGGTTTGGTTTGGG

CATGTTCAGCATAATCATGCTTATTGTGGGAACGCAACTGAACCAATTACAGTTGTACTTAAeAAATTGGTCCCAGAATAACT

TTGGATGGAATCCATCGGGAACCACAACAGAACCCTGAGTTCTAAAAGTGGAAAGTAAAACACCAATTAACCCATGGACGTGG

AAAAGAGGCATCACGACATAAGATCTGTCCAAGGGCGTTAGCTTGTAAGTGTTAGCAATGTTCAACGTGCTTCTCACAATGTT

eAAATGTAACAAAGGCACCGTTTTTGGAGTGGAGGTGGTACCACTGGTATGCAAAATCAGGGCAACGTCACTGGAACGGGCAA

ACCCAGGGAATTTAACGGGATTTGTGTTGACAAATTTGGCGTTGTTCAAAGACCGGTAAATAACCCTTTTGTAGTTGTCCTCT

GGAGAGTATATATCATACTCTACCCTAAACCTGGTCGCATCGAAGGCCAGCTCTACGATAAAACATCCAAACGTGGAGGCAGA

TTTTAGAATTTCAGAACTCTGTAACTTTGTGGTACCCTTTGGGACGCAAATCGCCTTAGATTTCAGGTCATTCAAATAAAAAT

TGAACTCCTTTTCCTTATAATTGGGATTCAAGGGCGCGCCAATTTTAGCGTCCATAGTAGCACCGAGGAAAGCGACGATAAAT

TCCAGCCCATTACGCATGGATATCGCCACTGTATCTTGTCTGAAAACAGCTCCGTACAATGGAGAATTAGGATTTGTGAACAT

GGTCTGGAAGTGACCCACCATGTGGGATAGATCCCTGTAGGTCACCTGAGTGTCCGTTTCAGGAACAATAACGGCGACATTAT

CGGATACGCTAAAAGTATCGTTGAACGAAGCAGTAACAGTAGCGGCACTTGTCAT (SEQ ID NO：14)

ACLY(人(Homo sapiens))

GCGAGCCGATGGGGGCGGGGAAAAGTCCGGCTGGGCCGGGACAAAAGCCGGATCCCGGGAAGCTACCGGCTGCTGGGGTGCTC

CGGATTTTGCGGGGTTCGTCGGGCCTGTGGAAGAAGCTGCCGCGCACGGACTTCGGCAGAGGTAGAGCAGGTCTCTCTGCAGC

CATGTCGGCCAAGGCAATTTCAGAGCAGACGGGCAAAGAACTCCTTTACAAGTTCATCTGTACCACCTCAGCCATCCAGAATC

GGTTCAAGTATGCTCGGGTCACTCCTGACACAGACTGGGCCCGCTTGCTGCAGGACCACCCCTGGCTGCTCAGCCAGAACTTG

GTAGTCAAGCCAGACCAGCTGATCAAACGTCGTGGAAAACTTGGTCTCGTTGGGGTCAACeTCACTCTGGATGGGGTCAAGTC

CTGGCTGAAGCCACGGCTGGGACAGGAAGCCACAGTTGGCAAGGCCACAGGCTTCCTCAAGAACTTTCTGATCGAGCCCTTCG

TCCCCCACAGTCAGGCTGAGGAGTTCTATGTCTGCATCTATGCCACCCGAGAAGGGGACTACGTCCTGTTCCACCACGAGGGG

GGTGTGGACGTGGGTGATGTGGACGCCAAGGCCCAGAAGCTGCTTGTTGGCGTGGATGAGAAACTGAATCCTGAGGACATCAA

AAAACACCTGTTGGTCCACGCCCCTGAAGACAAGAAAGAAATTCTGGCCAGTTTTATCTCCGGCCTCTTCAATTTCTACGAGG

ACTTGTACTTCACCTACCTCGAGATCAATCCCCTTGTAGTGACCAAAGATGGAGTCTATGTCCTTGACTTGGCGGCCAAGGTG

GACGCCACTGCCGACTACATCTGCAAAGTCAAGTGGGGTGACATCGAGTTCCCTCCCCCCTTCGGGCGGGAGGCATATCCAGA

GGAAGCCTACATTGCAGACCTCGATGCCAAAAGTGGGGCAAGCCTGAAGCTGACCTTGCTGAACCCCAAAGGGAGGATCTGGA

CCATGGTGGCCGGGGGTGGCGCCTCTGTCGTGTACAGCGATACCATCTGTGATCTAGGGGGTGTCAACGAGCTGGCAAACTAT

GGGGAGTACTCAGGCGCCCCCAGCGAGCAGCAGACCTATGACTATGCCAAGACTATCCTCTCCCTCATGACCCGAGAGAAGCA

CCCAGATGGCAAGATCCTCATCATTGGAGGCAGCATCGCAAACTTCACCAACGTGGCTGCCACGTTCAAGGGCATCGTGAGAG

CAATTCGAGATTACCAGGGCCCCCTGAAGGAGCACGAAGTCACAATCTTTGTCCGAAGAGGTGGCCCCAACTATCAGGAGGGC

TTACGGGTGATGGGAGAAGTCGGGAAGACCACTGGGATCCCCATCCATGTCTTTGGCACAGAGACTCACATGACGGCCATTGT

GGGCATGGCCCTGGGCCACCGGCCCATCCCCAACCAGCCACCCACAGCGGCCCACACTGCAAACTTCCTCCTCAACGCCAGCG

GGAGCACATCGACGCCAGCCCCCAGCAGGACAGCATCTTTTTCTGAGTCCAGGGCCGATGAGGTGGCGCCTGCAAAGAAGGCC

AAGCCTGCCATGCCACAAGATTCAGTCCCAAGTCCAAGATCCCTGCAAGGAAAGAGCACCACCCTCTTCAGCCGCCACACCAA

GGCCATTGTGTGGGGCATGCAGACCCGGGCCGTGCAAGGCATGCTGGACTTTGACTATGTCTGCTCCCGAGACGAGCCCTCAG

TGGCTGCCATGGTCTACCCTTTCACTGGGGACCACAAGCAGAAGTTTTACTGGGGGCACAAAGAGATCCTGATCCCTGTCTTC

AAGAACATGGCTGATGCCATGAGGAAGCACCCGGAGGTAGATGTGCTCATCAACTTTGCCTeTCTeCGCTCTGCCTATGACAG

CACCATGGAGACCATGAACTATGCCCAGATCCGGACCATCGCCATCATAGCTGAAGGCATCCCTGAGGCCCTCACGAGAAAGC

TGATCAAGAAGGCGGACCAGAAGGGAGTGACCATCATCGGACCTGCCACTGTTGGAGGCATCAAGCCTGGGTGCTTTAAGATT

GGCAACACAGGTGGGATGCTGGACAACATCCTGGCCTCCAAACTGTACCGCCCAGGCAGCGTGGCCTATGTCTCACGTTCCGG

AGGCATGTeCAACGAGCTCAACAATATCATCTCTCGGACCACGGATGGCGTCTATGAGGGCGTGGCCATTGGTGGGGACAGGT

ACCCGGGCTCCACATTCATGGATCATGTGTTACGCTATCAGGACACTCCAGGAGTCAAAATGATTGTGGTTCTTGGAGAGATT

GGGGGCACTGAGGAATATAAGATTTGCCGGGGCATCAAGGAGGGCCGCCTCACTAAGCCCATCGTCTGCTGGTGCATCGGGAC

GTGTGCCACCATGTTCTCCTCTGAGGTCCAGTTTGGCCATGCTGGAGCTTGTGCCAACCAGGCTTCTGAAACTGCAGTAGCCA

AGAACCAGGCTTTGAAGGAAGCAGGAGTGTTTGTGeCCCGGAGCTTTGATGAGCTTGGAGAGATCATCCAGTCTGTATACGAA

GATCTCGTGGCCAATGGAGTCATTGTACCTGCCCAGGAGGTGCCGCCCCCAACCGTGCCCATGGACTACTCCTGGGCCAGGGA

GCTTGGTTTGATCCGCAAACCTGCCTCGTTCATGACCAGCATCTGCGATGAGCGAGGACAGGAGCTCATCTACGCGGGCATGC

CCATCACTGAGGTCTTCAAGGAAGAGATGGGCATTGGCGGGGTCCTCGGCCTCCTCTGGTTCCAGAAAAGGTTGCCTAAGTAC

TCTTGCCAGTTCATTGAGATGTGTCTGATGGTGACAGCTGATCACGGGCCAGCCGTCTCTGGAGCCCACAACACCATCATTTG

TGCGCGAGCTGGGAAAGACCTGGTCTCCAGCCTCACCTCGGGGCTGCTCACCATCGGGGATeGGTTTGGGGGTGCCTTGGATG

CAGCAGCCAAGATGTTCAGTAAAGCCTTTGACAGTGGCATTATCCCCATGGAGTTTGTGAAeAAGATGAAGAAGGAAGGGAAG

CTGATCATGGGCATTGGTCACCGAGTGAAGTCGATAAACAACCCAGACATGCGAGTGCAGATCCTCAAAGATTACGTCAGGCA

GCACTTCCCTGCCACTCCTCTGCTCGATTATGCACTGGAAGTAGAGAAGATTACCACCTCGAAGAAGCCAAATCTTATCCTGA

ATGTAGATGGTCTCATCGGAGTCGCATTTGTAGACATGCTTAGAAACTGTGGGTCCTTTACTCGGGAGGAAGCTGATGAATAT

ATTGACATTGGAGCCCTCAATGGCATCTTTGTGCTGGGAAGGAGTATGGGGTTCATTGGACACTATCTTGATCAGAAGAGGCT

GAAGCAGGGGCTGTATCGTCATCCGTGGGATGATATTTCATATGTTCTTCCGGAACACATGAGeATGTAA (SEQID NO：15)

FAS(牛分支杆菌亚种，Mycobacterium bovid subsp.bovis)：

ATGAGTCAGACGGTGCGCGGTGTGATCGCACGACAAAAGGGCGAACCCGTTGAGCTGGTGAACATTGTCGTCCCGGATCCCGG

ACCCGGCGAGGCCGTGGTCGACGTCACeGCCTGCGGGGTATGCCATACCGACCTGACCTACCGCGAGGGCGGCATCAACGACG

AATACCCTTTTCTGCTCGGACACGAGGCCGCGGGCATCATCGAGGCCGTCGGGCCGGGTGTAACCGCAGTCGAGCCCGGCGAC

TTCGTGATCCTGAACTGGCGTGCCGTGTGCGGCCAGTGCCGGGCCTGCAAACGCGGACGGCCCCGCTACTGCTTCGACACCTT

TAACGCCGAACAGAAGATGACGCTGACCGACGGCACCGAGCTCACTGCGGCGTTGGGCATCGGGGCCTTTGCCGATAAGACGC

TGGTGCACTCTGGCCAGTGCACGAAGGTCGATCCGGCTGCCGATCCCGCGGTGGCCGGCCTGCTGGGTTGCGGGGTCATGGCC

GGCCTGGGCGCCGCGATCAACACCGGCGGGGTAACCCGCGACGACACCGTCGCGGTGATCGGCTGCGGCGGCGTTGGCGATGC

CGCGATCGCCGGTGCCGCGCTGGTCGGCGCeAAACGGATCATCGCGGTCGACACCGATGACACGAAGCTTGACTGGGCCCGeA

CeTTCGGCGCCACCCACACCGTCAACGCCCGCGAAGTCGACGTCGTCCAGGCCATCGGCGGCCTCACGGATGGATTCGGCGCG

GACGTGGTGATCGACGCCGTCGGCCGACCGGAAACCTACCAGCAGGCCTTCTACGCCCGCGATCTCGCCGGAACCGTTGTGCT

GGTGGGTGTTCCGACGCCCGACATGCGCCTGGACATGCCGCTGGTCGACTTCTTCTCTCACGGCGGTGCGCTGAAGTCGTCGT

GGTACGGCGATTGCCTGCCCGAAAGCGACTTCCCCACGCTGATCGACCTTTACCTGCAGGGCCGGCTGCCGCTGCAGCGGTTC

GTTTCCGAACGCATCGGGCTCGAAGACGTCGAGGAGGCGTTCCACAAGATGCATGGCGGCAAGGTATTGCGTTCGGTGGTGAT

GTTGTGA(SEQ ID NO：1G)

AMPK(人)

AGTTCCTGGAGAAAGATGGCGACAGCCGAGAAGCAGAAACACGACGGGCGGGTGAAGATCGGCCACTACATTCTGGGTGACAC

GCTGGGGGTCGGCACCTTCGGCAAAGTGAAGGTTGGCAAACATGAATTGACTGGGCATAAAGTAGCTGTGAAGATACTCAATC

GACAGAAGATTCGGAGCCTTGATGTGGTAGGAAAAATCCGCAGAGAAATTCAGAACCTCAAGCTTTTCAGGCATCCTCATATA

ATTAAACTGCACCAGGTCATCAGTACACCATCTGATATTTTCATGGTGATGGAATATGTCTCAGGAGGAGAGCTATTTGATTA

TATCTGTAAGAATGGAAGGAAATCTGATGTACCTGGAGTAGTAAAAACAGGCTCCACGAAGGAGCTGGATGAAAAAGAAAGTC

GGCGTeTGTTCCAACAGATCCTTTCTGGTGTGGATTATTGTCACAGGCATATGGTGGTCCATAGAGATTTGAAACCTGAAAAT

GTCCTGCTTGATGCACACATGAATGCAAAGATAGCTGATTTTGGTCTTTCAAACATGATGTCAGATGGTGAATTTTTAAGAAC

AAGTTGTGGCTCACCCAACTATGCTGCACeAGAAGTAATTTCAGGAAGATTGTATGCAGGCCCAGAGGTAGATATATGGAGCA

GTGGGGTTATTCTCTATGCTTTATTATGTGGAACCCTTCCATTTGATGATGACCATGTGCCAACTCTTTTTAAGAAGATATGT

GATGGGATCTTCTATACCCCTCAATATTTAAATCCTTCTGTGATTAGCCTTTTGAAACATATGCTGCAGGTGGATCCCATGAA

GAGGGCCACAATCAAAGATATCAGGGAACATGAATGGTTTAAACAGGACCTTCCAAAATATCTCTTTCCTGAGGATCCATCAT

ATAGTTCAACCATGATTGATGATGAAGCCTTAAAAGAAGTATGTGAAAAGTTTGAGTGCTCAGAAGAGGAAGTTCTCAGCTGT

CTTTACAACAGAAATCACCAGGATCCTTTGGCAGTTGCCTACCATCTCATAATAGATAACAGGAGAATAATGAATGAAGCCAA

AGATTTCTATTTGGCGACAAGCCCACCTGATTCTTTTCTTGATGATCATCACCTGACTCGGCCCCATCCTGAAAGAGTACCAT

TCTTGGTTGCTGAAACACCAAGGGCACGCCATAeCCTTGATGAATTAAATCCACAGAAATCCAAACACCAAGGTGTAAGGAAA

GCAAAATGGCATTTAGGAATTAGAAGTCAAAGTCGACCAAATGATATTATGGCAGAAGTATGTAGAGCAATCAAACAATTGGA

TTATGAATGGAAGGTTGTAAACCCATATTATTTGCGTGTACGAAGGAAGAATCCTGTGACAAGCACTTACTCCAAAATGAGTC

TACAGTTATACCAAGTGGATAGTAGAACTTATCTACTGGATTTCCGTAGTATTGATGATGAAATTACAGAAGCCAAATCAGGG

ACTGCTACTCCACAGAGATCGGGATCAGTTAGCAACTATCGATCTTGCCAAAGGAGTGATTCAGATGCTGAGGCTCAAGGAAA

ATCCTCAGAAGTTTCTCTTACCTCATCTGTGACCTCAeTTGACTCTTCTCCTGTTGACCTAACTCCAAGACCTGGAAGTCACA

CAATAGAATTTTTTGAGATGTGTGCAAATCTAATTAAAATTeTTGCACAATAA (SEQ ID NO：17)

在Po 1g解脂耶氏酵母菌株中转化载体并在亮氨酸缺陷型琼脂板上选择。使用PCR筛选正确插入基因组中的菌落。

Δ9-FW AATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGA(SEQ ID NO：18)

Δ9-REV ATGGATCCCTAAGCAGCCATGCCAGACATAC(SEQ ID NO：19)

GLUT1-FW AATGGAGCCCAGCAGCAAGAAGGTGA(SEQ ID NO：20)

GLUT1-REV AATGGGTACCTCACACTTGGGAGTCAGeC(SEQ ID NO：21)

血红蛋白FW AGAGACCGGGTTGGCGGCGCA(SEQ ID NO：22)

血红蛋白REV CAGCGTCTTGAGCGTACAAA(SEQ ID NO：23)

细胞色素FW AATGATCATCAACGGCAAGGTCT(SEQ ID NO：24)

细胞色素REV TTATTTCTGACCCTGGAGGTAGAAG(SEQ ID NO：25)

丙酮酸羧化酶FW AATGCTGAAGTT℃CGAACAGT(SEQ ID NO：26)

丙酮酸羧化酶 CGATGGTACCTCACTCGATCTCCAGGATG(SEQ ID NO：27)

在YPD培养基(完全培养基：酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖)和YNB培养基(基本培养基，包含所有营养物，但不含氨基酸，以及不含氮源或碳源)中培养所得菌落。当使用YNB培养基进行培养时，以硫酸铵提供氮并以葡萄糖提供碳，碳氮比为150。该C/N比对于启动油积累是必要的。在酵母中消耗氮后，过量糖转换入油积累。

收获油：在氮受限型培养基中培养细胞。72小时之后收获细胞并在60℃下干燥2天。在90℃下，用1％硫酸和甲醇直接处理细胞24小时。油转化为FAME(脂肪酸甲酯)并通过己烷萃取。将己烷萃取重复两次以回收95％的FAME。蒸发己烷级分并在5ml己烷中重悬。将10μl级分注入GC-MS以量化FAME。

如早期所描述的(Voelker和Davies，1994)，收获并制备细胞培养物用于脂肪酸分析。采用具有电子冲击电离源的单四极MS通过GC-MS量化每个样品的脂肪酸含量。GC柱是ID为0.25mm和膜厚度为25μm的30m长的HP-5MS(5％苯基)-甲基聚硅氧烷。GC洗脱条件如下：100℃作为起始温度(5分钟)、15分钟升至250℃，在250℃下保持10分钟。

实施例1

使用GC-MS探测生长于对数和稳定生长期解脂耶氏酵母培养物中总游离脂肪酸(FFA)储积的定性谱(图1A-C)。主要的FFA储积包含饱和棕榈酸和硬脂酸以及不饱和油酸。比较两个生长期的FFA谱显示出稳定期没有油酸，而在对数期中观察到硬脂酸和油酸的类似的峰密度(图1A，B)。稳定期中的总脂质(FFA+脂质)回收了部分量的油酸的分析表明，油酸进入TAG形成途径(图1C)。油酸的剩余储积用于下游多聚不饱和脂肪酸并因此不能被援救。因此，油酸在稳定生长期期间以瞬时形式导入TAG形成，其与胞内TAG储存途径活化的时间符合。这表明可存在监测点机制来监控检测油酸水平以调节油积累。

实施例2

因为在小鼠中，SCD对于脂肪生成是必要的(参见，例如Regulation of stearoyl辅酶A desaturases and role in metabolism.Prog Lipid Res.2004Mar；43(2)：91-104)，并被报道对于在大多数生物中合成不饱和脂肪酸是重要的，所以我们测试了解脂耶氏酵母SCD在TAG积累中作为限速步骤的角色。编码SCD的酿酒酵母OLE1基因与解脂耶氏酵母蛋白质序列的蛋白质序列分析显示蛋白质具有51％的同一性。解脂耶氏酵母去饱和酶包含对其它硬脂酸辅酶A去饱和酶而言典型的3个组氨酸盒子和细胞色素b5结构域。因为去饱和酶在基因转录水平(参见例如，Regulation of stearovl 辅酶A desaturase bypolyunsaturated fatty acids and cholesterol. James M.Ntambi.Journal of LipidResearch，第40卷，1549-1558，September 1999)和在细胞生长的对数和稳定期(参见MolCell Biol Res Commun.1999Apr；1(1)：36-43)受到高度调节，所以我们用半组成型启动子对天然解脂耶氏酵母去饱和酶基因表达进行调控。将单拷贝的经修饰基因稳定地整合入基因组中。突变型和野生型菌株的GC-MS谱在不饱和与饱和脂肪酸比率方面表现出显著增加(图2A，B)。用尼罗红染色的胞内脂质的共聚焦显微镜观察表现出不饱和脂肪酸增多和TAG过量积累之间的相互关系(图2C：野生型，图2D：SCD过表达型)。在大多数情况下，SCD过表达细胞的整个细胞体积完全充满TAG(图2D)。这些发现提供了关键调节基因的证据，所述基因出乎意料地足以通过改变不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率诱导胞内TAG的过表达。

生长期和稳定期细胞的共聚焦图像在油积累模式中显示出显著不同。我们测试了再进入细胞分裂周期后的稳定期富油突变细胞的胞内TAG移动。我们用含有高浓度糖(300g/l)的基本培养基分批补给稳定期细胞。细胞有效地再进入对数期，然后快速生长并在96小时内进行消耗所有糖的生物质生产。有趣的是，图像分析示出即使在对数期期间也积累过量的胞内油的突变菌株，这对产油酵母而言是非典型的。虽然野生型细胞不能在高糖浓度中生长，但是即使在有利生长的糖浓度下，对数期中也不存在持续的油生产和酵母样体征。

总之，这些结果使用高浓度的糖建立了连续的补料分批过程，表明改造的酵母菌株能够在对数生长期和稳定生长期期间连续地积累油。

实施例3

产生了两种类型的突变酵母，其过表达下列基因：突变体1：SCD、血红蛋白、Glut1、细胞色素；突变体2：血红蛋白、Glut1、细胞色素。将各基因克隆入质粒YLEX的位点PmlI与Kpn之间。用载体转化Po 1g解脂耶氏酵母菌株并在亮氨酸缺陷琼脂板上选择。使用PCR筛选正确插入基因组中的菌落。在碳氮比(C/N)为150的YPD培养基和YNB培养基中培养所得菌落。该C/N比对引发油积累是必要的。消耗氮后，过量的糖进入酵母中的油积累。

为了测量最大油积累，在氮限制型培养基中培养细胞。72小时之后，收获细胞并在60℃下干燥2天。在90℃下，将细胞直接用1％硫酸和甲 醇处理24小时。油转化为FAME(脂肪酸甲酯)并通过己烷萃取。将己烷萃取重复两次以回收95％的FAME。蒸发己烷级分并在5ml己烷中重悬。将10μl级分注入GC-MS以量化FAME。突变菌株中的最大油积累是80g/l。

比较了突变体1(“D9”)和野生型酵母(“LS”)的葡萄糖摄取动力学。图3示出72小时后突变体1消耗了所提供的全部糖，而野生型酵母仅消耗了所提供的糖的约70％。还观察到即使在延长的一段时间，野生型菌株也未消耗所有糖。

然后确定突变菌株是否可以使用生物质水解产物作为碳源。将2L生物反应器设置为在1％酵母提取物的存在下包含玉米秸秆水解产物(Hz)。Hz包含20g葡萄糖。我们添加(补料分批)180g葡萄糖至终浓度为200g/l。我们确定野生型不能在有毒生物质Hz中生长。在摇瓶中培养突变体1和突变体2细胞至50ml中的最终OD为3。将过夜培养物加入各生物反应器并在30℃下进行发酵72小时。在相同条件下运行两个反应器，其中一个具有突变体1，另一个具有突变体2。搅拌为800rpm，pH设置为5.5。

由于培养基中一些营养物因子的限制，所以在72小时内，两种菌株均消耗了所提供葡萄糖的约50％(图4A，示出突变体1菌株)。两种菌株的50％糖消耗的原因是存在Glut1，已知Glut1将葡萄糖转运入细胞。突变体1消耗了123克葡萄糖而突变体2消耗了105克糖。该结果表明与野生型相比，突变细胞能够消耗糖的几乎50％并良好地抵抗Hz的毒性，在早期试验中，野生型生长不良且消耗少于10g糖。突变菌株示出强生长并良好地消耗糖。由于营养因子的一些消耗，所以未消耗剩余的糖(参见图5和6)。

与突变体2相比，突变体1(具有过表达基因的组合)示出增加的油合成。每升突变体1产生26g油(图4B)，每升突变体2产生14g油。这表明过表达基因的组合不仅引起所提供糖的消耗增加而且引起增加地产生更多油-有用的生物燃料前体。

实施例4

接着，我们在2升发酵容器中测量了改造菌株和野生型菌株的生长优势、总脂质生产、碳水化合物底物向脂质转化的转化效率以及底物耐受。

使用GC-MS测量脂质的总量(图7)。在改造菌株中观察到是比野生 型菌株10倍的脂质生产(80g/l)，代表为其他人(S.Papanikolaou I.Chevalot，M.Komaitis，I.MarcG.Aggelis，Single cell oil production by Yarrowia lipolytica growing on anindustrial derivative of animal fat in batch cultures Appl MicrobiolBiotechnol.2002Mar；58(3)：308-12)所述的解脂耶氏酵母菌株20倍的增加。单不饱和脂肪酸的主要种类是油酸，其与对照菌株相比增加为8.5倍(g/l)(图8)。总不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比显著地增加，总不饱和脂肪酸未增加到超过饱和脂肪酸，但是其中少数为c18.1的情况(参见图7和8)。突变菌株的糖-油转化率确定为0.28g/g，当考虑到用于生产生物质的糖时，其接近理论值。

在经改造菌株和野生型菌株之间观察到了显著且出乎意料的32倍生长优势(图9)。突变菌株的生长特性在对野生型菌株渗透性致死的糖浓度下保持相同(图10)。较高的糖耐受对于通常用于工业生物燃料生产的高重力发酵而言尤为重要。之前，在解脂耶氏酵母培养物中观察到较高的生物质产生和脂质积累之间的负相关(Papanikolaou S，Chevalot I，Komaitis M，Marc I，Aggelis G.Single cell oil production by Yarrowialipolytica growing on an industrial derivative of animal fat in batchcultures.Appl Microbiol Biotechnol.2002Mar；58(3)：308-12.)。因此，在我们改造的菌株中较高的生物质生产和过量的脂质积累之间的联系是出乎意料的。由于脂肪储存主要用于合成膜和出芽活动(FEBS J.2008 Nov；275(22)：5552-63)，对数期细胞的一个可能性是通过活化细胞分裂途径来引导过量脂质重新流向膜合成和/或将脂质分泌至胞外基质。这将在、均衡进入稳定期细胞周期后早期细胞内脂质积累后的过量脂质生产。事实上，较高的生物质生产与生长早期的脂质分泌相关。

图11示出突变和野生型解脂耶氏酵母的生长和脂质生产动力学。与野生型(对照)菌株相比，突变菌株不仅表现出强生长优势，其还产生显著更高量的脂肪酸。

总之，这些结果表明在葡萄糖作为单一碳源的基础上，有效代谢改造产油酵母表现出极理想的多个表型。

实施例5

探测了导致突变菌株多种表型特性的SCD调节机制。考虑到解脂耶氏酵母去饱和酶基因与线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和小 鼠中的类似功能基因的低序列同一性，测试了解脂耶氏酵母中所克隆的跨物种SCD的脂肪酸特异性。与过表达天然耶氏酵母基因的突变体类似，秀丽隐杆线虫和小鼠中的SCD对硬脂酸具有类似的特异性，表现出较高的生物质产量。共聚焦成像证实了稳定生长期期间过量的油积累。这些结果表明对油酸的去饱和酶活性与TAG的过量积累相关。由于已知面包酵母(baker’s yeast)中的SCD在转录和转录后水平受到调节(参见Tabor DE，Kim JB，Spiegelman BM，Edwards PA，Identification of conserved cis-elements and transcription factors requiredfor sterol-regulated transcription of stearovl辅酶 A desaturase.J BiolChem.1999 Jul 16；274(29)：20603-10；Shimano H，Sterol regulatoryelement-bindingprotein family as global regulators of lipid synthetic genes in energymetabolism.Vitam Horm.2002；65：167-94)，研究了油酸对去饱和酶基因的反馈抑制作为可能的调节机理。我们稳定地整合了单拷贝天然去饱和酶基因与包含启动子区的1kb上游序列。突变菌株积累了过量油并如之前突变体一样具有生长优势和糖耐受。这表明与面包酵母不同，油积累不受驱动去饱和酶表达的启动子序列调控。这意味着耶氏酵母中去饱和酶基因的负调节是在转录上是非依赖性的并可能发生在代谢水平。该数据第一次提供了在产油酵母中通过克服油酸的抑制作用进行油调节的机制。

实施例6

可以在多种基质中培养本发明提供的经改造微生物。图13示出以藻类生物作为碳水化合物源时突变解脂耶氏酵母菌株的强生长。图14示出培养于藻类生物质上的经改造微生物细胞中的油积累。图15示出培养于粗甘油中的经改造细胞中的油积累。

实施例7

Δ-12去饱和酶负责将包含油酸的脂质转化为高级链脂质。为了生产生物燃料，考虑到柴油燃料的冷流特性，优选C18链脂肪酸如硬脂酸和油酸。因此，在一些实施方案中，期望阻断或抑制C18脂肪酸转化为较长链脂肪酸。

其可通过抑制或阻断宿主微生物中野生型Δ-12去饱和酶基因的表达来完成(例如过表达Δ9去饱和酶(SCD)的微生物)。为此，产生了核 酸构建体以敲除解脂耶氏酵母中野生型Δ-12去饱和酶。敲除构建体的示意性结构示于图16中。该载体包含侧翼为腐草霉素(例如，Zeocin^TM)抗性基因的Δ-12去饱和酶基因的基因组序列。该构建体的序列示于以下。

Δ-12去饱和酶敲除载体序列

CCAACAGACCGACCATAGAAATGGATTCGACCACGCAGACCAACACCGGCACCGGCAAGGTGGCCGTGCAGCCCCCCACGGCC

TTCATTAAGCCCATTGAGAAGGTGTCCGAGCCCGTCTACGACACCTTTGGCAACGAGTTCACTCCTCCAGACTACTCTATCAA

GGATATTCTGGATGCCATTCCCCAGGAGTGCTACAAGCGGTCCTACGTTAAGTCCTACTCGTACGTGGCCCGAGACTGCTTCT

TTATCGCCGTTTTTGCCTACATGGCCTACGCGTACCTGCCTCTTATTCCCTCGGCTTCCGGCCGAGCTGTGGCCTGGGCCATG

TACTCCATTGTCCAGGGTCTGTTTGGCACCGGTCTGTGGGTTCTTGCCCACGAGTGTGGCCACTCTGCTTTCTCCGACTCTAA

CACCGAGAGACCGGGTTGGCGGCGCATTTGTGTCCCAAAAAACAGCCCCAATTGCCCCAATTGACCCCAAATTGACCCAGTAG

CGGGCCCAACCCCGGCGAGAGCCCCCTTCACCCCACATATCAAACCTCCCCCGGTTCCCACACTTGCCGTTAAGGGCGTAGGG

TACTGCAGTCTGGAATCTACGCTTGTTCAGACTTTGTACTAGTTTCTTTGTCTGGCCATCCGGGTAACCCATGCCGGACGCAA

AATAGACTACTGAAAATTTTTTTGCTTTGTGGTTGGGACTTTAGCCAAGGGTATAAAAGACCACCGTCCCCGAATTACCTTTC

CTCTTCTTTTCTCTCTCTCCTTGTCAACTCACACCCGAAATCGTTAAGCATTTCCTTCTGAGTATAAGAATCATTCAAAATGG

CCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTC

TCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGT

GGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGA

ACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCC

GGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGATCCATGGCCTGTCCCCACGTTGCCGGTCTTGCCTCCTACTACCT

GTCCATCAATGACGAGGTTCTCACCCCTGCCCAGGTCGAGGCTCTTATTACTGAGTCCAACACCGGTGTTCTTCCCACCACCA

ACCTCAAGGGCTCTCCCAACGCTGTTGCCTACAACGGTGTTGGCATTTAGGCAATTAACAGATAGTTTGCCGGTGATAATTCT

CTTAACCTCCCACACTCCTTTGACATAACGATTTATGTAACGAAACTGAAATTTGACCAGATATTGTTGTAAATAGAAAATCT

GGCTTGTAGGTGGCAAAATGCGGCGTCTTTGTTCATCAATTCCCTCTGTGACTACTCGTCATCCCTTTATGTTCGACTGTCGT

ATTTCTTATTTTCCATACATATGCAAGTGAGATGCCCGTGTCCTGGCCATCACCTACCTGCAGCACACCGACCCCACTCTGCC

CCACTACCACGCCGACCAGTGGAACTTCACCCGAGGAGCCGCCGCCACCATCGACCGAGAGTTTGGCTTCATCGGCTCCTTCT

GCTTCCATGACATCATCGAGACCCACGTTCTGCACCACTACGTGTCTCGAATTCCCTTCTACAACGCCCGAATCGCCACTGAG

AAGATCAAGAAGGTCATGGGCAAGCACTACCGACACGACGACACCAACTTCATCAAGTCTCTTTACACTGTCGCCCGAACCTG

CCAGTTTGTTGAAGGTAAGGAAGGCATTCAGATGTTTAGAAACGTCAATGGAGTCGGAGTTGCTCCTGACGGCCTGCCTTCTA

AAAAGTAGAGCTAGAAATGTTATTTGATTGTGTTTTAACTGAACAGCA (SEQ ID NO：28)

在解脂耶氏酵母的A-12去饱和酶敲除细胞中过表达一系列基因(包括A9去饱和酶、Glut1、血红蛋白和细胞色素b5)以进一步增加流入细胞的糖和增加油含量。观察到细胞大小的显著增加，其中在按体积计多至95％的细胞充有油。

实施例8

在3％乙酸类溶液中培养过表达SCD的解脂耶氏酵母148小时(图17)。在约84小时时向细胞培养物添加2％甘油以提供甘油来驱动脂肪酸生产。后者是使用乙酸类作为原料生产油的瓶颈。通过共聚焦激光显微镜 观察到使用掺入甘油的乙酸类培养基显著增加的油生产，是更经济有效地生产油的新方法。

虽然已在本文中描述并说明了本发明的数个实施例，但是本领域技术人员将易于预想多种其它方法和/或结构用于实现本文所述的功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或更多个优点，并且认为这些变化和/或改变的每一个也在本发明的范围内。更一般地，本领域技术人员将易于理解本文所述的所有参数、尺度、材料和构造意在为示例性的，并且实际参数、尺度、材料和/或构造将取决于所使用的本发明教导的具体应用。本领域技术人员将理解或能够使用不多于例行实验来确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同变体。因此，应当理解前述实施例方案仅表示为示例性的，并且在所附权利要求书和其等同变体的范围内，可以在与具体地描述和要求保护的不同地本发明实施。本发明指向本文所述的各个特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，只要这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不互相矛盾，那么两个或更多个这些特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任意组合也包含在本发明的范围内。

本文所限定和使用的所有定义应当理解为控制字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的常规含义。

除非清楚地指出矛盾，否则本说明书和权利要求书中所使用的不定冠词应当理解为意指“至少一个”。

本说明书和权利要求书中所使用的短语“和/或”应当理解为联合的元素的“或者或二者”，即，在一些情况下，元素相联合地存在，在另一些情况下，元素分开存在。除非清楚地表现出相矛盾，否则无论与具体地确定的那些元素相关或不相关，除由短语“和/或”具体地确定的元素以外的其它元素可以任选地存在。因此，作为非限制性例子，参照“A和/或B”，当与开放式语言如“包含/包括”联合使用时，在一个实施方案中，可以指A而没有B(任选地包括除B以外的元素)；在另一实施方案中，可以指B而没有A(任选地包含除A以外的元素)；在又一实施方案中，可以指A和B二者(任选地包含其它元素)等。

本说明书和权利要求书中所使用的“或”应当理解为与如上所定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或者“和/或”应当理解为包括，即，包括一些元素或元素列表中的至少一个，还包括多于一个，以及任选地其它未列出的项目。仅清楚地指出矛盾的术语， 如“仅一个”或者“准确地一个”，或者当用于权利要求书中时，“由...组成”是指包含一些元素或元素列表中的准确的一个元素。一般，当前面为排他性术语如“或”、“...中的一个”“...中的仅一个”或者“...中的准确的一个”时，应当将本文所使用的术语“或”仅理解为表示排他的替选(即，“一个或者另一个但并非二者”)。当用于权利要求书中时，“基本由...组成”应具有如在专利法领域中使用的其常规含义。

本说明书和权利要求书中所使用的指一个或更多种元素列表的短语“至少一个”应当理解为选自元素列表中的任意一个或更多个元素的至少一个元素，但不必要地包括具体地列于元素列表中的每个元素的至少一个，并且不排除元素列表中元素的任意组合。无论与具体地限定的那些元素相关或不相关，该定义还允许任选地存在除元素列表中具体地限定的元素以外的元素。因此，作为一个非限制性例子，“A和B的至少一个”(或者，等同地，“A或B的至少一个，”或者等同地“A和/或B的至少一个”)在一个实施方案中可以指至少一个，任选地包括多于一个，A而不存在B(任选地包括除B以外的元素)；在另一实施方案中，可以指至少一个，任选地包括多于一个，B而不存在A(任选地包括除A以外的元素)；在又一实施方案中，可以指至少一个，任选地包括多于一个，A和至少一个，任选地包括多于一个，B(和任选地包括其它元素)；等。

还应当理解，除非清楚地指出矛盾，否则在包括多于一个步骤的本文所要求包括的任意方法中，方法的步骤的顺序不必要地受所引用方法步骤的顺序的限制。

REFERENCES

1.J.Sambrook and D，Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press；3rd edition(January 15，2001)，978-0879695774

2.David C.Amberg，Daniel J.Burke；and Jeffrey N.Strathern，Methods inYeast Genetics：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press(April 2005)，978-0879697280

3.John N.Abelson，Melvin I.Simon，Christine Guthrie，and Gerald R.Fink，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Part A，Volume 194(Methods inEnzymology Series，194)，Academic Press(March 11，2004)，978-0121827786

4.Christine Guthrie and Gerald R.Fink，Guide to Yeast Geneties andMolecular and Cell Biology，Part B，Volume 350(Methods in Enzymology，Vol 350)，Academic Press；1st edition(July 2，2002)，978-0123106711

5.Christine Guthrie and Gerald R.Fink，Guide to Yeast Geneties andMolecular and Cell Biology，PartC，Volume 351，Academic Press；1st edition(July9，2002)，978-0123106728

6.Gregory N.Stephanopoulos，Aristos A.Aristidou and Jens Nielset，Metabolic Engineering：Principles and Methodologies，Academic Press；1edition(October 16，1998)，978-0126662603

7，Christina Smolke，The Metabolic Pathway Engineering Handbook：Fundamentals，CRC Press；1edition(July 28，2009)，978-1439802960

本文中所提到的所有出版物、专利和序列数据库入口(包括列于以上的那些条目)的全部内容通过引用并入本文，等同于表示每个单独的申请或专利具体地和单独地通过引用并入本文。在相互矛盾的情况下，以本申请(包括本文中任意定义)为准。

Claims (41)

1.分离的产油真菌细胞，其包含提高SCD表达的重组硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因和/或提高SCD表达的，相对于相同类型未修饰细胞的，至少一个额外的SCD基因拷贝，和

降低Δ-12去饱和酶表达的遗传修饰。

2.权利要求1所述的分离的产油真菌细胞，其中降低Δ-12去饱和酶基因产物表达的遗传修饰为用核酸构建体转化，所述核酸构建体包含：

(a)包含合适的同源或异源启动子的表达盒，

(b)包含编码靶向Δ-12去饱和酶基因产物之干扰RNA的核酸的表达盒，和/或

(c)在插入所述细胞的基因组时降低Δ-12去饱和酶基因产物的表达水平的核酸序列。

3.权利要求1所述的分离的产油真菌细胞，其中：

所述细胞包含重组硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因；

所述重组SCD基因包含所述细胞基因组中的内源核苷酸序列；

所述内源核苷酸序列编码所述细胞内源的SCD蛋白；

所述重组SCD基因是重组的是因为所述内源核苷酸序列已通过诱变或者通过重组事件被改变；并且

所述诱变或重组事件提高了天然SCD蛋白的表达。

4.权利要求2所述的分离的产油真菌细胞，其中所述核酸构建体抑制或消除所述Δ-12去饱和酶基因产物的表达。

5.权利要求4所述的分离的产油真菌细胞，

其中通过缺失、破坏、突变和/或替换天然Δ-12去饱和酶基因的编码序列或调节天然Δ-12去饱和酶基因表达的调节区或调节区的一部分来介导对Δ-12去饱和酶基因产物表达的抑制或消除。

6.权利要求2、4或5所述的分离的产油真菌细胞，其中所述核酸构建体插入所述细胞的基因组中。

7.权利要求1至6中任一项所述的分离的产油真菌细胞，其中SCD表达的提高赋予所述细胞将碳水化合物源转化为脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或三酰甘油(TAG)的有利表型。

8.权利要求1至7中任一项所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞是产油酵母细胞。

9.权利要求8所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞是解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)细胞。

10.培养物，其包含权利要求1至9中任一项所述的产油真菌细胞。

11.权利要求10的培养物，其还包含碳水化合物源。

12.权利要求11所述的培养物，其中所述碳水化合物源是可发酵糖。

13.权利要求11或12所述的培养物，其中所述碳水化合物源是单糖。

14.权利要求11或12所述的培养物，其中所述碳水化合物源是葡萄糖和/或甘油。

15.权利要求11至14中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源未灭菌。

16.权利要求11至15中任一项所述的培养物，其中所述培养物保持在未灭菌条件下。

17.权利要求11至16中任一项所述的培养物，其中所述培养物不包含对所述产油真菌细胞有选择性的抗生素或抗增殖剂。

18.权利要求11至17中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源来自植物或藻类生物质。

19.权利要求11至18中任一项所述的培养物，其中所述碳水化合物源来自纤维素、半纤维素、淀粉或甘油。

20.权利要求18或19所述的培养物，其还包含纤维素水解酶或半纤维素水解酶。

21.权利要求18至20中任一项所述的培养物，其中所述生物质或所述纤维素或半纤维素在热水或稀酸或氨纤维膨胀处理中预处理，用水解酶预处理，通过蒸汽预处理和/或石灰预处理。

22.一种用于生产脂肪酸或三酰甘油的方法，其包括

使碳水化合物源与权利要求1-9中任一项的分离的产油真菌细胞接触；和

在适于由所述细胞至少部分地将所述碳水化合物源转化为脂肪酸或三酰甘油的条件下孵育与所述细胞接触的所述碳水化合物源。

23.权利要求22所述的方法，其中所述碳水化合物源是可发酵糖或来自植物或藻类生物质的碳水化合物淀粉。

24.权利要求22或23所述的方法，其中所述碳水化合物源来自纤维素或半纤维素。

25.权利要求22至24中任一项所述的方法，其中在纤维素水解酶或半纤维素水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所述细胞接触。

26.权利要求22至25中任一项所述的方法，其中在每克生物质15IU纤维素水解酶或半纤维水解酶的存在下，使所述碳水化合物源与所述细胞于55℃接触48小时。

27.权利要求22至26中任一项所述的方法，其中在热水或稀酸或氨纤维膨胀处理中和/或用水解酶预处理所述生物质或所述纤维素或半纤维素。

28.一种用于生产重组产油真菌细胞的方法，其包括用第一核酸和第二核酸转化真菌细胞，其中：

所述第一核酸设置成与所述细胞的天然硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因重组，或者所述第一核酸包含至少一个拷贝的SCD基因；

所述第一核酸提高了SCD的表达；和

所述第二核酸降低了Δ-12去饱和酶的表达。

29.权利要求28所述的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。

30.权利要求29所述的方法，其中所述酵母细胞是解脂耶氏酵母。

31.权利要求1的分离的产油真菌细胞，其中所述SCD基因是

编码SEQ ID NO:1的核苷酸序列。

32.权利要求31所述的分离的产油真菌细胞，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:2。

33.权利要求31至32中任一项所述的分离的产油真菌细胞，其还包含异源的启动子。

34.权利要求33所述的分离的产油真菌细胞，其中所述异源启动子是组成型启动子或诱导型启动子。

35.权利要求33所述的分离的产油真菌细胞，其中所述异源启动子是翻译延伸因子(TEF)启动子。

36.权利要求33所述的分离的产油真菌细胞，其中所述异源启动子是药物诱导型启动子。

37.权利要求33所述的分离的产油真菌细胞，其还包含经修饰SCD启动子。

38.权利要求1所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞包含提高SCD表达的重组硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因。

39.权利要求1所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞包含提高SCD表达的，相对于相同类型未修饰细胞的，至少一个额外的SCD基因拷贝。

40.权利要求8所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞选自：解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、贝酵母(S.bayanus)、克鲁氏乳酸酵母(K.lactis)、Waltomyces lipofer、Mortierella alpine、Mortierellaisabellina、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneu)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、淀粉酶酵母(Saccharomyces diastasicus)、许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

41.权利要求1至7任一项所述的分离的产油真菌细胞，其中所述细胞选自：曲霉菌西肉萨米(Aspergillus shirousamii)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)和里氏木霉(Trichoderma reesei)。