CN102839153A - 一种以cd3+cd8+为主的活化淋巴细胞的扩增、冻存及复苏方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的培养、冷冻及复苏方法，可以解决患者为连续使用活化的CD3+CD8+为主的淋巴细胞而需多次采血的问题。其包括：（1）通过将外周血样提取出的淋巴细胞与IL-2，IL-15，抗CD3抗体，抗CD28抗体接触，以扩增活化的以CD3+CD 8+为主活化淋巴细胞；（2）活化淋巴细胞的冻存；（3）活化淋巴细胞的复苏。本发明所培养的活化淋巴细胞成分清晰，CD4+CD25+Treg细胞含量极少，并含有大量的CD8+T淋巴细胞，可以根据病人其他治疗如放疗化疗来调整活化淋巴细胞的回输时间和次数，以更好的治疗肿瘤，感染性疾病以及免疫缺陷症等疾病。

Description

一种以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的扩增、冻存及复苏方法

技术领域

本发明涉及活化淋巴细胞的扩增、冻存以及复苏方法，属于生物技术领域。

背景技术

机体的免疫系统具有识别和杀伤肿瘤细胞的能力，已经获得了大量研究数据的证实。近年来，肿瘤特异性细胞免疫治疗在临床实践中显示了非常令人兴奋的疗效。2002年，RosenbergSA等人在Science杂志报道了利用体外大量扩增的肿瘤特异性肿瘤浸润淋巴细胞过继回输方法，他们在体外筛选出具有病人自身恶黑细胞特异性杀伤作用的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），大量扩增后回输给自体病人。在这种方法中，经过体外IL-2和抗CD3抗体的联合作用，数量高达1011的、肿瘤细胞高度特异的多种肿瘤抗原特异性识别的TILs被回输至经清除淋巴细胞化疗的病人体内，这些细胞以CD3+CD8+CD56-的T细胞为主。在接受治疗的13例病人中，6例病人完全缓解（CR，肿瘤完全消失），4例病人部分缓解（PR，肿瘤消失50%以上，无新发肿瘤）。这10例病人均发生明显的肿瘤缩小和/或消失。在Dr.Rosenberg的长期临床实践中，他们发现，利用来源于肿瘤的肿瘤浸润淋巴细胞进行晚期恶性黑色素瘤的治疗，其有效率可达50%以上。Greenberg和Yee C的研究组在利用具有肿瘤特异性杀伤能力的CD8+T细胞克隆进行的治疗中发现，多次使用这类细胞、联合使用化疗药或不使用化疗药进行晚期恶性黑色素瘤病人的治疗，可以使部分病人肿瘤长期稳定、明显延长病人生存期。

然而，在这些特异性细胞免疫治疗过程中，存在着特异性细胞培养扩增的技术难题。首先，对于肿瘤浸润淋巴细胞来说，（1）需要解决肿瘤组织体外原代培养的技术难题，以鉴定所获得的肿瘤浸润淋巴细胞对自体肿瘤有杀伤能力；（2）对于生命关键性器官所发生的肿瘤，需要鉴定特异性浸润T淋巴细胞所识别是否为组织相关性抗原，以避免自身免疫病的发生。所谓组织相关性抗原，指的是在肿瘤中高表达，在正常对应的组织器官中低表达的肿瘤抗原。在免疫治疗黑色素瘤时，可能会发生白癜风的副作用，而对如肝、脑等生命重要器官，由于这类抗原诱导的特异性杀伤细胞所可能产生的自身免疫病，使肿瘤浸润淋巴细胞进行特异性免疫治疗的应用受到限制。其次，对于使用抗原和树突状细胞（DC）进行体外肿瘤抗原特异性的淋巴细胞克隆来讲，（1）需要通过leukophresis获取大量的外周血单个核细胞以获得DC和饲养细胞；（2）每一个目的抗原均须进行体外抗原刺激，以获得肿瘤特异性T细胞克隆，技术复杂、耗时长、细胞用量大，限制了多种抗原特异性T细胞的获得。另外，活化的淋巴细胞需多次输注才能达到较好的治疗效果，多数医疗单位利用血细胞分离机采集单个核细胞，而这种采集方法价格昂贵，多次采集给患者带来心理及身体的痛苦。如果一次采集的单个核细胞可以冻存，当患者治疗需要时，复苏并诱导为活化的淋巴细胞，就为患者节约了费用，减轻了痛苦。

传统的体外扩增淋巴细胞的方法，是以CD3抗体作为淋巴细胞激活剂，并采用大剂量的IL-2，这样虽然在短期内得到大量活化的T细胞，但很容易导致活化诱导的细胞死亡，最终难以获得足够数量的细胞毒性T淋巴细胞，并且含有大量的CD4+CD25+Treg细胞（见具体实施方式14）。

小剂量的抗CD3单抗可以活化静止的T细胞，诱导其产生杀伤肿瘤的作用，这种杀伤作用既包括对肿瘤细胞的直接杀伤，又包括分泌相关的细胞因子对肿瘤细胞产生间接杀伤，还可通过诱导肿瘤细胞发生凋亡对其产生作用。另一方面加入抗CD3单抗后可以激活肿瘤细胞的凋亡途径，导致凋亡细胞的数量增加，而这种凋亡作用主要通过Fas途径产生。

但大剂量加入CD3单抗进行培养时并未产生直线增加的杀伤和诱导作用，相反出现凋亡数量下降的现象，甚至出现对T细胞的抑制作用，坏死及凋亡细胞的数量均下降，这可能是因为T细胞受体(TCR)的数量有限，在过量的抗CD3单抗作用下，不但不能激活T细胞，反而会因受体表面被封闭而无法活化。

发明内容

为了解决了现有活化淋巴细胞制备（主要是指CIK细胞）纯度低，增殖力低的缺点。并解决病人因为多次使用细胞而需多次采血的问题。本发明联和使用抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-2、IL-15等共同培养，另外通过免疫磁珠技术去除在培养过程中产生的CD4+CD25+Treg细胞，使得培养的细胞种类纯度更高。本发明冻存以及复苏的方法，可以解决患者为连续使用活化的CD3+CD8+为主的淋巴细胞而需多次采血的问题。

我们在使用本发明所培养的活化的淋巴细胞治疗的临床观察，在多名患者中，观察到肿瘤的长期稳定、配合化疗肿瘤的明显缩小等现象。这种现象，与肿瘤特异性细胞免疫治疗观察到的效果类似。同时，活化的淋巴细胞群体中CD8+T淋巴细胞百分比越高，治疗效果越好。因此，我们怀疑在这些“非特异性免疫细胞”中，可能存在肿瘤特异性CD8+杀伤性T淋巴细胞，发挥了其抗肿瘤效果。人体内T淋巴细胞包括许多针对不同抗原的特异性细胞，这些细胞经过培养后，理论上他们会针对不同的肿瘤抗原或病毒抗原具有广泛的识别和杀伤效果。

CD28分子又称TP44，是一种包括202个氨基酸的I型跨膜糖蛋白。可以提供T细胞活化所需的共刺激信号，促进T细胞活化增殖。利用CD28单抗作为CD28的配体，以CD3单抗激活TCR信号途径，可有效地增强CD3AK细胞的增殖活性，并延缓CD3AK细胞的凋亡。CD28共刺激使外周血淋巴细胞活化显著促进细胞因子产生，CD28单抗协同CD3单抗可明显提高外周血淋巴细胞上清中IFNγ、IL-2、IL-4水平，并且CD28单抗能抑制IFNγ、IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)等的mRNA降解

IL-2是主要由活化的T细胞分泌的重要的细胞生长因子。它最初是从丝裂原刺激的淋巴细胞的培养上清中纯化出来的，是调节T淋巴细胞应答的一种重要的细胞因子。在抗原活化后，能促进T细胞的增值，但是在后期，随着活化T细胞数量的增多和IL-2的浓度的逐渐升高，T细胞便很快地进入Fas/FasL介导的的活化诱导的细胞死亡(AICD)。，因此单纯使用IL-2并不能是T细胞在体外较长时间的扩增

IL-15也是一种重要的细胞生长因子，它主要由单核细胞和树突状细胞表达分泌，能够促进NK细胞，T细胞和B细胞的增殖和分化。IL-15是由能够刺激IL-2依赖的T细胞系的增殖，而且这种增殖效应不能被anti-IL-2抗体所阻断。因此IL-15与IL-2具有相似的生物学效应，即两者都能促进T细胞的分化增值，然而，与IL-2不同的是，IL-15受体结合后，能够稳定rc链，且上调抗凋亡基因bcl-2，从而表现有抗AICD和延长细胞存活时间的作用。

CD4+CD25+Treg细胞是自然产生并成熟于胸腺的独特细胞群，占CD4+T细胞5%一10%。它可通过细胞接触依赖机制或抑制性细胞因子依赖机制主动抑制自身反应性T细胞的活化，维持自身免疫耐受，防止自身免疫病的发生。

CD4+CD25+Treg细胞主要在机体免疫系统中发挥负向调节作用，既能抑制不恰当的免疫反应，又能限定免疫应答的范围、程度及作用时间，对效应细胞的增殖、免疫活性的发挥起抑制作用。抑制性表现在Treg细胞能够抑制许多免疫细胞的活性、增殖及功能，如CD4+Th细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CDld限制性NKT细胞、单核/巨噬细胞、初始/记忆B细胞和树突状细胞(DCs)等。经TcR介导的信号刺激可以是抗CD3单抗产生的多克隆的刺激，也可以是抗原特异性刺激，一旦被活化这种作用即为非抗原特异性，并且这种免疫抑制性不具有MHC限制性能够抑制同种同型或同种异型T细胞的增殖。

另外肿瘤患者免疫功能低下，外周血中总淋巴细胞降低，各淋巴细胞亚群比例紊乱，且血清中存在众多免疫抑制因子，这些因素不利于外周血活化淋巴细胞的扩增，特别是在放疗、化疗之后，很难保证提供足够数量的细胞。如果可以利用低温冻存技术保存外周血单个核细胞，在需要时复苏并诱导为有细胞毒活性的CIK细胞，这个问题就迎刃而解了。

本发明的第一方面涉及一种以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的扩增方法

（a）将外周血血样中分离出的单个核细胞在含有淋巴细胞激活剂和细胞因子IL-2的培养基中培养；所述淋巴细胞激活剂为抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体的终浓度为0.1-100ng/ml；抗CD28抗体的终浓度为0.1-50ng/ml；所述IL-2终浓度为100U/ml至5000U/ml；

（b）将（a）步骤中培养得到的淋巴细胞用mini MACS磁珠分选去除CD4+CD25+Treg细胞；

（c）将（b）步骤中培养得到的淋巴细胞在含有细胞因子IL-2和IL-15的培养基中培养；所述IL-2终浓度为50-500U/ml；IL-15的终浓度为10-500ng/ml；

（d）收集（c）步骤中得到的淋巴细胞用于回输或冻存。

以下对本发明进行具体说明

在本发明的方法中，其中所述步骤（a）抗CD3抗体的终浓度优选为1-75ng/ml，抗CD28抗体的终浓度优选为2-30ng/ml。

本发明的方法中，步骤（a）中使用的淋巴细胞激活剂还可以含有其他激活剂，例如PHA和/或IFN-r。优选的步骤（a）中的PHA的终浓度可以是例如1-100ng/ml，而IFN-r的终浓度可以是例如100-2000U/ml。

本发明的方法中，为在短时间内获得大量具有增殖能力的淋巴细胞，所以在培养基中加入高浓度的IL-2进行培养。步骤（a）中优选的IL-2的终浓度为2000-4000U/ml。

本发明的方法中，为去除在培养过程中转化增殖的CD4+CD25+Treg细胞使得培养的细胞CD8+T细胞纯度更高，在步骤（b）中用mini MACS间接免疫磁珠正选去除CD4+CD25+Treg细胞。

本发明的方法中，步骤（c）中优选的IL-2的终浓度可以为例如200-500U/ml，优选的IL-15的终浓度可以为例如200-400ng/ml。

本发明的方法中，步骤（c）还可以含有其他类似功能细胞因子例如IL-7和/或IL-12和/或IL-21。优选的IL-7的终浓度为10-200ng/ml和/或IL-12的终浓度为5-100ng/ml和/或IL-21的终浓度为1-200ng/ml。更优选的IL-7的终浓度为50-100ng/ml和/或IL-12的终浓度为20-50ng/ml和/或IL-21的终浓度为10-100ng/ml。

在本发明的方法中，其中所述步骤（a）开始至步骤（b）结束所需时间为3-4天，步骤（c）中细胞培养如用于临床回输所需时间为6-8天，如用于细胞冻存所需时间为1-2天。

本发明培养的细胞主要为CD3+CD8+T细胞，CD3+CD8+T细胞含量可大于90%。

第二方面，本发明提供了一种活化的以CD3+CD8+为主的淋巴细胞的冻存方法：

（e）取生长在对数期的以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞进行收集，收集方法为：以300-2000r/min的速度离心，10分钟，得到沉淀细胞；

（g）将在（e）步骤中得到的细胞加入冻存液使细胞浓度为0.1-5×10⁷/ml；将细胞悬液转入冻存管中；

（h）将（g）中得到的细胞放于程序降温盒中在零下20℃放置1-5小时，再转于-80℃冰箱放置16-48小时，转入液氮罐中长期冻存；

在本发明的方法中，其中所述步骤（e）中所述对数期是指淋巴细胞总数为原始淋巴细胞总数的2-100倍时，优选的，是CD3+CD8+淋巴细胞总数为步骤（a）中原始分离得到的CD3+CD8+淋巴细胞的2-100倍，更优选的，是CD3+CD8+淋巴细胞总数为步骤（a）中原始分离得到的CD3+CD8+淋巴细胞的5-20倍；

在本发明的方法中，其中所述步骤（e）中以CD3+CD8+为主的淋巴细胞的收集如下：取细胞放于离心管中，以400-600r/min的离心速度离心10分钟，除去上清液；

在本发明的方法中，其中所述步骤（g）中所用冻存液为胎牛血清与DMSO按照9：1的体积比配制，也可为培养基与DMSO按照9:1的体积比配制，也可为胎牛血清和培养基的混合液体与DMSO按照9:1的体积比配制。

在本发明的方法中，其中所述步骤（g）优选的为在零下20℃放置2-3小时，再转于-80℃冰箱放置20-24小时。

第三方面，本发明提供了一种以CD3+CD8+为主的冻存的自体活化淋巴细胞的复苏以及复苏后培养方法：

（i）取出（h）步骤中冻存的细胞，在37℃水浴锅中速融；

（j）将（i）中得到的细胞迅速转入37℃预热新鲜培养基中，然后转入细胞培养板中培养；

（k）吸取（j）中所培养细胞的培养基的上清，并重新加入含有细胞因子IL-2的新鲜培养基；所述IL-2的终浓度为1000-5000U/ml；

（l）待（k）中细胞长满孔后，转移至含有淋巴细胞激活剂的培养瓶中，并添加含有细胞因子IL-15的新鲜培养基；所述IL-15的终浓度200-500ng/ml；所含淋巴细胞激活剂为抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体的终浓度为1-100ng/ml，抗CD28抗体的终浓度为2-200ng/ml；

（m）待（l）中细胞数量扩增到2-10倍时，添加含有细胞因子IL-2以及IL-15的新鲜培养基进行扩大培养；所含细胞因子IL-2的终浓度为50-500U/ml，IL-15的终浓度为50-500ng/ml；

（n）收集（m）中扩增活化的淋巴细胞。

在本发明的方法中，其中所述步骤（k）中优选的IL-2的终浓度可以为例如1000-2000U/ml。

在本发明的方法中，其中所述步骤（l）中优选的IL-15的终浓度可以为例如200-500ng/ml。

在本发明的方法中，其中所述步骤（l）中优选的可以为抗CD3抗体的终浓度为50-100ng/ml，抗CD28抗体的浓度为20-80ng/ml。

在本发明的方法中，其中所述步骤（m）优选的细胞数量扩增的倍数是2-5倍。

在本发明的方法中，其中所述步骤（m）中优选的IL-2的终浓度为50-200U/ml，IL-15的终浓度为20-100ng/ml。

在本发明的方法中，第一第二，第三方面中所述培养基为RPMI-1640培养基或其他效果类似的培养基，其中所述其他效果类似的培养基为DMEM培养基和/或AIM-V培养基。并且，第一，第二，第三方面的方法中，其中所述培养基可为同一种培养基，也可为RPMI-1640、DMEM、AIM-V培养基中两种或多种。此外，在淋巴细胞的培养过程中还可以向培养基中加入血清和血浆，血清或血浆的来源可以是自体的（来源和淋巴细胞相同）也可以是异体的（来源于淋巴细胞不同）但从安全角度考虑，优先的，选择自体来源的血清或血浆，更优先的，选择可不用添加血清或血浆的成品商业化无血清培养基例如AIM-V。

本发明的有益效果是：

现有活化淋巴细胞制备（主要是指CIK细胞）纯度低，增殖力低，里面含有大量CD4+CD25+Treg细胞，CD4+CD25+Treg细胞会分泌大量免疫抑制因子，使得细胞回输到体内后受到免疫抑制因子的影响后并不能发挥太大作用。并且因为大多数病人需要做化疗，使得病人体内淋巴细胞活性降低，这就造成了现有活化淋巴细胞制备（主要是指CIK细胞）很难连续采血操作，影响了病人使用活化淋巴细胞的效果。

本发明所培养的活化淋巴细胞成分清晰，CD4+CD25+Treg细胞含量极少，并含有大量的CD8+T淋巴细胞，我们在使用本发明所培养的活化的淋巴细胞治疗的临床观察，活化的淋巴细胞群体中CD8+T淋巴细胞百分比越高，治疗效果越好。

本发明冻存以及复苏的方法，可以解决患者为连续使用活化的CD3+CD8+为主的淋巴细胞而需多次采血的问题，从而可以根据病人其他治疗如放疗化疗来调整活化淋巴细胞的回输时间和次数，以更好的治疗肿瘤，感染性疾病以及免疫缺陷症等疾病。

附图说明

图1为未冻存的淋巴细胞形态；

图2为冻存后复苏的细胞形态；

图3为未冻存淋巴细胞的细胞表型；

图4为冻存过后复苏培养的淋巴细胞的细胞表型。

具体实施方式

1.淋巴细胞的活化

取病人外周血50ml，分装入离心管中，以1600r/min离心10min，去除上层血浆，加入30ml生理盐水，混匀，将稀释好的血细胞每30ml小心加入到15mlFicoll的上层中，然后离心2000r/min，20min。离心完毕后，取中间白细胞层，用生理盐水反复洗涤3遍，加入37℃预热的AIM-V培养基中，使细胞浓度为2×10⁶/ml，加入抗CD3抗体，抗CD28抗体以及IL-2，使得抗CD3的浓度为60ng/ml，抗CD28抗体的浓度为15ng/ml，IL-2的浓度为4000U/ml。然后将培养瓶放入二氧化碳培养箱，37℃，CO₂浓度为5%。从培养的第二天开始，用显微镜进行观察细胞生长状况。

2.CD4+CD25+Treg细胞的去除

细胞培养第三天左右，观察细胞生长状况，如果细胞生长良好，则进行此步操作。将细胞悬液调整到适宜的细胞浓度，加入PE-labeled antihumanCD25，4℃孵育30min后取出，以MACS专用PBS离心洗涤3次，再加入Anti-PE磁珠，同样置4℃孵育30min，过MACS柱，MACS柱内为阳性分选所得到的CD4+CD25+Treg细胞，洗脱下来的为去除Treg细胞所得到的活化淋巴细胞。

3.淋巴细胞的扩增

将去除Treg细胞的淋巴细胞用AIM-V培养基重悬，使得细胞浓度为2×10⁶/ml，加入IL-2和IL-15使得IL-2的浓度为200U/ml，而IL-15的浓度为300ng/ml。连续用显微镜观察细胞生长状况，如果生长状况良好，则加入根据细胞浓度加入相应的培养基和相应的细胞因子，使得细胞浓度维持在2×10⁶/ml，细胞因子浓度也维持在IL-2的浓度为200U/ml，而IL-15的浓度为300ng/ml。

4.细胞的收集

如果细胞用于冻存，则在细胞培养第5天左右，CD3+CD8+淋巴细胞总数为原始分离得到的CD3+CD8+淋巴细胞的20倍时开始收集。如果用于回输，则在细胞培养第10天左右进行收集。收集过程如下：

将细胞转移到离心管中，1600r/min，离心10分钟，细胞用生理盐水洗涤两次，如果冻存则加入相应冻存液；如果回输，则重悬于5%的白蛋白生理盐水中。

5.细胞表型的检测

用含有1%人血清白蛋白的生理盐水悬浮PBMC或活化淋巴细胞，冰浴10分钟。用预冷的PBS洗涤细胞两次（300g，4℃离心5min沉淀细胞团块）。用预冷染色缓冲液重悬细胞至终细胞密度至2×107cells/ml。每管加入50μl细胞悬液。每管加入适量（各种抗体最适用量）抗体，包括FITC标记抗CD3抗体，PE标记抗CD25抗体，PE-Cy5标记抗CD4抗体，APC标记抗CD8抗体，PE标记抗CD16抗体，APC标记抗CD56抗体包括用于补偿设置的单色管及加有各种同型对照的阴性管。冰浴避光孵育20min。每管加入1ml PBS，300g，4℃离心5分钟。小心吸弃上清或倾去上清。重复洗涤过程一次。振荡悬浮细胞沉淀。用0.5毫升PBS重悬细胞。如细胞不能即时检测，染色细胞必须用4%多聚甲醛4℃固定30分钟，用染色缓冲液洗涤重悬细胞后4℃避光保存。上机检测。

检测结果包括CD4、CD8比例及二者比值，CD3+CD4+CD25+细胞亚群所占比例，CD3＋CD16＋CD56＋和CD3-CD16＋CD56＋细胞亚群的检测（见图3）。

其中在刚开始分离的外周血单个核细胞中，T细胞约占40-70%，而经过本发明培养后，T细胞占细胞群的95%以上，其中CD3+CD8+T细胞的比例在90%以上。

6.活化淋巴细胞的冻存

消化贴壁细胞或收集悬浮细胞，将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心5～10分钟，弃上清液，用一定量冻存液（冻存液为胎牛血清与DMSO按照9：1的比例配制）将细胞重悬，计数，调整细胞密度至10⁷个/ml左右，将细胞悬液分装至2ml冻存管中，每管1～1.5ml，将冻存管口封，贴上标签，做好记录，按下列程序降温：20℃（1～2小时）→－80℃（16～18小时或隔夜）→液氮（LN2）。

7.活化淋巴细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴内，轻晃冻存管使液体尽快融化，通常应在1分钟内融化，用75%的酒精棉球擦拭冻存管及管盖，将解冻的细胞悬液移至一定量的未加细胞因子的AIM-V培养基中，将细胞浓度稀释到1.0×10⁶/ml，并转入24孔培养板中培养，过夜。

8.复苏后细胞的继续培养

第二天，从每孔中取出一般上清液，并补充相应量的含有2000U/ml IL-2的新鲜培养基，待细胞培养板的空内细胞长满后，将细胞转入培养瓶中培养，添加相应量的AIM-V培养基，并添加相应量的IL-15，以及抗CD3单抗和抗CD28单抗，使得IL-15的浓度为200ng/ml，抗CD3单抗的浓度为80ng/ml，抗CD28单抗的浓度为40ng/ml。

待上述细胞扩增到其3倍时，加入新鲜的AIM-V培养基进行扩大培养，使细胞浓度在3×10⁶/ml，并添加相应细胞因子IL-2和IL-15，使IL-2的浓度在100U/ml，IL-15的浓度在50ng/ml。

9.复苏后培养细胞的收获

细胞培养第11天左右进行活化淋巴细胞的收集。收集过程如下：将细胞转移到离心管中，1600r/min，离心10分钟，细胞用生理盐水洗涤两次，重悬于5%的白蛋白生理盐水中。

10.复苏后培养的淋巴细胞表型检测

用含有1%人血清白蛋白的生理盐水悬浮活化淋巴细胞，冰浴10分钟。用预冷的PBS洗涤细胞两次（300g，4℃离心5min沉淀细胞团块）。用预冷染色缓冲液重悬细胞至终细胞密度至2×107cells/ml。每管加入50μl细胞悬液。每管加入适量（各种抗体最适用量）抗体，包括FITC标记抗CD3抗体，PE标记抗CD25抗体，PE-Cy5标记抗CD4抗体，APC标记抗CD8抗体，PE标记抗CD16抗体，APC标记抗CD56抗体包括用于补偿设置的单色管及加有各种同型对照的阴性管。冰浴避光孵育20min。每管加入1ml PBS，300g，4℃离心5分钟。小心吸弃上清或倾去上清。重复洗涤过程一次。振荡悬浮细胞沉淀。用0.5毫升PBS重悬细胞。如细胞不能即时检测，染色细胞必须用4%多聚甲醛4℃固定30分钟，用染色缓冲液洗涤重悬细胞后4℃避光保存。上机检测。

检测结果包括CD4、CD8比例及二者比值，CD3+CD4+CD25+细胞亚群所占比例，CD3＋CD16＋CD56＋和CD3-CD16＋CD56＋细胞亚群的检测（见图4）。

11.冻存复苏后与未冻存活化淋巴细胞形态的比较

倒置显微镜下观察：外周血单个核细胞呈悬浮生长，大小均匀，折光性一致，活化淋巴细胞经培养后部分细胞明显增大，可见细胞集落，胞核密度加强，体积增大，胞膜光滑，未见突起。体积明显大于普通淋巴细胞。新鲜与冻存后的单个核细胞诱导的活化淋巴细胞在形态上无明显差别。

复苏后的细胞呈异型性，细胞明显增大，可见很多大小不一的细胞集落，胞核密度加强，体积增大细胞状态良好(见图1，图2)

12.冻存后复苏与未冻存活化淋巴细胞的体外增殖情况及表型

细胞培养过程中，每天取样计数，结果显示在初培养细胞数量为2.5X10⁷左右时未冻存细胞培养第10天和冻存后复苏的细胞培养第11天左右时，细胞数量均可达到3X10⁹左右，细胞表型中CD3+CD8+T细胞的比例均在90%以上，CD4+CD25+T细胞的比例均在5%以下

13.冻存后复苏与未冻存活化淋巴细胞体外杀伤活性的比较

试剂：①四甲基偶氮盐（MTT，10mg/ml）；②酸化异丙醇：含0.04mol/L HCl的异丙醇；③96孔细胞培养板。

肿瘤细胞系：对数期生长的HepG2

操作方法：

用含IL-2的10%FBS的RPMI-1640培养基调整冻存与未冻存活化淋巴细胞密度至1.5×10⁶/ml；取对数生长期细胞经不完全工作培养液洗涤，胎盼蓝染色计数，以含10%FBS的RPMI-1640培养液调整细胞密度至2×106/ml备用。

冻存与未冻存活化淋巴细胞与不同的靶细胞株按效靶为5:1，10：1，20：1的比例分别取100μl接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。设不同浓度效应细胞200μl/孔单独培养测定效应细胞的吸光度。同时将靶细胞株用含10%FBS的RPMI-1640培养液调整至3×104～1×105/ml，取100μl细胞悬液和100μl培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度；将上述接种好的细胞培养板置37℃，5%CO2孵育20h；于终止培养前，每孔加入MTT 10μl，混匀后再培养4h；吸弃上清液，每孔加入溶剂（酸化异丙醇）100μl，稍振荡待甲臜产物充分溶解；在酶标仪上，测定OD570-620nm；细胞毒性百分率按下列公式计算：

ODE+T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值

ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值

ODT=相应浓度单独靶细胞的OD值

冻存复苏后细胞和未冻存细胞杀伤活性的比较如表所示，说明冻存复苏后的细胞杀伤活性未下降。

表1活化淋巴细胞体外杀瘤比较（%）

不同组别在同一效靶比时对hela的细胞毒活性无显著性差异（P>0.05）

14.本发明培养方法与现有培养方法培养活化淋巴细胞的比较

无菌采集5名肝癌患者外周血50ml，收集白细胞；白细胞经生理盐水稀释后用淋巴细胞分离液(比重为1.077±0.002)分离出单个核细胞，洗涤2次，各分成相等两份，一份用本发明方法培养，一份用现有方法培养。

现有方法培养：

用RPMI 1640完全培养液(内含灭活的10%自体血浆)重悬细胞，调整细胞浓度为2X10⁶/ml。第0天加入IFN-_「(1000U/ml)，入培养箱孵育24小时后再加入IL-2(1500U/ml)、抗CD3单抗(100ng/ml)继续培养。每3-4天根据细胞浓度添加新鲜RPMI 1640完全培养液(内含灭活的10%自体血浆)，并补加IL-2至1000U/ml。至第7，14，21，28天收集细胞进行有关检测。

本发明培养：

按照本发明方法进行培养，至第7，14，21，28天收集细胞进行有关检测。

表2本发明方法与现有方法细胞扩增倍数比较

	7d	14d	21d	28d
					现有方法	6.28±2.76	67.79±10.53	98.37±12.64	121.54±11.82
本发明	11.73±1.88*	150.32±15.37*	285.91±17.26*	427.65±13.58*

^*与现有方法培养的细胞相比P<0.05

现有培养方法一般培养到14d左右时为其顶峰，继续培养细胞容易死亡，而本发明可以培养到第28天，细胞仍在快速增长。

表3本发明方法与现有方法培养后细胞表型CD4+CD25+的比较

^*与现有方法培养的细胞相比P<0.05

现有培养方法中CD4+CD25+所占的比例一直很高，尤其培养到28d时。而本发明中CD4+CD25+所占的比例很低。

15.实际案例

结肠癌肝部转移患者，女，59岁，血象一直比较低。治疗方案为化疗加本发明培养的活化淋巴细胞回输治疗，化疗方案为草酸铂方案：Oxaliplatin120mg/m²D1，5-Fu400mg/m²CIV24h D1-5，CF200mg/m²D1-5，化疗1周期结束后第3天，回输本发明培养的活化淋巴细胞(4x10⁹)，静脉滴注，1小时之内滴完，各1天回输1次，回输3次后隔1周进行下1周期化疗，共进行4个周期转移灶大部分消失，病人状态良好，血象恢复正常，食欲下降体重减轻等症状均消失，睡眠也正常。

Claims (10)

1.一种以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的扩增方法，其特征是，

（a）将外周血血样中分离出的单个核细胞在含有淋巴细胞激活剂和细胞因子IL-2的培养基中培养；所述淋巴细胞激活剂为抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体的终浓度为0.1-100ng/ml；抗CD28抗体的终浓度为0.1-50ng/ml；所述IL-2终浓度为100U/ml至5000U/ml；

（b）将（a）步骤中培养得到的淋巴细胞用mini MACS磁珠分选去除CD4+CD25+Treg细胞；

（c）将（b）步骤中培养得到的淋巴细胞在含有细胞因子IL-2和IL-15的培养基中培养；所述IL-2终浓度为50-500U/ml，IL-15的终浓度为10-500ng/ml；

（d）收集（c）步骤中得到的淋巴细胞用于回输或冻存。

2.如权利要求1所述的扩增方法，其特征是，所述步骤（a）抗CD3抗体的终浓度为1-75ng/ml，抗CD28抗体的终浓度为2-30ng/ml；IL-2的浓度为2000-4000U/ml。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征是，步骤（c）中IL-2的终浓度为200-500U/ml，IL-15的终浓度为200-400ng/ml。

4.如权利要求1所述的扩增方法，其特征是，所述步骤（a）中使用的淋巴细胞激活剂还含有激活剂PHA和/或IFN-r；所述PHA的终浓度为1-100ng/ml，而IFN-r的终浓度为100-2000U/ml。

5.如权利要求1所述的扩增方法，其特征是，所述步骤（c）还含有细胞因子IL-7、IL-12、IL-21中的一种或几种；所述IL-7的终浓度为10-200ng/ml，IL-12的终浓度为5-100ng/ml，IL-21的终浓度为1-200ng/ml。

6.如权利要求1所述的扩增方法，其特征是，所述培养基为RPMI-1640培养基、DMEM培养基或者AIM-V培养基。

7.权利要求1-6中任意一项所扩增的以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的冻存方法，其特征是，

（e）取权利要求1-6的生长在对数期的以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞进行收集，收集方法为：以300-2000r/min的速度离心，得到沉淀细胞；

（g）将在（e）步骤中得到的细胞加入冻存液使细胞浓度为0.1×10⁷-5×10⁷/ml；将制备的细胞悬液转入冻存管中；

（h）将（g）步骤中得到的冻存管放于程序降温盒中在零下20℃放置1-5小时，再转于-80℃冰箱放置16-48小时，转入液氮罐中长期冻存。

8.如权利要求7所述的冻存方法，其特征是，所述步骤（e）中对数期是指淋巴细胞总数为原始分离得到淋巴细胞总数的2-100倍；所述步骤（e）中以CD3+CD8+为主的淋巴细胞的收集为：取细胞放于离心管中，以400-600r/min的离心速度离心10分钟，除去上清液；所述步骤（g）中所用冻存液为胎牛血清与DMSO按照9：1的体积比配制，或者培养基与DMSO按照9:1的体积比配制，或者为胎牛血清和培养基的混合液体与DMSO按照9:1的体积比配制，所述培养基为RPMI-1640培养基、DMEM培养基或者AIM-V培养基；所述步骤（g）为在零下20℃放置2-3小时，再转于-80℃冰箱放置20-24小时。

9.权利要求7或8冻存的以CD3+CD8+为主的活化淋巴细胞的复苏方法，其特征是，

（i）取出权利要求7或8的（h）步骤中冻存的细胞，在37℃水浴中速融；

（j）将（i）中得到的细胞迅速转入37℃预热新鲜培养基中，然后转入细胞培养板中培养；

（k）吸取(j)中所培养细胞的培养基的上清，并重新加入含有细胞因子IL-2的新鲜培养基；所述IL-2的终浓度为1000-5000U/ml；

（l）待（k）中细胞长满孔后，转移至含有淋巴细胞激活剂的培养瓶中，并添加含有细胞因子IL-15的新鲜培养基；所述IL-15的终浓度200-500ng/ml；所含淋巴细胞激活剂为抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体的终浓度为1-100ng/ml，抗CD28抗体的终浓度为2-200ng/ml；

（m）待（l）中细胞数量扩增到2-10倍时，添加含有细胞因子IL-2以及IL-15的新鲜培养基进行扩大培养；所含细胞因子IL-2的终浓度为50-500U/ml，IL-15的终浓度为50-500ng/ml；

（n）收集（l）中扩增活化的淋巴细胞。

10.如权利要求9所述的复苏方法，其特征是，所述步骤（k）中IL-2的终浓度为1000-2000U/ml；所述步骤（l）中的IL-15的终浓度为200-500ng/ml，抗CD3抗体的终浓度为50-100ng/ml，抗CD28抗体的终浓度为20-80ng/ml；所述步骤（m）细胞数量扩增的倍数是2-5倍；所述步骤（m）中IL-2的终浓度为50-200U/ml，IL-15的终浓度为20-100ng/ml；所述培养基为RPMI-1640培养基、DMEM培养基或者AIM-V培养基。

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