CN102838671A - 定点突变和定点修饰的生长激素、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及经过定点突变的生长激素、定点修饰的生长激素，所述生长激素可以是人源的，也可以是其它动物的。本发明还涉及定点突变和定点修饰生长激素的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入生长激素基因中，借助非天然氨基酸与修饰剂，如聚乙二醇与生长激素定点连接。本发明进一步涉及定点突变或修饰的生长激素的应用，如作为稳定、长效生长激素等的用途。

Description

定点突变和定点修饰的生长激素、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及定点突变和定点修饰的生长激素，所述的定点突变为用非天然氨基酸定点突变生长激素的天然氨基酸，还涉及将经过所述定点突变的生长激素进行定点修饰，例如进行聚乙二醇化的生长激素衍生物。本发明还涉及定点突变和定点修饰生长激素的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入生长激素基因中，借助非天然氨基酸与修饰剂，如聚乙二醇与生长激素定点连接。本发明进一步涉及定点突变或修饰的生长激素的应用，如作为稳定、长效生长激素等的用途。 

背景技术

生长激素 

天然的人生长激素（hGH）（Bazan,F.Immunology Tody11:350-354(1991);Mott,H.R.和Campebell,I.D.Current Opinion in Structural biology5:114-121(1995);Silvennoinen,O.和Ihle，J.N.(1996)SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS）是由人下脑垂体分泌的蛋白质，生长激素的分子量为22kD，其由191个氨基酸残基组成，序列如下： 

FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFS ESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLL KDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKV ETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:1) 

编码hGH的碱基序列如下: 

TTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCG  TCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGG AACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATT CCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCAT CTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCG CCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTA GAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCA GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTAC TCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTC CTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAA（SEQ ID NO：2） 

hGH的主要生物学功能是促进幼小的哺乳动物身体组织的生长并保持住老年哺乳动物的组织，其中所涉及的组织包括骨骼、结缔组织、肌肉、以及诸如肝、肠、和肾等器官的组织。因此hGH可用于治疗因脑垂体机能不足而导致的侏儒症或Turner综合征，另外也可用于促进儿童生长，治疗慢性肾功能不全、艾滋病衰竭和衰老等。 

由于人生长激素是蛋白质，其体内半衰期小于2小时，因此用药手段主要局限于频繁的注射方法，常规的方法为每天注射，用药周期在六个月到一年，这种频繁的注射，给病人带来严重的不便，并且提高了用药成本（Clar R,等，1996，J Biol Chem271:21969-21977；hoffman AR,等，2005，J Clin Endocrinol Metab90:6431-6440）。因此，改善生长激素的用药方法，减少用药频率，降低用药成本，提高病人依从性，增加疗效成为重要课题。 

聚乙二醇修饰 

共价连接亲水性聚合物聚乙二醇（PEG）是一种增加生物活性分子（包括蛋白、肽尤其是疏水性分子）的水溶性、提高其生物利用度、延长血清半衰期、调节免疫原性、提高生物活性常用的方法。PEG已经广泛用于药品修饰、人工移植等方面，提高了药品的生物相容性、降低其毒性和免疫原性。为使得PEG的特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与 PEG聚合物连接有关的有利特征，例如增加其水溶性和循环半衰期，而不会影响母体分子的生物活性(MacGillivray等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.1996,81:1806-1809)。 

利用聚乙二醇（PEG）修饰蛋白质，可以延长其半衰期，减少免疫原性，增加稳定性，是一项已成功得到应用的技术。目前利用此技术开发的产品，已经上市的包括PEG-门冬酰胺酶，PEG-ADA（腺苷脱氨酶），PEG-干扰素和PEG-GCSF（粒细胞集落刺激因子）。其中PEG-干扰素由原来的每两天或每天注射一次降低到每周一次，而且疗效显著改善。PEG-GCSF也有每天注射一次改善为给个化疗疗程注射一次(Bailonetal.,Bioconjugate Chem.,12:195-202,2001;Kinstler et al.,US Patent5985265,1999;Kinstler et al.,Pharm.Res.,13:996-1002,1995)。 

现有蛋白聚乙二醇化学修饰过程中会有一些副反应的发生。例如，组氨酸含有反应活性的亚氨基（-N（H）-），但许多与-NH₂反应的化合物也可与（-N（H）-）-反应。同样，氨基半胱氨酸的侧链具有游离巯基，其结构式为-SH。在有些情况下，PEG与赖氨酸-NH₂反应的同时，也能与半胱氨酸、组氨酸或其他残基反应。如此产生经PEG修饰后的复杂混合物，并且有可能破坏所修饰蛋白的生物活性。因此，需要在蛋白内单一位点处引入化学官能基团，使得一种或一种以上的PEG聚合物能够在蛋白表面上处选择性偶合到蛋白上（Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation,Nektar Molecular Engineering Catalog，2003,1-17）。 

遗传密码扩展技术 

经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨酰tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码扩展的技术—利用琥珀终止密码子（TAG）来编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当 中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质。使用这一方法，可以将非天然氨基酸（包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸）引入蛋白质中（L.Wang等人，（2001），SCIENCE292:498-500;J.W.Chin等，2002，Journal of the American Chemical Society124:9026-9027;J.W.Chin,＆P.G.Schultz,2002,ChemBioChem11:1135-1137）。这些研究表明，有可能且有选择性且常规地引入化学官能基团到蛋白质中，例如，羰基、炔基、和叠氮基团等特殊化学基团，这些基团一般能够有效且选择性地形成稳定的共价键，更加有利于蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。 

面对现有技术中存在的生长激素修饰物不均质性的问题，本领域迫切需要提供改善生长激素修饰物的不均质性的方法和均质的生长激素修饰物。 

发明内容：

发明人经过对现有技术的思考和研究，利用古甲烷球菌的tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到蛋白中，从而得到定点突变的生长激素。然后将所述定点突变的生长激素作为可被进一步定点修饰的原料，对该定点突变的生长激素进一步进行修饰，进而得到定点修饰的生长激素，所述的定点修饰例如将聚乙二醇定点到生长激素特定的氨基酸进行的方法，从而得到性能改善的生长激素，例如得到能够延长生长激素半衰期的修饰产物。 

本发明最重要的改进是在人生长激素中定点引入了非天然氨基酸，由于这种非天然氨基酸的存在，为后续定点修饰的特异性提供了保证。例如光交联反应或者Click反应仅仅能够发生在所述的非天然氨基酸上，而不会在人生长激素的其它位点发生，这对于定点修饰的生长激素的均质性至关重要。 

具体地，在本发明的一个具体的实施方案中，提供了引入非天然氨基酸的人生长激素，主要通过两个步骤：（1）构建含有在选定的具 有TAG突变的编码人生长激素基因的载体，（2）获得pACYC-tRNA/PylRS质粒，将步骤（1）与（2）在合适的宿主菌中共表达，且在培养基中填入需要的非天然氨基酸，获得引入突变的人生长激素。 

该突变系统的原理在于：突变型的tRNA^Pyl，PylRS满足下列关系：（1）：tRNA^Pyl不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA酶，只能被突变型的PylRS酰化；（2）：突变型的PylRS只能酰化tRNAPyl，不能酰化其它tRNA，因此，突变性tRNAPyl和PylRS之间的关系式正交性的。这种正交性的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸酰化到这种正交的tRNA上，并且只能酰化这种tRNA，而不能酰化其它的tRNA。获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA系统，使非20种常见氨基酸的Lys-diazirine或Lys-azido等与琥珀密码子TAG相对应，从而将非天然氨基酸定点引入到人生长激素中。 

在本发明的一个具体的实施方案中，通过将带有琥珀密码子TAG的人生长激素基因插入到载体（例如pMAL-c5X质粒）中，将所述的与pACYC-tRNA/PylRS一起转化大肠杆菌工程菌，即可通过在发酵液中添加非天然氨基酸例如Lys-diazirine或Lys-azido获得定点突变的人生长激素。 

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明提供了一种定点引入非天然氨基酸的突变重组人生长激素及其聚乙二醇化定点修饰的方法，该重组人生长激素的特征为所属突变人生长激素中某一特定氨基酸位点突变为非天然氨基酸Lys-diazirine，该diazirine基团可以特异的与聚乙二醇单甲醚乙烯醚反应，或定点突变为非天然氨基酸Lys-azido,该azido基团可以特异地和炔-聚乙二醇发生click反应，将聚乙二醇通过非天然氨基酸定点偶联在人生长激素上。 

在本发明的一个实施方案中，将纯化的Lys-Diazirine定点突变hGH蛋白与修饰后的聚乙二醇（聚乙二醇单甲醚乙烯醚）在365nm紫外光照下发生连接反应，使得分子量5k的PEG通过hGH上的非天然氨基酸对hGH实行定点修饰，经简单离子交换色谱纯化即可获得PEG-Lys-Diazirine-hGH。经体内外实验初步证明，经PEG定点修饰的 hGH依然保持其原有的生物活性，并大大延长了其血清半衰期。相似的方法，在Lys-Diazirine定点突变hGH蛋白上还可以偶联分子量10k、15k、20k、30k、40k、50k的PEG，得到了类似的体内体外活性结果。 

在本发明的另外的实施方案中，将纯化的Lys－azido定点突变hGH蛋白与聚乙二醇（聚乙二醇-炔）进行Click反应，使得分子量10k，30k的PEG通过hGH上的非天然氨基酸对hGH实行定点修饰，经简单离子交换色谱纯化即可获得PEG-Lys-azido-hGH。经体内外实验初步证明，经PEG定点修饰的hGH依然保持其原有的生物活性，并且其反应便捷性和回收率比用光交联反应高。其中在hGH蛋白上还可以偶联分子量10k、15k、20k、30k、40k、50k的PEG。 

在本发明的实施方案中，出于方便后续纯化的考虑，发明人选用麦芽糖结合蛋白（MBP）与突变人生长激素（MhGH）的融合表达，由于融合蛋白具有MBP蛋白标签，更加易于通过一种高效色谱填料（Dextrin Sepharose^TM High Performance）亲合纯化带有麦芽糖结合蛋白标签的突变人生长激素融合蛋白（MBP-MhGH）。MBP-MhGH之间是通过FXa识别肽IEGR连接，纯化后的MBP-MhGH很容易经FXa切割释放出游离的hGH，再经简单纯化即可获得纯品hGH。 

在本发明的实施方案中，鉴于人生长激素难以在大肠杆菌中实现可溶性表达，本发明选用麦芽糖结合蛋白（MBP）与突变人生长激素（MhGH）的融合表达，较容易实现突变生长激素可溶性表达。不过包涵体表达也可以。 

在本发明中提供了一种可由大肠杆菌中重组表达的，定点引入非天然氨基酸的突变人生长激素，该生长激素保留了天然生长激素的活性。 

1.更为具体地，本发明提供了定点突变的生长激素，其在特定位点的1个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自： 

所示的Lys-diazirine， 

所示的Lys-azido，或 

其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种； 

所述特定位点选自：示于SEQ ID NO：1的序列的第Y35位,P48位,Q49位，S57位，K70位，L87位，G131位，R134位，Y143位和K145中的1个位点。 

2.定点突变的生长激素，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-diazirine，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示： 

由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第35位,48位,49位，57位，70位，87位，92位，131位，134位，143位和K145位氨基酸中的一个， 

R₁为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基， 

R₂为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基， 

R₃为 

3.定点突变的生长激素，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式 如下式所示： 

由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第35位,48位,49位，57位，70位，87位，92位，131位，134位，143位和K145位氨基酸中的一个， 

R₁为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基， 

R₂为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基， 

R₄为 

4.经过修饰的上述项目1－3中任一项的定点突变的生长激素，其连接方式如下式所示，其中R₅和R₆独立地为H、相同或不同分子量PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团，且二者不同时为H， 

Lys-diazirine插入hGH后定点偶联分子式； 

Lys-azido插hGH后定点偶联分子式。 

5.项目4的经修饰的定点突变的生长激素，所述修饰为在R₇上连接不同分子量PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团。 

6.编码突变的生长激素的核酸分子，所述核酸分子与编码SEQ ID NO：1的核酸分子SEQ ID NO：2的区别在于，其中编码SEQ ID ＮO：1的第Y35位,P48位,Q49位，S57位，K70位，L87位，G131位，R134位，Y143位，K145位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。 

7.核酸载体，其可操作地连接有项目5的核酸分子。 

8.宿主细胞，其中含有项目6的核酸载体。 

9.项目7的宿主细胞，其中还含有表达甲烷球菌的tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的质粒。 

10.项目7或8的宿主细胞，其为真核宿主细胞或原核宿主细胞。 

11.定点改良生长激素的方法，包括步骤： 

（1）选择步骤：在生长激素的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点； 

（2）基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的生长激素的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG； 

（3）表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的生长激素的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体； 

（4）获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒， 

（5）表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达； 

（6）对于能够表达突变蛋白的宿主，对表达产物进行生长激素活性检测，保留野生型生长激素80％以上活性的突变体设定为定点改良候选物。 

12.项目11的定点改良生长激素的方法，其中在步骤（6）之后还进一步包括： 

（7）表达定点改良候选物，并对产物进行纯化； 

（8）对非天然氨基酸进行特异性化学修饰，所示修饰包括聚乙二醇化、糖基化或酰基化； 

（9）对（8）中经修饰的生长激素进行稳定性或活性检测，相比野生型得到提高的生长激素为改良的生长激素。 

13.制备定点PEG化的生长激素的方法，包括： 

（1）获取聚乙二醇单甲醚乙烯醚； 

（2）将适量的项目2的定点突变的生长激素与适量的（1）的聚乙二醇单甲醚乙烯醚在适合反应的条件下在紫外光下光照适当的时间，得到用聚乙二醇定点修饰的突变的生长激素。 

14.项目13的方法，其中聚乙二醇单甲醚乙烯醚的分子式为CH₃O-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O-CH=CH₂，分子量范围2kD-100kD，n为1－60的整数。 

15.制备定点PEG化的生长激素的方法，包括在合适的条件下将项目3的定点突变的生长激素与适量的炔－PEG进行Click反应，得到用聚乙二醇定点修饰的突变的生长激素。 

16.项目15的方法，其中的PEG的分子量范围为2kD-100kD。 

17.定点改良的生长激素，其在项目1－3任一项的定点突变的生长激素的非天然氨基酸位置定点引入PEG，所述PEG的分子量范围为2kD-100kD。 

18.组合物，其中含有有效量的项目1-3中任一项的生长激素，权利要求4的经过修饰的定点突变的生长激素或者项目17的定点改良的生长激素。 

19.药物组合物，其中含有有效量的项目1-3中任一项的生长激素，权利要求4的经过修饰的定点突变的生长激素、项目17的定点改良的生长激素，以及药学上可以接受的赋形剂。 

20.项目1-3中任一项的生长激素，项目4的经过修饰的定点突变的生长激素或者项目17的定点改良的生长激素在制备长效生长激素、稳定性高的生长激素或多功能生长激素、治疗垂体机能不足而导致的侏儒症或Turner综合征的药物、或用于促进儿童生长，治疗慢性肾功能不全、艾滋病衰竭或衰老的药物中的用途。 

附图说明：

图1：Lys-diazirine-Y35hGH表达条件优化。其中 

A：IPTG浓度对目的蛋白表达的影响，从左至右各泳道分别为浓度从0.02至2.5mM的IPTG，方框内为目的蛋白条带，图示0.02mM IPTG诱导下目的蛋白表达量最高； 

B：诱导前菌体浓度对目的蛋白表达的影响。从左至右各泳道分别为诱导前菌体浓度OD600（0.1，0.3,0.4，0.55,0.7,1.0,1.3,1.65,1.9），经灰度扫描分析，OD600为0.7时目的蛋白占总菌体蛋白的比率最高； 

C：不同诱导时间对目的蛋白表达影响，从左至右各泳道图示为诱导表达时间，图示诱导12小时目的蛋白表达量最大。 

D：不同诱导温度对目的蛋白表达的影响，+：添加Lys-diazirine，-不添加Lys-diazirine，图示30℃目的蛋白表达量最高； 

E：不同非天然氨基酸浓度对目的蛋白表达的影响，各泳道从左至 右为0.05至5.0mM的非天然氨基酸，图示1.0mM时目的蛋白表达量已经最高； 

F：不同培养基对目的蛋白表达的影响，所选培养基为：LB，2YT，GMML，+：添加Lys-diazirine，-不添加Lys-diazirine，图示2YT培养基的目的蛋白表达量最高； 

图2：MBP-Lys-diazirine-Y35hGH融合蛋白的纯化及酶切后纯化鉴定图，其中 

A，MBP-Lys-diazirine-Y35hGH蛋白经麦芽糖结合蛋白亲和柱纯化色谱图，箭头所指为目的蛋白收集峰。 

B，蛋白纯化鉴定，1：诱导后全菌体液（添加Lys-diazirine）2：诱导后全菌体液（不添加Lys-diazirine）3：沉淀4：上清5：穿透液6，7，8，目的收集峰。 

C，MBP-Lys-diazirine-Y35hGH融合蛋白经FXa切割后，经分子筛superdex G75纯化，箭头所指为目的收集峰。 

D，1：融合蛋白切割未纯化，2：经分子筛纯化后样品。 

图3：部分生长激素突变体的Lys-diazirine或Lys-azido掺入表达结果 

其中，WT，表示生长激素野生型表达菌，Y35、F92、G131、R134、Y143、K145分别是各个突变体的简称，泳道从左向右共27条，泳道1为分子量marker，泳道2为野生型hGH，泳道3是空白泳道，自泳道4开始，每个突变体名称（如Y35）下方从左向右方向的第一个“＋”表示在培养基中加入Lys-diazirine，第一个“－”表示在培养基中未加入Lys-diazirine，第二个“＋”表示在培养基中加入Lys-azido，第一个“－”表示在培养基中未加入Lys-azido。 

图4：部分生长激素突变体的Lys-diazirine掺入表达结果 

其中，每个突变体名称（如P48）下方从左向右方向的＋表示在 培养基中加入Lys-diazirine，－表示在培养基中未加入Lys-diazirine。 

图5：生长激素突变体的Lys-azido掺入表达结果 

其中，每个突变体名称（如P48）下方从左向右方向的＋表示在培养基中加入Lys-azido，－表示在培养基中未加入Lys-azido。 

图6：突变生长激素的鉴定 

Ａ：非天然氨基酸标记MBP-Y35hGH的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色鉴定图，WT表示为野生型MBP-hGH融合蛋白；Lys-diazirine表示光交联非天然氨基酸；Lys-azido表示为叠氮非天然氨基酸；+/-表示为非天然氨基酸的添加/不添加。 

Ｂ：western鉴定结果，一抗为hGH抗体，1：2000稀释。图示标记同本图A。 

图7：Lys-diazirine定点突变的hGH经光交联定点修饰示意图 

其中Ａ表示聚乙二醇单甲醚乙烯醚的合成示意图； 

Ｂ表示Lys-diazirine定点突变的hGH与聚乙二醇单甲醚乙烯醚经光交联定点与PEG偶联示意图。 

图8：聚乙二醇单甲醚乙烯醚定点偶联hGH的SDS-PAGE鉴定图，其中，第一泳道，蛋白分子量标准；第2泳道，突变人生长激素Lys-diazirine-Y35hGH；第3泳道，PEG与Lys-diazirine-Y35hGH经紫外交联后的产物；第4泳道，PEG与Lys-diazirine-Y35hGH未经紫外交联；第5泳道，正常的生长激素hGH；第6泳道，PEG经琥珀酰亚胺与hGH非特异修饰的产物5kPEG-Succinimide-hGH。 

图9：Lys-azido定点突变的hGH经Click反应定点修饰示意图 

其中Ａ表示聚乙二醇单甲醚炔丙基醚(mPEG-炔）合成示意图 

Ｂ表示Lys-azido定点突变hGH经Lys-azido与mPEG-炔点偶联示意图。 

图10:Lys-azido-Y35hGH与10kPEG的Click反应条件摸索 

图中，泳道Ｍ表示分子量Marker,0.75,1,1.5,2,0,2,4,6,8,10,12,24分别表示Click反应的时间。 

图11：Lys-azido-Y35hGH的定点30kPEG偶联结果，由图可见30kDPEG成功偶联到Lys-azido-Y35hGH蛋白上。 

为了更好地理解本发明，发明人用实施例对具体试验进行阐述和说明，其中所述实施例仅用于说明，并不限定本发明的保护范围。任何与本发明等价的变体或者实施方案都包括在本发明中。 

实施例1：包含定点突变的人生长激素的基因载体的构建

(1)辅助质粒的获得 

从保藏地：中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏地址：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）的含有质粒pACYC-tRNA/PylRS的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS（由北京大学化学院陈鹏教授馈赠）中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS（以下简称该质粒为辅助质粒），该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸Lys-diazirine和Lys-azido的tRNA和tRNA合成酶。 

(2)含天然人生长激素的质粒的获得 

其中将含有pMAL-hGH-Y35表达质粒的大肠杆菌进行保藏（保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4952的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）pMAL-hGH-Y35，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）。 

(3)定点突变位点的选择 

根据对hGH的晶体结构进行解析[Cunningham,B.C.and J.A.Wells,High-resolution epitope mapping o fhGH-receptor interactions  by  alanine-scanning  mut agenesis,Science,1989,244(4908):p.1081-5;De Vos,A.M.,M.Ultsch,and A.A.Kossiakoff,Human growth hormone and extracellular domain of  its  receptor:crystal  structure  of    the  complex.Science,1992,255(5042):p.306-12]发现hGH的一些组成氨基酸暴露在外，其中一些还位于抗原决定簇中，如第Y35，P48，Q49，S57，K70，L87，F92，G131，R134，Y143，K145等。这些裸露的氨基酸极易受到体内多种蛋白酶的水解，因而降低了它们在体内的半衰期以及与之相关的药效。 

通过文献查阅，发明人选取第Y35，P48，Q49，S57，K70，L87，F92，G131，R134，Y143，K145这几个敏感位点，作为定点突变的靶氨基酸，用不被蛋白酶识别的非天然氨基酸置换这几个特定的点，然后可以以此为原料，对hGH进行定点修饰，将有可能避开蛋白酶的降解，从而提高蛋白稳定性，延长其体内半衰期。 

(4)定点突变的引物设计以及突变载体构建 

发明人针对人生长激素第Y35，P48，Q49，S57，K70，L87，F92，G131，R134，Y143，K145这几个位点，分别设计能够使编码所述氨基酸的密码子突变为TAG的引物，具体引物如下表所示。 

表1：突变引物列表 

利用定点突变试剂盒（ 

Lightning Site-Directed Mutagenesis Kits，Catalog#210518），按说明书操作将天然人生长激素第Y35，P48，Q49，S57，K70，L87，F92，G131，R134，Y143，K145这几个位点的氨基酸密码子突变为琥珀终止密码子TAG,然后将突变基因插入至pMAL-c5X质粒（New England BioLabs Inc.Cat.NO.N8108s），构建得到表达质粒pMAL-hGH-Y35、pMAL-hGH-P48、pMAL-hGH-Q49pMAL-hGH-S57、pMAL-hGH-K70、pMAL-hGH-L87、pMAL-hGH-F92、pMAL-hGH-G131、pMAL-hGH-R134、pMAL-hGH-Y143、和pMAL-hGH-K145（在本申请中，有时简写为pMAL-Y35-hGH、pMAL-P48-hGH、pMAL-Q49-hGH、pMAL-S57-hGH、pMAL-K70-hGH、pMAL-L87-hGH、pMAL-F92-hGH、pMAL-G131-hGH、pMAL-R134-hGH、pMAL-Y143-hGH、和pMAL-K145-hGH），经测序验证突变成功。 

其中将含有pMAL-hGH-Y35表达质粒的大肠杆菌进行保藏（保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4952的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）pMAL-hGH-Y35）。 

(5)定点突变的生长激素表达株的构建 

将步骤（1）得到的辅助质粒pACYC-tRNA/PylRS(氯霉素抗性)和步骤(4)得到的表达质粒pMAL-hGH-Y35（氨苄青霉素抗性）两个质粒同时转化大肠杆菌Ecoli.BL21（DE3）亚型，经双抗性平板（氯霉素抗性和氨苄青霉素抗性）筛选出共转化的阳性菌株（阳性菌株表示同时转化有两个质粒），命名为表达株pMAL-Y35h-hGH。 

依照相同的共转染方法，获取其余各表达株，分别为表达株：pMAL -P48-hGH、pMAL-Q49-hGH、pMAL-S57-hGH、pMAL-K70-hGH、pMAL-L87-hGH、pMAL-F92-hGH pMAL-G131-hGH、pMAL-R134-hGH、pMAL-Y143-hGH、和pMAL-K145-hGH。 

实施例2：定点突变的人生长激素的表达和纯化

本发明中构建pACYC-tRNA/PylRS质粒与表达源自古甲烷球菌的tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的质粒共表达后，在宿主菌中，从原理上看，利用这套蛋白质翻译系统能够使非天然氨基酸Lys-diazirine或者与Lys-diazirine结构近似的叠氮非天然氨基酸Lys-azido掺入到蛋白中，从而造成生长激素的定点突变。不过是否这两种氨基酸都能掺入到蛋白质中，是否都能够适合大量表达和纯化，需要进一步的试验摸索。 

下面，发明人对Lys-diazirine和Lys-azido这两种非天然氨基酸的掺入可能性和突变蛋白质的生产性能进行了检测。 

1：非天然氨基酸Lys-diazirine的合成和鉴定

非天然氨基酸Lys-diazirine的化学合成反应式如下。 

如上式所示，将原料1（5-羟基-2-戊酮）15mL与液氨40mL在-40℃下搅拌反应5h，之后降温至-60℃，缓慢滴加NH₂OSO₃H（20g）的甲醇溶液，加毕升至室温，反应过夜。滤除沉淀，向上清液中加入三乙胺， 冰浴条件下缓慢加入I₂，至反应液颜色变深，不再产生气泡为止。反应完全后蒸除溶剂，经乙醚萃取后干燥。蒸除乙醚，剩余液体减压蒸馏获得25.4g无色粘稠液体产物2。 

将上述产物2用吡啶溶解，0℃搅拌下加入11g TsCl，反应过夜。待反应完全后将反应液倒入浓盐酸与冰水的混合液中，乙醚萃取，醚层分别用1N盐酸和1N NaOH洗涤。有机相干燥柱分得到11.8g无色粘稠液体产物3。 

将上述产物3用DMF溶解，加入NaN₃室温反应隔夜至反应完全，加入大量水，乙醚萃取。蒸除乙醚，剩余产物用THF:水(9:1)混溶，加入三苯基磷，室温反应。反应完后加1N HCl混匀，旋干THF，二氯甲烷把未反应的原料，PPh₃和O=PPh₃洗掉，液相加1N NaOH调pH到12，二氯甲烷萃取出4.0g产物4。 

将5.2g原料5（Boc-Lys-OMe）与羰基二咪唑反应，制备出5.9g化合物6。之后化合物6与上述产物4（4.0g）偶联得到化合物7，最后经过两步脱保护，将Boc和甲酯脱除，得到目标4.5g产物8，即Lys-diazirine。经谱学验证，结果为： 

¹H NMR(400MHz,D₂O):δ3.10(1H,t,J=6.3Hz),2.96(4H,m),1.25(10H,m),0.90(3H,s);¹³C NMR(100MHz,D₂O):183.63,160.66,56.00,39.80,39.30,34.49,30.84,29.20,26.75,23.92,22.43,18.80;HREIMS m/z308.16937[M+1]⁺(calcd for C₁₂H₂₂N₅NaO₃,308.16931)，证明所得到的Lys-diazirine结构正确。 

2：突变生长激素的非天然氨基酸Lys-diazirine掺入表达

将实施例1的步骤5获得的表达株pMAL Y35-hGH在LB培养基（且使之含有100ug/ml氯霉素和100ug/ml氨苄青霉素）中37℃培养12-16小时后，再经二级扩增至菌液OD值到0.6-1.0时，用1mM IPTG和1mM Lys-diazirine诱导表达6-8小时后收集菌体。此表达试验采用的阳性对照为野生型pMAL hGH表达菌（实施例1步骤2获得），除了接种的表达菌不同之外，其它条件与突变菌相同。 

3：突变生长激素的Lys-diazirine的表达条件优化

A：诱导剂IPTG浓度优化： 

将以pMAL-Y35-hGH，以1:100的比例把过夜培养物接种至多个含有3mlCm+Amp+LB培养基的摇菌管中，当OD600达1.0时，加入非天然氨基酸Lys-diazirine至终浓度为1mM，L-阿拉伯糖至终浓度为0.2%，以诱导pACYC-tRNA/PylRS表达特异识别Lys-diazirine的tRNA和氨酰tRNA合酶，37℃200r/min培养0.5h。加入IPTG浓度为0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mM，30℃诱导过夜，收集菌体，SDS-PAGE鉴定。结果见图1的A图 

根据图分析可知表达产物在可溶性蛋白中的含量，IPTG浓度越低，非天然氨基酸插入效率越高，故选定IPTG诱导浓度为0.02mM。 

B.诱导前菌体浓度优化

同前培养pMALY35-hGH表达菌株，其中加入的IPTG的浓度固定为：0.02mM，在菌体生长的不同阶段加入IPTG进行诱导，培养4h。从图1的B图可以看出，当菌体浓度OD600在0.1-1.9之间时，随着菌体浓度的增加,目的蛋白表达量亦增加。OD600为0.7时，目的蛋白表达含量可达23.4%。若诱导前菌体浓度再增加，却不利于目的蛋白表达。分析原因认为这可能是由于培养基被消耗或菌体慢慢老化，因此在高密度发酵时可以通过分批补料培养，增加新鲜培养基，来保持菌体活性和提高目的蛋白表达量。 

C.诱导时间对表达量的影响

在确立IPTG浓度为0.02mM、诱导前菌体浓度为OD600=0.7的基础上，试验了不同时间对产物表达量的影响(见图1的C图)。具体操作步骤同A：导剂IPTG浓度优化，其中将IPTG浓度设为0.02mM、诱导前菌体浓度为OD600=0.7。结果显示，随着诱导时间的增加，目的蛋白的表达量逐渐提高诱导12h或过夜，非天然氨基酸插入效率最高。 

D.诱导温度对表达量的影响

培养温度不仅影响细菌生长和细胞代谢调控，而且可影响载体质粒的稳定性和复制效率。较高的温度有利于细菌的高密度发酵，而低 温培养能促进提高重组产物的表达量，因此可以在不同阶段采取不同的培养温度。本部分具体操作步骤同A：诱导剂IPTG浓度优化。只是将IPTG浓度设为0.02mM、诱导前菌体浓度为OD600=0.7、诱导时间设为12小时。在添加IPTG后，将培养温度设为16℃、25℃、30℃、37℃不同温度。图1中的D图总结出诱导温度在30℃时，目的蛋白表达量最高。 

E.非天然氨基酸浓度对表达量的影响

细菌表达目的蛋白时需要多少量的非天然氨基酸，需要进行优化。在具体操作流程同上的条件下，采取已经优化好的实验条件，在诱导前半小时提前加入不同浓度的非天然氨基酸0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mM。SDS-PAGE鉴定结果如图1的E所示。结果显示：加入量太少会直接影响蛋白表达量，浓度越大表达量越大。但加入量超过1mM后表达量没有明显差别。由图1中的E可认为1mM为最适浓度。 

F.培养基对表达量的影响

上述条件一直选用最常见的细菌培养基LB，其它一些培养基是否会更适合表达。利用上述实验流程，采取已经优化好的实验条件，选取三种常见细菌培养基LB，2YT，GMML，进行初步优化。结果如图1的F结果显示2YT培养基的目的蛋白表达量最高。 

总之，经过上述条件的优化，可初步确定表达条件为，表达宿主菌为DH10B，培养基为2YT，IPTG诱导前菌体OD600为0.7，IPTG诱导剂浓度为0.02mM，非天然氨基酸Lys-diazirine加入量为1mM，诱导温度30℃，诱导时间12小时。 

对其它各表达菌，进行了相类似的表达条件优化，得到的结果相近。 

4：Lys-diazirine突变蛋白质的纯化

1）.将步骤2收集的菌体,以1g/ml column buffer（20mM Tris pH7.4，200mM NaCl，1mM EDTA）的比例重悬菌体。加入溶菌酶至1mg/ml，Triton X-100至0.5%。冰上振荡30min。 

2）.将步骤1的产物反复冻融，破碎细胞。条件是液氮（30秒） 之后移到37℃水浴（至样品融化）重复液氮冷冻和37℃水浴溶解共4次。 

3）.将步骤2的产物高速离心，吸取上清作为可溶性成分。 

4）.将步骤3的产物上清样品过0.22μm滤膜后，用麦芽糖结合蛋白亲和柱纯化（详细步骤参见New England BioLabs Inc.Cat.NO.N8108s的说明书），结果见图2的Ａ图。 

5）.将步骤4的纯化得到的融合蛋白的进行FXa切割，条件是1ug FXa，100ug融合蛋白，20mM Tris（pH 7.4），1mM EDTA，室温切割6小时。 

6）.将步骤5切割后产物的superdex G75分子筛过滤，洗脱缓冲液：20mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，收集目的蛋白组分，结果见图2的Ｃ图。 

经过上述工艺途径，可以成功获得电泳纯级(>95%)目的蛋白样品（见图2的Ｂ和Ｄ），为后续活性实验提供足够的实验样品。 

5：其它各Lys-diazirine突变蛋白质的纯化

用表达菌pMAL-hGH-P48、pMAL-hGH-Q49pMAL-hGH-S57、pMAL-hGH-K70、pMAL-hGH-L87、pMAL-hGH-F92、pMAL-hGH-G131、pMAL-hGH-R134、pMAL-hGH-Y143和pMAL-hGH-K145替换pMAL-hGH-Y35，按照前述步骤2－4的方式培养，进行纯化，分离得到用非天然氨基酸Lys-diazirine定点突变人生长激素第Y35，P48，Q49，S 57，K70，L87，F92，G131，R134，Y143，K145位氨基酸的突变体蛋白质纯品（简称为Lys-diazirine-Y35-hGH，Lys-diazirine-P48-hGH，Lys-diazirine-Q49-hGH     ，Lys-diazirine-S57-hGH     ，Lys-diazirine-K70-hGH     ，Lys-diazirine-L87-hGH     ，Lys-diazirine-G131-hGH    ，Lys-diazirine-R134-hGH    ，Lys-diazirine-Y143-hGH，Lys-diazirine-K145-hGH）。 

6：突变生长激素的Lys-azido掺入表达及纯化

非天然氨基酸Lys-azido的化学合成反应式如下 

如上式所述，将原料1（2-溴乙醇）2.3mL溶于90mL丙酮以及15mL水的混合溶液，加入NaN33.12g，60℃油浴加热回流反应20h。冷却至室温，旋蒸除去丙酮，无水乙醚萃取（30mL×8），无水Na2SO4干燥，旋蒸除去溶剂得2.62g无色液体产物2。 

将2（500mg，5.74mmol）加入到三光气（1.70g，5.74mmol）的THF(10ml)溶液中。0℃搅拌反应8h，溶剂蒸干。剩余物在真空下干燥1h，得到无色油状产物3。 

将3溶解在1.5ml的THF中并缓慢加入Boc-Lys-OH（1.7g，6.88mmol）的1M NaOH（20ml）/THF(5ml)的溶液中。0℃搅拌反应12h并逐渐升温到室温。重新将反应液冷却到0℃并用0℃的1M的盐酸溶液将反应液pH值调整至2-3。反应液用EtOAc萃取（30mL×5），有机层用2×100ml的饱和食盐水洗涤。无水Na2SO4干燥有机层、过滤、旋蒸除去溶剂得到1.65g无色粘稠液体产物4不用进一步纯化。 

将4溶于15mL CH2Cl2中，搅拌下缓慢滴加15mL TFA，室温下反应30min后蒸出溶剂，剩余液体产物用5mL甲醇溶解，加入100mL乙醚，析出大量白色固体沉淀，过滤干燥得到1.38g白色固体终产物5。1H NMR(D2O):δ=1.22-1.45(m,4H),1.67-1.73(m,2H),2.99(m,2H),3.38(m,2H),3.70(m,1H),4.09(m,2H).13C NMR(D2O):δ=21.4,28.4,29.6,39.5,53.4,56.2,57.8,116.0(TFA),153.1,162.3(TFA),172.9.HRMS:m/z calcd for C9H17N5O4[M]+:259.1281;found:259.1283，证明得到的Lys-azido结构正确。 

除了用Lys-azido替换Lys-diazirine外，其它条件与前述步骤2－5相同，进行各个Lys-azido突变生长激素的蛋白表达和纯化试验。即可得到用非天然氨基酸Lys-azido定点突变人生长激素第Y35，P48， Q49，S57，K70，L87，F92，G131，R134，Y143，K145位氨基酸的突变体蛋白质纯品（简称为Lys-azido-Y35-hGH，Lys-azido-P48-hGH，Lys-azido-Q49-hGH，Lys-azido-S57-hGH，Lys-azido-K70-hGH，Lys-azido-L87-hGH，Lys-azido-G131-hGH，Lys-azido-R134-hGH，Lys-azido-Y143-hGH，Lys-azido-K145-hGH）。 

将各突变生长激素的表达菌的全菌液进行SDS－PAGE进行插入效率比较，结果见图3－5。所述结果表明初步验证在hGH的Y35，P48，Q49，S57，K70，L87，G131，R134，Y143，K145位点能够成功插入两种非天然氨基酸。其中Y35，P48，Q49，S57，K70的插入效率较高，未出现截断型蛋白，更加适用蛋白的大量表达。 

通过对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶进行扫描和灰度分析目的蛋白占全菌总蛋白的百分比，比较各个位点非天然氨基酸插入效率。不过F92并没有成功引入了Lys-diazirine突变或者Lys-azido突变。 

由图3可知，加入Lys-diazirine或Lys-azido后，在分子量72kDa附近，与野生型的表达位置相接近的位置上，除了F92外，其它突变体Y35、G131、R134、Y143、K145都能够有效表达，但是G131、R134、Y143、K145在接近55kDa条带附近表达了大量的截断的蛋白质，这些蛋白会在后续的纯化中有一定影响。 

由图4可知：加入Lys-diazirine后，在分子量72kDa附近，与野生型的表达位置相接近的位置上，突变体P48、Q49、S57、K70、L87都能够有效表达，且在接近55kDa条带附近未见表达大量的截断的蛋白质。 

由图5可知：加入Lys-azido后，在分子量72kDa附近，与野生型的表达位置相接近的位置上，突变体P48、Q49、S57、K70、L87都能够有效表达，且在接近55kDa条带附近未见表达大量的截断的蛋白质。 

分析F92未能插入的原因主要要从下述几个方面进行考虑：人生长激素是一种由大约20种氨基酸组成的具有191个氨基酸残基的生物大分子，内含若干对二硫键并组成复杂的高级结构。特异氨酰tRNA 和氨酰tRNA合酶介导的非天然氨基酸的定点插入效率，受到前后氨基酸残基空间位阻、TAG密码子前后碱基、以及菌体生长、诱导表达等条件的影响，非天然氨基酸并不是很容易就能够在所有位点实现高效的插入。获得一个定点标记有非天然氨基酸的人生长激素，需要考虑多种因素，优化表达条件，最终优选出能够高效表达的位点及生产菌株。因此，在生长激素各个位点引入非天然氨基酸的效率高低不同，例如F92位点几乎插入不进非天然氨基酸。 

7.突变生长激素的鉴定

为验证插入的插入有非天然氨基酸的生长激素确实高效表达，将表达菌或者纯化蛋白进行SDS－PAGE后，利用hGH抗体进行Western blot检测。以第35位插入效果鉴定为例，其它各点的突变体鉴定与此类似。 

将取各个突变菌的全菌液样品1ml，5000转/分钟离心一分钟，用100ul PBS重悬，取20ul重悬液，按1:1比例加入2×上样缓冲液混匀，然后98℃煮样10分钟，10000转/分钟离心5分钟。将上述样品同时分别制备两块SDS电泳胶，1块用于考马斯亮蓝染色，1块用于western blot。考马斯亮蓝染色和western blot具体步骤参见《分子克隆》。结果见图6的A和B：证明得到了突变的生长激素突变体。 

实施例3：突变体的聚乙二醇定点偶联

当在生长激素中引入Lys-diazirine后，可以通过光交联的方式进行PEG偶联，当在生长激素中引入Lys-azido后，需要通过Click反应进行PEG偶联，下面分别对两种偶联进行了试验。 

1：Lys-diazirine定点突变体的PEG定点光交联（见图7）

A：聚乙二醇单甲醚乙烯醚的合成 

将一定量通式为ROH（其中R代表CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2）（分子量为2kD-100kD）的聚乙二醇加入到一定量甲苯溶液中，低温下加入2-3倍当量的强碱（如氢化钠等），室温反应1小时后，加入2倍当量的溴乙烯，60℃反应12小时后用甲醇萃灭反应，纯化后即得聚 乙二醇单甲醚乙烯醚，干燥备用。 

以聚乙二醇5000单甲醚乙烯醚的制备为例：将市售的聚乙二醇5000单甲醚10.07g（0.005mol）溶于二氯甲烷（100mL），冰浴冷却至0℃，搅拌下分批加入0.6g氢化钠（60%）（0.015mol），缓慢升至室温，继续搅拌1小时。滴入20mL1.0M溴乙烯的四氢呋喃溶液（0.01mol），室温搅拌12小时。冷却至，缓慢滴入甲醇溶液萃灭反应。除去溶剂后，残余物用二氯甲烷溶解（20mL），搅拌下缓慢倒入150mL乙醚溶液中，析出白色固体。抽滤，滤饼干燥即得聚乙二醇5000单甲醚乙烯醚8.2克，收率82%。IRν:3030,1657,823cm-1。该红外谱证明所得到的化合的结构正确。 

B：突变hGH经非天然氨基酸与聚乙二醇（PEG）定点偶联 

将实施例2得到引入非天然氨基酸的纯品Lys-diazirine-Y35hGH,将其与步骤1得到的分子量5000的PEG单甲醚乙烯醚按1：2摩尔比混合（漩涡混匀），经365nm的紫外光照10分钟，使二者共价交联，然后经Source30Q离子交换色谱柱分离纯化（分离条件：10mM Tris，pH7.4，0-100mM NaCl梯度洗脱），获得纯度大于95%的纯品修饰蛋白（见图8）。 

为了证明这一点，发明人将琥珀酰亚胺偶联PEG的生长激素与本发明获得的修饰蛋白进行了电泳比较（见图8），比较结果显示，PEG经hGH上的非天然氨基酸Lys-diazirine是定点偶联的，在电泳检测时表现为单一条带（见图3第三泳道），而常规的经琥珀酰亚胺的PEG化，显示出多条条带，证明传统的的琥珀酰亚胺偶联具有非特异性，其得到的产物不是均质的（见图8第6泳道）。 

其它位点Lys-diazirine突变蛋白质的PEG定点偶联方法与Lys-diazirine-Y35hGH相同，得到相近的修饰效果。 

2．Lys-azido定点突变蛋白的定点PEG偶联（见图9）

A：聚乙二醇单甲醚炔丙基醚(mPEG-炔）的合成 

将一定量通式为ROH（其中R代表CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2）（分子量为2kD-100kD）的聚乙二醇加入到一定量甲苯溶液中，低温下加 入2-3倍当量的强碱（如氢化钠等），室温反应1小时后，加入2倍当量的3-溴丙炔，80℃反应12小时后用甲醇萃灭反应，纯化后即得聚乙二醇单甲醚炔丙基醚（Macromol.Rapid commun.2008,29,1097-1103.），干燥备用。 

以聚乙二醇5000单甲醚炔丙基醚的制备为例：将市售的聚乙二醇5000单甲醚10.07g（0.005mol）溶于甲苯（100mL），冰浴冷却至0oC，搅拌下分批加入0.6g氢化钠（60%）（0.015mol），缓慢升至室温，继续搅拌1小时。滴入3-溴丙炔0.78mL（0.01mol），80℃加热反应12小时。冷却至室温，缓慢滴入甲醇溶液萃灭反应。除去溶剂后，残余物用二氯甲烷溶解（20mL），搅拌下缓慢倒入150mL乙醚溶液中，析出白色固体。抽滤，滤饼干燥即得聚乙二醇5000单甲醚丙烯醚9.1克，收率91%。1HNMR(400MHz,CDCl3):2.52(brs,1H),3.37(s,3H),3.47-3.82(m),4.20(br s,2H).13CNMR(100MHz,CDCl3):57.9,58.5,68.6,68.6,69.9,670.0,70.1,71.5,74.3,79.2，证明得到的化合物的结构正确。 

B：通过Click反应偶联10kPEG

10k PEG Click反应体系如下： 

Cu丝小段（足量） 

注（1,2,3-triazol-1-yl)ethanesul fonic acid，简称BTTES） 

反应条件：4℃，隔一定时间取样，SDS-PAGE鉴定，结果见图10，由图可知Click反应速度较快，能在2小时内达到平衡，而长时间进行反应则大大增加蛋白的降解。根据实验结果，确定反应时间为1.5h，大约有60%的hGH被PEG化。 

C：通过Click反应偶联30kPEG

30k PEG Click反应体系如下： 

Cu丝小段（足量） 

结果经验证30kD PEG成功偶联到Lys-azido-Y35hGH蛋白上,结果见图11。 

经过上述反应条件能够在1.5小时内将大约60%的hGH定点PEG化，反应后的复合物经离子交换后可以获得>95%纯度的PEG定点修饰蛋白（Source15Q，20mM Tris pH7.4，0-250mM NaCl梯度）。 

其它位点Lys-azido突变蛋白质的PEG定点偶联方法与Lys-azido-Y35hGH相同，得到相近的修饰效果。 

实施例4：定点聚乙二醇化修饰的人生长激素的体外活性评价

（1）STAT磷酸化实验 

生长激素通过JAK-STAT信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要生物学过程（JiS,JBiol Chem,2002,277:28384-28393.）。 

STAT（Signal transducers and activators of transcription）磷酸化实验，就是利用hGH刺激人IM-9淋巴细胞后，通过流式细胞仪检测STAT磷酸化的水平的高低，评价hGH的体外活性。 

具体过程如下：人IM-9淋巴细胞（购自American Type Cluture Collection）培养在RPMI1640+10%FBS（胎牛血清）的培养基中，在检测前饥饿过夜，然后将WHO hGH（野生型生长激素），Lys-diazirine-hGH、Lys-azido-hGH（实施例2制备得到的含有非天然氨基酸的人生长激素），PEG-Lys-diazirine-hGH组、PEG-Lys-azido-hGH（实施例3制备得到的非天然氨基酸被PEG化的人生长激素），分别按照0.1nM、1.0nM、10nM、50nM浓度于37℃孵育 10分钟，刺激后的细胞按照pSTAT5检测试剂盒（Cell Signaling Technology）说明书经固定、透化等处理,获得的样品经流式细胞仪检测（FACS Array，BD Biosciences）检测，数据利用Flowjo软件处理，计算得到各样品EC50值（结果见表2）。 

（2）BrdU掺入法检测生长激素促细胞增殖的能力 

生长激素能够促进细胞增殖，因此可以利用BrdU掺入法检测生长激素促进细胞增殖的能力，具体过程如下：将白介素-3依赖的小树细胞系BAF3细胞，按5×104/孔，铺96孔板。将受试样品然后将WHO hGH，Lys-diazirine-hGH组（具体见表2），PEG-Lys-diazirine-hGH组（具体见表2），分别按照0.1nM、1.0nM、10nM、50nM浓度刺激细胞后，加入50uM的BrdU（Sigma-Aldrich）。48小时后，细胞经固定透化，DNAse处理，暴露含有BrdU的表位，然后通过APC连接的抗BrdU抗体染色，经FACS Array检测分析。 

通过SigmaPlot(Systat Software,Inc.）软件处理pSTAT和BrdU阳性细胞百分数随给药蛋白剂量依赖曲线计算EC50值。结果见表2。 

表2，hGH突变体和PEG修饰产物的体外活性 

*将野生型hGH的活性比作1，其它样品与此相比。每组样品数n=3。 

结果显示，将非天然氨基酸插入人生长激素并没有明显影响其生物活性，而进一步的PEG化修饰，导致其EC50升高数倍，说明该位点的修饰影响了人生长激素的活性，但其仍然具有较高的活性，因此还需要对其它位点，或不同分子量的PEG，或其它分子（例如：环糊精，蛋白，糖，多肽，核酸等）进行尝试研究，以获得综合效果最佳的修饰方案。 

实施例5：聚乙二醇定点修饰的人生长激素的体内半衰期检测

成年雄性SD大鼠被随机分为WHO hGH组（阳性对照组，野生型生长激素），Lys-diazirine-hGH、Lys-azido-hGH（实施例2制备得到的含有非天然氨基酸的人生长激素，具体见表3），PEG-Lys-diazirine-hGH组、PEG-Lys-azido-hGH（实施例3制备得到的非天然氨基酸被PEG化的人生长激素，具体见表3）每组6只。各组的蛋白按1mg/kg剂量皮下注射，在不同的时间点取血，测定血清中hGH的含量，结果显示经第35位光交联非天然氨基酸定点5kPEG修饰的人生长激素（5kPEG-Lys-diazirine-Y35hGH）的血清半衰期延长至8.3小时，经第57位叠氮非天然氨基酸定点10kPEG修饰的人生长激素（10kPEG-Lys-azido-S57hGH）的半衰期延长至11小时左右（见表3）。证明经过本发明的定点修饰的人生长激素的可以作为长效药物使用。 

表3，hGH突变体和PEG修饰产物的半衰期 

每组动物数n=6 

在半衰期试验中检测了5k和10kPEG的修饰结果，已经得到了30kPEG修饰物，但是还没有完成活性实验。结果也显示，分子量大一些的PEG的效果要好些，例如5k修饰物的半衰期没有10KPEG修饰物的半衰期长。 

上述各组的PEG修饰后的hGH经阴离子纯化后，经高效液相色谱（HPLC）分析纯度>95%，最终经过蛋白质谱鉴定蛋白分子量，确证1分子的5kPEG或10kPEG被定点偶联在1分子的hGH上，由此证明所述的PEG修饰物是均质的。 

Claims (20)

1.定点突变的生长激素，其在特定位点的1个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸选自：

所示的Lys-diazirine，

所示的Lys-azido，或

其它含有双吖丙啶、叠氮结构的非天然氨基酸中的至少1种；

所述特定位点选自：示于SEQ ID NO：1的序列的第Y35位,P48位,Q49位，S57位，K70位，L87位，G131位，R134位，Y143位和K145中的1个位点。

2.定点突变的生长激素，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-diazirine，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：

由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第35位,48位,49位，57位，70位，87位，92位，131位，134位，143位和K145位氨基酸中的一个，

R₁为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，

R₂为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，

R₃为

3.定点突变的生长激素，其与示于SEQ ID NO：1的序列的区别在于：在SEQ ID NO：1所示的序列的第N位的氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸与SEQ ID NO：1所示的序列的连接方式如下式所示：

由R₁到R₂的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第35位,48位,49位，57位，70位，87位，92位，131位，134位，143位和K145位氨基酸中的一个，

R₁为SEQ ID NO：1所示序列的第1至第N-1位氨基酸残基，

R₂为SEQ ID NO：1所示序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，

R₄为

4.经过修饰的权利要求1－3中任一项的定点突变的生长激素，其连接方式如下式所示，其中R₅和R₆独立地为H、相同或不同分子量PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团，且二者不同时为H，

Lys-diazirine插入hGH后定点偶联分子式；

Lys-azido插入hGH后定点偶联分子式。

5.权利要求4的经修饰的定点突变的生长激素，所述修饰为在R₇上连接不同分子量PEG，环糊精，糖，核酸，氨基酸，多肽或羧基端修饰基团。

6.编码突变的生长激素的核酸分子，所述核酸分子与编码SEQ ID NO：1的核酸分子SEQ ID NO：2的区别在于，其中编码SEQ IDＮO：1的第Y35位,P48位,Q49位，S57位，K70位，L87位，G131位，R134位，Y143位，K145位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

7.核酸载体，其可操作地连接有权利要求5的核酸分子。

8.宿主细胞，其中含有权利要求6的核酸载体。

9.权利要求7的宿主细胞，其中还含有表达甲烷球菌的tRNA（tRNA^Pyl）和吡咯赖氨酰-tRNA合成酶（tRNA^Pyl）的质粒。

10.权利要求7或8的宿主细胞，其为真核宿主细胞或原核宿主细胞。

11.定点改良生长激素的方法，包括步骤：

（1）选择步骤：在生长激素的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点；

（2）基因突变：将编码对应于（1）中选择的位点的生长激素的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG；

（3）表达载体构建：将（2）基因突变步骤得到的突变的生长激素的编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；

（4）获得pACYC-tRNA/PylRS质粒：从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS质粒，

（5）表达：将（3）得到的突变序列表达载体与（4）的pACYC-tRNA/PylRS质粒共同转染相同的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有Lys-diazirine或者Lys-azido的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达；

（6）对于能够表达突变蛋白的宿主，对表达产物进行生长激素活性检测，保留野生型生长激素80％以上活性的突变体设定为定点改良候选物。

12.权利要求11的定点改良生长激素的方法，其中在步骤（6）之后还进一步包括：

（7）表达定点改良候选物，并对产物进行纯化；

（8）对非天然氨基酸进行特异性化学修饰，所示修饰包括聚乙二醇化、糖基化或酰基化；

（9）对（8）中经修饰的生长激素进行稳定性或活性检测，相比野生型得到提高的生长激素为改良的生长激素。

13.制备定点PEG化的生长激素的方法，包括：

（1）获取聚乙二醇单甲醚乙烯醚；

（2）将适量的权利要求2的定点突变的生长激素与适量的（1）的聚乙二醇单甲醚乙烯醚在适合反应的条件下在紫外光下光照适当的时间，得到用聚乙二醇定点修饰的突变的生长激素。

14.权利要求13的方法，其中聚乙二醇单甲醚乙烯醚的分子式为CH₃O-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O-CH=CH₂，分子量范围2kD-100kD，n为1－60的整数。

15.制备定点PEG化的生长激素的方法，包括在合适的条件下将权利要求3的定点突变的生长激素与适量的炔－PEG进行Click反应，得到用聚乙二醇定点修饰的突变的生长激素。

16.权利要求15的方法，其中的PEG的分子量范围为2kD-100kD。

17.定点改良的生长激素，其在权利要求1－3任一项的定点突变的生长激素的非天然氨基酸位置定点引入PEG，所述PEG的分子量范围为2kD-100kD。

18.组合物，其中含有有效量的权利要求1-3中任一项的生长激素，权利要求4的经过修饰的定点突变的生长激素或者权利要求17的定点改良的生长激素。

19.药物组合物，其中含有有效量的权利要求1-3中任一项的生长激素，权利要求4的经过修饰的定点突变的生长激素、权利要求17的定点改良的生长激素，以及药学上可以接受的赋形剂。

20.权利要求1-3中任一项的生长激素，权利要求4的经过修饰的定点突变的生长激素或者权利要求17的定点改良的生长激素在制备长效生长激素、稳定性高的生长激素或多功能生长激素、治疗垂体机能不足而导致的侏儒症或Turner综合征的药物、或用于促进儿童生长，治疗慢性肾功能不全、艾滋病衰竭或衰老的药物中的用途。

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