CN102827844B - 一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，该方法包括提取癌细胞/正常细胞总RNA；DNase I及RNase I酶切；逆转录成cDNA及双链合成，加接头；抑制性消减杂交，PCR产物克隆建库，测序分析；对候选分子进行进一步实验验证等步骤。经在正常细胞和肿瘤细胞中应用验证，证实该方法可系统、快速的筛选人肿瘤相关的自然反义转录子。

Description

一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法

技术领域

本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体地，本发明涉及一种筛选人肿瘤相关自然反义转录子的方法。

背景技术

自然反义转录子（natural antisense transcripts，以下称NAT）通常是指自然情况下生物体内生成的反义RNA（antisense RNA），它们与其对应的互补RNA（complementary RNA）通过互补碱基配对，形成双链的自然正义-反义转录子（natural sense-antisense transcript，以下称NSAT），引起靶基因的降解或翻译抑制来调控靶基因的表达。NAT按照其作用方式分为两种：大多数NAT来源于与正义转录子相同的基因组位点，由编码正义转录子的相对链所编码，称为顺式编码NAT（cis-NAT），这类分子与靶基因的序列完全互补；与此相反，来源于与正义转录子不同的基因组位点的NAT称为反式编码NAT（trans-NAT），它们与靶基因序列只是部分互补。

近年人们在研究NAT时发现，NAT表达水平的改变与人类肿瘤的发生和转移等密切相关，因此，NAT的异常表达被认为是研究肿瘤中不可忽视的重要因素。由于NAT的重要功能，目前国内外的多家研究机构对其进行了深入研究，发现自然界中可能存在的NAT远远超出我们最初的预期。这些研究大多采用生物信息学预测的方法，具有方便、快捷等优点，但所得结果不够可靠，且不能在特定的细胞或组织中系统筛选差异表达的NAT分子。为解决这些方法的局限和不足，我们利用双链RNA分子能够耐受RNaseI的降解，而单链RNA分子会被RNase I降解的原理，将提取的总RNA用RNase I酶切后再进行逆转录反应，就可以将在细胞内与靶分子以双链的NSAT（natural sense-antisensetranscripts）形式存在的NAT分子从总RNA中分离出来，而且这种方法排除了人为干扰因素，理论上用该方法得到的NSAT应为自然条件下生物体内真实存在的。运用该原理，结合抑制性消减杂交等实验方法，我们就可以快速系统地筛选人正常细胞及对应的肿瘤细胞或正常组织及对应的癌组织间差异表达的NAT分子，从而获得人肿瘤相关的NAT分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于RNase保护分析及抑制性消减杂交的人肿瘤相关自然反义转录子的新型筛选方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法，包含以下步骤：

1）提取人正常细胞和对应的肿瘤细胞总RNA；

2）分别加入过量的DNase I和RNase I，酶切步骤1）获得的人正常细胞及对应的肿瘤细胞总RNA，然后通过酚/氯仿抽提回收；

3）以步骤2）中的双链RNA为模板，以随机六引物及逆转录酶将其反转录为cDNA；

4）以随机六引物为引物，用T4DNA聚合酶催化合成cDNA第二链并补平末端；

5）以Rsa I酶切双链cDNA，得到带有平末端的酶切产物，回收纯化后加双蒸水；

6）将步骤5）的检测子cDNA分为两份，一份连接SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，一份连接SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；驱动子(Driver)cDNA不连接头；

7）用T4DNA聚合酶补平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，加适量双蒸水溶解；

8）以正常细胞和癌细胞互为检测子和驱动子进行双向抑制性消减杂交；其中在正向消减中，以癌细胞为检测子，以正常细胞为驱动子；在反向消减中,以正常细胞为检测子，以癌细胞为驱动子；

9）将步骤8）的杂交产物用缓冲液稀释后作为模板进行两轮PCR扩增；PCR的引物核苷酸序列对应于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

10）将步骤9）PCR扩增后的正向和反向消减杂交产物纯化，后与pGEM-T载体连接克隆，并分别构建正向和反向cDNA消减杂交文库，鉴定出阳性克隆后进行测序；

11）根据步骤10）所获得的测序结果进行分析，确定候选的靶分子。

进一步地，步骤1）之后还包括检测所提取的总RNA的步骤。

进一步地，步骤3）中酶切条件为37℃水浴中酶切30min。

进一步地，步骤5）中酶切双链cDNA时间为2h。

进一步地，步骤5）中加双蒸水调整浓度至300ng/μl。

进一步地，步骤9）中两轮PCR扩增循环次数分别为28和12。

本发明还提供一种根据上述方法筛选的人肿瘤相关的自然反义转录子在制备检测肿瘤试剂盒中的应用。

本发明还提供一种根据上述方法筛选的人肿瘤相关的自然反义转录子在制备检测肿瘤制剂中的应用。

本发明的优点及有益效果：

本发明所述的基于RNase保护分析及抑制性消减杂交的人肿瘤相关自然反义转录子的新型筛选方法可用于系统、快速的筛选人肿瘤相关自然反义转录子，通过在多种正常细胞/癌细胞中的实验证实，采用本方法能有效的筛选人肿瘤相关自然反义转录子。

附图说明

图1是本发明提供的一种筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法流程示意图；

图2是pGEM-T载体的图谱；

图3A-3B是总RNA经RNase I酶切前后产物电泳示意图，其中图3A为酶切前电泳示意图，图3B为酶切后电泳示意图；其中M为100bp DNA梯状电泳；

图4是文库质粒酶切图；其中M为100bp DNA梯状电泳；

图5A-5B是候选NATs分子ET1-AS测序结果图，其中图5A为测试结果第一页，图5B为测试结果第二页；

图6是ET1-AS的表达对ET1 mRNA表达水平的影响图；其中柱1为pcDNAET-AS转染Skov3细胞24h，柱2和柱3为pcDNAET-AS转染Skov3细胞48h，柱4为野生型Skov3细胞，柱5为pcDNA3转染Skov3细胞24h，柱6为pcDNA3转染Skov3细胞48h；

图7是ET1-AS的表达对ET1蛋白表达水平的影响图；其中泳道1为野生型Skov3细胞，泳道2为Skov3细胞转染pcDNA 3，泳道3为Skov3细胞转染pcDNAET-AS24h；泳道4为Skov3细胞转染pcDNAET-AS48h。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明提供的筛选人肿瘤相关的自然反义转录子的方法包含以下步骤：

1.细胞培养/组织标本材料的取材

按各种细胞的优化培养条件培养目的细胞；如采用组织标本材料，则组织标本材料应在术后立即置液氮中保存。

2.总RNA的提取

采用总RNA抽提试剂Trizol提取总RNA，操作步骤按Trizol试剂说明书进行。

(1)在所得细胞中，按照1×10⁷个细胞中加入1ml的Trizol试剂，反复吹打裂解细胞。如为组织，先加入适量Trizol试剂后用匀浆机进行研磨。

(2)室温放置5分钟，使细胞充分裂解。

(3)加入0.5ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5分钟。

(4)4℃，12000rpm离心15分钟，液体分为三层。

(5)取无色水相移至另一干净EP管中，加等量异丙醇颠倒混匀，室温放置10分钟。

(6)4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清。

(7)加入75％乙醇洗涤RNA沉淀。

(8)4℃，7500rpm离心5分钟，弃上清。加入无水乙醇洗涤沉淀，利于尽快去除水分。

(9)加入20μl二乙基焦碳酸酯（DEPC）水溶解沉淀，紫外分光光度计测其浓度。

3.RNA样品的检测

（1）在一RNase-free离心管中加入：

（2）混合液在65℃加热15min后立即置冰上2min，离心收集样品，加入2μl上样缓冲液后在甲醛变性凝胶中电泳45min，在紫外灯下观察。观察结果如图3A所示。

4.总RNA的DNaseI处理

用上述方法大量提取的总RNA中会不可避免的有微量的基因组DNA污染，必须用DNaseI彻底消化样品中的DNA。

（1）在一RNase-free离心管中加入：

（2）混匀，瞬时离心，37℃水浴30min后，80℃加热10min灭活DNase I。

（3）加入150μl的RNase-free水，再加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀。

（4）12000rpm离心10min，取上层转移到另一RNase-free的1.5ml离心管。

（5）加入40μl，4M的LiCl及600μl预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

（6）离心回收沉淀，用70%乙醇清洗沉淀，干燥后用50μl的RNase-free水溶解。

（7）用1%甲醛变性凝胶电泳确认基因组DNA被消化，确认RNA的完整性。

（8）取适量样品稀释后测定RNA的浓度。

5.总RNA的RNase I处理

（1）在一RNase-free的离心管中，加入：

（2）混匀，瞬时离心，37℃保温1h。然后在70℃加热20min灭活RNaseI_f。

（3）取5μl进行1%甲醛变性凝胶电泳，确认23S，16S rRNA被完全降解。结果如图3B所示。

（4）加入100μl的RNase-free水，再加等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀。

（5）12000rpm离心10min，将上清转移至另一RNase-free的离心管。

（6）加入40μl，4M的LiCl及600μl预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。

（7）离心回收沉淀，用70%乙醇清洗沉淀，干燥后用50μlRNase-free水溶解。

6.cDNA第一链的合成

以双链RNA（dsRNA）变性后的单链RNA为模板，以随机六引物（Promega合成）为引物，在逆转录酶（M-MuLV（RNase H-））的作用下生成cDNA。

（1）在一RNase-free的离心管中，加入：

（2）混合物80℃加热10min后立即置冰上，离心收集后加入：

5×第一链缓冲液             4μl

0.1M二硫苏糖醇（DTT）       2μl

共                          19μl

（3）轻轻混匀，25℃放置2min。

（4）加1μl（200单位）M-MuLV（RNase H-），混匀后25℃放置10min。

（5）42℃水浴加热50min。

（6）70℃加热15min终止反应。

（7）加1μl（2单位）RNase H，37℃保温20min。

（8）95℃加热5min，灭活RNase H。

（9）加入等体积的酚/氯仿，充分混匀。

（10）13000rpm离心10min后，取上层于另一离心管中。

（11）加入1/10体积的3M醋酸钠（NaAC，pH5.2）及3倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置30min。

（12）离心回收沉淀，70%乙醇清洗，干燥后用50μl双蒸水（ddH₂O）溶解。

7.cDNA第二链合成及末端补平

（1）在一RNase-free的离心管中，加入：

（2）70℃保温10min，点动离心，置于冰浴。

（3）在样品管中加入T4DNA聚合酶2μl，37℃保温10min。

（4）加入4μl，500mM的乙二胺四乙酸(EDTA)。

（5）等体积加入酚\氯仿\异戊醇，抽上清，12000rpm离心3min。

（6）上清液转移至一干净试管，加2体积的乙醇，1/10体积的乙酸钠，-20℃保温30min沉淀，12000rpm离心15min，收集沉淀，70%乙醇洗沉淀，干燥，采用Tris-EDTA复溶。

8.RsaI酶切双链cDNA

(1)检测子（Tester）和驱动子（Driver）cDNA经37℃过夜酶切，酶切体系为：

双链cDNA（ds cDNA）              43.5μl

10×Rsa限制缓冲液    5.0μl

Rsa I（10U/μl）                 1.5μl

(2)每管用2.5μl EDTA/肝糖（Glycogen）混合物终止反应。

(3)加入50μl苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，并沉淀出酶切后的cDNA双链，溶解于5.5μl双蒸水中。

9.接头连接

酶切消化的Tester双链cDNA分为两份，一份与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列连接，另一份与SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列连接，具体步骤如下：

（1）取1μl酶切的Tester dscDNA，用5μlddH2O稀释。

（2）连接反应液（Ligation Master Mix）的制备如下：

无菌水（sterile H₂O）            3μl

5×连接缓冲液          2μl

T4DNA连接酶（Ligase）            1μl

（3）在两个EP管中分别加入如下试剂：

（4）在另一离心管中混合1.5μl的Tester1-1和1.5μl的Tester1-2，连接反应完成后即为本实验所需要的unsubtracted tester control1-c。

（5）轻微离心，16℃过夜连接。

(6)加入1μl的20×EDTA/Glycogen Mix，终止反应；72℃温育5min使连接酶失活。

(7)取1μl unsubtracted tester control1-c，用1ml ddH2O稀释，该样品将用来进行PCR检测。

(8)所有样品放入-20℃保存。

10.第一次杂交

(1)每个杂交反应的体系为：

(2)每个反应管中加一滴矿物油覆盖，短暂离心。

（3）98℃变性5min，使DNA充分变性。

（4）68℃杂交10小时（杂交时间不少于6小时，也不能超过12小时），完成后立即进行第二次杂交。

11.第二次杂交

（1）配制第二次杂交混合液

Driver cDNA             1μl

4×Hybridzaion Buffer   1μl

无菌水                  2μl

（2）取1μl混合液加一滴矿物油覆盖后于PCR仪上98℃变性1.5min。

（3）将移液器调到15μl，轻轻将枪头伸入混合样品2中矿物油与液面交界出，小心将样品吸出，并吸入少许空气；用同样的方法吸入新鲜的变性Driver，此时混合样品2和新鲜变性Driver在枪头内由一段气体柱分开，将这一状态的混合物打入装有混合样品1的离心管中，用枪头混匀，短暂离心。

（4）68℃保温过夜。

（5）加入200μl的dilution buffer后68℃保温7min。

12.两次PCR扩增

（1）第一次扩增反应体系为：

第一次扩增程序为：

产物10倍稀释作为第二次PCR的模板。

（2）第二次扩增反应体系为：

第二次扩增反应程序为：

13.PCR产物与T载体的连接

在一50μl离心管中，加入：

14.连接产物的转化及NATs文库的构建

（1）连接产物65℃加热10min灭活T₄DNA连接酶。

（2）取新鲜制备或-70℃保存的感受态细胞100μl，置于冰上，完全解冻后，将细胞均匀悬浮。

（3）加入10μl连接液，轻轻混匀。

（4）于冰上放置30min。

（5）42℃水浴热激60s，迅速置冰上。

（6）加入900μl的LB，37℃振荡培养1h。

（7）8000rpm离心3min，用枪头吸掉600μl上清液，用剩余的LB液将细胞悬浮。

（8）加入4μl的0.5M IPTG和20μl的20mg/ml X-gal与菌液混匀。

将菌液涂布于Amp抗性平板，过夜培养后取2块96孔培养板，向每孔中加入LB培养液150μl，用灭菌牙签挑取转化平板上的白色克隆接种于对应的培养孔中，将培养板盖好，置30℃培养18～24h，加入灭菌的50％甘油50μl，振荡混匀2min。封好盖子后，置-80℃冰箱保存。文库质粒酶切图如图4所示。

15.克隆测序结果的生物信息学分析

（1）从测序结果中去除克隆载体序列和上、下游引物序列，将得到的NATs分子序列编号保存，用NCBI的BLAST程序进行网上在线初步比对分析（网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），初步确定同源的核苷酸序列在基因组的位点。

（2）从网上（网址：http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway）下载相应位点的核苷酸序列、内含子序列和注释信息。

（3）用DNAStar软件打开人的基因组序列文件，将NATs序列与之比对，进行NATs的基因组定位分析。

16.对本方法有效性的验证

为验证本方法的有效性，发明人在所筛选到的候选分子中，随机选取ET1-AS进行实验验证。

（1）RNA提取如前所述。

（2）链特异性逆转录：用ET-AS的链特异引物进行逆转录，引物核苷酸序列如下所示，其他条件如前所述。

本实验方案中所涉及的引物核苷酸序列：

引物1（SEQ ID NO:1）:

5'-AAAACTGCAGCCAATCAATACTTAACACCA-3'

引物2（SEQ ID NO:2）:

5'-GCTCTAGAGCTTCGATTTTT TTTTTTTTTTTT-3'

ET1-AS

RT and Forward引物（SEQ ID NO:3）:

5'-TATCTAACCTTGAAATCCCCCCCTG-3'

Reverse引物（SEQ ID NO:4）:

5'-CTGGGTGCTCAGTTGTCTAACCTGA-3'

抑制性消减杂交所用低聚核苷酸：

Adaptors:

adaptor1（SEQ ID NO:5）:

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′

adaptor 2R（SEQ ID NO:6）:

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′

PCR引物（SEQ ID NO:7）:

5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′

巢式PCR引物:

巢式引物1（SEQ ID NO:8）:

5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′

巢式引物2（SEQ ID NO:9）:

5′-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′

控制引物:

GAPDH 5'引物（SEQ ID NO:10）:

5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′

GAPDH 3'引物（SEQ ID NO:11）:

5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′

（3）PCR扩增：PCR引物为SEQ ID NO:7所示序列，PCR条件为94℃，30s；60℃，45s；72℃，45s；30个循环。

（4）克隆测序：将PCR扩增产物克隆至pGEM-T载体，pGEM-T载体图谱如图2所示，由上海生工公司进行测序，测序结果如图5A和图5B。

（5）构建ET1-AS的表达载体：用HindIII/BamHI分别双酶切pcDNA3.0，分别凝胶电泳回收目的片段后进行连接转化，再进行阳性克隆鉴定，构建ET1-AS的表达载体pcDNAET-AS。

（6）ET1-AS重组表达载体转化Skov3细胞：将重组质粒pcDNAET-AS用Lipofectamine 2000试剂转染Skov3细胞。具体操作依照试剂盒附带操作规程进行。以质粒pcDNA 3为阴性对照。

（7）ET1-AS对ET-1表达调控的检测：

A.real-time PCR：用Trizol法提取转染24、48h后细胞的总RNA，并进行质量鉴定。按照逆转录试剂盒说明，冰上操作将不同时间点的RNA逆转录成cDNA。再以逆转录出的cDNA为模板建立反应体系(按Takara公司SYBRPremix Ex Taq试剂盒说明书进行)。ET-1引物序列:

SEQID NO:12：5'-GCCTCGTAGAAGTCTGGT-3'，（上游），

SEQID NO:13：5'-AAATCAAGGACAGGGAAT-3'（下游），

SEQID NO:14（内参GAPDH）:

5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3'(上游)，

SEQID NO:15：

5'-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT-3'（下游），

反应条件为:95℃，10s预变性；95℃，5s；68℃，30s；共25个循环进行。实验采用3个复孔，结果见图6。

B.Western Blot分析：细胞转染24、48h后，裂解细胞，用Lowry法蛋白定量，高温变性后进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转印至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST对PVDF膜进行封闭。第一抗体为兔单克隆抗体(1：1000稀释)，第二抗体是辣根酶标记山羊抗兔IgG(1：10000稀释)。内参beta actin的一抗及二抗同上述方法稀释使用。Western发光检测试剂孵育PVDF膜，暗室显影，结果见图7。

（8）结果分析：通过上述real-time PCR和Western Blot分析，证实了ET1-AS的的表达能显著的降低ET-1 mRNA及蛋白的表达，证实ET1-AS可特异的作用于ET-1 mRNA靶点，并抑制ET-1的表达，进而进一步证实了采用我们的筛选体系所得到的NATs分子是真实存在且具有相应生理功能的：

表1采用该方法从HepG2和L02细胞中筛选出的差异表达的候选NATs分子

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (1)

1.一种筛选肝癌相关的自然反义转录子的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）提取人正常肝细胞和肝癌肿瘤细胞总RNA，随后检测所提取的总RNA； 

2）分别加入过量的DNase I和RNase I，酶切步骤1）获得的人正常肝细胞及肝癌肿瘤细胞总RNA，然后通过酚/氯仿抽提回收；

3）以步骤2）中的双链RNA为模板，以随机六引物及逆转录酶将其反转录为cDNA；

4）以随机六引物为引物，用T4 DNA聚合酶催化合成cDNA 第二链并补平末端；

5）以Rsa I酶切双链cDNA，时间为2h，得到带有平末端的酶切产物，回收纯化后加双蒸水调整浓度至300ng/μl；

6）将步骤5）的检测子cDNA分为两份，一份连接SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，一份连接SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；驱动子 (Driver) cDNA不连接头； 

7）用T4 DNA 聚合酶补平粘末端，采用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，加适量双蒸水溶解；

8）以正常肝细胞和肝癌细胞互为检测子和驱动子进行双向抑制性消减杂交；其中在正向消减中，以肝癌细胞为检测子，以正常肝细胞为驱动子；在反向消减中, 以正常肝细胞为检测子，以肝癌细胞为驱动子；

9）将步骤8）的杂交产物用缓冲液稀释后作为模板进行两轮PCR扩增，两轮PCR扩增循环次数分别为28和12；PCR的引物核苷酸序列对应于SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列；

10）将步骤9）PCR扩增后的正向和反向消减杂交产物纯化，后与pGEM-T载体连接克隆，并分别构建正向和反向cDNA消减杂交文库，鉴定出阳性克隆后进行测序；

11）根据步骤10）所获得的测序结果进行分析，确定候选的转录子。