CN102803496A

CN102803496A - 用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(vigs)

Info

Publication number: CN102803496A
Application number: CN2010800354468A
Authority: CN
Inventors: 叶健; 蔡南海; 曲景; Y·F·耿; Y·P·步
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2009-06-10
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2012-11-28
Also published as: WO2010144058A8; EP2440666A4; US8853493B2; US20120096595A1; EP2440666B1; CN107129998A; EP2440666A1; WO2010144058A1; AU2010259295A1; AU2010259295B2

Abstract

本发明涉及采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法对棉花基因进行功能性分析。更具体地，本发明借助于烟草脆裂病毒(TRV)载体RNA1和RNA2在棉花中诱导基因沉默，并可分析对棉花植物表型的影响。此外，本发明还提供瞬时表达载体TRV RNA2，以便在强亚基因组启动子的影响下在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因。

Description

用于棉花中基因功能性分析的病毒诱导的基因沉默(VIGS)

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月10日提交的美国临时专利申请61/185,631的权益，在此通过引用将其并入本申请。

序列表提交

本申请与电子形式的序列表一起提交。序列表名称为2577_195PCT_Sequence_Listing.txt，于2010年6月3日创建。在此通过引用将电子形式序列表中的信息并入本申请。

背景技术

本发明涉及在基因组规模上功能性分析棉花基因的领域。更具体地，本发明涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)在基因组规模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本发明还涉及用于在棉花植物中瞬时表达基因的瞬时表达载体和用于在棉花植物中瞬时表达基因的方法。

本文所用的出版物和其它材料是用于说明本发明的背景，或提供与实践有关的额外细节，它们在此援引加入且分别列在参考书目中供参考。

棉花(棉属(Gossypium spp.))是世界上最重要的纤维植物和重要的油料作物，其生长在超过80个国家中，在2006/2007生长季节世界产量的记录是122,000,000(480磅/包)(美国农业部海外局)。消费量与产量之间的逆差发生在1994/1995年，预期在2009/2010生长季节将持续增加至2,500,000(480磅/包)(United States Department of Agriculture-Foreign AgriculturalService[USDA-FAS]2009)。棉花生产为约100,000,000名农民带来收入，且约150个国家参与到棉花进口和出口(Lee et al.，2007)。估计世界范围内其经济影响为约$5,000,000,000,000/年。而且，改进食物和饲料用的棉花种子能够显著提高食物挑战型经济中数百万人的营养和生计。棉花也是可再生生物燃料的潜在候选植物。棉花纤维由近乎纯的纤维素组成。与木质素相比，纤维素易于转化为生物燃料。最佳的棉花纤维生产和加工将确保这种天然可再生的产品相比于源自石油的合成不可再生纤维更有竞争力，以确保更加可持续的发展。

为了解决上述问题，棉花的许多农艺学性质，如纤维长度和强度、农业产率、耐旱性和抗害虫性需要通过可利用的遗传资源和鉴定基因功能的快速方法来增强(Udall et al.，2006)。

棉花是广泛生长且用于生产天然织物纤维和棉花籽油的重要作物。棉花纤维是用于研究细胞伸长以及细胞壁和纤维素生物合成的模型系统。此外，棉花纤维是单细胞，因此细胞伸长可独立于细胞分裂来评价。将棉花纤维用作植物发育的模型系统的最显著优点之一是Beasley和Ting在1973年对棉花胚珠的培养方法进行了优化。

棉花属包括约45个二倍体(2n＝2x＝26)和5个四倍体(2n＝4x＝52)的物种，它们全部显示出二体遗传模式。尽管也在一定程度上使用其它三种物种，海岛棉(Gossypium barbadense)(四倍体)、亚洲棉(Gossypium arboretum)(二倍体)和草棉(Gossypium herbaceum)(二倍体)，但最普遍的棉花变种是陆地棉(Gossypium hirsutum)(陆地棉，四倍体)的形式，其占世界范围内每年棉花作物的约95％。其它这三类物种也是重要的遗传资源，为专门育种目的提供了基因库。例如，对生物和非生物胁迫具有高抗性的草棉可被用作与陆地棉进行种间杂交以改善其对各种胁迫抗性的良好起始遗传材料。因此，也十分需要在棉属和亲缘植物中进行基因功能性分析的独立于物种的方法。

目前，棉花全基因组测序刚刚开始。同时，不断增加的棉属EST序列(目前约400,000个)组和源自在一系列生长条件下由各种组织和器官构建的不同文库的非冗余基因(unigene)组可在网络上以及通过基于这些序列的微阵列分析来获得(Udall et al.，2006)。其它植物基因组序列的可用性起到在棉花EST数据库中鉴定和注解假定的直系同源物的有用平台的作用。虽然可从棉花纤维差异以及叶毛状体和次生木质部细胞形成之间说明相似性，但最终需要在棉花中直接检测假定的直系同源基因的功能。此外，已知棉花纤维表达在其它植物中尚无已知同源物的基因，这些基因赋予了一些独特的纤维性质。即使一些转录因子基因的功能已在拟南芥(Arabidopsis)中测试，但它们的确切功能仍需要在同源棉花植物中进一步确认。

鉴定棉属的农艺学和品质性状的重要方法是稳定转化入棉花。然而，稳定转化的棉花植物的低效生产限制了大规模基因鉴定。而且，此过程费力且耗时，不适用于基因组规模上的高通量分析。而且，仅有少量栽培品种可用作转化的宿主。通常，难以通过在棉花中的稳定转化来从良好的起始遗传材料中直接鉴定重要的遗传元件。

因此，希望开发出在基因组规模上独立于物种的棉属基因高通量功能性分析的方法。

发明内容

在一个实施方式中，本发明涉及在棉花(棉属)植物中直接操作靶基因表达的方法。更具体地，本发明涉及在全部棉花物种和种质，特别是在四倍体棉花，如陆地棉(Gossypium hirsutum)和海岛棉(Gossypium barbadense)，二倍体棉花，如草棉(Gossypium herbaceum)和亚洲棉(Gossypium arboretum)，以及源自种内和种间杂交的种质中调节或抑制一种或多种靶基因表达的方法。所述方法已对属于若干功能性种类的基因，包括参与发育、小RNA途径和次级代谢生物合成的转录因子等进行了测试。特别预期本发明的方法和组合物可用于棉花基因的功能性分析中。

本发明涉及在基因组规模上功能性分析棉花基因的领域。更具体地，本发明涉及使用病毒诱导的基因沉默(VIGS)在基因组规模上高通量功能性分析棉花基因的方法。本发明还涉及用于在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因的瞬时表达载体和用于在棉花植物和植物组织中瞬时表达基因的方法。

本发明涉及VIGS在可靠且快速和以高通量方式评价棉花(棉属)植物和植物组织基因功能中的应用。一方面，本发明提供了用于在棉花(如陆地棉)中进行VIGS的高效和可再生的系统以及方法。在一个实施方式中，本发明提供了烟草脆裂病毒(TRV)全病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方式中，本发明提供了用于全基因组功能性分析的快速沉默方法。在另一实施方式中，本发明提供了TRV VIGS系统在克隆和功能性鉴定若干功能性种类基因中的应用。这些重要的基因可用于改进棉花农艺学性状，如抗害虫性。

在一个实施方式中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNA1的载体为合成的植物载体。在另一实施方式中，TRV RNA2包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列。在一个实施方式中，第一沉默序列为目标基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为目标基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNA干扰(RNAi)的短发夹RNA(shRNA)。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNAi的前体微小RNA(miRNA)或miRNA的序列。在另一实施方式中，核酸进一步包含能够沉默第二目标基因的第二沉默序列。在另一实施方式中，核酸包含能够沉默大于两个目标基因的大于两种沉默序列。

在一些实施方式中，目标基因为候选转录因子基因。在另一实施方式中，目标基因为叶绿素或类胡萝卜素生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为类黄酮生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为原花色素和花色素生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。在一个实施方式中，目标基因为小RNA(smRNA)生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为次级代谢毒剂生物合成中的候选基因，且对植物抗生物胁迫也很重要。在另一实施方式中，目标基因为与细胞伸长、细胞壁生物合成和纤维素生物合成相关的候选基因。

因此，第一方面，本发明提供了在棉花中进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法。根据此方面，所述方法包括：

(a)将包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体；

(b)制备农杆菌(Agrobacterium)的混合培养物，所述混合培养物包含：含有包含TRV RNA1序列的载体的农杆菌和含有修饰型TRV RNA2载体的农杆菌；

(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；和

(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导第一目标基因的基因沉默。

在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花植物或棉花幼苗。在此实施方式中，受感染的植物在步骤(c)中产生，且受感染的植物在步骤(d)中生长。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此实施方式中，受感染的棉花胚珠在步骤(c)中产生，且受感染的棉花胚珠在步骤(d)的培养中生长。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在此实施方式中，受感染的棉花纤维在步骤(c)中产生，且受感染的棉花纤维在步骤(d)的培养中生长。在进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。

在另一方面，本发明提供了在棉花中分析基因功能的方法。根据此方面，所述方法包括：

(a)将包含能够沉默候选基因的沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体；

(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织以产生受感染的植物组织；

(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以诱导候选基因的基因沉默；和

(e)分析所沉默的候选基因对受感染的植物组织的表型影响。

在此第二方面的一个实施方式中，植物组织为棉花植物或棉花幼苗。在此实施方式中，受感染的植物在步骤(c)中产生，且受感染的植物在步骤(d)中生长。在此第一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此实施方式中，受感染的棉花胚珠在步骤(c)中产生，且受感染的棉花胚珠在步骤(d)的培养中生长。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在此实施方式中，受感染的棉花纤维在步骤(c)中产生，且受感染的棉花纤维在步骤(d)的培养中生长。在进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。

在另一方面，本发明提供了用于在棉花植物或棉花组织中瞬时表达基因的瞬时表达载体和方法。根据此方面，瞬时表达载体包含TRV RNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，以及任选存在地包含第一感兴趣的序列的核酸。在一个实施方式中，亚基因组启动子能够被TRV复制酶识别。在另一实施方式中，亚基因组启动子为强衣壳蛋白亚基因组启动子。在进一步的实施方式中，亚基因组启动子源自烟草脆裂病毒组，而非TRV。在一个实施方式中，亚基因组启动子为合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子。在另一实施方式中，亚基因组启动子为辣椒环斑病毒(PepRSV)衣壳蛋白亚基因组启动子。用于在棉花中瞬时表达的感兴趣的核酸插入在亚基因组启动子的下游，且可操纵地连接于此启动子。

根据此方面，用于在棉花组织中瞬时表达感兴趣的核酸的方法包括：

(a)将包含待在棉花植物中表达的第一感兴趣的序列的核酸插入瞬时表达载体中，以产生TRV RNA2表达载体，所述瞬时表达载体包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，其中所述核酸可操纵地连接于所述亚基因组启动子；

(b)制备农杆菌的混合培养物，所述混合培养物包含：含有包含TRVRNA1序列的载体的农杆菌和含有TRV RNA2表达载体的农杆菌；

(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织；和

(d)使受感染的植物生长足够的时间，以瞬时表达目标基因。

在此另一方面的一个实施方式中，植物组织为棉花幼苗。在此另一方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此另一方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花植物。在另一实施方式中，植物组织为棉花纤维。在更进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。

在另一方面，本发明提供了修饰型TRV RNA1载体。根据此方面，修饰型TRV RNA1载体包含已插入至少一个内含子的TRV RNA1序列。在另一方面，修饰TRV RNA基因组以去除假定的内含子样特征和潜在的问题区域，如长的富含胸腺嘧啶的序列。此修饰型TRV RNA1载体可用于在任何上述方法中替换含TRV RNA1的载体。

附图说明

图1：根据本发明的用于棉花瞬时表达的方法。瞬时表达可用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)或基因表达。

图2：用一个内含子插入进行TRV RNA1修饰的示意图。

图3A-3C：棉酚生物合成基因的沉默。图3A：用对照和psTRV2∶CAD感染的棉花植物的表型。图3B：使用从处理植物的上部叶提取的总RNA进行实时定量PCR。实时PCR分析显示CAD转录物水平在系统叶中显著降低。图3C：来自cad沉默的棉花叶的棉酚和相关倍半萜化合物的HPLC色谱。CK：载体对照感染的；CAD，来自杜松烯合酶表达沉默的植物中的叶子。叔丁基蒽醌被用作内标。

图4A-C：VIGS对一种叶绿素生物合成基因镁螯合酶CH42基因的影响和对胡萝卜素生物合成基因八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因的影响。将携带psTRV1或psTRV2(载体对照1+2(图4A)或核对物(check)(图4B)、psTRV2∶CH42(图2A和2B)、psTRV2∶PDS(图2A))的根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株的培养物以1∶1的比例混合。使混合培养物真空进入2-3叶龄植物期的陆地棉植物。图4A：在接种后(DPI)14天采集的棉花叶；图4B：棉花芽和45DPI采集的棉花叶。CH42酶负责在叶绿素生物合成期间将Mg加入卟啉环中。CH42基因的沉默阻碍了新生叶中叶绿素合成，这些新生叶丧失了它们的绿色，但因存在类胡萝卜素而显出黄色。图4C：定量RT-PCR分析，以确定在CH42处理的棉花新生叶中沉默的陆地棉CH42RNA水平，和在PDS处理的棉花新生叶中陆地棉PDS RNA水平。数值代表来自具有标准偏差的3个独立实验的平均值。实时PCR分析显示CH42和PDS转录物水平在系统叶中显著降低。

图5A-C：VIGS系统不但在四倍体棉花陆地棉中起作用，而且也在二倍体棉花亚洲棉(图A、图B)和草棉(图C)中起作用。

图6：预测的假定的棉花AS1(GhAS1)蛋白(SEQ ID NO：18)与拟南芥AS1(AtAS1(GenBank登录号：NM_129319；SEQ ID NO：19))、普通烟(Nicotiana tabacum)AS1(NtAS1(GenBank登录号：AY559043；SEQ IDNO：20))和小翠云(Selaginella kraussiana)ARP(SkARP(GenBank登录号：AY667452；SEQ ID NO：21))的氨基酸序列比较。格式为CLUSTALW产生的比对图，共有序列(SEQ ID NO：22)列在下方。在保守的R2R3MYB结构域下方划线。

图7A-7H：转录因子AS1的沉默。图7A-7D：psTRV2∶AS1感染的棉花植物的表型。图7F和7G：psTRV2∶AS1感染的棉花植物的扫描电镜图。图9H：使用从处理植物的上部叶提取的总RNA进行实时定量PCR。实时PCR分析显示AS1转录物水平在系统叶中显著降低。PB：主要叶片；EB：异位叶片；ebad：近轴的异位叶片；ebab：远轴的异位叶片。CK：受感染的载体对照；AS1，来自AS1表达沉默的植物的叶。

图8A-8C：psTRV2∶AGO1感染的棉花植物的表型。PB：主要叶片；EB：异位叶片。

图9A和9B：棉花叶中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。图9A：psTRV2∶ANS或sTRV2∶ANR感染的棉花植物的表型显示出对叶、叶柄和芽的影响。图9B：使用从处理植物的上部叶提取的总RNA进行实时定量PCR。实时PCR分析显示ANR和ANS转录物水平在系统叶中显著降低。CK：受感染的载体对照；ANR，来自ANR表达沉默的植物的叶；ANS，来自ANS表达沉默的植物的叶。

图10：棉花皮中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。

图11：不同棉花器官中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。

图12：棉花芽中花色素和原花色素生物合成基因ANS和ANR的沉默。

图13A-13N：在psTRV2∶AN处理的植物中，在棉花叶(图13A和13B)、花芽和花球(图13D、13F、13H、13J、13L和13N)中，以及在对照植物的棉花花芽和花球中(图13C、13E、13G、13I、13K和13M)，CtBP直系同源基因AN的沉默。

图14：CtBP直系同源基因AN在棉花胚珠和纤维中的沉默。CK：受感染的载体对照；ANR，来自AN表达沉默的植物的叶。

图15：棉花CtBP直系同源基因AN在棉花纤维起始中起重要作用。1+2：受感染的载体对照；AN，来自AN表达沉默的植物的叶。

图16A和16B：CtBP直系同源基因AN在棉花系统叶(图16A)和胚珠(图16B)中的沉默。实时PCR分析显示AN转录物水平在系统叶和胚珠中均显著降低。CK：受感染的载体对照；AN，来自AN表达沉默的植物的叶。

图17A-J：细胞骨架基因Katanin(KTN)在棉花中的沉默。图17A：载体对照处理的植物中的表型影响；图17B：psTRV2∶KTN处理的植物中的表型影响；图17D、17F、17H和17J：psTRV2∶KTN处理的植物的花芽和花球中的表型影响；图17C、17D、17G和17I：对照植物的花芽和花球中的表型影响。

图18：KTN是棉花纤维伸长的必需基因。

图19：KTN在叶毛状体长度和模式中起作用。

图20A-20E：psTRV2∶GFP感染的植物。图20A：空载体感染的植物的表型。图20B-20D：psTRV2∶GFP感染的植物的表型。图20E：psTRV2∶GFP感染的植物的蛋白印迹。上栏：用抗GFP抗体检测的GFP蛋白。下栏：用作为上样对照的考马斯亮蓝染色的rbcL带。栏1：空载体；栏2-4：psTRV2∶GFP进入的3种独立植物。

图21A和21B：棉花胚珠培养物。图21A：BT培养基中的2周龄培养物。图21B：体外胚珠培养物上的纤维长度。

图22A和22B：棉花中肌动蛋白基因表达。图22A：psTRV1+psTRV2处理的胚珠。全部胚珠能够很好地生长为纤维。图22B：psTRV1+psTRV2∶Actin 1处理的胚珠。虽然胚珠能够生长为纤维，但此纤维比对照纤维短。

图23A-23L：VIGS-GhActin1、VIGS-GhADF 1和psTRV1+psTRV2的胚珠表面的扫描电镜图。图23A-23D：在0(图23A)、1(图23B)和2(图23C、图23D)DPA时，psTRV1+psTRV2感染的胚珠，以及在感染后1(图23A、图23B、图23C)和2(图23D)天扫描的胚珠。注意到，纤维长度随时间增加。图23E-23H：在0(图23E)、1(图23F)和2(图23G、图23H)DPA时，psTRV1+psTRV2∶Actin 1感染的胚珠，以及在感染后1(图23E、图23F、图23G)和2(图23H)天扫描的胚珠。注意到纤维长度比在相同时期psTRv1+psTRV2中的纤维长度短，毛状体的表面粗糙且褶皱。图23I-23L：在0(图23I)、1(图23J)和2(图23K、图23L)DPA时，psTRV1+psTRV2∶GhADF 1感染的胚珠，以及在感染后1(图23I、图23J、图23K)和2(图23L)天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期psTRV1+psTRV2的纤维长度相同。

图24A-24C：VIGS-GhCTR 1、VIGS-GhDELLA 1和psTRV1+psTRV2的胚珠表面的扫描电镜图。图24A：在1DPA时psTRV1+psTRV2感染的胚珠和在感染后1天扫描的胚珠。图24B：在1DPA时psTRV1+psTRV2∶GhCTR 1感染的胚珠和在感染后1天扫描的胚珠。注意到纤维长度比相同时期sTRV1+sTRV2的纤维长度短。图24C：在1DPA时psTRV1+psTRV2∶GhDELLA 1感染的胚珠和在感染后1天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期psTRV1+psTRV2的纤维长度相同。

图25A-25C：VIGS-GhAlpha-tubulin 1、VIGS-GhBeta-tubulin 1和psTRV1+psTRV2的胚珠表面的扫描电镜图。图25A：在1DPA时psTRV1+psTRV2感染的胚珠和在感染后1天扫描的胚珠。图25B：在1DPA时psTRV1+psTRV2∶GhAlpha-tubulin1 DPA感染的胚珠和在感染后1天扫描的胚珠。注意到毛状体的表面粗糙且褶皱。图25C：在1DPA时psTRV1+psTRV2∶ADFGhBeta-tubulin 1感染的胚珠和在感染后1天扫描的胚珠。注意到毛状体的表面粗糙且褶皱。

图26A-26D：VIGS-GhMADS 9、VIGS-GhMBY5、VIGS-GhMBY6和psTRV1+psTRV2的胚珠表面的扫描电镜图。图26A：在1DPA时psTRV1+psTRV2感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。图26B：在1DPA时psTRV1+psTRV2∶GhMADS 9感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。注意到纤维长度比相同时期sTRV1+sTRV2的纤维长度长。图26C：在1DPA时psTRV1+psTRV2∶ADFGhMYB 5感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期psTRV1+psTRV2的纤维长度相同。图26D：在1 DPA时psTRV1+psTRV2∶ADFGhMYB 6感染的胚珠和在感染后3天扫描的胚珠。注意到纤维长度与相同时期sTRV1+sTRV2的纤维长度相同。

图27A和27B：棉花纤维中GhActin 1基因表达的RT-PCR分析。图27A：将作为RNA标准的微管蛋白基因用作对照。图27B：棉花纤维中GhActin 1基因表达。RT-PCR结果显示Actin 1的VIGS导致其mRNA表达显著降低。

图28：棉花纤维中VIGS-Actin 1的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhActin 1基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示Actin 1的VIGS导致其mRNA显著降低。

图29：棉花纤维中VIGS-ADF 1的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhADF 1基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示ADF 1的VIGS导致其mRNA显著降低。

图30：棉花纤维中VIGS-CTR 1的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhCTR 1基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示CTR 1的VIGS导致其mRNA显著降低。

图31：棉花纤维中VIGS-DELLA 1的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhDELLA 1基因表达的相对值以GhTubulin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示DELLA 1的VIGS导致其mRNA显著降低。

图32：棉花纤维中VIGS-GhAlpha-tubulin 1的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhAlpha-tubulin 1基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhAlphy-tubulin 1的VIGS导致其mRNA显著降低。

图33：棉花纤维中VIGS-GhBeta-tubulin 1的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhBeta-tubulin 1基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhBeta-tubulin 1的VIGS导致其mRNA显著降低。

图34：棉花纤维中VIGS-GhMADS 9的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhMADS 9基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhMADS 9的VIGS导致其mRNA显著降低。

图35：棉花纤维中VIGS-GhMYB 5的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhMYB 5基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhMYB 5的VIGS导致其mRNA显著降低。

图36：棉花纤维中VIGS-GhMYB 6的实时RT-PCR分析。感染后14天纤维中GhMYB 6基因表达的相对值以GhUbiquitin表达活性的百分数显示(参见材料和方法实施例12)。实时PCR结果显示GhMYB 6的VIGS导致其mRNA显著降低。

图37显示psTRV2001的图谱。sTRV2的序列从6785位核苷酸延伸至9696位核苷酸，如SEQ ID NO：82所示。

具体实施方式

病毒诱导的基因沉默(VIGS)(Ruiz et al.，1998；Burch-Smith et al.，2004)系统为在无需对植物进行遗传转化下确定基因产物的生物学功能提供了可能性。RNA和DNA病毒均诱导导致病毒相关siRNA产生的RNA沉默(Baulcombe，2004)。可构建携带插入的候选植物基因部分序列的重组病毒。此重组病毒可在整个植物中系统地移动，产生可介导内源候选基因转录物降解的siRNA(Brigneti et al.，2004；Burch-Smith et al.，2004)，导致接种植物中候选基因表达的沉默。

VIGS方法提供了若干机会：

(1)基因/基因家族敲减的有效反向遗传学工具；

(2)快速且高通量(Nasir et al.，2005)--全基因组ORF敲除少于1个月；

(3)瞬时、可逆的和所谓“可诱导的”敲除表型(Burch-Smith et al.，2004)；和

(4)适用于沉默的不同器官为通过不同感染方法在根(Valentine et al.，2004)、花(Liu et al.，2004)、叶(Liu et al.，2002)或果实(Fu et al.，2005)中敲除基因提供了机会。

烟草脆裂病毒(TRV)为双向的正链有义RNA病毒。TRV RNA1编码来自基因组RNA的134kDa和194kDa复制酶蛋白，来自亚基因组RNA的29-kDa移动蛋白和16-kDa富含半胱氨酸的蛋白。TRV RNA2编码来自基因组RNA的衣壳蛋白和来自亚基因组RNA的两种非结构蛋白。TRV RNA1可在没有RNA2下复制并系统地移动。在TRV RNA2cDNA构建体中，将非结构基因用多克隆位点(MCS)替换，此多克隆位点用于克隆VIGS中靶基因序列(MacFarlane and Popovich，2000)。

TRV VIGS系统已成功地用在一些植物中，如拟南芥(Burch-Smith et al.，2006)、辣椒(Capsicum annuum)(Chung et al.，2004)、番茄(Lycopersiconesculentum)(Liu et al.，2002)、矮牵牛(Petunia hybrida)(Chen et al.，2005)和马铃薯(Solanum tuberosum)(Brigneti et al.，2004)。这些植物中大多数已经实验证明是对一些TRV株敏感的宿主(Plant Virus Online，http colon backslashbackslash image dot fs dot uidaho dot edu backslash vide backslash descr808dot htm)。更重要地是，无法合理地预期此TRV VIGS系统在全部植物中必然起作用。例如，Dinesh Kumar et al.(2007)中说明了TRV VIGS系统可能起作用的植物列表。然而，此TRV VIGS系统无法在花生(Arachis hypogaea)和大豆(Glycine max)中起作用，因为尽管它们包含在Dinesh Kumar et al.(2007)的列表中，但仍不是TRV的宿主。事实上，如本文所述，TRV VIGS系统不在Dinesh Kumar et al.(2007)或在线病毒数据库中所列对烟草脆裂病毒(TRV)敏感的全部植物中起作用。而且，系统感染是待用于功能性基因分析的TRV VIGS系统所需的。一些植物局部地而非系统地对TRV敏感，因此TRV VIGS系统可在这些植物中起作用。在本发明前，尚不知道在包括棉花植物(棉属)的锦葵目中的植物是TRV的宿主或在一定程度上对TRV局部或系统地敏感。在筛选许多病毒载体后，发现棉花对TRV敏感且TRVVIGS系统可用在棉花中，因此，此发现是无法预期的。本发明的不可预期性进一步通过以下证实，即TRV VIGS系统无法在对TRV敏感或作为TRV宿主植物列出的全部植物中起作用。

一方面，本发明提供了用于在棉花中进行VIGS的高效和可再生的系统以及方法。在一个实施方式中，本发明提供了TRV全病毒基因组的进一步再合成。在另一实施方式中，本发明表明这些载体具有与原始载体类似的效率。在另一实施方式中，本发明提供了TRV VIGS系统在克隆和功能性鉴定棉花基因中的应用。根据此方面，瞬时表达载体包含TRV RNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，以及任选存在地包含第一感兴趣的序列的核酸。在一个实施方式中，亚基因组启动子能够被TRV复制酶识别。在另一实施方式中，亚基因组启动子为强衣壳蛋白亚基因组启动子。在进一步的实施方式中，亚基因组启动子源自烟草脆裂病毒组，而非TRV。在一个实施方式中，亚基因组启动子为合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子。在另一实施方式中，亚基因组启动子为辣椒环斑病毒(PepRSV)衣壳蛋白亚基因组启动子。用于在棉花中瞬时表达的感兴趣的核酸插入在亚基因组启动子的下游，且可操纵地连接于此启动子。此载体可用于在棉花植物中瞬时表达感兴趣的核酸。在另一实施方式中，本发明提供了其中内含子已插入TRV RNA1序列的修饰型TRV RNA1载体。

因此，一方面，本发明提供了在棉花中进行病毒诱导的基因沉默(VIGS)的方法。根据本发明，所述方法包括：

在一个实施方式中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNA1的载体为合成的植物载体。本文所示的结果和表型数据表明合成的TRV-VIGS系统可有效地用作TRV-VIGS系统，以诱导所需内源棉花基因的沉默。在另一实施方式中，TRV RNA2包含能够沉默第一目标基因的第一沉默序列。在一个实施方式中，第一沉默序列为目标基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为目标基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNA干扰(RNAi)的短发夹RNA(shRNA)。在另一实施方式中，第一沉默序列为编码能够对第一目标基因进行RNAi的前体微小RNA(miRNA)或miRNA的序列。在另一实施方式中，核酸进一步包含能够沉默第二目标基因的第二沉默序列。在另一实施方式中，核酸包含能够沉默大于两个目标基因的大于两种沉默序列。

在一个实施方式中，目标基因为候选转录因子基因。在另一实施方式中，目标基因为叶绿素或类胡萝卜素生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为类黄酮生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为原花色素或花色素生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为smRNA生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为植物激素信号途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为与非生物和生物胁迫抗性有关的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为脂肪酸生物合成中的候选基因，如硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶(SAD)基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因，如与细胞伸长、细胞壁生物合成和纤维素生物合成相关的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为相关棉花毛状体中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为次级代谢生物合成中的候选基因。本文所示的结果表明本发明的VIGS系统可有效地抑制靶宿主基因，且可作为快速的手段来测定候选基因的功能，以及研究诸如转录因子基因等调节基因的功能，或参与小RNA生物合成途径的基因的功能。本文所述的VIGS测定提供了在同源系统中检测棉花基因序列功能的手段。使用标准化的cDNA文库，可以通过本发明的VIGS系统进行基因功能的大规模筛选。

宿主植物可为陆地棉(四倍体)，但如本文所述，本发明不限于此物种。因此，宿主植物也可为海岛棉(四倍体)、亚洲棉(二倍体)和草棉(二倍体)，以及其它天然棉属物种，和全部商购棉花变种和种质，包括源自种内和种间杂交的种质。

第二方面，本发明提供了在棉花中分析基因功能的方法。根据本发明，所述方法包括：

(a)将包含待沉默候选基因的沉默序列的核酸插入包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型TRV RNA2载体；

分析所沉默的候选基因对受感染的植物组织的表型影响。

在一个实施方式中，目标基因为候选转录因子基因。在另一实施方式中，目标基因为smRNA生物合成中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为原花色素和花色素生物合成途径中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因为棉花纤维起始、伸长、次生壁沉积、成熟或种子发育中的候选基因。在另一实施方式中，目标基因如上所述。本文所示的结果表明本发明的VIGS系统可有效地抑制靶宿主基因，且可作为快速的手段来测定候选基因的功能，以及研究诸如转录因子基因等调节基因的功能，或参与小RNA生物合成途径的基因的功能。本文所述的VIGS测定提供了在同源系统中检测棉花基因序列功能的手段。使用标准化的cDNA文库，可以通过本发明的VIGS系统进行基因功能的大规模筛选。

一旦一种或多种棉花基因的功能被表征，可使用常规技术制备转基因植物以改变一种或多种基因的表达模式。或者，如本文所述可制备瞬时表达一种或多种基因的植物。

插入棉属植物的DNA(感兴趣的DNA)对转化过程不是至关重要的。通常，被引入植物的DNA是构建体的一部分。DNA可为感兴趣的基因，如蛋白的编码序列，或其可为能够调节基因表达的序列，如反义序列、有义抑制序列、shRNA、前体miRNA或miRNA序列。构建体通常包括与感兴趣DNA的5’端和/或感兴趣DNA的3’端可操纵连接的调节区域。本文中也将包含全部这些元件的盒称为表达盒。在表达盒构建体中，表达盒可额外地包含5’引导序列。调节区域(即启动子、转录调节区域和翻译终止区域)和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是天然/同源的。或者，调节区域和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是异源的。参见美国专利7,205,453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616。表达盒可额外地包含可选择的标记基因。参见美国专利7,205,453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616。

通常，表达盒将包括用于选择转化细胞的可选择的标记基因。使用可选择的标记基因来选择转化的细胞或组织。通常，植物可选择的标记基因将编码抗生素抗性，适合的基因包括以下至少一组：编码抗生素大观霉素的基因、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或aphiv)基因、乙酰乳酸合酶(als)基因。或者，植物可选择的标记基因将编码除草剂抗性，如对磺酰脲类除草剂、草铵膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸盐(2，4-D)的抗性，包括编码有此除草剂抗性的基因，所述除草剂对谷氨酰胺合酶起抑制作用，如草胺膦或basta(如bar基因)。参见WO 02/36782、美国专利7,205,453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616，和本文援引加入的那些文献。可选择的标记基因的此列表不意在限制。可使用任何可选择的标记基因。

大量启动子可用在本发明的实施中。可基于所需结果选择启动子。也就是说，核酸可与组成型的启动子、组织优选的启动子或用于在感兴趣的宿主细胞中表达的其它启动子组合。此类组成型的启动子包括，例如Rsyn7的核启动子(WO 99/48338和美国专利6,072,050)；核CaMV35S启动子(Odellet al.，1985)；大米肌动蛋白(McElroy et al.，1990)；泛素(Christensen and Quail，1989，和Christensen et al.，1992)；pEMU(Last et al.，1991)；MAS(Velten et al.，1984)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其它组成型的启动子包括例如美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463和5,608,142中描述的那些。

其它启动子包括诱导型启动子，特别是病原体诱导型启动子。此类启动子包括来自通过病原体感染诱导的病理相关蛋白(PR蛋白)，如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。其它启动子包括在病原体感染位点处或附近表达的那些。在另一实施方式中，启动子可为损伤诱导型启动子。在其它实施方式中，通过应用外源性化学调节剂，可用化学调节的启动子来调控植物中的基因表达。启动子可为应用化学品诱导基因表达的化学诱导型启动子，或应用化学品抑制基因表达的化学抑制型启动子。此外，可使用组织优选的启动子来靶向提高特定植物组织内部感兴趣的多核苷酸的表达。这些启动子分别描述于美国专利6,506,962、6,575,814、6,972,349和7,301,069以及美国专利申请公开文本2007/0061917和2007/0143880。

适合时，可最佳化感兴趣的DNA以提高在转化植物中的表达。也就是说，可使用植物优选的密码子来合成编码序列以改进表达。本领域中可获得合成植物优选的基因的方法。参见如美国专利5,380,831、5,436,391和7,205,453，以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616。

在植物中使用dsRNA进行基因沉默以及设计用于基因沉默的siRNA或shRNA分子是本领域熟知的。参见例如美国专利申请公开文本2004/0192626、2004/0203145、2005/0026278、2005/0186586、2005/0244858、2006/0212950、2007/0259827、2007/0265220、2007/0269815、20080269474和2008/0318896。在植物中使用miRNA进行基因沉默以及设计用于基因沉默的前体miRNA或miRNA分子是本领域熟知的。参见例如美国专利申请公开文本2006/0130176、2006/0218673、2007/0083947、2007/0130653、2007/0154896和2008/0313773。

在某些实施方式中，本发明还提供了从本发明的转基因植物获得的植物产物。术语“植物产物”意在包括可从特定植物获得的任何物，例如，果实、种子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蜡、蛋白、脂类、脂肪酸、维生素、全部或部分的植物组织(例如，根、叶、茎、花、棉桃、果实、皮)、细胞、细胞悬液、块茎和匍匐茎。

在另一方面，本发明提供了用于在棉花植物中瞬时表达基因的瞬时表达载体和方法。根据此方面，瞬时表达载体包含TRV RNA2序列和至少一个拷贝的强亚基因组启动子，以及任选存在地包含第一感兴趣的序列的核酸。在一个实施方式中，亚基因组启动子能够被TRV复制酶识别。在另一实施方式中，亚基因组启动子为强衣壳蛋白亚基因组启动子。在进一步的实施方式中，亚基因组启动子源自烟草脆裂病毒组，而非TRV。在一个实施方式中，亚基因组启动子为合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子。在另一实施方式中，亚基因组启动子为辣椒环斑病毒(PepRSV)衣壳蛋白亚基因组启动子。用于在棉花中瞬时表达的感兴趣的核酸插入在亚基因组启动子的下游，且可操纵地连接于此启动子。在另一实施方式中，核酸包含在棉花植物中分别待表达的两种或更多种感兴趣的序列。在另一实施方式中，载体包含两种或更多种核酸，每一核酸包含待在棉花植物中表达的感兴趣的序列，且每一核酸可操纵地连接于亚基因组启动子的单独拷贝。

在棉属植物中待瞬时表达的感兴趣的序列对本发明的瞬时表达方法不是至关重要的。感兴趣的序列可为感兴趣的基因，例如蛋白的编码序列，或其可为能够调节基因表达的序列，如反义序列、有义抑制序列或微小RNA(miRNA)序列。感兴趣的序列除了包括亚基因组启动子外，还通常包括调节区域，所述调节区域可操纵地连接于感兴趣序列的5’端和/或感兴趣序列的3’端。在瞬时表达盒中，感兴趣的序列可额外地包含5’引导序列。调节区域(即转录调节区域和翻译终止区域)和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是天然/同源的。或者，调节区域和/或编码信号锚的多核苷酸与宿主细胞之间或彼此之间是异源的。参见美国专利7,205,453以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616。

适合时，可最佳化感兴趣的序列以提高在植物中的瞬时表达。也就是说，可使用植物优选的密码子来合成编码序列以改进表达。本领域中可获得合成植物优选的基因的方法。参见如美国专利5,380,831、5,436,391和7,205,453，以及美国专利申请公开文本2006/0218670和2006/0248616。

在一个实施方式中，感兴趣的序列为(a)在棉花中待表达的基因的编码序列，如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫毒素蛋白(BT)和Flower locusT(FT)基因，以缩短开花时间；或(b)待下调的基因的序列，如候选转录因子基因、smRNA生物合成中的候选基因、植物激素信号途径中的候选基因、与非生物和生物胁迫抗性有关的候选基因、脂肪酸生物合成中的候选基因、棉花纤维发育中的候选基因、相关棉花毛状体中的候选基因和次级代谢生物合成中的候选基因。

(a)将包含待在棉花植物中表达的第一感兴趣的序列的核酸插入瞬时表达载体中，以产生TRV RNA2表达载体，所述瞬时表达载体包含烟草脆裂病毒(TRV)RNA2序列和至少一个拷贝的亚基因组启动子，其中所述核酸可操纵地连接于所述亚基因组启动子；

(c)将农杆菌的混合培养物引入棉花的植物组织；和

(d)使受感染的植物组织生长足够的时间，以瞬时表达目标基因。

在此方面的一个实施方式中，植物组织为棉花幼苗。在此方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花胚珠。在此方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花植物。在此方面的另一个实施方式中，植物组织为棉花纤维。在更进一步的实施方式中，棉花植物或幼苗被感染，且病毒在棉花组织中传播，使得VIGS在受感染的棉花植物或幼苗的全部组织中发生。

在一个实施方式中，包含TRV RNA2的载体和包含TRV RNA1的载体为合成的植物载体。在另一个实施方式中，第一感兴趣的序列为基因的有义链的序列。在另一实施方式中，第一感兴趣的序列为基因的反义链的序列。在另一实施方式中，第一序列编码前体miRNA或miRNA。如本文所示，本发明的瞬时表达载体可用于在棉花植物中快速地瞬时表达感兴趣的核酸。在另一实施方式中，核酸进一步包含待在棉花植物中表达的感兴趣的第二序列。在另一实施方式中，核酸包含待在棉花植物中表达的多于两种的感兴趣的序列。在另一实施方式中，两种或更多种核酸被插入瞬时表达载体中。在此实施方式中，每一核酸包含感兴趣的序列，且每一核酸可操纵地连接于亚基因组启动子的单独拷贝。两种或更多种核酸中的感兴趣的序列可以相同或不同。感兴趣的序列包括上述那些。

在某些实施方式中，本发明还提供了从本发明的瞬时表达植物获得的植物产物。术语植物产物摂意在包括可从特定植物获得的任何物，例如，果实、种子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蜡、蛋白、脂类、脂肪酸、维生素、全部或部分的植物组织(例如，根、叶、茎、花、棉桃、果实、皮)、细胞、细胞悬液、块茎和匍匐茎。

在另一方面，本发明提供了修饰型TRV RNA1载体，其具有改进的转录起始。有很多原因会引起RNA病毒载体的转录起始困难。首先是可能被RNA加工工具错误识别的非最佳化的基因组序列，如嵌在RNA基因组中的隐蔽剪接位点和富含胸腺嘧啶的假定的内含子序列。其次，TRV RNA1病毒载体编码约7.0Kb核苷酸的极大的转录物，其大小是平均植物基因大小(1-2Kb)的约3-4倍。实际上，植物基因通常包含促进来自细胞核的前mRNA加工和输出的大量内含子。在基于农杆菌渗入法(agroinfiltration)的VIGS和瞬时表达系统中，没有内含子序列，在来自病毒构建体的植物细胞核中产生的前mRNA转录物无法被有效地识别或适当地加工。

根据此方面，修饰型TRV RNA1载体包含已插入至少一个内含子的TRV RNA1序列。可插入另外的内含子以使病毒转录物更容易地被宿主细胞核前mRNA加工和输出工具识别，以此增加能发生病毒复制的植物细胞的百分数，以及增加能起始感染的效率。理论上，可使用任何植物内含子。在一个实施方式中，内含子的大小为约100核苷酸至约400核苷酸。在另一个实施方式中，内含子源自拟南芥。内含子插入位点可为TRV1基因组的共有AG/GT序列，或为匹配此共有序列而已通过沉默核苷酸取代来突变的序列。此修饰型TRV RNA1载体可用于在任何上述方法中替换含TRVRNA1的载体。

除非另有说明，本发明的实施应用本领域技术人员知晓的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术。

参见，例如Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Ausubel et al.，1992)，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley &Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecular biology of plants：a laboratory coursemanual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)；Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Guthrie and Fink，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology(Academic Press，New York，1991)；Harlow and Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；NucleicAcid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；thetreatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Methods InEnzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Fire et al.，RNA InterferenceTechnology：From Basic Science to Drug Development，Cambridge UniversityPress，Cambridge，2005；Schepers，RNA Interference in Practice，Wiley-VCH，2005；Engelke，RNA Interference(RNAi)：The Nuts & Bolts of siRNATechnology，DNA Press，2003；Gott，RNA Interference，Editing，andModification：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)，HumanPress，Totowa，NJ，2004；Sohail，Gene Silencing by RNA Interference：Technology and Application，CRC，2004。

实施例

本发明通过参考以下实施例来描述，这些实施例以说明的方式提供且不意在以任何方式限制本发明。使用本领域熟知的标准技术或以下具体描述的技术。

实施例1：实施例2-6的实验方法

棉花幼苗：棉花种子在温室中繁殖并发芽。将带有2-3片真正叶子的4至14日龄幼苗用于VIGS测定。仅具有子叶的更年幼幼苗也可用于VIGS测定。

合成的TRV RNA1表达载体：合成的TRV1载体全长(7756bp)序列包括：SphI位点、T-DNA右边界序列(152bp)、复制的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S增强子区域(752bp)(Shi et al.，1997)、TRV Ppk20株RNA1(6791bp)、地下三叶草斑驳病毒卫星RNA核酶序列(46bp)和SmaI位点序列。此全长序列被内源性SalI位点分为两部分。这两部分单独合成，并被克隆入pGH载体以得到两个载体pGH-YeJ-V1-1和pGH-YeJ-V1-2。合成的TRV RNA1片段V1-1(通过SphI和SalI酶处理从pGH-YeJ-V1-1释放)和V1-2(通过SalI和SmaI酶处理从pGH-YeJ-V1-2释放)与用SphI和EcoICRI酶处理的pBI121(GenBank登录号：AF485783)载体连接。新合成的TRV RNA1载体被称为psTRV1001(本文也称作psTRV1)。合成的psTRV1001的序列在SEQ IDNO：1中示出。合成的TRV RNA1序列与公开的TRV RNA1序列相同。

合成的TRV RNA2表达载体：合成的TRV2载体全长(2915bp)序列包括：HindIII位点、复制的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S增强子区域(752bp)(Shi etal.，1997)、TRV株ppk20RNA25′-序列(1639bp)、多克隆位点(61bp)、TRV株ppk20 RNA2 3′-序列(396bp)和HpaI位点。合成此全长序列，并克隆入pGH载体以得到pGH-YeJ-V2。将合成的TRV RNA2片段V2通过HindIII和HpaI位点连接入pCAMBIA0390(GenBank登录号：AF234291)。新合成的TRVRNA2载体被称为psTRV2001(本文也称作psTRV2)。合成的sTRV2的序列在SEQ ID NO：2中示出。合成的TRV RNA2序列与公开的TRV RNA2序列相同。合成的psTRV2001的序列在SEQ ID NO：82中示出。

合成的TRV瞬时表达载体：为了构建瞬时表达载体psTRV2100，将合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子(237bp，SEQ ID NO：3)多核苷酸插入psTRV2001载体的多克隆位点中，此多核苷酸包括在其5′末端的EcoRI位点和其3′末端的NcoI位点。将绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pK20GFPc用引物GFP-F(5’-TTATAGGTACCATGGCTAGCAAAGGAGAAGAAC-3’(SEQ ID NO：25))和GFP-R(5’-CCTAAGAGCTCTTAATCCATGCCATGTGTAATC CC-3’(SEQ ID NO：26)进行PCR扩增，并将GFP基因插入psTRV2100的NcoI和BamHI位点中。此载体称为psTRV2∶GFP。

修饰型sTRV1载体：使用基于PCR的策略将来自拟南芥actin1(内含子2，GenBank登录号U27981，位置1957-2111bp)的植物内含子引入TRVRNA1基因组中。三个片段基于三对引物来扩增：用于F1的F1P5和F1P3、用于F2的F2P5和F2P3、和用于F3的F3P5和F3P3。这些引物对的序列在表1中示出。引物相对于此内含子的位置显示在图2中。在第二轮PCR扩增中，通过使用F1P5和F3P3的重叠PCR得到更长的DNA片段。将PCR产物进一步用EcoRI和XbaI消化，并插入psTRV1001载体中。含内含子的psTRV1被称为psTRV1001-内含子(本文也称作psTRV1-内含子)。插入的内含子的序列为gtaagtacatttccataacgttccatcgtcattgattcttcattagtatgcgtttatgaagctttttcaatttaattctctttggtagatcttaagattcctctgtttcttgcaaaataaagggttcaattatgctaatattttttatatcaattttgacag(SEQ ID NO：27)。

表1：用于内含子合成的基因引物

引物	序列(5’→3’)	SEQ ID NO：	psTRV1001中的位置
				F1P5	cctgaattcaatatcgtgtttaaagacg	4	10764-10791
F1P3	ataattctagagggggactgtttctggtggcatg	5
				F2P5	cgttttgggtaactagaggtaagtacatttccataacgttcc	6
F2P3	aatgaatccttttctcacctgtcaaaattgatataaaaaata	7
				F3P5	ttatatcaattttgacaggtgagaaaaggattcattcctgttg	8
F3P3	cctacatgtacaaccctgatatgtatt	9	11115-11141

基因克隆和VIGS载体克隆：对来自陆地棉叶样品的cDNA产物进行PCR以扩增候选基因，并将其克隆到合成载体psTRV2001的XbaI和BamHI位点中。基因克隆中所用的引物在表2中示出，表2中也包括所克隆基因序列的参照。

表2：基因引物和基因序列

农杆菌渗入法：将合成的psTRV载体和它们的衍生物通过电穿孔引入农杆菌株AGL1。3ml培养物在50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平以及28℃下生长24小时。1天后，将培养物接种入含50mg/L卡那霉素、10mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)和20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)的LB培养基中，并在28℃摇床中过夜生长。农杆菌细胞通过离心收集，并重悬浮于MMA溶液(10mM MES、10mM MgCl₂、200μM乙酰丁香酮)至最终OD₆₀₀为1.5。将农杆菌悬液在室温下静置3-4小时。在渗入前，将包含pTRV1/psTRV1或pTRV2/psTRV2载体的农杆菌培养物以1∶1的比例混合。通过注射器渗入或真空渗入将培养物渗入棉花植物中。对于注射器渗入，使用1ml无针头注射器将农杆菌接种物送入2或3片最新展开叶的下侧。对于真空渗入，将全部植物浸入农杆菌接种物并持续经历80-90kPa真空5分钟，随后快速解除真空，以使接种物迅速进入植物组织。下述全部数据通过真空渗入获得。然而，也可使用注射器渗入，但注射器渗入比真空渗入更耗时。通过真空渗入获得的沉默效果优于通过注射器渗入获得的沉默效果。在渗入后，多余的农杆菌细胞悬液被用于浸润所渗入植物的根系统。所渗入植物在16小时光照/8小时黑暗的光周期循环下，在25℃生长室中生长。相同方法也用于测试在假定宿主植物中进行VIGS的实验。

棉酚和相关萜类化合物的高效液相色谱测定：棉籽和其它组织中的棉酚和相关萜类化合物的水平通过使用下述基于HPLC的方法测定。将100mg新鲜棉花叶样品用研钵和杵在液氮中匀浆，并将1ml溶剂1(乙腈∶水∶磷酸乙酸＝80∶20∶0.1(V/V/V)，pH＝2.8-2.9)加入样品中。将植物组织进一步通过MIXER MILL MM300(Qiagen，Germany)破碎。将悬液以3000g离心10分钟。将50μl提取物部分在安装有微注射器的Agilent 1200HPLC系统上进行分析。将样品以恒溶剂强度由保持在40℃的Synergi 4μmFusion-RP 80A(Phenomenx)柱洗脱。流动相为乙醇∶甲醇∶异丙醇∶乙腈∶水∶乙酸乙酯∶二甲基甲酰胺∶磷酸＝16.7∶4.6∶12.1∶20.2∶37.4∶3.8∶5.1∶0.1(Stipanovicet al.，1988)。溶剂流速为1.0mL min^-1，总运行时间为45分钟。信号在272nm下监测。数据收集和分析在Agilent Chemstation软件上进行。使用叔丁基蒽醌作为内标。

GFP显像和荧光定量分析。为了在叶片和整株植物上可视地监测GFP荧光，使用手持式100W长波UV灯(UV Products，Upland，CA)，且使用安装有UV和Kenko黄色透镜(Tokyo，Japan)的Nikon Coolpix 995数码相机(Tokyo，Japan)拍摄荧光图像。

抗体和蛋白质凝胶印迹分析：总植物蛋白通过12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将抗GFP蛋白的鼠单克隆IgG用作一抗。将ECL过氧化物酶缀合的驴抗兔IgG用作二抗。使用ECL蛋白印迹检测试剂(GEhealthcare)来观察免疫反应性条带。将考马斯亮蓝染色的rbcL条带用作上样对照。

扫描电镜(SEM)。将新鲜叶用带子固定在样品室的内侧，随后用液氮冷冻。使用SEM(JSM-6360LV，JEOL，USA)收集图像。

RNA提取和分析。将100mg叶组织在液氮中研磨，并用植物RNA纯化试剂(Invitrogen)提取。RNA浓度使用Nanodrop(Thermo，USA)测定。将M-MLV逆转录酶(Promega，USA)用于逆转录反应。实时PCR使用PowerSYBRGreen PCR Master(Applied Biosystems，USA)，并使用表3所示的基因特异性引物在ABI7900HT中进行。全部样品一式三份进行，且数据在预设的Ct值(Applied Biosystems，USA)下用RQ管理工具分析。Jatropha rbcLmRNA用作内标。分析中包括的Ct值是基于3个生物平行测定，对每个生物样品进行三个技术平行测定。标准偏差基于3个生物平行测定来计算。

表3：基因特异性实时PCR分析中所用的引物。

实施例2：在棉花中开发VIGS系统，使用参与萜类化合物生物合成的基因作为标记基因

此实施例描述了棉花中基于烟草脆裂病毒(TRV)的载体的构建和其在基因沉默中的应用。当携带来自宿主基因序列的重组病毒感染植物时，病毒诱导的基因沉默(VIGS)开始。与VIGS载体中插入物具有序列同源性的内源性基因转录物通过转录后基因沉默机制(PTGS)来降解(Baulcombe，2004)。

棉酚和相关萜类化合物存在于叶腺体(the glands of foliage)、花器官和棉桃以及根等整个棉花植物中。棉酚和其它相关倍半萜化合物源自(+)-δ-杜松烯。在棉花中评价TRV VIGS克隆对抑制cad基因表达的基因抑制效率。δ-杜松烯合酶基因编码的酶负责参与法尼基二磷酸酯向(+)-δ-杜松烯环化的第一关键步骤。当此基因被沉默时，棉酚和其它倍半萜化合物的生物合成将被全部干扰。Sunilkumar et al.(2006)已经成功使用cad基因RNAi通过稳定转化来干扰棉花种子中的棉酚生物合成。此外，诱导这些萜类化合物以应答微生物感染。这些化合物保护植物免受昆虫和病原菌侵扰。

为了研究cad在棉花害虫抗性和发育功能中的作用，首先基于全长cDNA序列(GenBank登录号：AY800106)，使用引物(SEQ ID NO：10和11)通过PCR克隆了棉花cad(SEQ ID NO：16)，并将其插入psTRV2载体以得到psTRV2∶CAD。使用真空渗入，将包含psTRV1和psTRV2∶CAD载体的农杆菌培养物的混合物渗入棉花植物中。

在感染后(dpi)14天，受感染棉花植物的茎变为褐色且变脆，叶子开始枯萎。在psTRV2∶CAD处理植物的上部叶中没有明显的表型(图3A)。在25dpi时，褐色坏死和枯萎在大多数psTRV2∶CAD植物皮中可见，然而在仅载体对照植物中未见明显的表型(图3A)。在35dpi(25/30植物死亡)后，大多数psTRV2∶CAD植物死亡，这说明棉花中的VIGS以强力且可靠的方式发挥高效的作用。

使用从受处理植物的叶中提取的总RNA来进行实时定量PCR，以在分子水平上确认CAD基因的VIGS，结果显示在图3B中。在psTRV2∶CAD感染植物的上部叶中CAD RNA的积累远低于空sTRV2载体感染的植物，在CAD处理的植物中仅剩余0.2％的CAD RNA。

使用高效液相色谱(HPLC)来检验来自对照和沉默的植物叶的棉酚和相关倍半萜化合物。棉酚对空气氧化很敏感，且易于在醇溶液中形成缩醛，因此我们改进了提取和分析方法(具体参见实施例1)以得到正确和可重复的结果。正如所预期的，HPLC数据显示棉酚和相关倍半萜化合物水平几乎降低至0，而对照植物的这些化合物保持了高水平(图3C)。

CAD沉默植物中的这些结果和表型数据说明合成的sTRV VIGS系统可用于以强力且可靠的方式高效诱导目标内源性棉花基因的沉默。

目前，棉花全基因组测序刚刚开始。同时，不断增加的棉属EST序列(目前约400,000个)组和源自在一系列生长条件下由各种组织和器官构建的不同文库的非冗余基因的组可在网络上获得。这些表达序列标签(EST)为棉花的功能基因组学研究提供了大量信息。因此，本文所述的VIGS测定提供了在同源系统中检测棉花基因序列功能的手段。使用标准化的cDNA文库，可以通过基于VIGS系统的sTRV进行基因功能的大规模筛选。

实施例3：在棉花中开发VIGS系统，使用CH42和PDS作为标记基因

此实施例描述了棉花中基于其它烟草脆裂病毒(TRV)的载体的构建和其在病毒诱导的基因沉默中的应用。

我们测定了合成的TRV(sTRV)克隆在陆地棉中抑制CH42基因表达的基因沉默效率。CH42基因编码的酶负责在叶绿素生物合成期间将镁加入卟啉环中。当此基因被沉默时，叶绿素合成被阻断，因此叶丧失了它们的绿色，但因存在类胡萝卜素而显出黄色。

为了从陆地棉中扩增CH42同源物，假定的EST序列通过使用拟南芥CH42基因(NM 117962)作为GenBank全EST序列BLAST的种子序列来鉴定。在棉花中鉴定出一个编码假定的CH42蛋白的EST。设计PCR引物(SEQID NO：54和55)以通过PCR扩增陆地棉的653-bp CH42cDNA，且将CH42片段(SEQ ID NO：76)插入psTRV2MCS位点以得到psTRV2∶CH42。CH42的序列通过测序确认。

将携带psTRV1的农杆菌培养物与携带psTRV2∶CH42或psTRV2载体对照的农杆菌培养物混合。将混合培养物真空渗入具有2-3片真正叶子的陆地棉植物中(具体参见实施例1)。检验所处理植物的上部叶或生殖器官花芽的沉默效果(图4A和4B)。在几乎全部处理植物中，观察到靶基因在整株植物中的均匀沉默，这有助于使用VIGS进行高通量研究和快速分析，因为这允许简易取样和收集重复数据。使用从不同sTRV载体处理的植物中提取的总RNA来进行实时定量PCR，以在分子水平上确认CH42基因的VIGS，结果显示在图4C中。在psTRV2∶CH42感染植物的上部叶中CH42RNA的积累远低于空psTRV2载体感染的植物，在CH42处理的植物中仅剩余0.2％的CH42RNA。

我们进一步选择，以沉默另一种标记基因八氢番茄红素去饱和酶(PDS)，此基因编码参与类胡萝卜素生物合成的关键酶。PDS基因的沉默将抑制类胡萝卜素生物合成，这导致叶绿素在高光强度下的光氧化和破坏，引起光褪色的叶子。

为了从陆地棉中扩增PDS同源物，假定的EST序列通过使用拟南芥PDS基因(AY 057669)序列在GenBank全EST序列中进行BLAST来鉴定。在棉花中鉴定出一个编码假定的PDS蛋白的EST。设计PCR引物(SEQ IDNO：56和57)以通过PCR扩增陆地棉的479-bp PDS cDNA，且将PDS片段(SEQ ID NO：77)插入sTRV2MCS位点以得到psTRV2∶PDS。PDS的序列通过测序确认。将携带psTRV1的农杆菌培养物与携带psTRV2∶PDS或载体对照的农杆菌培养物混合。将混合培养物真空渗入具有2-3片真正叶子的陆地棉植物中。检验所处理植物的上部叶的沉默效果(图4A)。使用从不同sTRV载体处理的植物中提取的总RNA来进行实时定量PCR，以在分子水平上确认PDS基因的VIGS，结果显示在图4C中。在psTRV∶PDS感染植物的上部叶中PDS RNA的积累远低于空sTRV载体感染的植物，在PDS处理的植物中仅剩余10％的PDS RNA。

实施例4：在其它棉花种质中证实VIGS系统

棉花属包括约45个二倍体(2n＝2x＝26)和5个四倍体(2n＝4x＝52)的物种，它们全部显示出二体遗传模式。尽管也在一定程度上使用其它三种物种，海岛棉(四倍体)、亚洲棉(二倍体)和草棉(二倍体)，但最普遍的棉花变种是陆地棉(陆地棉，四倍体)的形式，其占世界范围内每年棉花作物的约95％。其它这三类物种也是重要的遗传资源，为专门育种目的提供了基因库。例如，对生物和非生物胁迫具有高抗性的草棉可被用作与陆地棉进行种间杂交以改善其对各种胁迫抗性的良好起始遗传材料。因此，也十分需要在棉属和亲缘植物中进行基因功能性分析的独立于物种的方法。

图5A-5C显示，通过对一种叶绿素生物合成基因镁螯合酶CH42基因的沉默作用，表明VIGS系统不但在四倍体棉花陆地棉中起作用，而且也在二倍体棉花亚洲棉和草棉中起作用。

携带psTRV1和psTRV2(图5A，载体对照1+2)或psTRV2∶CH42(图5B和5C)的根瘤农杆菌株的培养物以1∶1的比例混合。将混合培养物真空渗透入2-3叶龄植物期的亚洲棉和草棉植物。图5A和5B的棉花叶采自7DPI，而图5C的棉花叶采自14DPI。

我们的数据表明我们的sTRV VIGS系统可在全部测试的二倍体和四倍体棉花物种中，至少在它们的叶中起作用。这些数据表明此sTRV VIGS系统也可在源自种内或种间杂交的全部商购棉花变种和种质中起作用。

实施例5：使用VIGS分析棉花中转录因子基因的功能

转录因子(TFs)介导调节的mRNA产生是调节植物应答发育信号和环境暗示的主要方法，转录调节已在诸如拟南芥和大米等模式植物中广泛地研究。我们测试了TRV-VIGS系统在TF基因功能高通量分析中的应用。

拟南芥ASYMMETRIC LEAVES 1(AS1)和其直系同源物属于R2R3MYB家族。它们在枝条顶端分生组织、叶和果实发育中起到进化保守的作用(Sun et al，2002；Alonso-Cantabrana et al.，2007)。AS 1通过结合I类KNOTTED1-样同源盒(KNOX)基因的启动子来抑制其表达(Guo et al.，2008)，且其通过调节植物激素活性来促进干细胞功能(Alonso-Cantabrana et al.，2007)。AS1也通过选择性结合某些JP响应性基因启动子来负向调节对病原菌的诱导抗性(Nurmberg et al.，2007；Yang et al.，2008)。相反，AS1是抗细菌性病原体的非水杨酸(SA)依赖型细胞外防御的正向调节子(Nurmberg et al.，2007)。

为了研究AS1在棉花发育和生物胁迫中的作用，我们首先克隆了假定的棉花AS1基因同源物。我们使用拟南芥AS1(GenBank登录号：NM129319)的氨基酸序列和TBLASTN来检索GenBank棉花EST数据库。棉花EST克隆DT568841、DW499296、ES792898与拟南芥AS1显示出显著的同源性。基于这些信息，我们得到了全长cDNA编码的假定的棉花AS1蛋白。假定的棉花AS1基因的核苷酸序列在SEQ ID NO：17中示出。棉花AS1的氨基酸序列分析与拟南芥AS1显示出65.9％的相同性和75.8％的相似性(图4A)。与不同植物物种的其它AS1类似，此棉花AS1包含保守的R2R3MYB结构域(由图6中黑色下划线所示)。R2R3MYB结构域外侧的氨基酸序列在此假定的棉花AS1和其它AS1直系同源物之间显著不同(图6)。假定的棉花AS1基因的氨基酸在SEQ ID NO：18中示出。

为了扩增用于在棉花中通过VIGS进行功能性分析的AS1基因，设计PCR引物以获得418bp片段，将此片段插入psTRV2以得到psTRV2∶AS1。将包含psTRV1和psTRV2∶AS1载体的农杆菌培养物的混合物真空渗入棉花植物中。在18dpi后，在新生叶中可见到明显的表型。若干向下的卷曲是叶子近轴侧最明显的表型(图7B和图7C)。AS1表达沉默的叶子中具有正常的近轴/远轴极性，但在近轴区域显示出特异性分布，导致异位叶片在叶脉水平侧面上的形成(图7D)。异位近轴叶片(EB)直接发育自主要叶片(PB)的主叶脉且显示出固定极性(图7D)。也通过使用扫描电镜来详细地确认AS1处理的植物的这些表型(图7F和图7G)。这些表型也发现在AS1下调的烟草中(McHale and Koning，2004)。在拟南芥和烟草中，KNOX基因的异位表达导致异位近轴叶片的产生(Orr et al.，2000；McHale and Koning，2004)。在麻疯树(Jatropha)(大戟科(Euphorbiaceae)家族的小型木本植物)中，AS1样基因的沉默也导致类似的异位近轴叶片和向下的叶卷曲(参见2009年12月16日提交的国际专利申请PCT/SG20009/000481和2009年1月9日提交的美国临时专利申请61/143,484)。在此假定的棉花AS1基因沉默植物和其它AS1同源物下调植物间的表型相似性说明此基因为棉花中AS1基因同源物。

使用从受处理植物的叶中提取的总RNA来进行实时定量PCR，以在分子水平上确认AS1基因的VIGS，结果显示在图7H中。在psTRV2∶AS1感染植物的上部叶中AS1RNA的积累远低于空sTRV载体感染的植物，在AS1处理的植物中仅剩余17％的AS1RNA。

这些近轴叶片表型提供了这样的证据，即这是棉花AS1基因，且TRVVIGS可用在棉花中以用于对TF基因功能的快速筛选。这类基因对不同发育时期棉铃发育以及棉纤维起始和伸长都很重要。更重要地，最近的证据显示共同的网络调节拟南芥中叶和果实的模式(Nurmberg et al.，2007)。因此，可使用叶作为模式系统来快速测定TF的基因功能，并利用此信息进一步利用这些基因来修饰或增强棉花纤维的质量和数量。在某些实施方式中，本发明还提供了从本发明的转基因植物获得的植物产物。术语植物产物摂意在包括可从特定植物获得的任何物，例如，果实、种子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蜡、蛋白、脂类、脂肪酸、维生素、全部或部分的植物组织(例如，根、叶、茎、花、棉桃、果实、皮)、细胞、细胞悬液、块茎和匍匐茎。

实施例6：通过VIGS对棉花中的小RNA途径基因进行功能性分析

小RNA(smRNA)调节植物抗病毒以及植物发育和分化等多种过程。我们测试了TRV VIGS系统对参与smRNA生物发生途径的基因的功能进行高通量分析的能力。

全部RNA沉默途径需要18-至26-nt smRNA的生物发生，所述smRNA来自双联RNA(dsRNA)的裂解或单链病毒RNA内的高度结构化区域。微小RNA是一种重要的smRNA。通过结合ARGONAUTE1(AGO1)蛋白，miRNA引导RNA诱导的沉默复合物(RISCs)，以裂解具有部分或全部序列互补性的mRNA。因此，拟南芥AGO1结合miRNA并显示出对miRNA靶的剪接子活性，且强ago1功能缺失突变体积累过多miRNA靶转录物(Baulcombe，2004)。也已证明AGO1结合病毒源的siRNA，且ago1突变体显示出对病毒的超敏感性(Beclin et al.，2002；Morel et al.，2002)。

为了研究AGO1在棉花发育和生物胁迫中的作用，我们首先克隆了AGO1的棉花同源物。我们使用拟南芥AGO1(GenBank登录号：NM 179453)的氨基酸序列和TBLASTN来检索GenBank棉花EST数据库。一些棉花EST克隆显示出与拟南芥AGO1不同区域的显著同源性。基于此信息，我们获得了编码一部分假定的棉花AGO1蛋白的2329bp部分cDNA序列。棉花AGO1基因的核苷酸序列在SEQ ID NO：23中示出。棉花AGO1的氨基酸序列在SEQ ID NO：24中示出。在此776个氨基酸区域中，此假定的棉花AGO1的分析显示出与拟南芥AGO1具有87.5％的相同性和92.7％的相似性。

为了扩增用于在棉花中通过VIGS进行功能性分析的AGO1样基因，设计PCR引物以获得583bp片段，将此片段插入psTRV2以得到psTRV2∶AGO1。将包含psTRV1和psTRV2∶AGO1载体的农杆菌培养物的混合物真空渗入棉花植物中。将包含psTRV1和psTRV2∶AGO1载体的农杆菌培养物的混合物渗入棉花植物中。在27dpi后，在新生叶中可见到多种和变化的表型。若干向下的卷曲是叶子近轴侧(图8B)和远轴侧(图8C)最明显的表型。AGO1沉默的叶显示出在远轴区域的特异性破坏，导致远轴异位叶片的形成(图8C)。我们进一步观察到沿叶脉和面对主要远轴叶片的异位远轴侧出现的远轴叶片结构(图8C)。在拟南芥中，异位的PHAV表达导致在突变体中异位远轴叶片的形成(Kidner and Martienssen，2004)。在麻疯树(大戟科家族的小型木本植物)中，AGO1样基因的沉默也导致类似的异位远轴叶片和向上的叶卷曲(参见2009年12月16日提交的国际专利申请PCT/SG20009/000481和2009年1月9日提交的美国临时专利申请61/143,484)。这些表型相似性提示此基因为棉花中的AGO1同源物。

这些远轴叶片表型提供了这样的证据，即这是棉花AGO1基因，且TRVVIGS可用在棉花中以用于对小RNA调节途径和病毒抗性途径的功能的快速筛选。这类基因对不同发育时期棉铃发育以及棉纤维起始和伸长都很重要。更重要地，最近的证据显示共同的网络调节拟南芥中叶和果实的模式(Nurmberg et al.，2007)。因此，可使用叶作为模式系统来快速测定小RNA途径的基因功能，并利用此信息进一步利用这些基因来修改或增强棉花纤维的质量和数量。在某些实施方式中，本发明还提供了从本发明的转基因植物获得的植物产物。术语植物产物摂意在包括可从特定植物获得的任何物，例如，果实、种子、花粉、胚珠、植物胚、油、果汁、蜡、蛋白、脂类、脂肪酸、维生素、全部或部分的植物组织(例如，根、叶、茎、花、棉桃、果实、皮)、细胞、细胞悬液、块茎和匍匐茎。

实施例7：通过VIGS对棉花中的原花色素进行功能性分析

原花色素(PA)是一种主要类型的类黄酮中，即植物次级代谢产物中的最大类中的一种。PA是类黄酮生物合成途径的寡聚和聚合终产物。PA起到抗生素、antisporulants、取食抑制剂和酶变性剂的作用。许多证据已经显示出棉花凋谢病/昆虫抗性与棉花中PA水平的良好相关性。对PA生物合成途径进行的大多数遗传学研究已经在模式植物拟南芥和最近的蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)上进行。据我们所知，对棉花中PA生物合成途径没有进行基因功能性分析。我们利用我们的sTRV VIGS系统在棉花中破译用于PA生物合成过程的结构基因和相关网络。

PA是来自导致花青素的途径的一类产物。两种酶，即花色素合酶(ANS)和花色素(ANR)在花青素和PA生物合成之间的支路上起作用。在拟南芥和苜蓿属(Medicago)中，ANS将底物黄烷-3，4-二醇(无色花色素)转化为花色素，此花色素可用作ANR的底物以产生另一种主要的PA单元，即2，3-顺式-黄烷-3-醇(表儿茶素)。

编码ANS和ANR的两种假定的基因被用于插入功能性分析用的sTRVVIGS载体。为了从陆地棉中扩增这两种基因，根据用拟南芥ANS和ANR蛋白在GenBank EST数据库中的询问结果，我们设计了PCR引物(ANS：SEQ ID NO：58和59；ANR：SEQ ID NO：60和61)来扩增假定的GhANS andGhANR的部分片段。将PCR产物(ANS：SEQ ID NO：78；ANR：SEQ IDNO：79)进一步克隆入psTRV2以得到psTRV2∶ANS和psTRV2∶ANR。将包含psTRV1以及psTRV2、psTRV2∶ANS或psTRV2∶ANR的农杆菌培养物的混合物真空渗入具有2-3片真正叶子的棉花植物中。在接种后7-10天后，在psTRV2∶ANR棉花植物新生叶周围的叶缘出现了褐色表型。2-7天后，基因沉默表型在整个叶片，特别是3-5片新生叶的叶脉(图9A)中很明显，且褐色表型在渗入叶下的水平叶中也可见。褐色表型也发现在叶柄(图9A)、皮(图10)、根(图11)和生殖器官花芽(图12)上。我们推断，此褐色表型是由于阻断了ANR在花色素向原花色素单元转化上的功能。这种阻断导致积累了较高水平的有色底物花色素。相反，ANS植物与载体对照植物之间未显示出可见的表型差异。实时PCR的转录物分析显示，与载体(1+2)对照相比，在对应植物中ANS和ANR转录物水平降低99.9％(图9B)。

随后，我们使用了广泛使用的PA染色剂DMACA来检测基因沉默棉花中PA的聚集水平。DMACA(芳族醛)在与儿茶酚(与棉花PA相关的主要黄烷-3-醇)反应后显示出深蓝色。DMACA染色显示，载体(1+2)对照植物中的大多数组织包含高水平的PA(图11中的皮，图12中的叶、花芽、花、根，和图13中的全裂花芽)。例如，在棉花叶中，PA在韧皮部周围的薄壁组织细胞中高度聚集。在ANR植物中，叶脉区域和叶柄显示出更深的花色素红色。与ANR植物相反，由于既没有花色素红色，也没有PA蓝色，所以ANS植物显示无色(图11、图12和图13)。ANR和ANS沉默结果证明沉默效果可进入全部棉花植物，且显示很均匀的沉默效果，这对良好VIGS系统是很重要的优点(图4A-图7)。更重要地，沉默可在生殖器官如花芽、花和胚珠中实现。这些结果说明sTRV VIGS可用于筛选对棉花纤维发育重要的基因。ANS和ANR沉默也发现在大丽轮枝菌(verticillium dahliae)感染并引起枯萎病的棉花根中。这强烈地提示sTRV VIGS系统也可用于抗棉花真菌病。

实施例8：通过VIGS在棉花中对CtBP进行功能性分析

棉花纤维为种子毛状体且是棉花植物最重要的产物。棉花纤维发育经历了许多不同但重叠的步骤，包括纤维起始、伸长、次生细胞壁生物合成和成熟，以产生成熟的纤维。单细胞棉花纤维也为研究细胞伸长提供了独特的实验系统。以前实验中的许多证据已经显示sTRV VIGS系统在植物性以及生殖器官如花和花芽中均可有效地工作。在此实施例中，我们显示sTRV VIGS在棉花纤维中也可工作。

CtBP(C末端结合蛋白)是进化上保守的NAD(H)依赖性转录辅阻遏物，其活性已显示为受NAD/NADH比例的调节。虽然最近的研究已经对CtBP调节转录和与其它蛋白组分之间相互作用的机理提出了新观点，但仍未完全理解CtBP的生物学功能。ANGUSTIFOLIA(AN)是来自植物以及拟南芥中毛状体分支的对照叶宽度和模式的第一个C末端结合蛋白(CtBP)基因。然而，尚不知道CtBP或其直系同源物在棉花纤维发育中的作用。

为了从陆地棉中扩增AN直系同源物，假定的EST序列通过使用拟南芥AN基因(NM 100033)序列在GenBank全棉花EST序列中进行BLAST来鉴定。在棉花中鉴定出一个编码假定的AN蛋白的EST。设计PCR引物(SEQID NO：62和63)以通过PCR扩增陆地棉的621-bp ANcDNA，且将AN片段(SEQ ID NO：80)插入sTRV2MCS位点以得到psTRV2∶AN。AN序列也通过测序验证。将携带pTRV1的农杆菌培养物与携带psTRV2∶AN或载体对照的农杆菌培养物混合。将混合培养物真空渗入具有2-3片真正叶子的陆地棉植物中(具体参见实施例1)。在AN沉默的棉花植物的植物性器官中没有明显的表型，如毛状体分支的叶宽度(图13A和13B)和模式。使用从受处理植物的上部叶中提取的总RNA来进行实时定量PCR，以在分子水平上确认AN基因的VIGS，结果显示在图16A中。在psTRV2∶AN感染植物的上部叶中ANRNA的积累远低于空sTRV载体感染的植物，在AN处理的植物中仅剩余10％的ANRNA。这些数据提示，AN在叶宽度方向的叶展开上的作用在棉花中不保守。

与在植物性生长和发育上无明显作用相反，AN在器官大小确定，特别是宽度方向和纤维发育中起到很关键的作用。在AN沉默的棉花中，与各自的对照相比(图13C、13E、13G、13I、13K、13M)，花芽和花球更薄且更小(图13D、13F、13H、13J、13L、13N)。在AN沉默的花球中，最明显的表型显示为在一个胚珠很少的起始纤维和在一个花球中很少的总胚珠数(图14和图15)。实时PCR分析显示AN转录物水平在胚珠中显著降低(图16B)。这可由皮层MT的异常排列引起。现已证明，皮层微管的异常排列归因于拟南芥中细胞的异常形状。AN基因可通过控制皮层MT的排列来调节细胞生长的极性(Kim et al.，2002)。

除了AN在细胞骨架中的作用，其通过与其它蛋白组分的相互作用也可有诸如发育中逆转录调节等其它作用。AN编码与C末端结合蛋白/BrefeldinA核糖基化底物具有序列相似性的新型蛋白，已知此底物参与转录调节或囊泡发育。在动物王国中，CtBPs自身结合且起到转录协阻抑物的作用。在鼠中，CtBP参与胚胎发生，突变体导致在某些时期胚胎发育停止。这可有助于解释为何在棉花胚珠发育中一些AN沉默的胚珠是致死的(图14)。拟南芥中微阵列分析提示AN基因可能调节某些基因，如参与细胞壁形成的基因的表达(Kim et al.，2002)。

此实施例清楚地表明sTRV VIGS在棉花纤维和胚珠发育步骤中很好地工作，此步骤是确定棉花纤维长度、纤维和胚珠数量的关键时期。

实施例9：通过VIGS在棉花中对KTN进行功能性分析

药理学、生物化学和遗传学研究表明，微管细胞骨架在植物细胞形态发生中起重要作用。微管细胞骨架可参与将携带膜和细胞壁组分的囊泡和细胞器运输至根毛、毛状体细胞和花粉管中的细胞生长位点。因此，微管细胞骨架对细胞伸长和根尖生长是必需的。

剑蛋白(KTN)是异源二聚体微管(MT)切断蛋白，其使用来自ATP水解的能量产生沿MT的内部断裂。两个亚基之一的剑蛋白p60具有ATPase和MT结合/切断活性，p60亚基负责将剑蛋白靶向至某些亚细胞位置。在动物中，剑蛋白对将MT从它们在中心体的成核位点中释放起到重要作用。其也参与将MT切割为更小的片段，此片段用作进一步聚合的模板以在减数分裂和有丝分裂纺锤体组装期间增加MT数量。剑蛋白同源物存在于各种植物物种中。已显示拟南芥剑蛋白同源物具有体外ATP依赖的MT切割活性，且在细胞皮层和核周区域显示出点状定位模式(punctate localizationpattern)。通过遗传突变破坏剑蛋白功能会导致核周MT排列消失的延迟，并引起伸长细胞中皮层MT的异常组织化。因此，剑蛋白突变导致细胞伸长、纤维素微纤维沉积和激素应答的缺陷。剑蛋白的研究为我们理解其在细胞功能中的作用提供了新体会。

siRNA在胚珠和纤维中的富集提示纤维发育期间活性小RNA代谢和染色质修饰，然而miRNA在纤维中的普遍抑制与12个确定的miRNA靶的上调有关，这些miRNA靶编码转录和植物激素响应因子，包括发现待在棉花纤维中高表达的基因。微管动力学在miRNA引导的转录抑制中起作用，但在miRNA引导的分裂中不起作用。然而，尚不知道KTN在生殖器官发育或其直系同源物在棉花纤维发育中的作用。

为了从陆地棉中扩增KTN直系同源物，假定的EST序列通过使用拟南芥KTN基因(NM_106684.4)序列在GenBank全棉花EST序列中进行BLAST来鉴定。在棉花中鉴定出一个编码假定的KTN蛋白的EST。设计PCR引物(SEQ ID NO：64和65)以通过PCR扩增陆地棉的675-bp KTN cDNA，且将KTN片段(SEQ ID NO：81)插入sTRV2MCS位点以得到psTRV2∶KTN。KTN的序列通过测序确认。将携带pTRV1的农杆菌培养物与携带psTRV2∶KTN或载体对照的农杆菌培养物混合。将混合培养物真空渗入具有2-3片真正叶子的陆地棉植物中(具体参见实施例1)。

在KTN沉默的棉花植物的植物性器官中有明显的表型，如深绿和较小的叶片、较短的叶柄(相比于图17A中的载体对照和图17B中的KTN沉默)以及毛状体分支的模式和叶毛状体的长度(图19)。这些数据提示KTN在植物发育中发挥多种重要作用。

KTN不但在植物性生长和发育中起作用，而且也在器官大小确定，特别是宽度方向和纤维发育中起到很关键的作用。在KTN沉默的棉花中，与各自的对照相比(图17C、17E、17G、17I)，花芽和花球更薄且更小(图17D、17F、17H、17J)。KTN沉默的花球中最明显的表型变现为在一个胚珠中纤维更短(图18)。这可由皮层MT的异常排列引起。现已证明，皮层微管的异常排列归因于拟南芥中细胞的异常形状。

实施例10：使用瞬时表达载体在棉花中表达

使用经遗传工程化以产生诸如苏云金杆菌(Bt)毒素等表达蛋白或多肽的作物已快速增加至大于32,000,000公顷。在难以转化的棉花中很需要快速表达外源或内源性多肽的瞬时系统。

使用本发明方法的瞬时表达的实例如下所述。简单地，此方法需要包含植物启动子、编码蛋白的DNA序列的异源DNA构建体。优选地，DNA构建体编码另一种感兴趣的基因。例如，DNA构建体可包含这样的基因，此基因的表达导致在渗入植物中棉花对昆虫抗性的增加或增加棉花纤维长度或其它农艺学性质。

在以下实施例中，瞬时表达绿色荧光蛋白(GFP)的棉花植物从被包括GFP基因的农杆菌真空渗入的组织中获得。此GFP基因和其它基因如GUS、荧光素酶基因可作为简单地可筛选标记用在下述一些实例中，简单的原因是因为它们的表型易于在真空渗入的植物中检测到。有理由预期，通过使用标准分子生物学技术产生的DNA构建体，可应用本发明来获得实际上表达其它任何基因的棉花植物。在其它实施方式中，用于获得瞬时表达的棉花植物的方法包括将GFP与包括感兴趣基因的其它基因融合。

为了扩增在棉花中作为标记以用于瞬时表达分析的GFP基因，针对被插入psTRV2001以psTRV2∶GFP的片段设计PCR引物，此psTRV2001具有合成的豌豆早枯病毒(PEBV)亚基因组启动子。将包含psTRV1和psTRV2∶GFP载体的农杆菌培养物的混合物真空渗入棉花植物中。在3dpi时，当在全部植物中用紫外光刺激渗入的棉花植物时，强GFP表达被快速地筛选(图20B、20C、20D)。收集棉花叶，并使用GFP抗体来检测麻疯树毒蛋白。蛋白印迹分析显示强GFP积累在棉花叶中。核酮糖1，5-二磷酸盐羧化酶/加氧酶的大亚基的考马斯亮蓝染色表明了可比较的样品上样。

实施例11：包含内含子的修饰型VIGS载体

有很多原因会引起RNA病毒载体的转录起始困难。首先是可能被RNA加工工具错误识别的非最佳化的基因组序列，如嵌在RNA基因组中的隐蔽剪接位点和富含胸腺嘧啶的假定的内含子序列。其次，TRV RNA1病毒载体编码约7.0Kb核苷酸的极大的转录物，其大小是平均植物基因大小(1-2Kb)的约3-4倍。实际上，植物基因通常包含有助于来自细胞核的前mRNA加工和输出的大量内含子。在本发明的基于农杆菌渗入法的VIGS和瞬时表达系统中，没有内含子序列，在来自病毒构建体的植物细胞核中产生的前mRNA转录物无法被有效地识别或适当地加工。另外的内含子可使病毒转录物更容易地被宿主细胞核前mRNA加工和输出工具识别，以此增加能发生病毒复制的植物细胞的百分数，以及增加能起始感染的效率。

共有序列AG/GT被用作内含子插入的靶序列。在第二轮筛选循环中，我们使用NetgeneII程序(http colon backslash backslash www dot cbs dot dtudot dk backslash services backslash NetGene2/)来分析TRV1的序列，此程序使用为拟南芥序列设定的参数。我们注意到一个具有高可信度的包含AG/GT的位点(psTRV1001序列中10919-10922的位置)，以用作供体剪接位点。因此，我们选择此位点来插入植物内含子。

使用重叠PCR来产生TRV1，此TRV1与源自拟南芥的内含子序列融合，并插入psTRV1001载体中以得到psTRV1001-内含子载体。分析修饰的载体，以显示包含内含子的载体可导致更好的VIGS效率和更高的过表达水平。

实施例12：实施例13的材料和方法

实施例12和13中所述的方法涉及克隆与细胞伸长、细胞壁和纤维素生物合成进入病毒递送载体相关的靶棉花基因的短序列。载体用于体外感染棉花胚珠，且在若干天或周中，涉及抑制病毒复制的天然防御机制导致来自被靶向沉默的内源性植物基因的mRNA的特异性降解。此方法快速(从感染至沉默为1-4天)，不需要开发稳定的转化体，允许表征在稳定系中可能致死的表型，且提供沉默基因家族中单个或多个成员的潜力。

植物生长条件：全部棉花植物(陆地棉)在具有自然温度和光照的温室的盆栽土中生长。在开花期标记待用于收集子房的花芽，并在这天的后1天收集对应的棉桃。

棉花胚珠培养：在开花期后一天(DPA)，收集花芽或棉桃，并去除苞叶、萼片和花瓣。将子房使用75％乙醇消毒，随后用无菌水清洗3-5次。将胚珠在无菌条件下从子房中小心地切割下。将这些胚珠用包含肌动蛋白1基因的TRV感染。在用无菌水清洗3-5次后，将这些胚珠立即浮在添加有1.1mg/L IAA、1.7mg/L GA3和0.3mg/L IBA的BT培养基的表面上(Beasleyand Ting 1973)。使用前，对BT培养基充氧(纯氧)30分钟。将胚珠在32E C下的黑暗中孵育，除偶尔简单检查外不搅动。棉花胚珠培养物显示在图21A和21B中。

扫描电镜：为了检验纤维起始和伸长，将TRV-肌动蛋白1感染的胚珠置于铝样品支持器上的双侧粘性带上并立即用液氮冷冻。冷冻样品用JSM-6360LV扫描电镜(JEOL，Tokyo，Japan)观察。

总RNA提取：棉花纤维在液氮中冷冻，并用杵在冷研钵研磨成细粉末。根据Wan and Wilkins(1994)，从至多100mg研磨的纤维中提取总RNA。全部RNA制备物用DNase处理并用Qiagen RNeasy植物小试剂盒纯化。

逆转录PCR分析：在全部实验中进行两步RT-PCR步骤。首先，使用RT-PCR用的Superscript第一链合成系统(Invitrogen)从2μg总RNA中合成第一链cDNA，并用1μg寡聚脱氧胸腺嘧啶(dT)(dT15)来引发延伸。随后，将cDNA用作使用基因特异性引物的RT-PCR反应的模板。用于扩增GhActin 1的RT-PCR引物为Act-up(5′-ATATTCTAGAAGAAGAACTATGAGTTGCCT-3′；SEQ ID NO：28)和Act-dn(5′-ATGGG ATCCCGTAGAGATCCTTCCTGATAT-3′；SEQ IDNO：29)。微管蛋白基因用作RNA标准。用于扩增GhTubulin基因的RT-PCR引物为Tub-up(5′-GATGTTGTGCCCAAGGATGTTAATGC-3′；SEQ IDNO：30)和Tub-dn(5′-ATGAGATCA AACTTGTGGTCAATGCG-3′；SEQ IDNO：31)。

实时PCR分析：棉花纤维中GhActin 1基因的表达使用表4所示的基因特异性引物和荧光嵌入染料SYBR-Green，通过实时定量RT-PCR在检测系统(Applied Biosystems)中分析。棉花微管蛋白基因(GhTubulin)或泛素基因(GhUbiquitin)用作QRT-PCR反应中的标准对照。使用Power SYBR GreenPCR Master Mix(Applied Biosystems)和ABI 7900序列检测系统，根据生产商说明书(Applied Biosystems)来进行实时PCR反应。通过SYBR-绿色荧光来检测每个循环的靶基因的扩增。表达水平的相对值通过等式Y＝靶基因(肌动蛋白1)/标准对照(微管蛋白或泛素)来计算。

表4：基因特异性实时PCR分析中用的引物

实施例8：棉花基因在纤维发育中的功能

为了测试棉花基因在纤维发育中的功能，我们选择了GhActin 1、GhADF1、GhCTR 1、GhDELLA 1、GhAlpha-tubulin 1、GhBeta-tubulin 1、GhMADS9、GhMBY 5和GhMBY6。应用使用RNAi技术的VIGS(病毒诱导的基因沉默)方法。将候选基因的500-650bp片段构建入包括化学合成的烟草脆裂病毒(sTRV)RNA2序列的载体中，以产生修饰型sTRV2载体。为了了解是否全部候选基因的mRNA均降低，我们使用基因特异性引物(表4)，通过实时定量SYBR-Green RT-PCR在纤维中分析了全部候选基因的表达水平。为了了解是否纤维长度的变化也涉及全部候选基因，我们通过扫描电镜观察了胚珠表面。

GhActin1：棉花胚珠培养物中肌动蛋白表达显示在图22A和22B中。在野生型对照纤维和psTRV1+psTRV2对照载体中检测出明显的带，然而在VIGS-Actin 1行中未检测到信号或检测到弱信号(图27A，27B)。实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhActin1 RNAi的表达水平导致完全的GhActin 1沉默(图28)。SEM的结果提示，纤维长度比在相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度短，且毛状体的表面粗糙且褶皱(图23A-11D和图23E-23H)。全部VIGS-GhActin 1显示出短纤维表型和肌动蛋白1转录物水平的降低，这说明此表型是GhActin 1沉默引起的肌动蛋白1降低的结果。这些数据提示GhActin 1是纤维伸长中的主要和功能性基因。

GhADF 1：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhADF 1RNAi的表达水平导致完全的GhADF 1沉默(图29)。SEM的结果提示，纤维长度与相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度相同(图23A-23D和图23I-23L)。虽然全部VIGS-GhADF 1显示出ADF 1转录物水平降低，但纤维长度无任何变化。这些数据提示GhADF 1与纤维伸长无关。

GhCTR 1：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhCTR 1RNAi的表达水平导致完全的GhCTR 1沉默(图30)。SEM的结果提示，纤维长度比在相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度短(图24A和24B)。全部VIGS-GhCTR 1显示出短纤维表型和CTR 1转录物水平的降低，这说明此表型是GhCTR 1沉默引起的CTR 1降低的结果。这些数据提示GhCTR 1是纤维伸长中的主要和功能性基因。

GhDELLA 1：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhDELLA 1RNAi的表达水平导致完全的GhDELLA 1沉默(图31)。SEM的结果提示，纤维长度与相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度相同(图24A和24C)。虽然全部VIGS-GhDELLA 1显示出DELLA 1转录物水平降低，但纤维长度无任何变化。这些数据提示GhDELLA 1与纤维伸长无关。

GhAlpha-tubulin 1：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhAlpha-tubulin 1RNAi的表达水平导致完全的GhAlpha-tubulin 1沉默(图32)。SEM的结果提示，纤维长度比在相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度短，且毛状体的表面粗糙且褶皱(图25A和25B)。全部VIGS-GhAlpha-tubulin 1显示出短纤维表型和Alpha-tubulin 1转录物水平的降低，这说明此表型是GhAlpha-tubulin 1沉默引起的Alpha-tubulin 1降低的结果。这些数据提示GhAlpha-tubulin 1是纤维伸长中的主要和功能性基因。

GhBeta-tubulin 1：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhBeta-tubulin 1RNAi的表达水平导致完全的GhBeta-tubulin 1沉默(图33)。SEM的结果提示，纤维长度比在相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度短，且毛状体的表面粗糙且褶皱(图25A和25C)。全部VIGS-GhBeta-tubulin 1显示出短纤维表型和Beta-tubulin 1转录物水平的降低，这说明此表型是GhBeta-tubulin 1沉默引起的Beta-tubulin 1降低的结果。这些数据提示GhBeta-tubulin 1是纤维伸长中的主要和功能性基因。

GhMADS 9：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhMADS 9 RNAi的表达水平导致完全的GhMADS9沉默(图34)。SEM的结果提示，纤维长度比在相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度长(图26A和26B)。全部VIGS-GhMADS 9显示出短纤维表型和MADS 9转录物水平的降低，这说明此表型是GhMADS 9沉默引起的MADS 9降低的结果。这些数据提示GhMADS 9是纤维伸长中负调节子之一。

GhMYB 5：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhMYB 5RNAi的表达水平导致完全的GhMYB 5沉默(图35)。SEM的结果提示，纤维长度与相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度相同(图26A和26C)。虽然全部VIGS-GhMYB 5显示出MYB 5转录物水平降低，但纤维长度无任何变化。这些数据提示GhMYB 5与纤维伸长无关。

GhMYB 6：实时PCR的结果揭示，在VIGS-1、VIGS-2、VIGS-3、VIGS-4和VIGS-5行中，GhMYB 6RNAi的表达水平导致完全的GhMYB 6沉默(图36)。SEM的结果提示，纤维长度与相同时期psTRV1+psTRV2中的纤维长度相同(图26A和26D)。虽然全部VIGS-GhMYB 6显示出MYB 6转录物水平降低，但纤维长度无任何变化。这些数据提示GhMYB 6与纤维伸长无关。

除非特别指出或者上下文明确相反，否则本发明描述内容(特别是权利要求的上下文中)中，术语“一”、“所述”和类似词语应理解包括单数和复数。除非另外提到，否则术语“包括”、“具有”、“含有”、“包含”被认为是开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)。文中数值范围的列举仅仅是充当范围内每个单独数值一个一个提到的简写方法，除非特别指出，否则每个单独值并入说明书，如同每个单独在此提到。例如，如果公开了范围10-15，那么11、12、13和14也被公开了。除非特别指出或者上下文明确相反，否则文中描述的所有方法能以任何适宜顺序进行。任何实施例的使用，或者文中提供的举例语言(例如“诸如”)，除非文中要求保护，否则仅仅为了更好说明本发明，并不限制本发明范围。说明书语言不应解释为指定对于本发明实践关键的任何未要求元素。

应意识到本发明的方法和组合物包括各种形式的实施方案，本文仅仅公开了一小部分。本发明文中描述的实施方案包括本发明人已知的实施本发明的最好方式。本领域普通技术人员在阅读以上描述的基础上可显而易见实施方案的变化。本发明人期望技术人员可以适当应用这些改变，且可以本文所述不同的方式实施本发明。相应地，本发明包括适用法律允许的在所附权利要求中所述主题的所有修改和等价物。此外，除非特别指出或者上下文明确相反，则上述元素的所有可能范围内的任意变化组合均包含在本发明内。

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