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CN102791276B - 含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法 - Google Patents

含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法 Download PDF

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Abstract

通过无血清或低血清培养来制造含有维持有免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品。一种含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法，其特征在于，包含以下工序：增殖工序，在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的培养基中使间充质干细胞增殖；筛选工序，从上述增殖工序后的间充质干细胞中筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。

Description

含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种含有间充质干细胞的细胞制品及其制造方法，还涉及一种用于该制造方法的培养基用添加剂、培养基及试剂盒、以及使用它们的培养方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)不仅可以从骨髓、脂肪、滑膜、齿槽骨、齿根膜等成人的组织中分离，而且可以从胎盘、脐带血、脐带的各种细胞等中分离，并且可以在生物体外进行培养、增殖。而且，间充质干细胞具有多分化能力，不仅可以分化为多种间充质(成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞)的谱系细胞，而且可以分化为非间充质(神经前体细胞、肝细胞)的谱系细胞，因此，期待作为再生医疗或细胞治疗的细胞源的利用。
目前，在间充质干细胞的培养中，通常使用含有胎牛血清(FBS)的培养基。存在如下问题：在牛的血清中不仅存在批次差别，而且不同种动物源性血清蛋白质混入间充质干细胞中，在移植时引起免疫应答。即使使用人血清进行培养，也因个体差异而难以进行稳定的培养，另外，供体的身体负担大，而且费用高。
因此，为了供给更安全且稳定的品质的间充质干细胞，已知在其培养过程中使用不同种类的动物源性蛋白质混入少的无血清培养基为宜。即，优选将间充质干细胞在无血清下进行培养并使其增殖。在专利文献1及非专利文献1中记载有间充质干细胞的无血清培养。如专利文献1及非专利文献1中记载的那样，通过将间充质干细胞进行无血清培养，与含5～15％FBS培养基中间充质干细胞的培养相比，可得到更优异的增殖促进效果，而且，通过该培养，可得到具有维持的(提高的)多分化能力的间充质干细胞。
另外，已公开间充质干细胞不仅自身的免疫原性低，而且对各种免疫效应细胞(T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞)的功能产生影响(非专利文献2～5)。因此，期待着将间充质干细胞应用于涉及免疫反应的各种疾病的治疗(非专利文献6)。在非专利文献7中记载有间充质干细胞抑制小鼠混合淋巴细胞反应(MLR)引起的T细胞增殖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2007/080919号小册子(2007年7月19日公开)
非专利文献
非专利文献1:加藤幸夫，第五回医療機器フォーラム予稿集，33-35,2007
非专利文献2:Keating,A.,Cell Stem Cell,2,106-108,2008
非专利文献3:Corcione,A.等,Blood107,367-372,2006
非专利文献4:Ramasamy,R.等,Transplantation83,71-76,2007
非专利文献5:Aggarwal,S.等,Blood105,1815-1822,2005
非专利文献6:Le Blanc K.等,J Intern Med.,262,509-525,2007
非专利文献7:Djouad,F.等,Blood102,3837-3844,2003
发明内容
发明要解决的课题
在再生医疗方面，移植时的免疫学的排斥反应为重要的问题，为了抑制排斥反应，可使用免疫抑制剂。但是，免疫抑制剂的副作用等成为问题。另一方面，由于间充质干细胞具有免疫抑制能力，因此，如果利用间充质干细胞，则不需要使用免疫抑制剂。因此，如果通过异种蛋白质、合成培养基混入的危险性低的无血清或低血清培养可以得到具有免疫抑制能力的间充质干细胞，则是有利的。就含FBS培养基而言，尤其是从不仅牛血清白蛋白的量、而且具有变应性的其它可溶性物质混合存在方面考虑，都存在问题，不含有FBS的培养基的使用是不可缺少的。
本发明是鉴于上述问题点而完成的发明，其目的在于，提供一种用于通过无血清或低血清培养来制造维持有免疫抑制能力的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题，对无血清培养给间充质干细胞的免疫抑制能力带来的影响进行了潜心研究，结果发现，在含有特定的添加剂的无血清培养基中进行培养的间充质干细胞维持免疫抑制能力，而且提高其免疫抑制效果，直至完成了本发明。
即，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法的特征在于，包含以下工序：增殖工序，在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖；筛选工序，从上述增殖工序后的间充质干细胞中筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。
本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的特征在于，是利用上述的制造方法制造的。
本发明所述的培养基用添加剂为用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清的培养基用添加剂，特征在于含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸。
本发明所述的培养基为用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清培养基，特征在于含有上述培养基用添加剂。
本发明用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的培养方法，特征在于包含在上述培养基中将间充质干细胞进行培养的工序。
本发明用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的试剂盒，特征在于至少包含上述培养基用添加剂。
发明的效果
本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法包含以下工序：增殖工序，在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖；筛选工序，从上述增殖工序后的间充质干细胞中筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞，因此，可以通过无血清或低血清培养来制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品。
本发明的其它目的、特征及优异的方面通过以下所示的记载充分地得知。另外，参照附图，本发明的优点通过以下的说明而清楚。
附图简述
图1是表示在MSCGM培养基中将小鼠源性活化T细胞和hMSC进行共培养时，hMSC对于抗CD3及抗CD28刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图。
图2是表示在本发明的一个实施方式中所述的无血清培养基A中将小鼠源性活化T细胞和hMSC进行共培养时，hMSC对于抗CD3及抗CD28刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图。
图3是表示在MSCGM培养基中将小鼠源性活化T细胞和hMSC进行共培养时，hMSC对于有丝分裂原刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图。
图4是表示在本发明的一个实施方式中所述的无血清培养基A中将小鼠源性活化T细胞和hMSC进行共培养时，hMSC对于有丝分裂原刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图。
图5是表示hMSC对于小鼠混合淋巴细胞反应刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图(培养第3天的结果)。
图6是表示hMSC对于小鼠混合淋巴细胞反应刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图(培养第4天的结果)。
图7是表示从培养开始第8天的脂肪组织源性hMSC的增殖状态的图。
图8是表示培养基1及培养基2对于初期的滑膜源性hMSC的增殖促进效果的图，(a)是表示从培养开始第12天的滑膜源性hMSC的细胞数的图，(b)是表示从培养开始第12天的滑膜源性hMSC的增殖状态的图。
图9是表示从培养开始第0天至第68天的滑膜源性hMSC的细胞数的经时变化的图。
图10是表示从培养开始第5天的骨髓源性hMSC(细胞1)的增殖状态的图。
图11是表示从培养开始第5天的骨髓源性hMSC(细胞2)的增殖状态的图。
图12是表示从培养开始第5天的骨髓源性hMSC(细胞3)的增殖状态的图。
图13是表示培养基1对于正常人皮肤成纤维细胞及人软骨肉瘤细胞株的增殖的效果的图，(a)是表示从培养开始第14天的正常人皮肤成纤维细胞的集落数的图，(b)是表示从培养开始第14天的人软骨肉瘤细胞株的集落数的图。
具体实施方式
下面，对本发明的实施方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于此，可以以在记述的范围内加入有各种变形的方式实施。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特殊说明，表示数值范围的“A～B”是指“A以上，B以下”。
如上所述，在专利文献1及非专利文献1中，记载有在不含有血清的培养基(无血清培养基)中不丧失增殖性而用于培养细胞的培养基。该培养基是将特定的生长因子群、磷脂及脂肪酸的复合物添加于基础培养基而形成的，通过使用该培养基，即使在无血清条件下，也带来与10％血清的情况相同或更大的细胞增殖促进效果。另外，可以在该培养基中将间充质干细胞进行无血清培养，而仍旧维持分化能力和提高其维持能力。而且，在该培养基中，可以进行骨髓源性MSC、脂肪源性MSC、滑膜源性MSC的无血清培养。
根据本发明，作为这种可以在无血清条件下使间充质干细胞大量增殖的培养基的进一步效果，实现免疫抑制能力的维持或提高的间充质干细胞的培养，可以制造特别对再生医疗用途有用的含有间充质干细胞的细胞制品。
(1)含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法
本发明提供一种在无血清条件下制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的方法。本发明所述细胞制品的制造方法包含以下工序：增殖工序，在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖；筛选工序，从上述增殖工序后的间充质干细胞中筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。
(增殖工序)
在本发明所述的制造方法的增殖工序中，将间充质干细胞在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基A中进行培养并使间充质干细胞增殖。
本说明书中所使用的情况，“无血清培养基”是指不含有血清的培养基，“无血清培养”是指不使用血清的培养。另外，“低血清培养”是指：使用与一般的含血清培养基(例如含10％FBS培养基)相比含有的血清量少的培养基的培养，及与使用一般的含血清培养基的培养相比使用含血清培养基的培养期间短的培养。
在本说明书中，“细胞制品”为用于作为再生医疗用材料的再生医疗等的、将细胞进行了制剂化的治疗药，不仅包含使细胞仍旧为原来的状态且不使功能变化并进行了制剂化的物质，而且包含在特定的条件下进行培养及增殖，由此将使分化能力、免疫抑制能力等功能提高的细胞进行制剂化的物质。
另外，在本说明书中，“间充质干细胞”不仅包含从骨髓、脂肪细胞、滑膜细胞、齿槽骨、齿根膜等成人的组织中分离的间充质干细胞，而且包含从胎盘、脐带血、胎儿的各种细胞等中分离的间充质干细胞，优选为人间充质干细胞，但可以为大鼠、小鼠等非人动物源性间充质干细胞。
就用于构成在增殖工序中使用的无血清培养基A的基础培养基而言，只要在该领域中为众所周知的动物细胞用培养基，就没有特别限定，作为优选的基础培养基，可列举例如：Ham’s F12培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、MCDB培养基等。这些基础培养基可以单独使用，也可以混合使用多种。在一个实施方式中，用于构成无血清培养基A的基础培养基优选将MCDB和DMEM以1:1的比率混合成的培养基。
在一个实施方式中，将在上述基础培养基上添加有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基A用于增殖工序即可。对于基础培养基的FGF的含量，以终浓度计，优选为0.1～100ng/ml，进一步优选为3ng/ml。对于基础培养基的PDGF的含量，以终浓度计，优选为0.5～100ng/ml，进一步优选为10ng/ml。对于基础培养基的TGF-β的含量，以终浓度计，优选为0.5～100ng/ml，进一步优选为10ng/ml。
对于基础培养基的HGF的含量，以终浓度计，优选为0.1～50ng/ml，进一步优选为5ng/ml。对于基础培养基的EGF的含量，以终浓度计，优选为0.5～200ng/ml，进一步优选为20ng/ml。对于基础培养基的磷脂的总含量，以终浓度计，优选为0.1～30μg/ml，进一步优选为10μg/ml。对于基础培养基的脂肪酸的总含量优选为基础培养基的1/1000～1/10，进一步优选为1/100。
通过使用这种无血清培养基A，防止异种蛋白质的混入，同时可得到与含血清培养基相同或更大的增殖促进效果，可以使间充质干细胞如所希望那样增殖。
在本发明所述的制造方法的增殖工序中，作为无血清培养基A含有的磷脂，可列举例如：磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰甘油等，可以单独含有这些磷脂，也可以组合含有。在一个实施方式中，无血清培养基A可以组合含有磷脂酸和磷脂酰胆碱，这些磷脂可以为动物源性，也可以为植物源性。
作为无血清培养基A含有的脂肪酸，可列举例如：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸等，就本实施方式所述的培养基用添加剂而言，可以单独含有这些脂肪酸，也可以组合含有。另外，本实施方式所述的无血清培养基A除含有上述脂肪酸之外，还可以含有胆固醇。
本说明书中所使用的情况，FGF是指从成纤维细胞生长因子(FGF：fibroblast growth factor)家族中选择的生长因子，优选为FGF-2(bFGF)，也可以从FGF-1等其它FGF家族中选择。另外，本说明书中所使用的情况，PDGF是指从血小板衍生生长因子(PDGF：platelet derived growth factor)家族中选择的生长因子，优选为PDGF-BB或PDGF-AB。而且，本说明书中所使用的情况，TGF-β是指从转化生长因子-β(TGF-β：transforming growthfactor-β)家族中选择的生长因子，优选为TGF-β3，也可以从其它TGF-β家族中选择。
本说明书中所使用的情况，HGF是指从肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor)家族中选择的生长因子，EGF是指从上皮生长因子(EGF：epidermal growthfactor)家族中选择的生长因子。
另外，在一个实施方式中，无血清培养基A还可以含有选自结缔组织生长因子(CTGF：connective tissue growth factor)、血管内皮细胞生长因子(VEGF：vascular endothelial growth factor)及抗坏血酸化合物构成的组中的至少2种因子。
本说明书中所使用的情况，抗坏血酸化合物是指抗坏血酸(维生素C)或抗坏血酸2磷酸或与它们类似的化合物。
需要说明的是，无血清培养基A中所含的上述的生长因子可以为天然的，也可以为通过基因重组而制造的。
在一个方面，优选无血清培养基A含有脂质抗氧化剂。在一个实施方式中，无血清培养基A中所含的脂质抗氧化剂可以为DL-α-生育酚醋酸酯(维生素E)。无血清培养基A还可以含有表面活性剂。在一个实施方式中，无血清培养基A中所含的表面活性剂可以为普卢兰尼克F-68或吐温80。
无血清培养基A还可以含有胰岛素、运铁蛋白及硒酸盐。本说明书中所使用的情况，胰岛素可以为胰岛素样生长因子，可以来自天然的细胞，也可以为通过基因重组而制造的。本发明所述的培养基用添加剂还可以含有地塞米松或其它糖皮质激素。
在增殖工序中，在上述的无血清培养基A中播种从人等动物组织或细胞中利用目前公知的方法分离的间充质干细胞，培养至增殖为所希望的数量。作为培养条件，对于1ml培养基，优选播种1～2×104个间充质干细胞，培养温度优选为37℃±1℃，培养时间优选为48～96小时，且5％CO2下。通过这样培养，可以有效且大量地得到具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。
在增殖工序中，就用于培养的培养容器而言，只要可以增殖间充质干细胞，就没有特别限定。可以优选使用例如Falcon制75cm2烧瓶、住友胶木制75cm2烧瓶等。但是，有时细胞的增殖因细胞、因使用的培养容器的种类而受到影响。因此，为了使间充质干细胞更有效地增殖，作为在增殖工序中使其增殖的对象的每种间充质干细胞(以下，也称为“增殖对象细胞”)，优选使用适于增殖的培养容器进行增殖工序。
作为适于增殖对象细胞的增殖的培养容器的选择方法，可以列举例如在增殖对象细胞中选择最适的培养容器的方法。具体地进行说明时，准备多种培养容器，除培养容器的种类不同之外，在相同的培养条件下使增殖对象细胞增殖，利用公知的方法测量从培养开始2周后的细胞数，可以从细胞数多的容器按顺序判断为适于增殖对象细胞的增殖的培养容器。另外，增殖对象细胞的增殖速度快的情况，即使在从培养开始经过2周之前，也可以从达到汇合状态的80～90％的细胞数的期间短的容器按顺序判断为适于增殖对象细胞的增殖的培养容器。
在本发明所述的制造方法的增殖工序中，在适于增殖对象细胞的增殖的培养容器已经清楚的情况，使用该培养容器即可。与此相对，在适于增殖对象细胞的增殖的培养容器不清楚等情况下，本发明所述的制造方法可以在增殖工序之前还包含用于选择适于增殖对象细胞的增殖的培养容器的“培养容器选择工序”(后面进行描述)。
需要说明的是，就间充质干细胞的增殖而言，细胞粘附于培养容器为必需条件，因此，增殖对象细胞对于培养容器的粘附弱时，优选在增殖工序中，在上述无血清培养基A中还含有细胞粘附分子。作为上述“细胞粘附分子”，可以列举例如：纤连蛋白、骨胶原、明胶等。这些细胞粘附分子可以单独使用一种，也可以组合使用多种。
对于无血清培养基A的细胞粘附分子的含量，以终浓度计，优选为1～50μg/ml，进一步优选为5μg/ml。在一个实施方式中，使用纤连蛋白作为细胞粘附分子的情况，通过以对于无血清培养基A的纤连蛋白的终浓度为5μg/ml的方式进行添加，可以使增殖对象细胞对于培养容器的粘附效率提高。
另外，在增殖工序中，可以将间充质干细胞继代至少1次。由于间充质干细胞锚定依赖性地增殖，因此，在间充质干细胞局部地不均匀地增殖等的情况下，在增殖工序的中途将间充质干细胞进行继代，由此可以改善培养条件。
作为间充质干细胞的继代方法，没有特别限定，可以使用目前公知的间充质干细胞的继代方法进行继代。由于继代后的间充质干细胞的状态良好，因此，优选在上述增殖工序中、在进行继代的情况下使用不含有来自哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂将上述间充质干细胞进行剥离。作为上述“不含有来自哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂”，可以列举例如ACCUTASE(Innovative Cell Technologies,Inc.)。
在此，对使用ACCUTASE作为上述“不含有来自哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂”的一个例子时的继代方法进行说明。按照(i)～(vi)的顺序将间充质干细胞进行剥离、继代。需要说明的是，在以下说明的继代方法中，假定使用T-25烧瓶(Falcon制)作为培养容器。
(i)使用PBS(-)5mL清洗细胞层。
(ii)添加ACCUTASE2mL。
(iii)在室温下静置2分钟左右，在确认细胞剥离的基础上，使细胞悬浮液移至离心管。
(iv)在培养容器中添加PBS(―)7mL，冲洗烧瓶底面。
(v)使上述(iv)溶液移至上述(iii)的离心管，以1500rpm(200×g)离心5分钟。
(vi)除去上清液，以5,000个/cm2的播种浓度使用无血清培养基A进行播种。
需要说明的是，在增殖工序中，优选供给从人等动物组织中采取后继代至少1次(P1)的间充质干细胞。
(筛选工序)
在本发明所述的制造方法的筛选工序(也称为“第1筛选工序”。)中，从上述增殖工序后的间充质干细胞中筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。在上述的无血清培养基A中进行了增殖的增殖工序后的间充质干细胞至少维持有免疫抑制能力，甚至免疫抑制能力提高。因此，通过将这种间充质干细胞以免疫抑制能力为基准进行筛选，可以挑选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。而且，通过将挑选的间充质干细胞用作细胞制品，实现抑制免疫学的排斥反应的间充质干细胞的移植治疗而不用免疫抑制剂。
上述的无血清培养基A不含有异种蛋白质，而且，在该培养基中培养的间充质干细胞维持作为干细胞的功能。另外，在上述的无血清培养基A中培养的间充质干细胞与在含胎牛血清培养基中培养的间充质干细胞相比，增殖能力高，且显示免疫抑制效果的活性也高。因此，将在上述的无血清培养基A中培养的间充质干细胞用于移植治疗时，保持其特性的细胞增加，同时，每个细胞的活性也高，因此，可以期待协同效果。
另一方面，本发明人等担心由于上述的无血清培养基A的增殖能力的效果的致瘤性，利用体外的软琼脂培养法和体内的高灵敏度免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)的致瘤性试验法分别进行了研究。具体而言，将3批滑膜源性人间充质干细胞和1批骨髓源性人间充质干细胞在上述的无血清培养基A中进行培养，将培养细胞1,000,000个移植在软琼脂培养用的培养基及NOG小鼠的皮下10处。其结果，就软琼脂培养而言，在Hela细胞1,000个的移植中看到肿瘤集落，与此相对，3批间充质干细胞均为阴性。另一方面，就NOG小鼠而言，即使仅1个HepG2细胞混合存在，即使在检测出肿瘤结节的实验条件下，在任一移植组织中都没有看到肿瘤结节(数据未显示)。由此也明确，利用本发明制造的细胞制品在移植治疗中的有用性。
在本说明书中，“免疫抑制能力”为抑制将异种或同种细胞等进行异体移植时产生的免疫排斥反应的能力，是指通过抑制T细胞的增殖等，对各种免疫效应细胞的功能产生影响而抑制其引起的免疫反应的能力。其为抗炎症能力的一部分。在本说明书中，“维持免疫抑制能力”是指间充质干细胞本来具有的免疫抑制能力没有通过上述增殖工序而丧失，“提高了免疫抑制能力”是指在上述增殖工序的前后间充质干细胞具有的免疫抑制能力提高。
在筛选工序中，在上述增殖工序后的无血清培养基A中将进行了增殖的间充质干细胞和免疫细胞共培养，通过对共培养后的培养基中的免疫细胞数进行评价，可以筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞，但并不限定于此。例如，在使用T细胞作为免疫细胞的情况下，如后述的实施例所示，对T细胞的增加量或细胞因子的产生量进行评价，在使用B细胞或活化NK细胞作为免疫细胞的情况下，通过对这些细胞的增加量进行评价，可以筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。另外，在使用树突细胞作为免疫细胞的情况下，通过对其分化、成熟、活化等进行评价，可以筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。用于这种筛选的免疫细胞优选为T细胞、B细胞或活化NK细胞，更优选为T细胞或B细胞，最优选为T细胞。
(第2筛选工序)
本发明所述的制造方法还可以包含第2筛选工序，其从上述增殖工序后的间充质干细胞中筛选不具有致瘤性的间充质干细胞。
就在上述的无血清培养基A中进行了增殖的增殖工序后的间充质干细胞而言，不具有致瘤性的间充质干细胞选择性地增加。因此，通过将这种间充质干细胞以致瘤性为基准进行筛选，可以挑选不具有致瘤性的间充质干细胞。而且，通过将挑选的间充质干细胞用作细胞制品，实现不具有致瘤性的间充质干细胞的移植治疗。因此，本发明也可以提供一种在无血清条件下含有不具有致瘤性的间充质干细胞的细胞制品的制造方法。
关于间充质干细胞是否具有致瘤性，如在上述“筛选工序”中说明的那样，可以利用目前公知的体外的软琼脂培养法、体内的高灵敏度免疫缺陷小鼠(NOG小鼠)的致瘤性试验法等进行确认，但并不限定于这些。即，在本说明书中，“不具有致瘤性的间充质干细胞”是指利用确认上述致瘤性的有无的方法确认有不具有致瘤性的间充质干细胞。
需要说明的是，在本发明所述的制造方法中，还包含第2筛选工序的情况，进行上述第1筛选工序和该第2筛选工序的顺序没有特别限制。即，可以在第2筛选工序之前进行第1筛选工序，也可以在第2筛选工序之后进行第1筛选工序。
(血清培养工序)
本发明所述的制造方法还包含血清培养工序，其将增殖工序后的间充质干细胞在筛选工序之前、在含血清培养基中进行培养。在血清培养工序中，将在增殖工序中进行了无血清培养的间充质干细胞在含血清培养基中进行培养。在进行血清培养工序的情况，将血清培养工序后的间充质干细胞供于筛选工序。
作为在血清培养工序中使用的含血清培养基，可以使用目前公知的含血清培养基，也可以将在上述基础培养基上添加有10％FBS的含10％FBS培养基用作含血清培养基。在血清培养工序中，在这种含血清培养基上将增殖工序中得到的间充质干细胞进行播种并培养。作为培养条件，对于1ml培养基，间充质干细胞的数量优选为1～2×104个，培养温度优选为37℃±1℃，培养时间优选为48～96小时，且为5％CO2下。通过这样培养，可以有效且大量地得到在更早期发挥免疫抑制能力的间充质干细胞。
而且，将在含血清培养基中进行培养的间充质干细胞供于筛选工序，挑选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。
这样，通过将间充质干细胞在无血清培养基A中进行前培养之后，在含血清培养基中进行主培养，可得到与前培养及主培养同时在含血清培养基中进行培养的情况相同或更大的免疫抑制效果，而且，可以更早期地发挥间充质干细胞的免疫抑制效果。另外，由于仅在主培养时使用血清，因此，血清的含量少，可以实现低血清培养。
(前增殖工序)
本发明所述的制造方法还可以包含前增殖工序，其在上述增殖工序之前，在含有FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基B中使间充质干细胞增殖。
在此，上述“无血清培养基B”不含有HGF及TGF-β，在这一方面与上述“增殖工序”项中说明的无血清培养基A不同。关于HGF及TGF-β以外的成分(FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸)及基础培养基，如上述“增殖工序”项中关于无血清培养基A说明的那样，因此，在此省略说明。
另外，在一个方面，优选无血清培养基B与无血清培养基A同样含有脂质抗氧化剂。另外，无血清培养基B还可以含有表面活性剂。另外，无血清培养基B还可以含有胰岛素、运铁蛋白及硒酸盐。另外，无血清培养基B还可以含有地塞米松或其它糖皮质激素。关于这些成分，也与上述“增殖工序”项中关于无血清培养基A说明的那样，在此省略说明。
需要说明的是，就无血清培养基B中所含的上述成分的含量而言，只要为上述“增殖工序”项中关于无血清培养基A说明的含量的范围内，可以与无血清培养基A中所含的各成分的含量相同，也可以不同。
在前增殖工序中，在上述的无血清培养基B中将从人等动物组织中利用目前公知的方法分离的间充质干细胞进行播种，培养至增殖为所希望的数量。作为培养条件，优选对于1ml培养基将1～500mg的组织片(含有MSC)进行分离，将间充质干细胞进行播种，培养温度优选为37℃±1℃，培养时间优选为3～14天，且为5％CO2下。
对供于前增殖工序的间充质干细胞没有特别限制，优选为初期的间充质干细胞，即从人等动物组织中采取后根本未经过继代培养的细胞。如后述的实施例所示，通过在供于增殖工序之前、在无血清培养基B中使初期的间充质干细胞预先增殖，可以使在增殖工序中得到的间充质干细胞的数量非常显著地增加。
在一个实施方式中，作为前增殖工序中的间充质干细胞的培养方法，例如，以2×105个/cm2的播种浓度在无血清培养基B中将间充质干细胞进行播种，其后1周左右，每2天追加并添加播种时培养液量的10％的无血清培养基B，使细胞增殖至细胞数为汇合状态的70～80％。通过这样将在无血清培养基B中预先培养的间充质干细胞供于增殖工序，可以有效且大量地得到具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞。
另外，为了在前增殖工序中使间充质干细胞更有效地增殖，优选对作为在前增殖工序中进行增殖的对象的每种间充质干细胞(以下，也称为“前增殖对象细胞”)使用适于增殖的培养容器进行前增殖工序。作为适于前增殖对象细胞的增殖的培养容器的选择方法，如上述“增殖工序”项中说明的那样，因此，在此省略说明。
另外，与增殖工序同样地，在前增殖工序中，在前增殖对象细胞对于培养容器的粘附弱的情况下，在上述无血清培养基B中还可以含有细胞粘附分子。关于上述细胞粘附分子，如上述“增殖工序”项中说明的那样，因此，在此省略说明。
另外，与增殖工序同样地，在前增殖工序中，可以将间充质干细胞继代至少1次。通过在前增殖工序的中途将间充质干细胞进行继代，可以改善培养条件。需要说明的是，前增殖工序优选在原代培养(P0)～继代第3次(P3)的期间进行。关于在前增殖工序中途继代间充质干细胞的方法及将前增殖工序后的细胞供于增殖工序时的继代方法，如上述“增殖工序”项中说明的那样，因此，在此省略说明。
(培养容器选择工序)
本发明所述的制造方法还可以包含培养容器选择工序，其在上述增殖工序之前(或上述前增殖工序之前)选择适于间充质干细胞的增殖的培养容器。作为适于间充质干细胞的增殖的培养容器的选择方法，如上述“增殖工序”项中说明的那样，因此，在此省略说明。
(2)用于制造细胞制品的无血清的培养基用添加剂
本发明提供一种用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清的培养基用添加剂。本发明所述的培养基用添加剂含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸。本发明所述的培养基用添加剂可以添加于目前公知的基础培养基、作为用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清培养基(无血清培养基A)使用。
作为本发明所述的培养基用添加剂含有的磷脂，可列举例如：磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰甘油等，本发明所述的培养基用添加剂可以单独含有这些磷脂，也可以组合含有。在一个实施方式中，本发明所述的培养基用添加剂组合含有磷脂酸和磷脂酰胆碱。另外，这些磷脂可以为动物源性，也可以为植物源性。
作为本实施方式所述的培养基用添加剂含有的脂肪酸，可列举例如：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸等，本实施方式所述的培养基用添加剂可以单独含有这些脂肪酸，也可以组合含有。另外，本实施方式所述的培养基用添加剂除含有上述脂肪酸之外，还可以含有胆固醇。
本说明书中所使用的情况，FGF是指从成纤维细胞生长因子(FGF：fibroblast growth factor)家族中选择的生长因子，优选为FGF-2(bFGF)，也可以从FGF-1等其它FGF家族中选择。另外，本说明书中所使用的情况，PDGF是指从血小板衍生生长因子(PDGF：platelet derived growth factor)家族中选择的生长因子，优选为PDGF-BB或PDGF-AB。而且，本说明书中所使用的情况，TGF-β是指从转化生长因子-β(TGF-β：transforming growthfactor-β)家族中选择的生长因子，优选为TGF-β3，也可以从其它TGF-β家族中选择。
本说明书中所使用的情况，HGF是指从肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor)家族中选择的生长因子，EGF是指从细胞表皮生长因子(EGF：epidermal growth factor)家族中选择的生长因子。
另外，在一个实施方式中，无血清培养基A还可以含有选自结缔组织生长因子(CTGF：connective tissue growth factor)、血管内皮细胞生长因子(VEGF：vascular endothelial growth factor)及抗坏血酸化合物构成的组中的至少2种因子。
本说明书中所使用的情况，抗坏血酸化合物是指抗坏血酸(维生素C)或抗坏血酸2磷酸或与它们类似的化合物。
需要说明的是，本发明所述的培养基用添加剂中所含的生长因子可以为天然的，也可以为通过基因重组而制造的。
在一个方面，本发明所述的培养基用添加剂优选含有脂质抗氧化剂。在一个实施方式中，本实施方式所述的培养基用添加剂中所含的脂质抗氧化剂可以为DL-α-生育酚醋酸酯(维生素E)。本发明所述的培养基用添加剂还可以含有表面活性剂。在一个实施方式中，本实施方式所述的培养基用添加剂中所含的表面活性剂可以为普卢兰尼克F-68或吐温80。
本发明所述的培养基用添加剂还可以含有胰岛素、运铁蛋白及硒酸盐。本说明书中所使用的情况，胰岛素可以为胰岛素样生长因子，可以来自天然的细胞，也可以为通过基因重组而制造的。本发明所述的培养基用添加剂还可以含有地塞米松、或其它糖皮质激素。
(3)用于将动物细胞进行无血清培养的试剂盒
本发明提供一种用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清的培养基用添加剂。本发明所述的培养基用添加剂(培养基用添加剂A)含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸。另外，本发明所述的培养基用添加剂还可以含有细胞粘附分子。
本发明所述的培养基用添加剂试剂盒可以在同一容器内包含FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸，也可以分别包含这些成分。另外，本发明所述的培养基用添加剂试剂盒还可以含有细胞粘附分子。
关于上述细胞粘附分子，如本说明书中的上述“(1)含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法”项的“增殖工序”中说明的那样，因此，在此省略说明。
本发明所述的培养基用添加剂试剂盒可以添加于目前公知的基础培养基，作为用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清培养基(无血清培养基A)使用。
本说明书中所使用的情况，“组合物”是指在一种物质中含有各主要成分的方式，“试剂盒”是指在其它物质中含有各主要成分的至少1种的方式。因此，容易理解，本发明所述的培养基用添加剂试剂盒中所包含的生长因子、磷脂及脂肪酸与关于培养基用添加剂的上述物质相同。
另外，本发明所述的试剂盒为用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的试剂盒，至少包含本发明所述的培养基用添加剂(培养基用添加剂A)。另外，本发明所述的试剂盒还可以包含含有FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的培养基用添加剂B。需要说明的是，可以将关于“无血清培养基B”的说明换用另一词句读作关于“培养基用添加剂B”的说明。
(4)用于制造细胞制品的无血清培养基
本发明提供一种用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清培养基。本发明所述的培养基含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸。本发明所述的培养基可以作为用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的无血清培养基(无血清培养基A)使用。
本发明所述的培养基含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸即可，这些成分可以同时添加于基础培养基上，也可以分别添加。即，可以说，本发明所述的培养基含有上述的培养基用添加剂中所含的成分或培养基用添加剂试剂盒中所包含的成分即可。
就用于构成本发明所述的培养基的基础培养基而言，只要是在该领域中众所周知的动物细胞用培养基，就没有特别限定，作为优选的基础培养基，可列举例如：Ham’s F12培养基、DMEM培养基、RPMI-1640培养基、MCDB培养基等。这些基础培养基可以单独使用，也可以混合使用多种。在一个实施方式中，用于构成本发明所述的培养基的基础培养基优选将MCDB和DMEM以1:1的比率混合成的培养基。
(5)用于制造细胞制品的培养方法
本发明提供一种用于制造含有具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞的细胞制品的培养方法。本发明所述的培养方法包含在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基(无血清培养基A)中将间充质干细胞进行培养的工序(培养工序A)。可以说，本发明所述的培养方法在将间充质干细胞进行培养时，使用上述的无血清培养基即可。
另外，本发明所述的培养方法还可以包含：在上述培养工序A之前，在含有FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基B中，将间充质干细胞进行培养的工序(培养工序B)。
需要说明的是，上述“培养工序A”及上述“培养工序B”分别与本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法中的“增殖工序”及“前增殖工序”相对应。因此，将关于本说明书中的上述“(1)含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法”项的“增殖工序”及“前增殖工序”的说明分别换用另一词句读作关于“培养工序A”及“培养工序B”的说明。
在一个实施方式中，本发明所述的培养方法可以包含将FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸同时添加于基础培养基上的工序。另外，在一个实施方式中，本发明所述的培养方法可以包含将FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸同时添加于基础培养基上的工序。就上述基础培养基而言，如上所述，只要是在该领域中众所周知的动物细胞用培养基，就没有特别限定。
(6)进一步用途
如上所述，根据本发明，即使为无血清或低血清培养基，也可以以与在含血清培养基中进行培养的情况同等或以上的速度使间充质干细胞增殖，而且，维持或提高进行了增殖的间充质干细胞的免疫抑制能力。而且，就在本发明中进行了增殖的间充质干细胞而言，不具有致瘤性的间充质干细胞选择性地增加。而且，在本发明中进行了增殖的间充质干细胞的分化能力维持或提高(参照专利文献1)。因此，在将这种含有间充质干细胞的细胞制品施用于患者的情况，不仅可以实现利用间充质干细胞的优异的移植治疗，而且有效地抑制作为移植治疗的大问题之一的免疫排斥反应，减轻患者的负担，同时，可以实现稳定的治疗。另外，与使用血清制造的现有细胞制品相比，不需要考虑血清的批量差别，可以在移植治疗中实现稳定的治愈率。
还可以说，利用本发明制造的细胞制品中所含的间充质干细胞维持了间充质干细胞本来具有的对免疫效应细胞产生影响的功能，因此，还可以期待该间充质干细胞具有免疫调节作用及免疫耐受作用，将利用本发明制造的细胞制品也应用于期待有这些作用的治疗。而且，根据利用本发明制造的细胞制品，通过间充质干细胞的抗炎症作用，也可以期待作为移植治疗中的抗炎症剂的功能。另外，就本细胞制品而言，也期待抗炎症作用引起抗衰老效果。
而且，就利用本发明制造的细胞制品而言，期待：更有效地进行不仅在需要间充质干细胞的移植的地方进行施用(局部施用)的局部疾病的治疗，而且利用在静脉内等进行施用并输送至全身的全身施用，对通过骨髓移植等引起的急性GVHD等的强免疫排斥反应的治疗，使人的存活率显著地提高。另外，由于利用本发明制造的细胞制品是通过无血清培养而制造的，因此，有用的生长因子或分化因子不会与血清蛋白质一起非特异性地吸附在陶瓷等移植材料上。因此，利用本发明制造的细胞制品移植形成的组织再生能力更高，其结果，治疗效果也高。而且，不用说，也可以进行合并有局部施用和全身施用的治疗。
另外，利用本发明制造的细胞制品中所含的间充质干细胞具有维持或提高的免疫抑制能力，抑制移植时的免疫排斥反应，因此，可以应用于将自身以外的组织及细胞移植给他人的(供体和受体不同)异体移植的治疗。而且，可以说，也可以优选不仅用于使用人组织或人细胞的同种异体移植(同种移植)，而且用于使用人以外的动物组织或动物细胞的异种移植(异种移植)。
而且，利用本发明制造的细胞制品与仅使用现有的含血清培养基而得到的间充质干细胞相比，早期发挥免疫抑制效果，因此，期待在移植时早期发现治疗效果，可预料治愈率的增加。
另外，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法还可以包含血清培养工序，其将上述增殖工序后的间充质干细胞在上述筛选工序之前，在含有血清的培养基中进行培养。
另外，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法优选还包含前增殖工序，其在上述增殖工序之前，在含有FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基B中使间充质干细胞增殖。
还可以包含第2筛选工序，其从上述增殖工序后的间充质干细胞中筛选不具有致瘤性的间充质干细胞。
另外，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法优选在上述增殖工序中，使用适于上述间充质干细胞的增殖的培养容器使该间充质干细胞增殖。
另外，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法优选在上述增殖工序中，上述无血清培养基A中还含有细胞粘附分子。
另外，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法在上述增殖工序中，可以将上述间充质干细胞继代至少1次。
另外，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法优选在上述增殖工序中、在进行继代的情况下，使用不含来自哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂将上述间充质干细胞进行剥离。
另外，本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法还可以包含培养容器选择工序，其在上述增殖工序之前选择适于间充质干细胞的增殖的培养容器。
而且，在本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法中，其特征在于，上述磷脂选自由磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰甘油构成的组。
另外，在本发明所述的含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法中，其特征在于，上述脂肪酸选自由亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸构成的组。
另外，本发明所述的培养基用添加剂还可以含有细胞粘附分子。
另外，本发明所述的试剂盒还可以包含含有FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的培养基用添加剂B。
需要说明的是，在用于实施发明的方式的项中进行的具体的实施方式及以下的实施例归根结底是阐明本发明的技术内容的，不应该仅限定于这种具体实例而狭义地解释，本领域技术人员可以在本发明的精神及所附的专利权利要求内进行变更而实施。
另外，本说明书中中所记载的全部学术文献及专利文献在本说明书中作为参考被引用。
实施例
以下，利用实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不受实施例限定。
[实施例1]
进行以下的实验。
(1.细胞培养)
人骨髓源性间充质干细胞(骨髓源性hMSC)从Lonza WalKersville，Inc.(以下，Lonza社)购入，在间充质干细胞基础培养基(MSCBM)(Lonza社)中加入有间充质细胞生长添加物(MCGS)(Lonza社)的含血清培养基(MSCGM培养基)或表1所示的无血清的培养基1中进行培养。
[表1]
作为小鼠脾细胞(splenocyte)，将从日本Charles River公司购入的BALB/c(H-2d)的脾脏进行磨碎并使其溶血后，将悬浮于1％FBS/AdvancedPRM1(GIBCO社)的物质用于实验。
(2.脾脏细胞的活化)
＜2-1：有丝分裂原引起的刺激＞
在96孔板的各孔上播种小鼠脾脏细胞(1×105)，用2.5ng/ml佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(以下称为PMA)、125ng/ml离子霉素进行刺激。
＜2-2：利用CD3抗体/CD28抗体的刺激＞
在96孔板的各孔上播种小鼠脾脏细胞(1×105)，用2.5μg/ml CD3抗体、0.5μg/ml CD28抗体进行刺激。
(3.活化脾脏细胞和骨髓源性hMSC的共培养)
作为骨髓源性hMSC的前处理，在96孔板的各孔上播种骨髓源性hMSC1×104，确认贴附后(数小时至一夜培养)，使用γ射线源40装置进行γ射线照射，阻碍细胞分裂。在其上播种如上述那样进行了活化的小鼠脾脏细胞，与骨髓源性hMSC共培养。
(4.细胞增殖测定)
在从共培养开始第3天及第4天，在各孔上加入[3H]-胸腺嘧啶核苷，进一步培养8小时。使培养细胞吸附于玻璃过滤器之后，用液体闪烁计数器测定胸腺嘧啶核苷的摄取，测定细胞增殖。
(5.结果)
将骨髓源性hMSC和小鼠源性活化T细胞的共培养在含10％FBS的MSCGM培养基或作为无血清培养基A的培养基1(STK2(注册商标))中进行培养，将其结果示于图1～4。在图1～4中，数值用平均值±标准偏差表示。同样的结果由3次以上的独立的实验结果可得到。#4及#5分别表示独立的骨髓源性hMSC的结果。
图1是表示在MSCGM培养基中将小鼠源性活化T细胞和骨髓源性hMSC进行共培养时，骨髓源性hMSC对于抗CD3及抗CD28刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图，图2是表示在培养基1中将小鼠源性活化T细胞和骨髓源性hMSC进行共培养时，骨髓源性hMSC对于抗CD3及抗CD28刺激T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图。
图3是表示在MSCGM培养基中将小鼠源性活化T细胞和骨髓源性hMSC进行共培养时，骨髓源性hMSC对于PMA及离子霉素刺激(有丝分裂原刺激)T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图，图4是表示在培养基1中将小鼠源性活化T细胞和骨髓源性hMSC进行共培养时，骨髓源性hMSC对于PMA及离子霉素刺激(有丝分裂原刺激)T细胞增殖反应的免疫抑制效果的图。
如图1～4所示，在培养基1中进行培养的骨髓源性hMSC与在含有血清的MSCGM培养基中进行培养的骨髓源性hMSC同样地抑制利用有丝分裂原刺激进行活化的T细胞及利用抗CD3/抗CD28刺激进行活化的T细胞的增殖。即，使用无血清的培养基1进行培养的骨髓源性hMSC显示维持免疫抑制作用。
[实施例2]
对骨髓源性hMSC对于小鼠混合淋巴细胞反应(MLR)引起的T细胞增殖的免疫抑制效果进行了研究。实验方法以及使用的细胞及培养基与实施例1相同。作为骨髓源性hMSC的前处理，在96孔板的各孔上播种2×104的骨髓源性hMSC，与实施例1同样地进行。另外，通过在96孔板的各孔上将小鼠脾脏细胞(2×105)和小鼠骨髓源性树突细胞(BMDC)(3.3×104)进行共培养来进行小鼠脾脏细胞的活化(MLR刺激)。
需要说明的是，就用于实验的BMDC而言，为分裂被抑制的细胞，该细胞通过以下制备：由从日本Charles River公司购入的C3H(H-2K)回收骨髓细胞并使其溶血后，在放入有GM-CSF的1％FBS/AdvancedPRMI(GIBCO社)中每一天更换培养基，在培养第6天用100ng/mlLPS给予刺激并培养一夜后进行清洗，使用γ射线源40装置进行γ射线照射。
将骨髓源性hMSC在MSCGM培养基及培养基1中分别进行前培养之后，将前培养后的每个骨髓源性hMSC和如上述那样进行了活化的小鼠脾脏细胞在MSCGM培养基中进行共培养。将结果示于图5及6。图5及6是表示骨髓源性hMSC对于MLR引起的T细胞增殖的免疫抑制效果的图。数值用平均值±标准偏差表示。同样的结果由3次以上的独立的实验结果可得到。图5表示培养第3天的结果，图6表示培养第4天的结果。图中，M表示在MSCGM培养基中进行前培养之后、在含血清培养基中进行培养时的结果，S表示在培养基1中进行前培养之后、在含血清培养基中进行培养的结果。
如图5及6所示，在培养基1中进行前培养的骨髓源性hMSC与在MSCGM培养基中进行前培养的骨髓源性hMSC同样地维持活化T细胞增殖抑制效果。另外，在MSCGM培养基中进行前培养的骨髓源性hMSC在从共培养开始第4天显示免疫抑制效果，与此相对，在培养基1中进行前培养的骨髓源性hMSC在从共培养开始第3天已经显示免疫抑制效果。即，在培养基1中进行前培养的骨髓源性hMSC的一方，更早期地显示免疫抑制效果。而且，没有显示数据，但在培养基1中进行前培养的骨髓源性hMSC对于有丝分裂原刺激T细胞增殖及抗CD3/抗CD28刺激T细胞增殖也显示同样的结果。
如实施例1及2的结果所示，可以确认：在培养基1中进行培养的骨髓源性hMSC不仅维持活化T细胞的细胞增殖抑制效果，而且与在MSCGM培养基(含血清培养基)中进行培养的骨髓源性hMSC相比，更早期地发挥活化T细胞的细胞增殖抑制效果。另外，对于将在MSCGM培养基中进行前培养的骨髓源性hMSC和活化小鼠脾脏细胞进行共培养的情况，存在骨髓源性hMSC显示免疫抑制效果之前的T细胞的增殖与对照培养基(不含有骨髓源性hMSC的活化小鼠脾脏细胞的培养基)中的T细胞的增殖相比更为活跃的时期。
这样显示：在培养基1中将骨髓源性hMSC进行培养时，不仅对在短期间内使需要的数量的细胞增殖是有利的，而且也维持免疫抑制效果。由此可以说，培养基1特别是对以临床应用为目标的骨髓源性hMSC的培养是有效的。
[实施例3]
进行以下的实验。
(1.细胞培养)
人脂肪组织源性间充质干细胞(脂肪组织源性hMSC)按以下的(i)～(vii)的顺序进行分离、培养。
(i)从人体中采取脂肪组织，使用无血清DMEM培养基将脂肪组织清洗2～3次。
(ii)将清洗后的脂肪组织使用剪刀细细地剪断(1mm3)。
(iii)一边用搅拌棒进行搅拌，一边使用0.1～0.2％胶原酶(GIBCO17100-017)溶液处理脂肪组织(37℃、30～60分钟)。
(iv)使用100mm的过滤器将胶原酶处理后的脂肪组织进行过滤后，进行100×g、10分钟离心分离，将脂肪组织源性hMSC进行分离。
(v)一边用搅拌棒进行搅拌，一边使用Red lysis buffer(sigma R7757)处理离心分离后的细胞(5～10分钟)。
(vi)将Red lysis buffer处理后的细胞使用无血清DMEM培养基清洗2～3次。
(vii)将清洗后的细胞播种在培养用板(BECTON,DICKINSON(Falcon)353047)上，使用表1所示的无血清的培养基1或含有10％FBS的MEM培养基(sigmaD6046)(称为“10％FBS-MEM”。)进行培养。
(2.细胞增殖测定)
在从培养开始第8天，使用光学显微镜目视观察细胞的增殖状态。
(3.结果)
将结果示于图7。图7是表示从培养开始第8天的脂肪组织源性hMSC的增殖状态的图。在图7中，将脂肪组织源性hMSC放大为40倍进行观察。如图7所示，显示：在培养基1中进行培养的脂肪组织源性hMSC与在10％FBS-MEM中进行培养的脂肪组织源性hMSC相比，细胞数显著地(2～3倍)增加。
[实施例4]
进行以下的实验。
(1.细胞培养)
人滑膜源性间充质干细胞(滑膜源性hMSC)按以下的(i)～(iii)的顺序进行分离。
(i)从人体中采取滑膜。
(ii)将得到的滑膜细胞用PBS清洗后，在0.4％胶原酶溶液10ml中加入组织并进行混合，在37℃下反应1～4小时。
(iii)过滤后，进行离心分离。
将通过离心分离得到的初期的滑膜源性hMSC使用以下的培养基进行培养。需要说明的是，作为无血清培养基B的培养基2为从表1所示的培养基1中除去了HGF及TGF-β的培养基。
·含10％FBS的DMEM(10％FBS-DMEM)(sigma D6046，FBS；Hyclone，PS(+))
·培养基1
·培养基2
在保持于37℃的二氧化碳培养箱内(95％空气和5％CO2)进行培养。
(2.细胞增殖测定)
在从培养开始第12天(继代第0次)，使用光学显微镜目视观察细胞的增殖状态。另外，利用库尔特计数器测定细胞的数量。
(3.结果)
将结果示于图8。图8是表示培养基1及培养基2对于初期的滑膜源性hMSC的增殖促进效果的图，(a)是表示从培养开始第12天的滑膜源性hMSC的细胞数的图，(b)是表示从培养开始第12天的滑膜源性hMSC的增殖状态的图。在图8的(b)中，将滑膜源性hMSC放大为10倍进行观察。
如图8(a)的图所示，确认：对于初期滑膜源性hMSC，培养基2的增殖促进效果显著地(使用培养基1时的8倍，使用含10％FBS的DMEM时的40倍以上)高。
[实施例5]
进行以下的实验。
(1.细胞培养)
人滑膜源性间充质干细胞(滑膜源性hMSC)按照实施例4的“1.细胞培养”项所示的(i)～(iii)的顺序进行分离。
将通过离心分离得到的初期的滑膜源性hMSC使用培养基2培养11天，其后，使用以下的培养基进行培养。
·含10％FBS的DMEM(10％FBS-DMEM)(sigma D6046，FBS；Hyclone，PS(+))
·培养基1
·培养基2
在保持于37℃的二氧化碳培养箱内(95％空气和5％CO2)进行培养。
(2.细胞增殖测定)
利用库尔特计数器测定细胞的数量。
(3.结果)
将结果示于图9。图9是表示从培养开始第0天至第68天的滑膜源性hMSC的细胞数的经时变化的图。
如图9的图所示，对初期的滑膜源性hMSC，使用培养基2进行培养，其后，使用培养基1将滑膜源性hMSC进行培养，由此确认，可以使滑膜源性hMSC有效地增殖(在从培养开始第48天，与从培养开始第11天相比，为使用10％FBS-DMEM时的10万倍，从培养开始第0天至第68天，为使用培养基2时的1万倍)。
[实施例6]
进行以下的实验。
(1.细胞培养)
人滑膜源性间充质干细胞(滑膜源性hMSC)按照实施例4的“1.细胞培养”项所示的(i)～(iii)的顺序进行分离。
为了将滑膜源性hMSC进行分离、增殖，将通过离心分离得到的滑膜源性hMSC移至烧瓶，从原代培养(P0)至继代第3次(P3)，使用培养基2，在继代第1次(P1)～继代第4次(P4)之间，使用表1所示的培养基1进行培养。就培养而言，在保持于37℃的二氧化碳培养箱内(95％空气和5％CO2)进行培养。
培养中培养基的更换每周进行2次。细胞的继代以7～21天间隔进行。就滑膜源性hMSC而言，对于1ml培养基，将1～2×104个间充质干细胞进行播种，在37℃、5％CO2培养条件下使其增殖。
(2.结果)
将1g的滑膜组织在培养基2和培养基1中组合而培养，由此可以在3～4周内取得1000人份(骨关节炎的最大移植细胞数：1.5×109个)的增殖。
[实施例7]
进行以下的实验。
(烧瓶)
使用以下的烧瓶。
·烧瓶1：Falcon制75cm2烧瓶
·烧瓶2：住友胶木制75cm2烧瓶
(培养液)
使用以下的培养液。
·含10％FBS的DMEM(10％FBS-DMEM)(sigma D6046，FBS；Hyclone，PS(+))
·培养基1
·培养基1+纤连蛋白(终浓度5μg/mL)
(细胞)
使用以下的骨髓源性间充质干细胞(骨髓源性hMCS)。
·细胞1(P2)：培养细胞1×106个，在培养第12天继代的细胞。
·细胞2(P3)：培养细胞1×106个，在培养第30天继代的细胞。增殖速度慢。
·细胞3(P1)：培养细胞1×106个，在培养第12天继代的细胞。
(培养方法)
以5,000个/cm2的播种密度在以下的条件下将每个骨髓源性hMCS(细胞1～细胞3)进行培养。需要说明的是，在使用培养液3的情况，仅在播种时添加纤连蛋白。
·条件A：烧瓶1+10％FBS-DMEM(阳性对照)
·条件B：烧瓶1+培养基1
·条件C：烧瓶1+培养基1+纤连蛋白
·条件D：烧瓶2+10％FBS-DMEM(阴性对照)
·条件E：烧瓶2+培养基1
·条件F：烧瓶2+培养基1+纤连蛋白
(2.细胞增殖测定)
＜细胞1＞
在成为继代第3次的时刻，在烧瓶中播种细胞，开始培养。在从培养开始第5天，使用光学显微镜目视观察细胞的增殖状态。
＜细胞2＞
在成为继代第4次的时刻，在烧瓶中播种细胞，开始培养。在从培养开始第5天，使用光学显微镜目视观察细胞的增殖状态。
＜细胞3＞
在成为继代第2次的时刻，在烧瓶中播种细胞，开始培养。在从培养开始第5天，使用光学显微镜目视观察细胞的增殖状态。
(3.结果)
＜细胞1＞
将结果示于图10。图10是表示从培养开始第5天的骨髓源性hMSC(细胞1)的增殖状态的图。在图10中，将骨髓源性hMSC放大为40倍进行观察。
如图10所示，在条件A及条件D下，看到死细胞，也看到3成左右的粘附的细胞。另外，在条件B及条件E下，细胞局部地增殖。就在条件A及条件D下进行培养的细胞而言，细胞的粘附状态明显不同，看到2成左右的细胞的粘附。而且，在条件C及条件F下，与条件B及条件E同样地，细胞局部地增殖。在条件F下，每烧瓶看到细胞的分散，与条件B及条件E同样地，看到2成左右的细胞的粘附。
＜细胞2＞
将结果示于图11。图11是表示从培养开始第5天的骨髓源性hMSC(细胞2)的增殖状态的图。在图11中，将骨髓源性hMSC放大为40倍进行观察。
如图11所示，在条件A及条件D下，细胞2顺利地增殖，增殖为汇合状态的约7成左右。细胞的状态良好。另外，在条件B下，细胞2增殖为汇合状态的7～8成左右，在条件E下，增殖为汇合状态的9成左右，大致成为汇合状态。在条件B及条件E下，与条件A及条件D相比，细胞萎缩，形成孔样的空间。而且，在条件C及条件F下，细胞2均增殖为汇合状态的8成左右。细胞的粘附状态为与条件B及条件E相同的状态，但细胞的数量稍微减少。
＜细胞3＞
将结果示于图12。图12是表示从培养开始第5天的骨髓源性hMSC(细胞3)的增殖状态的图。在图12中，将骨髓源性hMSC放大为40倍进行观察。
如图12所示，在条件A及条件D下，细胞3增殖为汇合状态的8～9成左右，稍微成为汇合的状态。另外，在条件B及条件E下，在条件B下看到一部分细胞的剥离，此外增殖为汇合状态的8～9成左右。而且，在条件C及条件F下，与条件B及条件E相比，没有看到细胞的剥离，增殖为汇合状态的9成左右。
由以上的结果确认：在条件B及条件E下，即使在使用细胞1～3的任一个细胞株的情况下，条件E的一方，细胞增殖能力高。即，确认：就细胞1～3的增殖而言，与烧瓶1相比，烧瓶2的一方适合。
另外确认：如条件C及条件F那样，通过添加作为细胞粘附分子的纤连蛋白，细胞的粘附率提高。
[实施例8]
进行以下的实验。
(1.软琼脂集落法)
使用96孔板，在各孔上加入软琼脂培养基(DMEM-10％FCS-0.6％琼脂)，在进行凝胶化之后添加悬浮有细胞的软琼脂培养基(DMEM-10％FCS-0.4％琼脂)。就细胞而言，使用人软骨肉瘤细胞株(OUMS-27，从JCRB细胞库购入)、正常人皮肤成纤维细胞(NHDF，从龙沙社购入)，每孔的细胞播种数设定为0～10000个。人软骨肉瘤细胞株为间充质细胞进行癌化形成的。制作添加于软琼脂培养基上的培养液的血清含量为10％、20％的组。需要说明的是，在本实验中，在培养液中添加血清是因为，设定其为细胞更活跃地增殖的条件。
在从培养开始2周后，将集落利用碘硝基氯化四氮唑蓝(Sigma product.)进行染色，在显微镜下计数在各孔内所形成的集落数。对形成的集落的直径为25μm以上的集落进行计数。
(培养液)
使用以下的培养液。
·含4.5g/L葡萄糖DMEM(DMEM4.5g/L glucose)
·培养基1(参照表1)
需要说明的是，在含4.5g/L葡萄糖DMEM中，以集落形成、增殖促进为目的添加葡萄糖。就OUMS-27而言，认为在低浓度的葡萄糖培养基(1g/ml)中集落形成不好，选择含高浓度葡萄糖的培养基(市售品)用于培养。
(2.结果)
图13是表示培养基1对于正常人皮肤成纤维细胞及人软骨肉瘤细胞株的增殖的效果的图，(a)是表示从培养开始第14天的正常人皮肤成纤维细胞的集落数的图，(b)是表示从培养开始第14天的人软骨肉瘤细胞株的集落数的图。需要说明的是，图13表示尺寸为25μm以上的集落的数量。
如图13(a)的图所示，就正常人皮肤成纤维细胞而言，在使用培养基1将正常人皮肤成纤维细胞进行培养的情况下，与使用含4.5g/L葡萄糖DMEM进行培养的情况相比，所形成的集落的数量显著增加。另一方面，如图13(b)的图所示，就人软骨肉瘤细胞株而言，在使用培养基1将正常人皮肤成纤维细胞进行培养的情况下，与使用含4.5g/L葡萄糖DMEM进行培养的情况相比，所形成的集落的数量显著减少。
由该结果得知：在使用培养基1作为培养液将细胞进行培养的情况，存在正常人皮肤成纤维细胞的干细胞、即不具有致瘤性的细胞的增殖促进，另一方面，人软骨肉瘤细胞株那样的具有致瘤性的细胞的增殖被抑制。即，得知：通过使用培养基1作为培养液将细胞进行培养，选择性地抑制具有致瘤性的细胞的增殖，同时可以使不具有致瘤性的正常细胞选择性地有效地增殖。
而且，由该结果暗示：除培养液不同之外，在同一条件下实行软琼脂集落法时，使用含4.5g/L葡萄糖DMEM作为培养液的一方，与使用培养基1作为培养液的情况相比，所形成的集落的数量显著地多时，判断为该细胞是具有致瘤性的细胞，使用含4.5g/L葡萄糖DMEM作为培养液的一方，与使用培养基1作为培养液的情况相比，所形成的集落的数量显著地少时，可以判断为该细胞为不具有致瘤性的细胞。
本发明并不限定于上述的各实施方式，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更，关于将不同的实施方式中分别公开的技术的方法适当组合而得到的实施方式，也包含在本发明的技术范围内。
工业上应用的可能性
根据本发明，可以提供一种使用间充质干细胞的更安全且利用价值高的移植治疗材料，因此，可以优选应用于使用间充质干细胞的移植治疗等的再生医疗。

Claims (10)

1.一种含有间充质干细胞的细胞制品的制造方法，特征在于包含以下工序：
增殖工序，在含有FGF、PDGF、TGF-β、HGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基A中使间充质干细胞增殖；
筛选工序，从所述增殖工序后的间充质干细胞中筛选具有维持或提高的免疫抑制能力的间充质干细胞，
还包含前增殖工序，在所述增殖工序之前，在含有FGF、PDGF、EGF、至少1种磷脂及至少1种脂肪酸的无血清培养基B中使间充质干细胞增殖，
所述无血清培养基B不含有HGF及TGF-β。
2.如权利要求1所述的制造方法，特征在于还包含血清培养工序：将所述增殖工序后的间充质干细胞在所述筛选工序之前，在含有血清的培养基中进行培养。
3.如权利要求1或2所述的制造方法，特征在于还包含第2筛选工序：从所述增殖工序后的间充质干细胞中筛选不具有致瘤性的间充质干细胞。
4.如权利要求1或2所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，使用适于所述间充质干细胞的增殖的培养容器使该间充质干细胞增殖。
5.如权利要求1或2所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，所述无血清培养基A中还含有细胞粘附分子。
6.如权利要求1或2所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，将所述间充质干细胞继代至少1次。
7.如权利要求6所述的制造方法，特征在于在所述增殖工序中，在进行继代时，使用不含有来自哺乳类及微生物的成分的细胞剥离剂将所述间充质干细胞进行剥离。
8.如权利要求4所述的制造方法，特征在于还包含培养容器选择工序：在所述增殖工序之前，选择适于间充质干细胞的增殖的培养容器。
9.如权利要求1或2所述的制造方法，特征在于所述磷脂选自由磷脂酸、溶血磷脂酸、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱及磷脂酰甘油构成的组。
10.如权利要求1或2所述的制造方法，特征在于所述脂肪酸选自由亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、十四烷酸、棕榈油酸、棕榈酸及硬脂酸构成的组。
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Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI812867B (zh) 2011-11-30 2023-08-21 安斯泰來再生醫藥協會 利用血管母細胞產生間葉基質細胞之方法
GB201202319D0 (en) 2012-02-10 2012-03-28 Orbsen Therapeutics Ltd Stromal stem cells
WO2014011407A2 (en) 2012-07-12 2014-01-16 Imstem Biotechnology, Inc. Mesenchymal-like stem cells derived from human embryonic stem cells, methods and uses thereof
JP5856029B2 (ja) * 2012-08-31 2016-02-09 阿部　博幸 間葉系幹細胞を未分化増殖させる方法、および間葉系幹細胞を濃縮する方法
US8835175B2 (en) * 2012-11-13 2014-09-16 Grifols, S.A. Culture medium for human mesenchymal stem cells
JP6438457B2 (ja) 2013-04-16 2018-12-12 オルブセン セラピューティクス リミテッド シンデカン−２の医療用途
AU2014297188B2 (en) * 2013-08-01 2017-05-11 Two Cells Co., Ltd. Cartilage-damage treatment agent and method for producing same
CN103484427A (zh) * 2013-08-28 2014-01-01 中国人民解放军南京军区福州总医院 一种经卵磷脂处理的脂肪基质血管组分制备技术
EP3074506A1 (en) 2014-02-12 2016-10-05 National University of Ireland, Galway Selection and use of stem cells
JP2017506511A (ja) 2014-02-14 2017-03-09 ナショナル ユニバーシティー オブ アイルランド， ゴールウェイ 無血清培地
PH12015000014A1 (en) * 2014-06-24 2016-10-17 Stempeutics Res Pvt Ltd Methods of upscaling mesenchymal stromal cell production, compositions and kit thereof
JP6885870B2 (ja) * 2015-03-04 2021-06-16 メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル 間葉系幹細胞の細胞培養法
EP3271396B1 (en) 2015-03-20 2022-03-16 Orbsen Therapeutics Limited Modulators of syndecan-2 and uses thereof
CN104762259A (zh) * 2015-04-21 2015-07-08 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法
CN106282103A (zh) * 2015-06-03 2017-01-04 周宇璠 动物间充质干细胞免疫抑制能增强无血清培养液
CN106282102A (zh) * 2015-06-03 2017-01-04 朱轶 动物间充质干细胞无血清培养液
MY188404A (en) * 2015-12-07 2021-12-07 Kintarocellspower Co Ltd Stem cell culturing method
JP6153653B2 (ja) * 2015-12-07 2017-06-28 株式会社Ｃｅｌｌｓ Ｐｏｗｅｒ 幹細胞培養方法
JP2017104106A (ja) * 2015-12-07 2017-06-15 株式会社Ｃｅｌｌｓ Ｐｏｗｅｒ 単一種幹細胞
WO2017122095A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 Orbsen Therapeutics Limited Sdc-2 exosome compositions and methods of isolation and use
US20190167725A1 (en) * 2016-02-23 2019-06-06 University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University Composition and method for improving efficacy of stem cells
WO2017155055A1 (ja) * 2016-03-10 2017-09-14 株式会社Ｃｅｌｌｓ Ｐｏｗｅｒ 培養生成液製造方法
JP6884606B2 (ja) * 2016-03-10 2021-06-09 グラドコフ・アレクセイ 培養生成液
CN108699516A (zh) * 2016-03-10 2018-10-23 金太郎细胞力量株式会社 培养生成液制造方法
JP6611400B2 (ja) * 2016-10-31 2019-11-27 株式会社 バイオミメティクスシンパシーズ 間葉系幹細胞又は培養上清を含むシノビオリン発現阻害剤
AU2017388339B2 (en) * 2016-12-28 2024-02-29 Hiroshima University Repair agent for living tissue damage and method for producing said repair agent
KR102722188B1 (ko) 2017-07-14 2024-10-24 오르브센 테라퓨틱스 리미티드 씨디39 기질 줄기세포 단리 방법 및 용도
AU2018310000B2 (en) * 2017-07-31 2021-08-05 Two Cells Co., Ltd. Composition for cryopreservation, method for producing cryopreserved material, cell preparation, method for producing cell preparation, and kit for cryopreservation
DE202018103067U1 (de) 2018-05-30 2018-06-20 Caire Medical-Biotechnology International Co. Zur Vermehrung und Gewinnung mesenchymaler Stammzellen geeignetes serumfreies Zellkulturmedium
KR20200025210A (ko) * 2018-08-29 2020-03-10 주식회사 스템모어 모유두 세포의 배양용 조성물 및 이를 이용한 모유두 세포의 배양 방법
WO2021039943A1 (ja) 2019-08-29 2021-03-04 味の素株式会社 間葉系幹細胞を含む生体由来細胞試料から間葉系幹細胞を製造する方法
AU2020354743B2 (en) 2019-09-26 2024-05-02 Hiroshima University Method for manufacturing repairing agent for biological tissue damage, and repairing agent for biological tissue damage
CN112899223A (zh) * 2019-12-04 2021-06-04 陕西光子动力航天科技有限公司 宫血干细胞制备方法
AU2021247767A1 (en) 2020-03-30 2022-10-20 Oriental Yeast Co., Ltd. Chromosome-stabilizing agent for stem cells
US20230146066A1 (en) 2020-04-30 2023-05-11 Oriental Yeast Co., Ltd. Stem cell medium and stem cell culturing method
CN111518761B (zh) * 2020-05-25 2022-04-29 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种间充质干细胞体外筛选、激活、扩增、冻存及其细胞库建立的方法
WO2022004938A1 (ko) * 2020-06-30 2022-01-06 주식회사 미래셀바이오 유사 중간엽 줄기세포의 제조방법
AU2021337035A1 (en) 2020-09-03 2023-03-30 Two Cells Co., Ltd. Composition for treating central nervous system diseases, method for producing composition for treating central nervous system diseases, and method for producing therapeutic formulation for central nervous system diseases
KR102296986B1 (ko) * 2021-01-21 2021-08-31 정덕수 우태아혈청 성분의 유해함을 극복하기 위한 화학적으로 정의된 줄기세포배양액 개발
CN112708596A (zh) * 2021-01-22 2021-04-27 华夏源细胞工程集团股份有限公司 一种间充质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖抑制的检测方法
KR102303948B1 (ko) * 2021-03-09 2021-09-24 주식회사 스마트셀랩 중간엽 줄기세포 및 면역세포 공동배양액을 포함하는 피부 재생용 화장료 조성물
CN113832099A (zh) * 2021-10-13 2021-12-24 浙江领蔚生物技术有限公司 用于制备治疗类风湿性关节炎药物的间充质干细胞制剂
CN114292811A (zh) * 2021-12-16 2022-04-08 优赛医疗科技(天津)有限公司 免疫调节功能增强型脐带间充质干细胞、干细胞制剂及脐带间充质干细胞的制备方法
CN114736858B (zh) * 2022-06-13 2022-08-19 广东先康达生物科技有限公司 一种脐带血nkt细胞的培养液及培养方法
WO2024195863A1 (ja) * 2023-03-22 2024-09-26 ロート製薬株式会社 間葉系幹細胞増殖促進剤、間葉系幹細胞用培地、間葉系幹細胞及び培養上清

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO162160C (no) 1987-01-09 1989-11-15 Medi Cult As Serumfritt vekstmedium, samt anvendelse derav.
JPH08308561A (ja) 1995-05-16 1996-11-26 Sumitomo Electric Ind Ltd 動物細胞培養用無血清培地
JPH09191874A (ja) 1996-01-22 1997-07-29 Kurabo Ind Ltd 正常ヒトメラニン細胞培養用無血清培地
US5834418A (en) 1996-03-20 1998-11-10 Theratechnologies, Inc. Process for the preparation of platelet growth factors extract
PT1066052E (pt) 1998-03-18 2006-06-30 Osiris Therapeutics Inc Celulas estaminais mesenquimatosas para a prevencao e tratamento
IL142914A0 (en) 1998-11-09 2002-04-21 Consorzio Per La Gestione Del Serum free medium for chondrocyte-like cells
CA2393071A1 (en) 1999-12-07 2001-06-14 Monash University Long-term cell culture compositions and genetically modified animals derived therefrom
EP1325953A4 (en) * 2000-09-12 2006-03-22 Yukio Kato METHOD FOR CULTIVATING MESENCHYMAL STEM CELLS
JP2005515777A (ja) 2002-01-25 2005-06-02 ジェンザイム・コーポレーション 軟骨細胞のための無血清培地およびその使用法
EP1511838A4 (en) 2002-06-07 2007-01-10 Es Cell Int Pte Ltd METHOD FOR CONTROLLING DIFFERENTIATION IN STEM CELLS
WO2004069172A2 (en) 2003-01-30 2004-08-19 The Government of the United States of America as represented by the Department of Veterans Affairs Multilineage-inducible cells and uses thereof
US20050032122A1 (en) 2003-08-06 2005-02-10 Shiaw-Min Hwang Optimizing culture medium for CD34<+> hematopoietic cell expansion
US20060216821A1 (en) 2004-02-26 2006-09-28 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Pluripotent embryonic-like stem cells derived from corneal limbus, methods of isolation and uses thereof
JP2007536935A (ja) * 2004-05-14 2007-12-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 間葉幹細胞の無血清増殖のための細胞培養環境
JP2007000077A (ja) 2005-06-23 2007-01-11 Hitachi Medical Corp 付着性動物細胞の無血清培養方法及び付着性動物細胞の無血清培養用培地
EP1969120A4 (en) 2005-12-14 2012-05-30 Organogenesis Inc COMPOSITIONS AND TREATMENTS FOR SKIN CARE
KR101107835B1 (ko) * 2006-01-13 2012-02-09 가부시키가이샤 투셀 동물 세포의 무혈청 배양에 사용하기 위한 배양 배지 첨가물, 키트 및 이의 용도
WO2009114860A2 (en) * 2008-03-14 2009-09-17 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Activated mesenchymal stem cells for the prevention and repair of inflammatory states

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Platelet Lysates Promote Mesenchymal Stem Cell Expansion: A Safety Substitute for Animal Serum in Cell-Based Therapy Applications;CHRISTELLE DOUCET et al;《JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY》;20051231;第205卷;228－236 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2545928A1 (en) 2013-01-16
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