CN102776157A

CN102776157A - 改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞

Info

Publication number: CN102776157A
Application number: CN2012102993005A
Authority: CN
Inventors: 郭浩; 王娟; 孙勇; 王波; 文军
Original assignee: SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Current assignee: SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Priority date: 2012-08-21
Filing date: 2012-08-21
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2032-08-21
Also published as: CN102776157B

Abstract

本发明涉及一种改进的酮还原酶多肽，该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性；所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM 20587；所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。

Description

改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞

技术领域

本发明涉及一种改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞。

背景技术

去氧肾上腺素（phenylephrine）又名苯肾上腺素，其化学学名为3-（2-（N-甲基氨基）-1-羟基）苯酚。它在临床上常用于阵发性室上性心动过速，可通过收缩血管，升高血压使迷走神经反射的兴奋而心率减慢。

去氧肾上腺素的合成方法包括化学法和生物法，将其酮底物立体选择性还原成具有手性结构的产物。

采用生物法制备去氧肾上腺素需要使用具有立体选择性的酮还原酶。

然而，现有的野生型酮还原酶KRED，其催化活性很低，例如，10g/l粗酶粉20小时只能完全转化1g/l的酮底物，无法满足工业化生产的需要。

目前对于去氧肾上腺素的生物制备，还没有一种既具有一定立体选择性，又具有较好催化活性的酮还原酶。

发明内容

本发明一方面提供了一种该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；

所述酶活性是指催化酮类化合物发生还原反应生成手性醇的酶活性；

所述野生型酮还原酶多肽具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列，且来源于高加索乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM 20587；

所述改进的酮还原酶多肽包含与SEQ ID No.2所示氨基酸序列有至少90%序列同源性的氨基酸序列，并且该改进的酮还原酶多肽的氨基酸序列中对应于SEQID No.2所示氨基酸序列中的第94位残基为酪氨酸残基。

在本发明的一个具体实施方案中，所述酶活性是指催化底物1-(3-羟基苯基)-2-[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮发生还原反应生成3-（（R）-2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-羟基）的酶活性。3-（（R）-2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-羟基）的酶活性经过还原反应脱去苄基后生成去氧肾上腺素。

在本发明的一个具体实施方案中，所述改进的酮还原酶多肽具有如SEQ IDNo.4所示氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方案中，该改进的酮还原酶多肽的酶活性是所述野生型酮还原酶多肽的酶活性的至少2倍。

本发明另一方面还提供了编码上述改进的酮还原酶多肽的基因，其包含与SEQ ID No.1所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方案中，该基因具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列。

本发明再一方面还提供了一种细胞，该细胞表达上述的改进的酮还原酶多肽。

优选的,所述细胞属于乳酸杆菌或大肠杆菌。更优选的,所述乳酸杆菌属于高加索乳酸杆菌。在本发明的一个具体实施方式中,所述大肠杆菌为E.coli.BL21(DE3)。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容。因此，所举的例子并不限制本发明的保护范围。

实施例1

一、制备能够表达如SEQ ID No.4所示氨基酸序列的改进的酮还原酶多肽的宿主细胞

步骤1：全基因合成如SEQ ID No.1所示核苷酸序列

步骤2：引入对第94位氨基酸的饱和突变

为了将饱和突变引入SEQ ID No.1所示核苷酸序列，我们以含有SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的质粒pET21b-KREDlk作为PCR反应模板，并设计了以下两对引物：

上游引物F1:5’-AGGGCTGCATATGACTGATCGTTTAAAACAC-3’（SEQID No.5）

下游引物R1:5’-CTCAAGCTTTTATTGAGCAGTGTATCCACC-3’（SEQID No.6）

上游引物F1和下游引物R1序列中标注下划线处表示酶切位点：

突变引物F2:5’-CAATGCCGGAAGTNNSGTCCTCAAGAG-3’（SEQ IDNo.7）

突变引物R2:5’-CTCTTGAGGACSNNACTTCCGGCATTG-3’（SEQ IDNo.8）

突变引物F2和突变引物R2序列中标注下划线处表示突变位点的简并碱基：

以质粒pET21b-KREDlk为模板，进行第一轮PCR反应，按以下次序，将各成分在灭菌EP管中混合，采用25μl反应体系：ddH₂O 16.3μl，PCR Buffer 2.5μl,dNTP 2μl,引物F1(10μmol/L)2μl,引物R2(10μmol/L)2μl,pET21b-KREDlk 1μl,Pfu DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl。扩增条件为：94℃2min，一个循环；94℃30s，55℃30s，72℃20s，30个循环；72℃，10min，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收在300bp处的特异性条带，使用博大泰克DNA片段快速回收试剂盒进行回收。然后进行第二轮PCR反应,反应体系为：ddH₂O16.3μl，PCR Buffer 2.5μl,dNTP 2μl,引物F2(10μmol/L)2μl,引物R1(10μmol/L)2μl,pET21b-KREDlk 1μl,Pfu DNA聚合酶0.2μl。扩增条件为：94℃2min，一个循环；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃，10min，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在500bp左右的特异性条带。然后，以前二轮PCR的产物为模板，进行第三轮PCR,反应体系如下：ddH₂O 14.3μl，PCR Buffer 2.5μl,dNTP 2μl,引物F1(10μmol/L)2μl,引物R1(10μmol/L)2μl,第一轮PCR回收产物1μl,第二轮PCR回收产物1μl，PfuDNA聚合酶0.2μl。扩增条件为：94℃2min，一个循环；94℃30s，55℃30s，72℃50s，30个循环；72℃，10min，一个循环。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收在800bp左右的特异性条带。该片段中则包含了具有饱和突变的所有突变序列。

步骤3：构建突变核苷酸序列的表达载体

在含有氨苄青霉素（Amp,100μg/ml）的LB培养基中接种含有质粒pET21b的大肠杆菌Top10菌株，于37℃摇床中培养过夜。取3ml菌液转入EP管中，12000rpm离心1min，收集菌体，根据博大泰克小量质粒制备试剂盒说明书操作提取pET21b质粒。

酶切质粒pET21b的反应体系为：NEB Buffer 25μl,pET21b 43μl,NdeI 1μl,Hind III 1μl，于37℃水浴中保温4h。然后酶切步骤2获得的突变后的基因片段，依次加入如下试剂：NEB Buffer25μl,基因片段43μl,NdeI 1μl,Hind III 1μl，于37℃水浴中保温4h。随后向两个反应体系中分别加入10μl6*loading buffer，进行凝胶电泳检测，胶回收被切成线性的DNA分子。

在EP管中分别加入H₂O 3.5μl,T4ligase Buffer 1μl,pET21b(NdeI,HindIIIdigested)2μl,步骤3所得片段被NdeI,HindIII酶切过的回收产物3μl,T4DNAligase0.5μl,于16℃连接5h。

将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)菌种:取一管BL21(DE3)感受态细胞（天根生化科技有限公司），将10μl连接产物和100μl感受态细胞混合，冰水浴中放置30min，42℃热激90s,置于冰上5min，然后加入LB800μl，于37℃摇床中培养40min。14,000rpm离心，弃800μl上清，用剩余液体悬浮沉淀的细胞，涂布于含有100μg/ml Amp的LB平板上，37℃培养箱中培养12-16h即可得到转化子。

然后对转化子进行菌落PCR鉴定(使用F1，R1为引物)，将含有约800bp插入片段的转化子作为阳性克隆。于96孔深孔板中每孔加入LB+Amp培养基1ml,挑选94个阳性克隆接种入96孔板，在37℃摇床中震荡培养16h，此即为突变体库。

步骤4：将步骤3获得的酮还原酶突变体库进行诱导发酵

将培养过夜的突变体库每孔取80μl菌液接种入一个新的96孔板，该板每孔内含新鲜LB+Amp培养基1ml，细胞在37℃，160rpm条件下生长至OD₆₀₀值达到0.8~1.0，随后加入IPTG至终浓度为1.0mM，于30℃诱导培养16小时。离心，弃上清，收集菌体供检测活性。

步骤5：筛选表达酮还原酶多肽的宿主细胞（大肠杆菌BL21(DE3)/pET21b-KRED）

利用酶促反应筛选表达改进的酮还原酶多肽的宿主细胞。

0.6毫升的酶促反应体系，其中包括：10g/L2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-（3-羟基）苯乙酮，0.1g/L NADPH，1mM Mg²⁺，500mM磷酸钠缓冲溶液(pH=6.5)，10g/L步骤四离心获得的宿主细胞。于30℃反应24h，加入等体积乙腈终止反应，10,000rpm离心5min，吸取上清液至一块新的96孔板上。使用HPLC分析来检测酶活（方法：检测柱：CNW柱

波长：214nm；流动相：A相(H2O+0.1%TFA)-B相(CH3CN+0.1%TFA)，流速为1.0ml/min，等度洗脱，23%B+77%A 10.0min stop，柱温28℃），将获得的产物峰的面积与BL21(DE3)/pET21b-KREDlk发酵菌液的反应峰面积做比较，超过BL21(DE3)/pET21b-KREDlk活性30%的即为筛选出的活性有所提高的突变体。

步骤6：鉴定

为了从所筛选出的（表达改进的酮还原酶多肽）的宿主细胞中获得酮还原酶的序列，将其所对应的菌种送测序，测序结果显示含有SEQ ID No.3所示核苷酸序列，编码SEQ ID No.4所示氨基酸序列。该菌种命名为BL21(DE3)/pET21b-KREDmu。

二、验证表达本发明的一种改进的酮还原酶多肽的宿主细胞（上述步骤5获得的大肠杆菌BL21(DE3)/pET21b-KREDmu）的效果

以表达野生型酮还原酶多肽（SEQ ID No.2所示氨基酸序列）的大肠杆菌BL21(DE3)/pET21b-KREDkl作为对照，验证上述步骤5获得的宿主细胞表达的改进的酮还原酶多肽的酶活性。

制备R型苯酚产物的50ml反应体系：

10g/L 2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-（3-羟基）苯乙酮，10g/L酮还原酶菌体（大肠杆菌BL21(DE3)/pET21b-KREDkl或者大肠杆菌BL21(DE3)/pET21b-KREDmu），10g/L葡萄糖脱氢酶菌体，200g/L葡萄糖，0.1g/LNADP⁺，1mM Mg²⁺，50mM磷酸钠缓冲溶液（pH=6.0）。反应装置利用250mL的三口瓶，30℃油浴，利用磁力搅拌。首先精确称取0.5克底物和10克葡萄糖，加入到反应瓶中。然后加入40mL去离子水，1mM硫酸镁，50mM，pH6.0磷酸钠缓冲液，快速搅拌10min，使反应体系充分混匀。此时测定pH约为4.7，用2.5N的NaOH将pH调节至5.1。向体系中加入500mg酮还原酶菌体细胞，500mg葡萄糖脱氢酶菌体细胞和5mg的氧化型辅酶II（NADP⁺钠盐）。整个反应过程中pH控制在5.05-5.15之间，温度控制在30℃。反应20h后HPLC分析（如步骤5所述）。

HPLC分析结果显示：具有SEQ ID No.4所示氨基酸序列的改进的酮还原酶多肽在筛选条件下能完全转化苯乙酮底物；而具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的野生型酮还原酶只能转化10%不到的苯乙酮底物。

同时，为了确定突变体的立体选择性，使用了低浓度底物作反应，以确保底物被完全转化为产物，反应体系为：1g/L 2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-（3-羟基）苯乙酮，0.1g/L NADPH，1mM Mg²⁺，500mM磷酸钠缓冲溶液(pH=6.5)，10g/L的BL21(DE3)/pET21b-KREDkl或BL21(DE3)/pET21b-KREDmu，于30℃反应24h。反应产物进行手性HPLC分析，结果显示：突变体可以将2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-（3-羟基）苯乙酮还原为3-（（R）-2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-羟基）苯酚，其立体选择性不低于野生型酮还原酶，e.e.值>99.9%。

SEQUENCE LISTING

<110> 尚科生物医药（上海）有限公司

<120> 改进的酮还原酶多肽、其编码基因以及表达该多肽的细胞

<130> 2012hj3

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 759

<212> DNA

<213> 高加索乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM 20587

<400> 1

atgactgatc gtttaaaaca caaagtagca attgtaactg gcggtaccat gggaattggc 60

ttggcaatcg ctgataagta tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120

gctgatgtag gtgaaaaagc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180

caacacgatg tttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaaaca 240

tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaagtt gcgtcctcaa gagtgttaaa 300

gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360

ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420

atgtcatcta tcgaaggtct tgttggtgat ccatctctgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480

ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540

gttcgggtta acactgttca tccaggtcct atcaagacac aaaggcttga ccaacttgaa 600

gggtgggaag aaatgatgtc acagcggacc gtgacaccaa tgggtcgtat cggtgaacct 660

aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720

gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 高加索乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM 20587

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Tyr Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Val

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Thr

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ser Cys Val Leu

85 90 95

Lys Ser Val Lys Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Leu Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Asp Gln Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 3

<211> 759

<212> DNA

<213> 高加索乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM 20587

<400> 3

atgactgatc gtttaaaaca caaagtagca attgtaactg gcggtaccat gggaattggc 60

ttggcaatcg ctgataagta tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120

gctgatgtag gtgaaaaagc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180

caacacgatg tttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaaaca 240

tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaagtt acgtcctcaa gagtgttaaa 300

gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360

ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420

atgtcatcta tcgaaggtct tgttggtgat ccatctctgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480

ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540

gttcgggtta acactgttca tccaggtcct atcaagacac aaaggcttga ccaacttgaa 600

gggtgggaag aaatgatgtc acagcggacc gtgacaccaa tgggtcgtat cggtgaacct 660

aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720

gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759

<210> 4

<211> 252

<212> PRT

<213> 高加索乳酸杆菌Lactobacillus kefiri DSM 20587

<400> 4

Met Thr Asp Arg Leu Lys His Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Met Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Tyr Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Val

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Thr

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ser Tyr Val Leu

85 90 95

Lys Ser Val Lys Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Leu Val Gly Asp Pro Ser Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Pro Ile Lys

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Asp Gln Leu Glu Gly Trp Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Val Thr Pro Met Gly Arg Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agggctgcat atgactgatc gtttaaaaca c 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcaagcttt tattgagcag tgtatccacc 30

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

caatgccgga agtnnsgtcc tcaagag 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

ctcttgagga csnnacttcc ggcattg 27

Claims

1.一种改进的酮还原酶多肽，其特征在于，

该改进的酮还原酶多肽的酶活性高于野生型酮还原酶多肽的酶活性；

2.如权利要求1所述的改进的酮还原酶多肽，其特征在于：所述酶活性是指催化底物1-(3-羟基苯基)-2-[甲基(苯基甲基)氨基]乙酮发生还原反应生成3-（（R）-2-（N-苄基-N-甲基氨基）-1-羟基）的酶活性。

3.如权利要求1所述的改进的酮还原酶多肽，其特征在于：所述改进的酮还原酶多肽具有如SEQ ID No.4所示氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的改进的酮还原酶多肽，其特征在于：该改进的酮还原酶多肽的酶活性是所述野生型酮还原酶多肽的酶活性的至少2倍。

5.一种编码如权利要求1-4中任意一项所述改进的酮还原酶多肽的基因，其特征在于：

编码所述改进的酮还原酶多肽的基因包含与SEQ ID No.1所示核苷酸序列有至少90%序列同源性的核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的基因，其特征在于：该基因具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列。

7.一种细胞，其特征在于：该细胞表达权利要求1-4中任意一项所述的改进的酮还原酶多肽。

8.如权利要求7所述细胞，其特征在于：所述细胞属于乳酸杆菌或大肠杆菌。

9.如权利要求8所述细胞，其特征在于：所述乳酸杆菌属于高加索乳酸杆菌。

10.如权利要求8所述细胞，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli.BL21(DE3)。