CN102732520A

CN102732520A - 一种活动性肺结核病特异的血清miRNAs的制备方法

Info

Publication number: CN102732520A
Application number: CN2012101719198A
Authority: CN
Inventors: 李继承; 张星
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-05-30
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-05-30
Also published as: CN102732520B

Abstract

本发明公开了制备活动性肺结核病特异的血清miRNAs的方法，包括以下步骤：A1：活动性肺结核病患者和健康对照者血清样本的采集和临床检测；A2：提取血清样本的总RNA；A3：活动性肺结核病特异的血清miRNAs的高通量测序筛查；A4：设计miRNAs茎环反转录引物以及上游、下游引物，茎环反转录引物为SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：18，通用的上游引物为SEQ ID NO：19，下游引物为SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：28。本发明制备活动性肺结核病特异的血清miRNAs，利用高通量测序初步筛查差异表达的血清miRNAs，应用茎环方法设计特异性的反转录引物，进行荧光定量PCR方法验证得到差异表达的血清miRNAs，对研究控制肺结核病传播，降低肺结核病的发生率具有重要的意义。

Description

一种活动性肺结核病特异的血清miRNAs的制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及的是制备活动性肺结核病特异(标志性)的血清miRNAs的方法。

背景技术

全世界有20亿人感染了结核分枝杆菌，2000万人患肺结核病，其中活动性肺结核病1200万例，每年新增肺结核病(pulmonary tuberculosis，TB)患者850～920万例，死亡率达120～150万例，是单一感染因素引起死亡人数最多的疾病。在世界上22个肺结核病最严重国家中，我国位列第2位，流行形势十分严峻。我国现有肺结核病患者451万人，其中活动性肺结核病患者约130万人，新发病例145万例/年，死亡率达13万例/年，超过了其他传染病死亡人数的总和。活动性肺结核病的研究难点是缺乏特异的标志物。研究资料表明，血清和血浆中存在稳定性的miRNAs，并且miRNAs表达谱的变化具有组织和细胞特异性，适合作为肺结核病的候选生物学标记物。

但是由于miRNAs分子量小，血清中含量少，但数量巨大，传统的测序法操作复杂，费用贵，测序深度有限，效率较低，不适于miRNAs的检测。所以，miRNAs的检测和分析就成了关键问题。随着高通量测序筛查技术的发展，miRNAs的研究得到了极大提高。该测序技术可以检测17-35个核苷酸内的任何RNA，基于所测目标miRNAs的标签序列和出现频率，可以用于发现新的miRNAs及检测已知miRNAs长度和序列的微小改变。并可根据需求调整提取范围，具有速度快、成本低、覆盖度深等优点，非常适合21-25个核苷酸组成的miRNAs的测序，可获得数据库中已知的miRNAs，还能发现新的miRNAs，准确度和灵敏度高。同时，用于发掘、鉴定并定量所有物种全基因组水平的miRNAs图谱，是解密miRNAs图谱的较好方法。目前尚无应用高通量测序筛查肺结核差异表达的血清miRNAs的报道。经过高通量测序筛查的差异表达miRNAs，还需荧光定量PCR验证。由于成熟的miRNAs长度太短，不能通过实时荧光定量PCR检测，但通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针，可以精确检测微量样品中miRNAs表达。miRNAs荧光定量PCR技术是一种新的检测技术，可以对成熟miRNAs进行定量，有效区分成熟miRNAs分子和前体分子以及其它成熟miRNAs的同源分子，具有快速、简单、省时、检测灵敏度高，样品消耗少(仅需1-10ng的总RNA或50pg左右的miRNAs)，超宽的线性范围，可跨越7个数量级，是非常适合的制备差异表达的miRNAs。

发明内容

本发明所有解决的技术问题是提供制备活动性肺结核病特异的血清miRNAs的方法。

本发明的技术方案如下：

一种活动性肺结核病特异的血清miRNAs的制备方法，包括以下步骤：A1：活动性肺结核病患者和健康对照者血清样本的采集和临床检测；A2：提取血清样本的总RNA；A3：活动性肺结核病特异的血清miRNAs的高通量测序筛查；A4：设计miRNAs茎环反转录引物以及上游、下游引物，茎环反转录引物为SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：18，通用的上游引物为SEQ ID NO：19，下游引物为SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：28；A5：荧光定量PCR验证活动性肺结核病特异的血清miRNAs。

所述的方法，所述A1具体执行以下操作：收集80例活动性肺结核患者和80例健康对照者。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，4个小时以内离心(3000x g，10min，4℃)，吸上清后分装成各200μL，保存于-80℃冰箱。

所述的方法，所述A2具体执行以下操作：将活动性肺结核病患者和健康对照者血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解；用移液器吸取200μL，加入到1.5ml无RNase EP管中，加入700μL Qiagen Lysis solution，置于涡旋仪剧烈涡旋混匀至充分裂解，直到看不到白色悬浮物；室温静置5min；加140μL氯仿；剧烈混合15s，静置分层3min；看到有分层现象时12000g，15min，4℃；用移液器取上清液体(大概500μL)转移到新的1.5mL收集管中，加1.5倍上清体积的无水乙醇，上下颠倒混匀；取700μL含乙醇的裂解液加到柱子中，8000g离心18s，弃下层，重置收集管于柱上；加入700μLRWTsolution，8000g离心18s，弃下层，将柱置于一新的收集管上；加入500μL RPE，8000g离心18s，弃下层，重置收集管于柱上；加入500μL RPE，8000g离心2min，弃收集管。把柱子放入新的2ml收集管中，全速离心1min；把柱子放入1.5mL Elution管中；加入30μL RNase-Free Water，静置1min，使溶液充分与柱结合，然后8000g离心1min。

取活动性肺结核病患者和健康对照者血清总RNA样本1.0μL，经nanodrop-2000检测OD值，在紫外分光光度计上测定A260/A280数值，当其数值在1.8～2.0之间表示总RNA的纯度较好；小于1.8说明溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，而大于2.0则可能总RNA已降解；而A260/A230，则比值应在2～2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。

所述的方法，所述A3具体执行以下操作：用高通量测序筛查技术，初步筛选活动性肺结核病患者和健康对照者之间差异表达的血清miRNAs。20例肺结核病患者和20例健康对照者各提供5mL的血清；血清要求：经Agilent Bioanalyzer检测后浓度≥5ng/ul，总量≥100ng；蛋白、盐离子等杂质少，PAGE胶电泳分离比较正常；根据结果和生物信息学软件分析，如归一化和差异分析计算方法挑选差异表达miRNAs；通过聚类方法包括层次聚类，Kmeans聚类及SOM等对不同的样本进行分类，并对差异miRNAs进行相似性分析，得到差异表达的血清miRNAs。

所述的方法，所述A3具体执行以下操作：根据高通量测序筛查技术得到的初步结果，选取的miRNAs满足三个条件：①在活动性肺结核病患者或健康对照者中检测miRNAs表达量至少达到20copies；②表达差异在2倍以上；③P值有显著差异(P＜0.01)。筛选出9个miRNAs：hsa-let-7i，hsa-miR-122，hsa-miR-146a，hsa-miR-146b-5p，hsa-miR-181a-2*，hsa-miR-320c，hsa-miR-378，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-93。

所述的方法，所述A4具体执行以下操作：在miRBase数据库中找到对应miRNAs的成熟序列，用通用茎环方法设计。在通用茎环的3’端加上6个与成熟miRNAs 3’端反向互补配对的碱基，即为茎环引物，可对miRNAs进行逆转录，最后使用通用的下游引物和miRNAs特异的上游引物进行扩增。茎环引物每次逆转录只能针对一种miRNAs或者3’端6个碱基相同的miRNAs。而荧光定量上下游引物设计，下游引物为茎环上的一部分，而上游引物可以通过primer 5.0设计，上下游引物长度20bp左右，退火温度Tm值在60℃左右，GC含量约40％-60％，扩增产物长约60bp。引物设计完成后，通过lesegene 7.0对引物进行评价。以内参miR-16在活动性肺结核病患者血清样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的miR-16产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的miR-16。即此定量无污染，准确，可靠。

所述的方法，所述A5具体执行以下操作：用Fermentas反转录试剂盒进行反转录。反转录反应体系：总RNA 2.5μL，RNase抑制剂RRI 0.25μL，dNTP(10mM each)0.5μL，5×M-MuLV buffer 1.0μL，茎环引物SLP(2μM)0.5μL，M-MuLV反转录酶0.25μL，总体积5μL。分两步方法进行，第一步：65℃，5min；冰上，10min。第二步：42℃，60min；70℃，15min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。

所述的方法，所述A5具体执行以下操作：用SYBR法进行荧光定量PCR验证差异表达的血清miRNAs。荧光定量PCR体系：ddH2O 7μL，SYBR system Mix 10μL，50*ROX refenence dye 0.4μL，FP(10μM)/RP(10μM)0.8μL，Template(cDNA)1μL，总体积20μL。混匀后稍离心，在ABI 7500中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：95℃30s，然后95℃5s，60℃31s，共40个循环。

所述的方法，所述A5具体执行以下操作：miRNAs荧光定量数据分析以miR-16为内参基因，对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。miRNA表达倍数的变化公式为RQ＝2^-ΔΔCT，其中ΔΔCT＝(CT miRNA-CT miR-16)OC-(CT miRNA-CT miR-16)Mean ON。RQ代表相对表达变化量，CT miRNA和CTmiR-16分别代表同个样本中目标miRNA和内参基因miR-16的Ct值，OC代表活动性肺结核病患者，ON代表健康对照者，Mean ON代表所有正常对照组中的平均值。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照为反应体系中不加cDNA模板，以ddH₂O代替，所有荧光定量PCR均做3次重复。

所述的方法，所述A5具体执行以下操作：miRNA相对表达量分析采用GraphPadPrism 5软件，采用软件中单样本T检验和独立样本T检验。P＜0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P＜0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异。差异表达的miRNA数据处理结果以平均值±标准误差表示，绘制含误差线的散点图。

本发明制备活动性肺结核病特异的血清miRNAs，利用高通量测序初步筛查差异表达的血清miRNAs，应用茎环方法设计特异性的反转录引物，进行荧光定量PCR方法验证得到差异表达的血清miRNAs，对研究控制肺结核病传播，降低肺结核病的发生率具有重要的意义。

附图说明

图1是用荧光定量PCR的方法检测在活动性肺结核病患者血清中表达量上调的hsa-miR-378(P＜0.05)；

图2是用荧光定量PCR的方法检测在活动性肺结核病患者血清中表达量上调的hsa-miR-483-5p(P＜0.01)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

材料：总RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；荧光定量PCR反转录试剂盒购自Fermentas公司；SYBR system Mix购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；96孔板及膜购自Axygen公司。

实施例1

活动性肺结核病患者和健康对照者血清样本的采集和临床检测：

收集80例活动性肺结核患者和80例健康对照者。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，4个小时以内离心(3000x g，10min，4℃)，吸上清后分装成各200μL血清样本，保存于-80℃冰箱。

实施例2

提取所有血清样本中的总RNA：

将活动性肺结核病患者和健康对照者血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解；用移液器吸取200μL，加入到1.5mL无RNase EP管中，加入700μL Qiagen Lysis solution，置于涡旋仪剧烈涡旋混匀至充分裂解，直到看不到白色悬浮物；室温静置5min；加140μL氯仿；剧烈混合15s，静置分层3min；看到有分层现象时12000g，15min，4℃；用移液器取上清液体(大概500μL)转移到新的1.5mL收集管中，加1.5倍上清体积的无水乙醇，上下颠倒混匀；取700μL含乙醇的裂解液加到柱子中，8000g离心18s，弃下层，重置收集管于柱上(重复2次)；加入700μLRWT solution，8000g离心18s，弃下层，将柱置于一新的收集管上；加入500μL RPE，8000g离心18s，弃下层，重置收集管于柱上；加入500μL RPE，8000g离心2min，弃收集管。把柱子放入新的2mL收集管中，全速离心1min；把柱子放入1.5mL Elution管中；加入30μL RNase-Free Water，静置1min，使溶液充分与柱结合，然后8000g离心1min。

取活动性肺结核病患者和健康对照者血清总RNA样本1.0μL，经nanodrop-2000检测OD值，在紫外分光光度计上测定A260/A280数值，测定结果总RNA浓度在5～10ng/μL之间，A260/A280数值在1.2～1.9之间。

实施例3：用高通量测序筛查技术，初步筛选活动性肺结核病患者和健康对照者的血清差异表达的miRNAs。

20例肺结核病患者和20例健康对照者各提供20mL的血清；血清要求：经AgilentBioanalyzer检测后浓度≥5ng/ul，总量≥100ng；蛋白、盐离子等杂质少，PAGE胶电泳分离比较正常；根据结果和生物信息学软件分析，如归一化和差异分析计算方法挑选差异表达miRNAs；通过聚类方法包括层次聚类，Kmeans聚类及SOM等对不同的样本进行分类，并对差异miRNAs进行相似性分析，得到差异表达的血清miRNAs。

所述的方法，高通量测序筛查技术得到的初步结果，在活动性肺结核病患者血清中检测到236个miRNAs，健康对照者中检测到254个miRNAs；活动性肺结核病患者和健康对照者共有91个差异表达的血清miRNAs，在肺结核病患者中有44个miRNAs表达量上调，47个miRNAs表达量下调。选取的miRNAs满足三个条件：①在活动性肺结核病患者或健康对照者中检测miRNAs表达量至少达到20copies；②表达差异在2倍以上；③P值有显著差异(P＜0.01)。筛选出9个miRNAs：hsa-let-7i，hsa-miR-122，hsa-miR-146a，hsa-miR-146b-5p，hsa-miR-181a-2*，hsa-miR-320c，hsa-miR-378，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-93。

实施例4：设计miRNAs茎环反转录引物以及上游、下游引物。

在miRBase数据库中找到对应miRNAs的成熟序列，hsa-let-7i(MIMAT0000415UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU)，hsa-miR-122(MIMAT0000421UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG)，hsa-miR-146a(MIMAT0000449UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU)，hsa-miR-146b-5p(MIMAT0002809UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU)，hsa-miR-181a-2*(MIMAT0004558ACCACUGACCGUUGACUGUACC)，hsa-miR-320c(MIMAT0005793AAAAGCUGGGUUGAGAGGGU)，hsa-miR-378(MIMAT0000732ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG)，hsa-miR-483-5p(MIMAT0004761AAGACGGGAGGAAAGAAGGGAG)，hsa-miR-93(MIMAT0000093CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG)。

用通用茎环方法设计。在通用茎环的3’端加上6个与成熟miRNAs 3’端反向互补配对的碱基，即为茎环引物，即：

hsa-let-7i：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACAGC，

hsa-miR-122：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAACA，

hsa-miR-146a：

GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAACCCA，

hsa-miR-146b-5p：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCCTA，

hsa-miR-181a-2*：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGTACA，

hsa-miR-320c：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCTC，

hsa-miR-378：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTTCT，

hsa-miR-483-5p：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCCCT，

hsa-miR-93：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCT；

可对miRNAs进行逆转录。

茎环引物每次逆转录只能针对一种miRNAs或者3’端6个碱基相同的miRNAs。而荧光定量上下游引物设计，下游引物为茎环上的一部分，而上游引物可以通过primer5.0软件设计，上下游引物长度20bp左右，退火温度Tm值在60℃左右，GC含量约40％-60％，扩增产物长约60bp。引物设计完成后，通过lesegene 7.0对引物进行评价。使用通用的下游引物和miRNAs特异的上游引物进行扩增。

通用的下游引物是：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，

上游引物：hsa-let-7i(5’-CTCGGCCTGAGGTAGTAGTTTG-3’)，

hsa-miR-122(5’-CGCGGTGGAGTGTGACAATG-3’)，

hsa-miR-146a(5’-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3’)，

hsa-miR-146b-5p(5’-ATGGCCTGAGAACTGAATTCC-3’)，

hsa-miR-181a-2*(5’-ATCTGTCACCACTGACCGTTG-3’)，

hsa-miR-320c(5’-ATGCCAAAAGCTGGGTTGA-3’)，

hsa-miR-378(5’-GATAATACTGGACTTGGAGTC-3’)，

hsa-miR-483-5p(5’-TCTCGGAAGACGGGAGGA-3’)，

hsa-miR-93(5’-CGCGGCAAAGTGCTGTTC-3’)，

以内参miR-16在活动性肺结核病患者血清样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的miR-16产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板(NTC)对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的miR-16。即此定量无污染，准确，可靠。

实施例5

荧光定量PCR验证活动性肺结核病相关的血清miRNAs。

用Fermentas反转录试剂盒进行反转录。反转录反应体系：总RNA 2.5μL，RNase抑制剂RRI 0.25μL，dNTP(10mM each)0.5μL，5×M-MuLV buffer 1.0μL，茎环引物SLP(2μM)0.5μL，M-MuLV反转录酶0.25μL，总体积5μL。分两步方法进行，第一步：65℃，5min；冰上，10min。第二步：42℃，60min；70℃，15min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。

荧光定量PCR体系：ddH₂O 7μL，SYBR system Mix 10μL，50*ROX refenence dye0.4μL，FP(10μM)/RP(10μM)0.8μL，Template(cDNA)1μL，总体积20μL。混匀后稍离心，在ABI 7500中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：95℃30s，然后95℃5s，60℃31s，共40个循环。

miRNAs荧光定量数据分析以miR-16为内参基因，对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量。miRNA表达倍数的变化公式为RQ＝2^-ΔΔCT，其中ΔΔCT＝(CT miRNA-CT miR-16)OC-(CT miRNA-CT miR-16)Mean ON。RQ代表相对表达变化量，CT miRNA和CT miR-16分别代表同个样本中目标miRNA和内参基因miR-16的Ct值，OC代表活动性肺结核病患者，ON代表健康对照者，MeanON代表所有正常对照组中的平均值。实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照为反应体系中不加cDNA模板，以ddH₂O代替，所有荧光定量PCR均做3次重复。

miRNA相对表达量分析采用GraphPad Prism 5软件，采用软件中单样本T检验和独立样本T检验。P＜0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P＜0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异。差异表达的miRNA数据处理结果以平均值±标准误差表示，绘制含误差线的散点图。

鉴定结果：

活动性肺结核病患者和健康对照者血清样本的采集和临床检测

共收集80例活动性肺结核患者和80例健康对照者。结核病患血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，离心。吸上清后分装成各200μL血清样本，保存于-80℃冰箱。最终入选样本保证男女性比率、年龄、活动性肺结核病原暴露史、疫苗接种和皮肤PPD测试在健康对照者和活动性肺结核病患中相似。病例基本信息见表1。^aP值表示在两组之间做T检验，^bP值表示在两组之间做χ²检验。

表1活动性肺结核患病例及健康对照临床病理信息

提取血清样本的总RNA

由于血清样本中总RNA富集度较低，通过Qiagen试剂盒提取200μL的血清可得到总RNA的浓度5～10ng/μL之间，A260/A280数值在1.2～1.9之间。由于含量较低，因此我们一般不进行凝胶电泳检测，并主要将总RNA反转录成cDNA用于荧光定量PCR。在血清样本中的总RNA具有异常稳定性，可以耐受反复冻融，酸碱处理，DNase处理等。血清样本中总RNA的NanoDrop-2000测定结果见表2。

表2血清样本中总RNA的NanoDrop-2000测定结果

活动性肺结核病特异的血清miRNAs的高通量测序筛查

用高通量测序筛查技术分析了20例肺结核病患者和20例健康对照者血清miRNAs。高通量测序筛查技术得到的初步结果，在活动性肺结核病患者血清中检测到236个miRNAs，健康对照者中检测到254个miRNAs；活动性肺结核病患者和健康对照者血清中小RNAs的种类见表3；活动性肺结核病患者和健康对照者血清中miRNAs的数量见表4。活动性肺结核病患者和健康对照者共有91个差异表达的血清miRNAs，在肺结核病患者中有44个miRNAs表达量上调见表5，47个miRNAs表达量下调见表6。

表3应用高通量测序筛查技术分析活动性肺结核病患者和健康对照者血清中小RNAs的种类

表4应用高通量测序筛查技术分析活动性肺结核病患者和健康对照者血清中miRNAs的数量

表5应用高通量测序筛查技术分析在活动性肺结核病患者血清中表达量上调的

表6应用高通量测序筛查技术分析在活动性肺结核病患者血清中表达量下调的

选取的miRNAs满足三个条件：①在活动性肺结核病患者或健康对照者中检测miRNAs表达量至少达到20copies；②表达差异在2倍以上；③P值有显著差异(P＜0.01)。筛选出9个miRNAs：hsa-let-7i，hsa-miR-122，hsa-miR-146a，hsa-miR-146b-5p，hsa-miR-181a-2*，hsa-miR-320c，hsa-miR-378，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-93。

设计miRNAs茎环反转录引物以及上游、下游引物：

在通用茎环法中有14对碱基形成茎结构，16个碱基形成环结构，这个茎环具有很高的稳定性。在通用茎环的3’端加上6个与成熟miRNAs 3’端反向互补配对的碱基，即为茎环引物，可对miRNAs进行逆转录，最后使用通用的下游引物和miRNAs特异的上游引物进行扩增。茎环引物每次逆转录只能针对一种miRNAs或者3’端6个碱基相同的miRNAs。而荧光定量上下游引物设计，反向引物为茎环上一部分，而上游引物可以通过primer 5.0设计，上下游引物长度20bp左右，退火温度Tm值在60℃左右，GC含量约40％-60％，扩增产物长约60bp。引物设计完成后，可以通过lesegene 7.0对引物进行评价。对9个血清miRNAs经荧光定量PCR后的表达结果和分析，以内参miR-16在活动性肺结核病患者血清样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好。对扩增的miR-16产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板(NTC)对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的miR-16。即此定量无污染，准确，可靠。

荧光定量PCR验证活动性肺结核病特异的血清miRNAs

对荧光定量PCR所得的数据进行分析，得出活动性肺结核病患者和健康对照者之间的血清miRNAs相对表达差异倍数，再用GraphPad Prism 5统计分析软件中的Mann-Whitney方法进行检验，分析血清miRNAs在两组样本血清中的差异表达在统计学上是否具有显著性差异(P＜0.05)。对60例活动性肺结核病患者和60例健康对照组血清中9个miRNAs进行了验证，结果发现hsa-miR-378和hsa-miR-483-5p在肺结核病组和健康对照组之间具有显著性差异(分别为P＜0.05和P＜0.01)，差异在2倍以上，Ct值＜35，检测率＞75％(图1和图2)。

本发明一种活动性肺结核病特异的血清miRNAs的制备方法，用于检测活动性肺结核病患者和健康对照者之间差异表达的血清miRNAs，具有较高的特异性和准确性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据以上说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种活动性肺结核病特异的血清miRNAs的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1：活动性肺结核病患者和健康对照者血清样本的采集和临床检测；A2：提取血清样本的总RNA；A3：活动性肺结核病特异的血清miRNAs的高通量测序筛查；A4：设计miRNAs茎环反转录引物以及上游、下游引物，茎环反转录引物为SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：18，通用的上游引物为SEQ ID NO：19，下游引物为SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：28；A5：荧光定量PCR验证活动性肺结核病特异的血清miRNAs。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A1具体执行以下操作：收集80例活动性肺结核患者和80例健康对照者。所有参加者血样为晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，4个小时以内离心：3000x g，10min，4℃；吸上清后分装成各200μL，保存于-80℃冰箱。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述A2具体执行以下操作：将活动性肺结核病患者和健康对照者血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解；用移液器吸取200μL，加入到1.5ml无RNase EP管中，加入700μL Qiagen Lysis solution，置于涡旋仪剧烈涡旋混匀至充分裂解，直到看不到白色悬浮物；室温静置5min；加140μL氯仿；剧烈混合15s，静置分层3min；看到有分层现象时12000g，15min，4℃；用移液器取上清液体转移到新的1.5mL收集管中，加1.5倍上清体积的无水乙醇，上下颠倒混匀；取700μL含乙醇的裂解液加到柱子中，8000g离心18s，弃下层，重置收集管于柱上，重复2次；加入700μLRWT solution，8000g离心18s，弃下层，将柱置于一新的收集管上；加入500μL RPE，8000g离心18s，弃下层，重置收集管于柱上；加入500μL RPE，8000g离心2min，弃收集管。把柱子放入新的2ml收集管中，全速离心1min；把柱子放入1.5mL Elution管中；加入30μL RNase-Free Water，静置1min，使溶液充分与柱结合，然后8000g离心1min，重复2次。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述A3具体执行以下操作：用高通量测序筛查技术，初步筛选活动性肺结核病患者和健康对照者之间差异表达的血清miRNAs；20例肺结核病患者和20例健康对照者各提供5mL的血清；血清要求：经Agilent Bioanalyzer检测后浓度≥5ng/ul，总量≥100ng；蛋白、盐离子等杂质少，PAGE胶电泳分离比较正常；根据结果和生物信息学软件分析，如归一化和差异分析计算方法挑选差异表达miRNAs；通过聚类方法包括层次聚类，Kmeans聚类及SOM等对不同的样本进行分类，并对差异miRNAs进行相似性分析，得到差异表达的血清miRNAs。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述A3具体执行以下操作：根据高通量测序筛查技术得到的初步结果，筛选出9个miRNAs：hsa-let-7i，hsa-miR-122，hsa-miR-146a，hsa-miR-146b-5p，hsa-miR-181a-2*，hsa-miR-320c，hsa-miR-378，hsa-miR-483-5p，hsa-miR-93。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述A4具体执行以下操作：在miRBase数据库中找到对应miRNAs的成熟序列，用通用茎环方法设计；在通用茎环的3’端加上6个与成熟miRNAs 3’端反向互补配对的碱基，即为茎环引物，可对miRNAs进行逆转录，最后使用通用的下游引物和miRNAs特异的上游引物进行扩增；茎环引物每次逆转录只能针对一种miRNAs或者3’端6个碱基相同的miRNAs；而荧光定量上下游引物设计，下游引物为茎环上的一部分，而上游引物可以通过primer 5.0设计，上下游引物长度20bp左右，退火温度Tm值在60℃左右，GC含量约40％-60％，扩增产物长约60bp；引物设计完成后，通过lesegene 7.0对引物进行评价；以内参miR-16在活动性肺结核病患者血清样本中扩增为例，观察扩增情况，扩增曲线平滑且随着循环数的增加，荧光信号具有明显的对数期，而空白对照无连续曲线生成，说明扩增情况良好；对扩增的miR-16产物做溶解曲线，有且只有一个明显的单峰，而无模板对照无明显波峰出现，说明经扩增后产物是特异的miR-16；即此定量无污染，准确，可靠。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述A5具体执行以下操作：用Fermentas反转录试剂盒进行反转录；反转录反应体系：总RNA 2.5μL，RNase抑制剂RRI 0.25μL，dNTP(10mM each)0.5μL，5×M-MuLV buffer 1.0μL，茎环引物SLP(2μM)0.5μL，M-MuLV反转录酶0.25μL，总体积5μL。分两步方法进行，第一步：65℃，5min；冰上，10min。第二步：42℃，60min；70℃，15min；反应完毕后，保存于-80℃冰箱。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述A5具体执行以下操作：用SYBR法进行荧光定量PCR验证差异表达的血清miRNAs；荧光定量PCR体系：ddH₂O7μL，SYBR system Mix 10μL，50*ROX refenence dye 0.4μL，FP(10μM)/RP(10μM)0.8μL，Template(cDNA)1μL，总体积20μL；混匀后稍离心，在ABI 7500中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：95℃30s，然后95℃5s，60℃31s，共40个循环。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述A5具体执行以下操作：miRNAs荧光定量数据分析以miR-16为内参基因，对目标基因进行归一化处理，已确保相等数量的样品中比较目标基因的量；miRNA表达倍数的变化公式为RQ＝2^-ΔΔCT，其中ΔΔCT＝(CT miRNA-CT miR-16)OC-(CT miRNA-CT miR-16)Mean ON。RQ代表相对表达变化量，CT miRNA和CT miR-16分别代表同个样本中目标miRNA和内参基因miR-16的Ct值，OC代表活动性肺结核病患者，ON代表健康对照者，Mean ON代表所有正常对照组中的平均值；实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照为反应体系中不加cDNA模板，以ddH₂O代替，所有荧光定量PCR均做3次重复。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述A5具体执行以下操作：miRNA相对表达量分析采用GraphPad Prism 5软件，采用软件中单样本T检验和独立样本T检验；P＜0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异，P＜0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异；差异表达的miRNA数据处理结果以平均值±标准误差表示，绘制含误差线的散点图。