CN102725638A - 生物化学血清标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测未知生物样品中的可溶性BAG3蛋白的存在和/或浓度的方法且测定优选地利用抗体通过ELISA测定来进行，所述抗体优选为单克隆抗体。呈可溶形式的所述蛋白的存在与心脏病相关或与胰腺肿瘤的存在相关。
Description
发明领域
本发明属于诊断血清标志物的技术领域。
现有技术
BAG3(RefSeq：NP_004272；基因ID 9531)是74kDa的胞浆蛋白，尤其集中于粗面内质网中。最近已描述了40kD的胞浆形式与突触体相关(Brown等人.，2008)。并且，在大肠杆菌(E.coli)中表达了重组形式和一些缺失突变体(Rose等人2007(a))。
在人类中，bag3基因表达在肌细胞、少数其它正常细胞类型以及一些癌症(白血病和淋巴瘤、骨髓瘤、胰腺癌和甲状腺癌、黑素瘤、骨肉瘤等)中是组成型的(Romano等人，2003；Homma等人.2006；Chiappetta等人.，2007，Rosati等人.，2007)，并在多种细胞类型中响应于不同的应激原被诱导：暴露于高温的胰腺癌系(Liao等人.2001)，与重金属一起孵育或经受高温的HeLa细胞(Pagliuca等人.，2003)，用氧化应激诱导剂马来酸二乙酯处理的白细胞(Bonelli等人.，2004)，被光损伤的鼠类视网膜细胞(Chen等人.，2004)，用低强度超声处理的Molt-4细胞(人类白血病T细胞)(Tabuchi等人.，2006)，暴露于HIV-1病毒的人类小胶质细胞(Rosati等人.，2007a)。这些发现表明BAG3表达的调控是针对应激的细胞应答中的重要组成部分，并且与bag3基因的启动子中对在多种形式的细胞应激中激活的转录因子HSF(热休克因子)1反应的元件的存在相一致。HSF1活性的调节导致BAG3蛋白的细胞水平的显著降低，表明该调控子在bag3的表达中起重要作用(Franceschelli等人.，2008)。EGR1是参与bag3表达的调控的另一转录因子(Gentilella等人.，2008)。
BAG3影响原发癌细胞的存活的第一个证据来自对原发性白血病细胞的研究，所述原发性白血病细胞来自患有B细胞慢性淋巴样白血病(B-CLL)的24位患者和患有急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的11位儿童：通过使用特异性反义寡脱氧核苷酸来降低BAG3水平导致了凋亡小体的100％以上的增加(p＜0.001)，还描述于EP 1465927A1和U.S.7,537,760B2中。因此与未处理的细胞和用相同的化疗药物处理的细胞相比较，这些细胞中的凋亡的百分比显著增高(Leone和Turco，2001，Romano等人.，2003a，2003b)。在正常白细胞中，证明该基因的过表达证明显著降低了凋亡应答(Bonelli等人.，2004)。
随后，人类甲状腺组织的分析显示正常组织和甲状腺肿样品检验为BAG3表达阴性，而癌症样品明显地检验为阳性，且在间变性肿瘤中观察到较高的BAG3表达。
在其他肿瘤中，诸如骨肉瘤和黑素瘤细胞，bag3特异性siRNA导致基底细胞的降低的存活，显示了与化疗剂的显著协同作用；小鼠中移植的人类黑素瘤细胞中的BAG3敲低显著降低了肿瘤生长，且提高了动物的存活(Ammirante等人.，出版中)。另一方面，bag3过表达导致了用化疗药物处理的或暴露于其他促凋亡刺激物的癌细胞的降低的凋亡(Rose等人.，2007(b))。
虽然已在不同的细胞系统中检测了胞浆BAG-3的存在，且发现其与肿瘤(例如，白血病或甲状腺癌)相关，以及更通常与细胞存活相关，但目前为止BAG3的可溶形式从未被描述，且其在血清中的存在从未与心区不适的状况相关联。
因此，本发明解决了鉴定BAG-3蛋白的新型分泌型可溶形式的问题，和其在人类和其他哺乳动物中产生的问题，其以令人惊奇的特异性和灵敏的方式与特定的疾病状况相关。
发明概述
本发明涉及用于检测未知生物样品中的可溶性BAG3蛋白的存在和/或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
a.获得生物样品，其由血清或血浆组成，
b.确定所述生物样品中可溶性BAG3的存在或浓度，
c.将获自样品的值与参考值或获自生物参考样品的值相比较，
d.任选地，进一步确定相似值的组(和可能地其进一步分成具有统计学上差异的平均值的组)，
e.将可溶性BAG3的存在和/或水平与病理状况相关联，其中所述病症是心脏病或胰腺癌。
优选地，定量步骤(b)利用抗体通过ELISA来进行，所述抗体优选地是单克隆的。可选地，可溶性蛋白可分离自患者的血清。
所提出的测定方法允许心脏病患者组与健康人组的统计学显著的分离，优选地在相当的年龄的组中。还可将所述患有心脏病的患者分层到处于增高的风险(心力衰竭，HF)的患者的亚组中。
附图描述
图1.显示大鼠中正常心脏组织中的和诱导梗死之后的BAG3蛋白的表达的免疫组织化学切片。
图2.利用抗BAG3抗体对来自心肌细胞的裂解物和上清液进行的蛋白质印迹。
图3.利用抗BAG3抗体对从患有慢性缺血性心脏病的患者的血清中纯化的可溶性蛋白的蛋白质印迹分析。
图4.用于BAG3检测的ELISA的校准曲线。
图5.根据年龄组，健康供体中BAG3血清浓度的图解表示。
图6.分成年龄组的健康供体中和患者中的BAG3血清浓度的图解表示。
图7.用于在患有心力衰竭的患者中检测BAG3蛋白的ELISA检验的ROC曲线。
图8.与患有非代偿失调的心脏病的患者相比较具有心力衰竭的诊断的患者中的BAG3血清浓度的图解表示。
图9.a)在存在或不存在LPS下，在用增高的剂量的可溶性重组BAG-3刺激的鼠类巨噬细胞(J774)中iNOS(诱导型一氧化氮合酶)蛋白和用于比较的对照蛋白(GAPDH)的产生，b)在相同的细胞类型中用格里斯试剂(Griess reagent)确定亚硝酸盐。
图10.rBAG3蛋白与J774细胞的表面结合的共聚焦显微镜分析。
发明详述
本发明基于与先前关于胞内形式所描述的功能(细胞周期和凋亡的调控)相比较具有非预期的生物活性的BAG3蛋白的可溶性形式的发现：例如由细胞主动分泌的该形式可激活单核细胞/巨噬细胞。
发现可溶性形式还是对于某些病理状况尤其是心脏病和胰腺癌高度特异性的血清生物化学标志物。因此本发明的目的是BAG3蛋白的可溶性形式和在由血清组成的生物样品中验证其水平以确定上述病理情况的存在的方法。
关于可溶性BAG3，其意为由细胞主动分泌的BAG3的形式，例如，如通过其与胰腺癌细胞(Panc-1)中的外来体的结合和通过其在活肿瘤细胞系的上清液中的存在(台盼蓝排除测定)所示，所述活肿瘤细胞系诸如Hep G2细胞(人类肝细胞癌)、C6细胞(大鼠成胶质细胞瘤)ASPC-1细胞(人类胰腺腺癌，human pancreatic adenocarcinoma)、ARO细胞(间变性甲状腺癌)、HT-29细胞(结直肠腺癌)和完全相同的Panc-1细胞，从而显示可溶性BAG3并不通过细胞死亡后培养基中的细胞内容物的释放而产生。
并且，可溶性BAG3在心肌细胞中的氧化应激的诱导后释放(或分泌)，且可例如通过SDS-PAGE从患有心脏病的患者的血清中被定量地纯化为分子量约75kD的形式。
因此，在生物样品中，因为可溶性BAG3的存在独立于细胞的存在，可将其与胞浆形式相区分。
事实上，例如，发现甲状腺瘤活检中的BAG3蛋白高于正常组织中的，但免疫组织化学染色仅在胞浆中检测到该蛋白。
根据可溶性BAG3作为病理状况的血清标志物的用途，本发明涉及通过使用单克隆抗体或多克隆抗体作为优选的捕捉剂和/或检测剂检测所述形式的存在和量的方法。
单克隆和多克隆抗BAG3抗体描述于EP 1465927A1和U.S.7,537,760B2中。
根据一个优选的实施方案，本方法包括以下步骤：
a.获得生物样品，其由血清或血浆组成，
b.确定所述生物样品中可溶性BAG3的浓度
c.将获自所述样品的结果与参考值或与获自参考血清样品的值相比较，
d.任选地，确定具有统计学上无差异的可溶性血清BAG-3平均值的患者的亚组(例如，21-43岁的患者组和44-65岁的组)，
e.将可溶性BAG3的水平或存在与选自心脏病或胰腺癌中的病理状况相关联。
定义心脏病指心绞痛、不稳定心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、急性冠心病(acute coronary disease)、急性心力衰竭、慢性心力衰竭和医源性心脏病。
根据一个优选的实施方案，生物样品是血清或血浆且是人类来源的。其还可获自任选地补充有例如具有抗凝活性的物质的全血。
生物样品中BAG3的存在优选地通过免疫学方法来确定，且甚至更优选地利用抗BAG3单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体(例如，ScFv片段、双抗体，等)来确定。
根据一个优选的实施方案，抗体是单克隆的且识别BAG3序列(RefSeq：NP_004272；基因ID 9531)中的表位，所述表位包括片段18-33、385-399或533-547。甚至更优选地，抗体是U.S.7,537,760中鉴定的那些抗体或本文所描述的于2002年12月17日保藏在热那亚高级生物技术中心(Advanced Biotechnology Center of Genoa)的亲代杂交瘤编号PD02009的亚克隆；可选地，它们可以是所述抗体的衍生物，比如重组形式和/或人源化的形式。
根据另一个实施方案，还可使用商业的抗BAG3抗体(例如：山羊抗Bag3多克隆抗体，Abcam；兔抗Bag3多克隆抗体，Abcam；小鼠抗Bag3单克隆抗体，Abcam；兔抗人类Bag3多克隆抗体，Abcam；小鼠抗人类Bag3单克隆抗体，克隆5A8，Abgent；抗Bag3多克隆抗体，AbnovaCorporation；山羊抗Bag3多克隆抗体，Abnova Corporation；小鼠抗Bag3多克隆抗体，Abnova Corporation；兔抗人类Bag3多克隆抗体，AtlasAntibodies；山羊抗Bag3/BIS/CAIR1多克隆抗体，Everest Biotech；山羊抗Bag3多克隆抗体，GeneTex；兔抗人类Bag3多克隆抗体，GeneTex；山羊抗人类Bcl-2-结合蛋白BIS(BAG3)多克隆抗体，LifeSpan BioSciences；兔抗人类Bcl-2-结合蛋白BIS(BAG3)多克隆抗体，LifeSpan BioSciences；山羊抗Bag3多克隆抗体，Novus Biologicals；小鼠抗人类Bag3多克隆抗体，Novus Biologicals；兔抗Bag3多克隆抗体，Novus Biologicals；兔抗人类Bag3多克隆抗体，Novus Biologicals；山羊抗人类BAG3/BIS/CAIR1多克隆抗体，Raybiotech，Inc.；兔抗人类Bag3多克隆抗体，Proteintech Group，Inc.；由Atlas Antibodies Antibody，Sigma-Aldrich提供的兔抗人类BAG3金标抗体；等)，优选地它们是单克隆的。
免疫学测定优选地是ELISA，其中第一捕捉配体是抗体，甚至更优选地选自识别BAG3的序列中对应于氨基酸18-33、385-399或533-547的表位的单克隆抗体；用于检测的第二抗体，其识别不同于捕捉抗体所识别的表位的表位，其可以是单克隆的、至少两个单克隆抗体的混合物或多克隆抗体。
虽然优选的测定实施方案包括抗BAG3抗体的使用，利用不同于抗体的BAG3结合分子可获得相同的结果，所述BAG3结合分子例如可溶性受体或天然配体或合成配体。
用于检测的配体可进而由抗体所识别，例如，用荧光团、生色团或能够将底物转化为生色团的酶所标记，从而用于目测生物样品中BAG3的存在的抗体；可选地，可直接将抗体与所述生色团基团相连。
可鉴定同样有效检测和/或测量可溶性BAG3的水平的不同的反应方案。例如，对于捕捉，可能使用第一抗体，例如，抗BAG3单克隆抗体，优选地选自由亲代克隆PD2009产生的单克隆抗体(识别BAG3序列的单一表位，且尤其是分别来自氨基酸18-33、385-399或533-547的氨基酸序列的AC-1、AC-2或AC-3)。对于检测，可能使用第二抗体，其可以是单克隆抗体或多克隆抗体(如果其是多克隆的，抗体优选地名为TOS-2，如由Rosati等人.，2007(a)所描述的，针对用作免疫原的完整重组蛋白所产生)或获自亲代克隆PD2009但不同于用于捕捉的抗体的单克隆抗体，比如，例如，AC-2或AC-3，或二者的混合物，其识别不同于AC-1所识别的表位的表位(分别对应于BAG3蛋白的氨基酸序列385-399和533-547)。
本领域中的技术人员可确定以上BAG3捕捉和/或检测方案的变化，即使所用的单克隆抗体或多克隆抗体不同于优选的测定实施方案所描述的那些，所述变化包括在本发明中。例如，该方法包括使用来源于上述单克隆抗体的抗体，比如以重组形式表达的那些抗体(诸如，例如，ScFv片段、微抗体(minibody)、双抗体等)或例如通过人源化修饰的那些抗体，等等。
一般，根据夹心方案进行可溶性BAG3的检测，其中血清中的可溶性蛋白与固定于固相上的第一分子(BAG3配体，捕捉步骤中)相互作用，然后与第二分子相互作用，所述第二分子通过在不同的位点的水平处结合已与捕捉配体结合的可溶性BAG3蛋白而允许直接或间接的比色检测或荧光检测。第二配体称作检测配体。
该方法还包括一个测定实施方案，其中使第一捕捉剂或第二检测剂吸附、粘附或共价结合于基质(也称固相)，例如微量滴定板或珠子或试管壁。
可选地，在分子分离(例如，通过SDS-PAGE)和随后的抗体识别之后也可在血清中检测可溶性BAG3，例如，通过蛋白质印迹，或通过对基于分子量所分离的蛋白的测序来进行检测。
所提出的测定方法允许将心脏病患者组与健康患者组分离，优选地在相当年龄的组中。并且，其将相同的心脏病患者分层，鉴定了具有更不利的预后的处于更高的风险(心力衰竭)的患者的亚群体。
对于心脏病，所选择的心脏病状将，例如，选自由以下组成的组：心绞痛、不稳定心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、来自药物的心脏损害，等。
以下报告了正常的或病理状态的特征性血清BAG3的值，所述值仅作为实例，因为它们随测定所用的方案而变化。可溶性BAG3的浓度为平均2.38ng/ml±0∶32，然而在21岁至43岁的年龄组中，BAG3的平均血清浓度为3.13ng/ml(±0.50)，而在44岁和65岁之间的供体中其为1.80ng/ml(±0.40)。
在具有心脏病的临床诊断(不同类型和等级的)的患者的血清中，可溶性BAG3蛋白在包括49岁到81岁(平均年龄：68.04±6.9)的年龄范围中存在，所检测的BAG3的浓度为平均8.30ng/ml±0∶58。
在罹患胰腺腺癌的患者中，可溶性BAG-3的浓度一般高于10ng/ml，平均为130.8ng/ml(±59.4)。
根据另一方面，本发明涉及可溶性人类BAG3蛋白作为病理状况的标志物的用途。具体地，病理状况是心脏病并选自由以下组成的组：心绞痛、不稳定心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭、医源性心脏损害等，或胰腺瘤，优选地为腺癌。
不受任何特定理论所束缚地，胰腺细胞和心肌细胞的BAG3分泌可代表对于应激的“生理性”细胞应答，在心脏的情况下，所述应激来源于病原损伤，和在胰腺腺癌的情况下，所述应激来源于氧和/或其他营养素的缺乏。
而且，本发明涉及可溶性人类BAG3蛋白激活免疫系统的靶细胞、优选哺乳动物巨噬细胞的用途，因为BAG2是高度保守的蛋白。
实验部分
实施例1.从亲代杂交瘤中分离AC-1、AC-2、AC-3克隆
通过从于2002年12月17日以编号PD02009保藏于热那亚高级生物技术中心并在U.S.7,537,760中被描述的亲代杂交瘤进行亚克隆来分离单克隆抗体AC-1、2和3，并通过对培养基进行ELISA测定来选择它们。
实施例2.从患有心脏病的患者的血清中纯化可溶性BAG3蛋白
通过蛋白质印迹分析罹患慢性缺血性心脏病的患者的血清。凝胶洗脱对应于75KD的条带(参见图1a)并通过质谱法(MALDI/MS)对通过胰蛋白酶消化获得的片段进行分析，并通过“MASCOT”软件进行鉴定。一些肽序列的分析(图1b)允许将蛋白鉴定为BAG3样的。实施例3.在大鼠中开发心肌应激模型
将重约220-250克的斯普拉格-道利雄性大鼠(Charles RiverLaboratories，Italy)用腹膜内注射口服戊巴比妥(60mg/kg)进行麻醉，且然后施插管术。在前侧剖胸术之后，使心脏外置并进行冠状动脉降支近前束的缝合。对照动物经历同样的程序但不连接动脉。在程序之后次日，通过经胸壁超声心动图根据涉及左心室的至少35％的大梗死的存在对所有存活者进行选择(IM组)。然后通过标准程序处死大鼠并用福尔马林处理左心室以用于免疫组织化学程序。图显示了代表对照组和IM组的BAG3蛋白表达数据。
图2显示了用实施例1中描述的BAG3特异性单克隆抗体获得的免疫组织化学的结果：在通过主动脉的暂时性闭塞诱导梗死之后，在来自大鼠的心脏组织中观察到了BAG3蛋白水平的显著增高。
然后蛋白质印迹分析显示了BAG3蛋白在暴露于由PEITC(异硫氰酸苯酯)诱导的氧化应激的心肌细胞的上清液中释放(图3)。
在该实验中，将以80％汇合接种并在37℃下在5％CO2气氛中在无血清培养基中孵育的大鼠心肌细胞用10μM PEITC处理图中所指示的时间。
在实验结束后，收获细胞并进行处理。利用抗BAG3抗体(TOS-2和AC-1)通过蛋白质印迹分析蛋白裂解物以评价胞内BAG3的表达水平，并将抗GAPDH抗体用作上样对照(图3A)；在图3B中，收集上清液，用丙酮沉淀(1∶9体积)并通过蛋白质印迹进行分析。
在Hep G2(人类肝细胞癌)、C6(大鼠成胶质细胞瘤)、Panc-1(人类胰腺腺癌)、ARO(间变性甲状腺癌)和HT-29(结直肠腺癌)细胞系的上清液中也检测了BAG3的存在。BAG3由所检验的多种肿瘤细胞系释放，但不在正常原代细胞诸如HUVEC(人类脐带内皮细胞)的培养基中释放。
实施例4.用于在血清中测量BAG-3的ELISA检验的开发
为检验BAG3蛋白在患有心脏病的患者的血液中是否是可检测的，利用按以下描述所制备的BAG3重组蛋白作为校准物开发了ELISA检验。
所检验的BAG3特异性抗体的不同组合为：
a)：
-第一单克隆抗体克隆AC-1，其被设计以识别BAG3蛋白的氨基酸18-33的序列(DRDPLPPGYEIKIDPQ)；
-称为TOS-2的第二多克隆抗体，其通过利用完整重组蛋白(RefSeq：NP_004272)作为免疫原而开发，其替代地用作由AC-1抗体捕捉的BAG3蛋白的检测物；
b)：
-第一单克隆抗体克隆AC-1；
-称为AC-2的第二单克隆抗体，其被设计以识别BAG3蛋白的氨基酸385-399的序列(SSPKSVATEERAAPS)并用作检测物；
c)：
-第一单克隆抗体克隆AC-1；
-称为AC-3的第二单克隆抗体，其被设计以识别BAG3蛋白的氨基酸533-547的序列(DKGKKNAGNAEDPHT)并用作检测物；
d)：
-第一单克隆抗体克隆AC-1；
-AC-2和AC-3抗体的混合物，用作检测物；
e)：
-第一单克隆抗体克隆AC-2；
-作为检测物：AC-1，或AC-3，或AC-1和AC-3抗体的混合物；
f)：
-第一单克隆抗体克隆AC-3；
-作为检测物：AC-1，或AC-2，或AC-1和AC-2抗体的混合物。
所检验的所有组合能够以定量的方式通过ELISA检验鉴定患者的血清中的可溶性BAG-3的存在。图4中的示例性实例显示了利用在添加3％牛血清白蛋白(BSA)的盐水溶液中重新构成的梯状浓度(scalarconcentration)的重组BAG3蛋白产生校准曲线。
重组蛋白由编码BAG3蛋白的cDNA所产生，所述cDNA对应于NCBIPubMed序列：NM_004281.3人类的核苷酸1-2608，通过从获自乳腺癌细胞系MCF-7的总RNA进行PCR而扩增且然后利用限制酶NcoI/XhoI克隆到表达载体pET 30a(+)(Novagen)中。
将所得的与6个组氨酸残基融合的重组蛋白在大肠杆菌中表达，并利用HisTrap HP柱(GE Healthcare)通过亲合色谱法进行纯化。
然后通过添加含AC-1抗体的溶液使96孔微量培养板官能化，随后用封闭溶液处理以防止非特异性相互作用。然后以图中所示浓度添加重组蛋白，通过多克隆抗体TOS-2来显示。通过使用与氢过氧化物酶(HR)缀合的抗兔第二抗体并随后添加TMB试剂(eBioscience，UK)而获得信号。
证实该测定对于分析患有心力衰竭的患者的血清中的可溶性BAG3蛋白的存在是有用的。
实施例5.对患有心脏病和胰腺癌的患者的血清进行的ELISA测定的验证
从健康供体中收集血清以检查未患任何种类的显性疾病的受试者中BAG3的血清浓度。供体的年龄范围为21岁到65岁。所检测的BAG3的浓度为平均2.38ng/ml±0.32。
存在轻微的年龄相关的浓度差异。具体地，在21-43岁组中，BAG3的平均血清浓度为3.13ng/ml(±0.50)，而在44岁和65岁之间的供体中其为1.80ng/ml(±0.40)(图5)。
然后收集来自具有心脏病的临床诊断(不同类型和等级的)的38位患者的血清以分析可溶性BAG3蛋白的存在。所检查的患者的年龄范围在49岁和81岁之间(平均年龄68.04±6.9)。所检测的BAG3的浓度为平均8.30ng/ml±0∶58。
患有心脏病的患者和健康供体之间的差异在总体患者中和在相同年龄范围的患者中，均是高度显著的(图6)。
并且，在患有心脏病的患者中识别了两个群体，其由患有或未患心力衰竭的受试者组成，并且以BAG3蛋白的不同的血清水平为特征，如图8中所描述，图8图解显示了与患有非代偿失调的心脏病的患者相比较具有心力衰竭的诊断的患者中的BAG3的血清浓度。
并且，在一些患有胰腺癌、结肠癌或肺癌的患者中也测量了可溶性BAG-3的血清水平。仅在患有胰腺癌的患者中测量了高于70ng/ml的血清水平，如以下表1中所示。
表1.癌症患者的血清中的可溶性BAG-3的水平
实施例6.确定ELISA测定的灵敏度和特异性
然后通过统计分析的程序分析所获得的数据以确定用于检测患有心力衰竭的患者中的BAG3蛋白的ELISA测定的灵敏度和特异性的值。
利用2.76ng/ml作为截断值，灵敏度值和特异性值分别为83.3％和77.08％，而阳性预测值和阴性预测值分别为75％和88.1％。图7显示了利用指定的截断值获得的ROC曲线。
实施例7.可溶性BAG3蛋白的功能活性的表征
使用重组BAG3蛋白进行巨噬细胞激活测定，以确定在血清中释放的蛋白对血细胞的可能作用。出于该目的，用不同浓度的重组BAG3蛋白处理鼠类单核细胞J774细胞系，利用促炎剂诸如脂多糖(LPS)作为阳性对照。以60％汇合接种J774细胞并与单独的或与浓度为10ng/ml的LPS组合的浓度为250ng/ml，500ng/ml和1mg/ml的重组BAG3蛋白孵育24小时。
在实验结束后，收获细胞并进行处理。利用抗iNOS抗体(iNOS：诱导型一氧化氮合酶)通过蛋白质印迹分析蛋白裂解物以评估酶的表达水平，并将抗GAPDH的抗体用作上样对照。数据显示于图9a)中。
并且，利用格里斯试剂(1％氨苯磺胺，0.1％萘乙二胺，5％磷酸)来证实培养基中与单核细胞激活相关联的亚硝酸盐的产生，并在BeckmanDU-62分光光度计中在550nM处进行测量(图9b)。
图9b)显示了浓度在500ng/ml时的重组蛋白与对照(由未处理的细胞组成)相比较将亚硝酸盐的产生提高了三倍(p＜0.001)；并且其活性是剂量依赖的(图9a和b))。
然后利用FluoroTag FITC缀合试剂盒(Sigma)将BAG3重组蛋白与FITC缀合。将相等的量的BSA-FITC(阴性对照)和rBAG3-FITC添加到培养基中，持续1小时。然后用3.7％的甲醛溶液固定细胞并通过Zeiss LSM共聚焦显微镜进行分析。
通过使用与荧光团缀合的重组蛋白验证BAG3蛋白与J774细胞的表面的结合(图10)。BAG3结合是特异性的，因为当使用其他蛋白例如BSA替代BAG3时未观察到BAG3结合。
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Claims (15)
1.用于在未知生物样品中检测可溶性BAG3蛋白的存在和/或浓度的方法，所述方法包括以下的步骤：
a.获得生物样品，所述生物样品由血清或血浆组成，
b.确定所述生物样品中可溶性BAG3的存在或浓度值，
c.将获自所述样品的所述值与参考值或与获自生物参考样品的值相比较，
d.任选地，进一步确定相似值的分组或分成具有统计学上差异的平均值的组，
e.将可溶性BAG3的存在和/水平与病理状况相关联，所述病理状况优选地选自由以下病状组成的组：心脏病或胰腺癌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定步骤b)利用可溶性BAG3的特异性配体来进行。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述生物样品是人类来源的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将抗凝血物质添加到所述生物样品中。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述特异性配体是抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述确定步骤b)通过单克隆的、多克隆的或重组的抗BAG3抗体或其片段(scFv、双抗体、微抗体)来进行。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗体是单克隆的且识别选自由以下的氨基酸序列组成的组的至少一个BAG3表位：BAG3的一级序列的18-33、385-399或533-547，或是其人源化的或其他通过重组修饰的重组衍生物。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述抗体或配体利用荧光团、生色团或能够将底物转化为生色团的酶来标记。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述确定步骤b)使用BAG3捕捉配体和检测配体利用夹心ELISA来进行，其中第一和第二均是单克隆抗体，并且其中第二抗体识别不同于所用的捕捉抗体所识别的表位的表位，或是几个单克隆抗体的混合物。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其中所述病理状态是心脏病。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述心脏病(步骤(e))选自由以下组成的组：心绞痛、梗死前心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭或医源性心脏病。
12.人类可溶性BAG3蛋白作为与氧化应激相关的病理状态的血清标志物的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述病理状态是心脏病或胰腺癌。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述心脏病选自由以下组成的组：心绞痛、梗死前心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、急性冠心病、急性心力衰竭、慢性心力衰竭和医源性心脏病。
15.一种试剂盒，所述试剂盒在由血清组成的生物样品中检测和定量可溶性BAG3，并鉴定癌症或心脏病患者中的病理状态，所述试剂盒包括识别选自由以下的氨基酸序列组成的组的BAG-3表位的至少一种抗体或其人源化的或其他通过重组修饰的重组衍生物：18-33、385-399或533-547(关于BAG3的一级序列)，和用于定量所述样品的标准BAG3蛋白，优选地是重组蛋白。
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