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CN102712906B - 分化细胞的新型制备方法 - Google Patents

分化细胞的新型制备方法 Download PDF

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CN102712906B CN201080042161.7A CN201080042161A CN102712906B CN 102712906 B CN102712906 B CN 102712906B CN 201080042161 A CN201080042161 A CN 201080042161A CN 102712906 B CN102712906 B CN 102712906B
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Abstract

本发明的目的在于提供一种扩增期望的分化阶段的细胞而制备特定细胞的方法。本发明提供一种特定细胞的制备方法，该方法是分化诱导细胞而制备特定细胞的方法，其中，为了扩增期望的分化阶段的细胞，在该期望的分化阶段的细胞内使癌基因强制表达。进一步地，还提供一种特定细胞的制备方法，抑制由在该期望的分化阶段的细胞内表达的癌基因而诱导的、癌基因诱导性细胞衰老(OIS)。

Description

分化细胞的新型制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备特定的分化细胞的方法以及根据该方法制备的细胞。尤其，本发明涉及一种制备分化的血球细胞的方法以及根据该方法制备的血球细胞。
背景技术
在为了治疗患者而需要特定的细胞时，需要确保能够达到治疗目的的充足数量的细胞。然而，由于从机体获取用于治疗的充足量的细胞较为困难，因此尝试了在机体外例如从其前体细胞等分化诱导目的细胞而制备的方法等。
在治疗与血液相关的疾病时，或者在进行外科治疗时，需要用于治疗的血球细胞。在血球细胞中，尤其血小板、前血小板(proplatelet)作为血液凝固(止血)所必须的细胞，进一步地巨核细胞作为产生血小板的细胞，是需求特别大的细胞。特别是血小板在白血病、骨髓移植、抗癌治疗等方面需要的量较多，且稳定供给的必要性高。迄今为止，为了确保血小板的供给，除了通过从献血者的血液中提取的方法外，采用了给予如TPO的类似物(mimetics)制剂的方法、从脐带血或骨髓细胞分化出巨核细胞的方法等。进一步地，尝试了在机体外扩增造血干细胞或造血前体细胞，从这些前体细胞制备血球细胞的方法等。例如，目前报道有从小鼠ES细胞建立造血干细胞株的方法(专利文献1)、从灵长类动物的胚胎干细胞向造血细胞分化的方法(专利文献2)或者在机体外简便且稳定地扩增维持造血干细胞的未分化性的CD34阳性/CD38阴性细胞的方法(专利文献3)等。
并且，在分化诱导细胞时，多功能干细胞的有用性很高。ES细胞和iPS细胞等多功能干细胞能够作为人工制备血小板等血球细胞的来源(source)而利用。近年来，由于iPS细胞的建立，多功能干细胞的有用性在再生医疗中作为细胞疗法的重要来源而进一步受到了关注。迄今为止，例如Takayama等人成功地从人类ES细胞分化诱导出巨核细胞以及血小板，其结果，出现了作为血小板输血源而利用从ES细胞分化的血小板的可能性(专利文献4以及非专利文献1)。进一步地，发明者们已确立从iPS细胞制备巨核细胞以及血小板的方法，可以解决在ES细胞来源的血小板的输血中难以回避的白血球抗原(human leukocyte antigen，HLA(人类白细胞抗原))的相容性问题。并且，以往，对于从献血者的血液提供的血小板而言，由于献血人数的持续不足等而难以稳定地供给充足的血小板，对于该问题，也认为可以通过从ES细胞或者iPS细胞分化诱导血小板而解决。但是，在迄今为止的方法中，从iPS细胞或者ES细胞制备的血小板由于制备量较少，且每次制造时都要通过一系列工艺才能制备，因此目前期望将以往的方法改善成确保血小板量的稳定性的有效的方法。
为了稳定地提供充足的这种巨核细胞和血小板等血球细胞而需要解决的问题，可以说在其他细胞的供给中也存在。
在通过细胞分化诱导而制备期望的细胞时，同样由于不容易大量制备期望的细胞的前体细胞，因此在目前阶段，最终难以确保充足量的分化的期望细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-141356号公报
专利文献2：日本特开2004-350601号公报
专利文献3：日本特开2006-61106号公报
专利文献4：WO2008/041370
非专利文献
非专利文献1：Takayama等，Blood，111：5298-5306 2008
发明内容
技术问题
虽然本发明的发明者们已确立关于血球细胞的从iPS细胞获得巨核细胞以及血小板的方法，但是在将该方法临床应用时，需要改善成能够大量产生巨核细胞以及血小板的方法。并且，如果着眼于将来的临床应用，则能够迅速应对血小板的供应需要，并且可以进行稳定的供应，也是重要的因素。
因此，鉴于上述方面，本发明提供一种方法，该方法为了通过分化诱导细胞而制备目的细胞，提高处于期望的分化阶段的细胞的增殖能力，扩增细胞数，从该细胞制备目的细胞。
进一步地，本发明通过使用上述方法而提供期望的分化的血球细胞。尤其，本发明提供成为成熟巨核细胞和血小板来源(source)的、作为血球细胞的、增殖能力高的巨核前体细胞及其制备方法。
并且，本发明的目的在于，提供从该巨核前体细胞大量且稳定地制备成熟巨核细胞和血小板的方法，以及通过这些方法制备的成熟巨核细胞以及从该成熟巨核细胞分化诱导的血小板。
并且，由于对于红血球细胞也指出了与血小板同样地稳定供给的必要性，因此提供红血球细胞的制备方法以及通过该方法制备的红血球，也作为本发明的目的。
进一步地，本发明的目的在于，提供一种长期保藏作为成熟巨核细胞的未成熟状态的细胞的巨核前体细胞的方法，该成熟巨核细胞作为血小板的前体细胞。
技术方案
发明者们比较通过四种基因(Oct3/4，SOX2，KLF-4，c-MYC)建立的iPS细胞和通过除了c-MYC的三种基因(Oct3/4，SOX2，KLF-4)建立的iPS细胞的巨核细胞以及血小板产生能力，明确了通过四种基因的iPS细胞更有意义且有效地产生巨核细胞以及血小板。进一步地，明确了建立时导入的四种基因的表达虽然在iPS细胞状态下被抑制，但是伴随巨核细胞的分化，诱导了c-MYC基因的再活化，参与巨核细胞的产生量的增加。进一步地，还明确了使c-MYC基因强制性表达的多核化前的巨核前体细胞获得高的增殖能力。
并且，一般使c-MYC等癌基因在细胞中过表达时，会加快细胞周期，使增殖活跃进行。已知，细胞对该增殖作为压力而捕获，诱导抑制该增殖的防御反应(oncogene-induced senescence，OIS：癌基因诱导性细胞衰老)，抑制过剩的细胞增殖。本发明的发明者等人进一步着眼于该现象，发现通过调控处于分化阶段的细胞的OIS而大量制备特定分化的细胞的方法。
本发明是基于以上见解而完成的。
即，本发明涉及以下(1)～(30)。
(1)一种特定细胞的制备方法，该方法是分化诱导细胞而制备特定细胞的方法，其中，为了扩增期望的分化阶段的细胞，在该期望的分化阶段的细胞内使癌基因强制表达。
(2)如上述(1)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，抑制由于在期望的分化阶段的细胞内使癌基因强制表达而诱导的、癌基因诱导性细胞衰老。
(3)如上述(1)或(2)所述的特定细胞的制备方法，所述癌基因诱导性细胞衰老的抑制是通过使多梳基因表达而实现的。
(4)如上述(1)至(3)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述期望的分化阶段的细胞是从胚胎干细胞或者诱导多能干细胞分化诱导的细胞。
(5)如上述(1)至(4)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，在所述期望的分化阶段的细胞内，导入外源癌基因、或者癌基因以及多梳基因，使该癌基因、或者该癌基因以及该多梳基因强制表达。
(6)如上述(5)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，在期望的分化阶段的细胞的前体细胞中导入所述外源癌基因或者多梳基因，使该癌基因、或者该癌基因以及该多梳基因强制表达。
(7)如上述(5)或(6)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，将所述癌基因和/或多梳基因分别可发挥作用地连接到诱导型启动子的下游，使该癌基因、或者该癌基因以及该多梳基因诱导性强制表达。
(8)如上述(5)至(7)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，为了促进所述期望的分化阶段的细胞的分化，抑制该期望的分化阶段的细胞内的癌基因或者、癌基因以及多梳基因的表达。
(9)如上述(8)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述癌基因、或者癌基因以及多梳基因的表达抑制是，通过分别可发挥作用地连接到抑制型启动子的下游，抑制该基因表达而实现的。
(10)如上述(1)至(9)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述癌基因为MYC家族基因。
(11)如上述(3)至(10)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述多梳基因为BMI1基因。
(12)如上述(6)至(11)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述期望的分化阶段的细胞的前体细胞是造血前体细胞，所述期望的分化阶段的细胞是多核化前的巨核前体细胞，所述特定细胞是成熟巨核细胞。
(13)如上述(6)至(11)中任意一项所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述期望的分化阶段的细胞的前体细胞是造血前体细胞，所述期望的分化阶段的细胞是多核化前的巨核前体细胞，所述特定细胞是血小板。
(14)如上述(12)或(13)所述的特定细胞的制备方法，其特征在于，所述造血前体细胞是存在于从胚胎干细胞或者诱导多能干细胞制备的网状结构物内的细胞。
(15)一种成熟巨核细胞，该成熟巨核细胞是如上述(12)或(14)所述的特定细胞。
(16)一种血小板，该血小板是如上述(13)或(14)所述的特定细胞。
(17)一种血液制剂，该血液制剂将记载于上述(16)的血小板作为有效成分。
(18)一种试剂盒，用于制备如上述(15)或(16)所述的成熟巨核细胞或者血小板。
(19)一种强制表达癌基因的期望的分化阶段的血球细胞。
(20)如上述(19)所述的血球细胞，进一步强制表达多梳基因。
(21)如上述(19)或(20)所述的血球细胞，其特征在于，所述期望的分化阶段的血球细胞是从胚胎干细胞或者诱导多能干细胞分化诱导的细胞。
(22)如上述(19)至(21)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，在所述期望的分化阶段的血球细胞内，导入外源癌基因、或者癌基因以及多梳基因，使癌基因、或者癌基因以及多梳基因强制表达。
(23)如上述(22)所述的血球细胞，其特征在于，将所述外源癌基因或者多梳基因导入到期望的分化阶段的血球细胞的前体细胞内，使该癌基因、或者该癌基因以及该多梳基因强制表达。
(24)如上述(22)或(23)所述的血球细胞，其特征在于，将所述癌基因和/或多梳基因分别可发挥作用地连接到诱导型启动子的下游，使该癌基因、或者该癌基因以及该多梳基因诱导性强制表达。
(25)如上述(19)至(24)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，所述癌基因为MYC家族基因。
(26)如上述(20)至(25)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，所述多梳基因为BMI1基因。
(27)如上述(23)至(26)中任意一项所述的血球细胞，其特征在于，所述期望的分化阶段的血球细胞的前体细胞是造血前体细胞，所述期望的分化阶段的血球细胞是多核化前的巨核前体细胞。
(28)如上述(27)所述的血球细胞，其特征在于，所述造血前体细胞是存在于从胚胎干细胞或者诱导多能干细胞制备的网状结构物内的细胞。
(29)一种冷冻细胞组合物，包含如上述(19)至(28)中任意一项所述的血球细胞。
(30)一种试剂盒，用于制备作为如上述(27)或(28)所述的血球细胞的多核化前的巨核前体细胞。
有益效果
根据本发明，能够扩增处于期望的分化阶段的细胞，并且可以大量地制备从该扩增的细胞分化的特定的细胞。
进一步地，当将本发明用在制备分化的血球细胞时，可以从多功能干细胞稳定且大量制备例如巨核细胞以及血小板等血球细胞。
并且，根据本发明而制备的血球细胞可以冷冻保藏。因此，如果作为血球细胞，例如制备多核化之前的巨核前体细胞，则由于能够冷冻保藏这些细胞，因此可以提供来源于相同来源的巨核前体细胞的成熟巨核细胞以及血小板。
尤其，根据本发明的方法，从iPS细胞能够大量制备可冷冻保藏的多核化前的巨核前体细胞(成熟巨核细胞的前体细胞)。其结果，如果将该多核化前的巨核前体细胞作为来源，则可以回避HLA相容性问题，并且可以制备并提供能够充分应对反复输血的量的血小板。
进一步地，根据本发明可以提供在体外(in vitro)稳定供给红血球细胞的方法。
附图说明
图1为比较从四种基因来源的iPS细胞和三种基因来源的iPS细胞产生的巨核细胞数的图表。纵轴表示将培养后第22天的ES细胞来源的CD42b阳性巨核细胞数作为1的各细胞来源的CD42b阳性巨核细胞数。横轴表示iPS细胞以及ES细胞的从培养开始的天数。3-f表示三种基因来源的细胞株，4-f表示四种基因来源的细胞株。ES表示ES细胞。
图2示出人类iPS细胞来源的巨核细胞中导入的基因的再活化的确认。对于未分化iPS细胞以及分化的巨核细胞确认了四种因子来源的iPS细胞(TkDA3-2、TkDA3-4以及TkDA3-5)和三种因子来源的iPS细胞(TkDN4-M)中的各导入基因(Oct3/4，SOX2，KLF-4，c-MYC)的表达。并且，作为基因导入的对照，还对导入了各基因的人类皮肤纤维芽细胞(HDF)确认了其表达。endo表示内源性基因，Tg表示导入的基因。对于未分化iPS细胞，还确认了REX1和NANOG的表达。
图3示出ES细胞来源的造血前体细胞中由于c-MYC的强制性表达而增加了巨核细胞数的情况。从培养人类ES细胞后第15天的网状结构物提取血液前体细胞，分别单独导入基因(OCT3/4，SOX2，KLF-4，c-MYC)，此后随时间计数产生的巨核细胞数。纵轴表示将只导入病毒载体的造血前体细胞(mock)来源的CD42b阳性巨核细胞数作为1时的、各细胞来源的CD42b阳性巨核细胞数。横轴表示ES细胞的从培养开始的天数。
图4为比较从四种基因来源的iPS细胞和三种基因来源的iPS细胞产生的血小板数的图表。纵轴表示将培养后第21天的ES细胞来源的血小板数作为1的各细胞来源的血小板数。横轴表示iPS细胞以及ES细胞的从培养开始的天数。3-f表示三种基因来源的细胞株，4-f表示四种基因来源的细胞株。ES表示ES细胞。
图5示出向模型小鼠输注iPS细胞来源的血小板的实验。A表示预先照射放射线而制造血小板减少模型的免疫缺陷小鼠。通过尾静脉向免疫缺陷小鼠输注从TkDA3-4株产生的血小板。B表示输注后的随时间变化(30分钟、2小时、24小时)。PB表示人类末梢血。
图6示出确认人类iPS细胞来源血小板的机体内的血栓形成能力。对人类iPS细胞来源血小板用四甲基罗丹明乙酯(TMRE：红色色素)染色，与血卟啉(Hematoporphyrin)混合，从小鼠尾静脉注射。向肠系膜微小动脉照射激光后，通过延时共焦显微镜观察0秒、6秒、13秒、20秒的血管内的血栓形成状态。blood flow为血流。
图7示出向从ES细胞制备的造血前体细胞导入基因的方法(protocol)的概要。
图8示出向从ES细胞制备的造血前体细胞导入c-MYC基因后，第9天时进行FACS分析的结果。A表示FACS分析结果。B示出导入c-MYC基因后，第9天的导入细胞的显微镜照。对照表示仅导入MYC病毒载体的细胞。
图9示出表达c-MYC基因的巨核前体细胞的增殖能力。纵轴表示CD42b阳性细胞数。横轴表示向细胞导入c-MYC基因开始的天数。■表示代替c-MYC而只导入病毒载体的对照结果。
图10表示导入了c-MYC基因和BMI1基因的巨核前体细胞的FACS分析结果。c-MYC/BMI1(上图)表示导入了c-MYC基因和BMI1基因这两种基因的细胞的FACS分析结果，c-MYC单独(下图)表示只导入了c-MYC基因的细胞的FACS分析结果。
图11示出向细胞导入c-MYC基因和BMI1基因而培养后第35天的细胞的FACS分析结果。A是关于巨核细胞的特异性功能分子的模式图。B表示FACS分析结果。
图12表示c-MYC/BMI1表达细胞的增殖能力的研究结果。纵轴表示细胞数，横轴表示向细胞导入基因后的天数。
图13表示采用电子显微镜观察从c-MYC/BMI1表达细胞来源的巨核前体细胞释放的血小板的观察照。
图14表示向ES细胞(KhES)来源造血前体细胞导入c-MYC基因和HOXA2基因、以及c-MYC基因和BCLXL基因，分别对于在第105天后以及第27天后的细胞进行了FACS分析的结果。
图15表示对基于pMX tet off载体的基因表达调控系统进行的确认。表示使在pMX tet off载体中夹着2A而连接c-MYC以及BMI1的结构(construct)在293GPG细胞内表达，研究是否起基因的表达调控功能的结果。A是说明载体的构建以及作用机制的图。B表示在添加或不添加四环素以及β-雌二醇的状态下，通过流式细胞仪研究细胞内的c-MYC表达的结果。B的横轴表示c-MYC表达量。“293gpg”表示对照293GPG细胞的结果。
图16表示研究基因调控载体表达细胞株的增殖能力以及分化能力的结果。A表示研究通过各种载体而使c-MYC以及BMI1表达的细胞的增殖能力的结果。纵轴表示细胞数，横轴表示向细胞导入基因后的天数。B表示采用抗CD42b(GPIb-alpha)抗体以及抗CD41a(整合素alphaIIb/beta3复合物)抗体(上部)、抗Glycophorin-a抗体以及抗CD41a抗体(下部)染色细胞，通过流式细胞仪分析的结果。B的上下部中，左侧均表示分别使pMX c-MYC以及Dsam BMI1强制性表达的细胞的结果，右侧均表示表达pMX tet offc-MYC 2A BMI1的细胞的结果。
图17表示在β-雌二醇存在下，研究表达pMX tet off c-MYC 2A BMI1的巨核细胞株的多核化程度。A表示仅导入载体(没有表达基因的株)的对照细胞的结果，B表示表达c-MYC以及BMI1的细胞的结果。
图18表示对于强制性表达c-MYC以及BMI1的巨核细胞来源血小板进行纤维蛋白原结合测定的结果。上部(人类血小板)表示人类末梢血来源的血小板的结果；中部(pMX tet off c-MYC 2A BMI1)表示β-雌二醇存在下的pMX tet off c-MYC 2A BMI1株来源血小板的结果；下部(pMx Myc DsamBmi1)是pMX c-MYC以及Dsam BMI1，表示强制性表达c-MYC以及BMI1的细胞株来源的血小板的结果。
图19表示研究从抑制c-MYC以及BMI1的表达的巨核细胞株产生的血小板的整合素活化能力的结果。左图表示ADP不存在下，右图表示在ADP存在下(50μM)通过流式细胞仪分析整合素活化能力。
图20表示从ES细胞向巨核细胞的分化的路径。
具体实施方式
本发明的一种实施方式是如下的制备特定细胞的方法，即在分化诱导成为来源(source)的细胞而制备特定的细胞的方法中，为了扩增(或者为了增殖)处于在从成为来源的细胞向特定细胞分化的过程中的期望的分化阶段的细胞，使癌基因在该期望的分化阶段的细胞内强制性表达。
在此，作为“成为来源的细胞”，是相当于经过分化诱导而可获得的目的细胞(在此，是特定细胞)的前体细胞的细胞，只要是具有分化能力的、除了最终分化的细胞以外的细胞，则任何一种都可以，例如，可以是完全没有分化的多功能干细胞等，或者也可以是虽然已进行一定程度的分化但依然具有分化能力的细胞(例如，血球细胞的造血前体细胞等)。并且，在本实施方式中，所制备的“特定的细胞”或者“特定细胞”，只要是除了完全没有分化的细胞(例如，多功能干细胞)以外的细胞，即使是保持一定程度未分化状态的细胞也可，即，是指从完全没有分化的阶段到最终分化的阶段之间出现的细胞，指除了完全没有分化的细胞以外的细胞。例如，本实施方式的“特定的细胞”或者“特定细胞”，如果表示血球细胞的示例的一部分，是指成熟巨核细胞、血小板或者红血球细胞等。
在本实施方式中，扩增(或者增殖)的“分化阶段的细胞”是指，从完全没有分化的阶段到最终分化的阶段之间出现的细胞，指除了完全没有分化的阶段的细胞(例如，多功能干细胞等)以及最终分化的阶段的细胞以外的细胞。例如，本实施方式的“分化阶段的细胞”，如果举出血球细胞的一示例，是指作为成熟巨核细胞的前体细胞的、造血前体细胞或者多核化前的巨核前体细胞等。作为分化阶段的细胞，例如可以使用从ES细胞(胚胎干细胞)或者iPS细胞(诱导多能干细胞)等多功能干细胞诱导的细胞等。
对于本发明中所使用的ES细胞(胚胎干细胞)，没有特别限制，一般将囊胚期的受精卵与饲养层细胞一起培养，分离增殖的内细胞团来源的细胞，进一步地反复进行继代培养操作，最终可以建立ES细胞株。如此，ES细胞从受精卵获得的情况较多，但是除此以外，还可以是从受精卵以外的例如脂肪组织、绒膜绒毛、羊水、胎盘、精巢细胞等获得的、具有与ES细胞类似的特征、具有分化多功能性的类似ES细胞的细胞。
并且，在本发明中所使用的iPS细胞(诱导多能干细胞)只要是通过向体细胞(例如，纤维母细胞或血液细胞等)导入赋予分化多功能性的多种转录因子(以下，在此称为“分化多功能因子”)基因而获得与ES细胞同等的分化多功能性的细胞，则可以是任何来源的细胞。作为分化多功能因子，已经报道有多种因子，在使用上没有限制，但是例如可以举出：Oct家族(例如，Oct3/4)、SOX家族(例如，SOX2、SOX1、SOX3、SOX15以及SOX17等)、Klf家族(例如，Klf4、Klf2等)、MYC家族(例如，c-MYC、N-MYC、L-MYC等)、NANOG、LIN28等。关于iPS细胞的建立方法，已经在多篇文献中有发表，因此可以参考这些文献(例如，参考Takahashi等，Cell 2006，126：663-676；Okita等，Nature 2007，448：313-317；Wernig等，Nature 2007，448：318-324；Maherali等，Cell Stem Cell 2007，1：55-70；Park等，Nature 2007，451：141-146；Nakagawa等，Nat Biotechnol 2008，26：101-106；Wernig等，Cell Stem Cell2008，10：10-12；Yu等，Science 2007，318：1917-1920；Takahashi等，Cell2007，131：861-872；Stadtfeld等，Science 2008322：945-949等)。
在本发明中所使用的癌基因是指，诱导包含该基因的细胞的癌化的基因，在使用上没有限制，但是例如可以举出，MYC家族基因、SRC家族基因、RAS家族基因、RAF家族基因、c-Kit或PDGFR、Abl等蛋白激酶家族基因等。
在本发明中，可以通过以下方法达到期望的分化阶段的细胞内的癌基因或者后面详细说明的polycomb基因(多梳基因)的强制性表达。即，将癌基因或者polycomb基因导入到该“期望的分化阶段的细胞”内，使这些基因强制性表达；并且，在该“期望的分化阶段的细胞”的前体细胞内导入这些基因，使这些基因强制性表达，维持该表达的同时使细胞进行分化，在“期望的分化阶段的细胞”内维持这些基因的强制性表达状态；进一步地，在该“期望的分化阶段的细胞”的前体细胞内导入这些基因，分化为“期望的分化阶段的细胞”时诱导这些基因的强制性表达。例如，在作为期望的分化阶段的细胞扩增多核化前的巨核前体细胞时，可以在其前驱阶段的造血前体细胞(后述)中导入癌基因或者polycomb基因，使这些基因强制性表达。在期望的分化阶段的细胞内强制性表达癌基因和polycomb基因时，可以将癌基因和polycomb基因同时导入到细胞内，也可以在不同的时机导入。
进一步地，在本发明的实施方式中，作为用于扩增(或者用于增殖)期望的分化阶段的细胞的方法，包括抑制由在该期望的分化阶段的细胞内强制性表达的癌基因诱导的、癌基因诱导性细胞衰老。
癌基因诱导性细胞衰老(oncogene-induced senescence，OIS)是指，由RAS或MYC等癌基因引起的异常的增殖刺激等而诱导的压力(stress)诱导性细胞衰老。如果在细胞内癌基因产物过表达，则会诱导CDKN2a(INK4a、ARF)基因座上被编码的p16或p19等癌抑制基因产物的表达。其结果，会诱导细胞衰老和细胞凋亡(apoptosis)，降低细胞的增殖活性。从而，可以预测如果防止癌基因诱导的OIS则能够以高水平维持细胞的增殖能力。
癌基因诱导性细胞衰老的抑制，例如可以通过在表达癌基因的细胞内使polycomb基因(多梳基因)表达而实现。polycomb基因(polycomb group，PcG)起到负调控CDKN2a(INK4a、ARF)基因座，防止细胞衰老的功能(以上，例如参考：小黑等人，“根据polycomb群蛋白质复合物的干细胞的衰老调控”，再生医疗，vol.6.No4 pp26-32；Jseus等，Nature Reviews Molecular CellBiology vol.7 pp667-6772006；Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.100 pp211-2162003)。从而，使MYC家族基因等癌基因表达的基础上，使polycomb基因在细胞内表达，由此可以防止OIS，可以进一步提高由癌基因产物引起的细胞增殖效果。
作为在本发明中所使用的polycomb群基因，例如可以举出BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3b等，但是尤其优选的polycomb群基因是BMI1基因。
进一步地，癌基因诱导性细胞衰老的抑制，还可以通过HOXA2基因或者BCLXL基因的表达而实现。
在使癌基因、polycomb基因在细胞内强制性表达时，可以通过本领域的技术人员公知的任何方法来实施，但是例如可以通过将外源癌基因或者外源polycomb基因例如利用基于慢病毒(Lentivirus)或者逆转录病毒(retrovirus)等的基因导入系统而导入到细胞内，使其表达。当进行利用病毒基因导入载体的基因表达时，可以在适宜的启动子的下游可发挥作用地连接该基因，并且将其插入到基因导入载体，然后导入到细胞内，使目的基因表达。在此，“可发挥作用”地连接是指，将启动子和目的基因连接以根据该启动子而顺式调控目的基因，实现目的基因的期望的表达。在本发明的实施中，例如可以使用CMV启动子、EF 1启动子等而组成性表达目的基因，或者还可以在由四环素等药物响应因素等反式因子而被活性调控的因素的作用下，设置适宜的启动子(诱导型启动子)，例如通过药物添加等调控而诱导性表达目的基因。对于这种基于药物的基因表达系统而言，为了实现癌基因或者polycomb基因的期望的表达调控，本领域的技术人员可以容易地选择合适的系统。还可以购买使用用于这种表达系统的市场上销售的试剂盒。并且，可以将作为表达调控的目的基因的癌基因、polycomb基因插入到不同的载体，但是将癌基因以及polycomb基因插入到同一个的载体是更为优选的。
并且，在本实施方式中，包括通过进一步分化诱导已表达癌基因或者癌基因以及polycomb基因的、期望的分化阶段的细胞而制备目的特定细胞的方法。在进一步分化诱导期望的分化阶段的细胞时，除了在适合该分化诱导的培养条件(培养基、培养温度等条件)下培养分化阶段的细胞以外，根据需要，还可以抑制调控在该分化阶段的细胞内表达的癌基因或者polycomb基因的表达。此时，癌基因、polycomb基因的表达的抑制，例如，可以通过以下的方法实现，即通过去除药物等而解除基因诱导，由此抑制由前述的诱导性表达系统诱导的表达。或者，还可以通过在不存在药物等时属于进行组成性表达调控的启动子、而存在药物时成为进行抑制性表达调控的抑制型启动子上，可发挥作用地连接癌基因或者polycomb基因，从而抑制性调控这些基因的表达。进一步地，还可以通过使用Cre/Lox系统等而去除导入的癌基因、polycomb基因，抑制性调控这些基因的表达。为了抑制性调控癌基因或者polycomb基因的表达，也可以使用适宜的市场上销售的试剂盒等。
在本实施方式中，包括扩增(增殖)作为期望的分化阶段的细胞的多核化前的巨核前体细胞，从多核化前的巨核前体细胞制备作为特定细胞的成熟巨核细胞的方法。在此，使癌基因或者癌基因以及polycomb基因在多核化前的巨核前体细胞内强制性表达时，优选在多核化前的巨核前体细胞的前驱阶段存在的造血前体细胞内，使癌基因或者癌基因以及polycomb基因表达。
在本说明书中，“多核化前的巨核前体细胞”是指，作为巨核系的特异性标记的CD41a阳性/CD42a阳性/CD42b阳性，且没有发生核的多倍体化的单核细胞或者双核细胞。并且，“造血前体细胞”是指，表征为CD34+细胞(CD34阳性细胞)的造血细胞，例如优选ES细胞或者iPS细胞来源的细胞，尤其优选从(从ES细胞或者iPS细胞制备的)网状结构物(又称作ES-sac或者iPS-sac)获得的细胞(尤其是刚从网状结构物分离的细胞)。在此，从ES细胞或者iPS细胞制备的“网状结构物”是指，ES细胞或者iPS细胞来源的立体囊状(内部有空间)结构物，由内皮细胞集落等而形成，内部包含造血前体细胞。关于网状结构物的详细内容，例如请参见TAKAYAMA等，BLOOD2008，111：5298-5306。
对于用于从人类ES细胞或者iPS细胞制备网状结构物的适宜的细胞培养条件而言，虽然根据所使用的ES细胞或者iPS细胞而不同，但是例如作为培养基，可以使用添加FBS而最终浓度达到15％的IMDM，在其他没有血清的情况下，也可以使用添加适宜增殖因子以及添加剂(supplement)等的培养基。进一步地，为了有效地形成网状结构物，优选添加0～100ng/ml、尤其优选添加20ng/ml左右的VEGF(血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor))。作为培养环境，虽然根据所使用的ES细胞或者iPS细胞的种类而不同，但是例如可以使用5％二氧化碳、36～38℃(优选37℃)的条件。对于直到形成网状结构物为止的培养期间而言，虽然根据ES细胞或者iPS细胞的种类而不同，但是从铺于饲养层细胞上开始，大约经过14～16天后，可以确认其存在。
所形成的网状结构物呈滤泡状结构，造血前体细胞在其内部以浓缩的状态存在。存在于网状结构物的内部的造血前体细胞可以通过物理方法，例如可以使用灭菌后的筛网状器具(例如，细胞过滤网(Cell Strainer)等)进行过滤，由此进行分离。在本发明中，可以使用如此得到的造血前体细胞。
对于在造血前体细胞内强制性表达的癌基因而言，虽然可以是上述的癌基因的任意一种，但是尤其优选MYC家族基因，作为MYC家族基因，例如可以举出c-MYC、N-MYC、L-MYC等，尤其优选c-MYC。并且，对于在造血前体细胞内强制性表达的polycomb基因而言，虽然可以是上述的polycomb基因的任意一种，但是尤其优选BMI1基因。
表达MYC家族基因等癌基因以及BMI1基因等polycomb基因的造血前体细胞，在添加下述物质中的任意一种或者两种以上组合添加的条件下进行培养，例如，在基因导入后约4至7天，成为获得高增殖能力的多核化前的巨核前体细胞。即，SCF(干细胞因子)(10～200ng/ml，例如100ng/ml)、TPO(血小板生成素)(10～200ng/ml，例如40ng/ml)、FL(Flt3配体)(10～200ng/ml，例如100ng/ml)、VEGF(10～200ng/ml，例如40ng/ml)等。对于如此获得的多核化前的巨核前体细胞，至少约30～50天，优选约50～60天以上，更优选60天以上，持续进行细胞增殖，其细胞数达到导入c-MYC基因以及BMI1基因时的细胞数的约1.0×104倍以上、优选约1.0×105倍以上、更优选约1.0×106倍以上为止进行扩增(例如，参见图12)。
在本发明中，包括在适合血球细胞的分化诱导的条件下培养通过本发明的方法而制备的多核化前的巨核前体细胞，产生成熟巨核细胞以及血小板的方法。在此，适合血球细胞的分化诱导的条件是指，例如可以举出添加下述物质中的任意一种或者两种以上组合添加的条件，即TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO(促红细胞生成素)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、SCF、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、Flt3配体、肝素(heparin)等。在分化诱导成熟巨核细胞以及血小板时，例如可以在TPO(10～200ng/mL，优选约100ng/ml)的存在下，或者在TPO(10～200ng/mL，优选约100ng/ml)、SCF(10～200ng/mL，优选约50ng/mL)以及肝素(10～100U/mL，优选约25U/mL)的存在下，培养7～15天左右。作为培养环境，只要是适宜在机体外进行血球细胞的分化诱导的环境即可，例如在5％二氧化碳、36～38℃(优选37℃)的条件下进行培养。
在将导入癌基因以及polycomb基因而获得高增殖能力的多核化前的巨核前体细胞分化诱导成成熟巨核细胞以及血小板等时，如上所述，根据需要还可以抑制性调控癌基因和polycomb基因的表达。
本发明的另一种实施方式是如下的制备红血球细胞的方法，即在制备红血球细胞的方法中，为了扩增红血球前体细胞，在造血前体细胞内使癌基因以及HOXA2基因或者BCLXL基因强制性表达，制备红血球细胞。进一步详细而言，本实施方式是如下的制备红血球细胞的方法，即，使MYC家族基因等癌基因在作为期望的分化阶段的细胞的红血球前体细胞内强制性表达，对于其结果被诱导的癌基因诱导性细胞衰老，通过HOXA2基因或者BCLXL基因的表达而抑制，扩增红血球前体细胞，制备作为特定细胞的红血球细胞。本实施方式是根据以下见解完成的，即通过向造血前体细胞一同导入作为癌基因的MYC和数十种造血转录因子和抗细胞凋亡相关基因，进行筛选，其结果HOXA2或者BCLXL增殖红血球前体细胞。
对于在造血前体细胞内强制性表达的癌基因而言，如上所述，只要是癌基因，任何基因都能使用，但是优选MYC家族基因，尤其优选c-MYC基因。
在本说明书中，“红血球前体细胞”是指，作为特异性红血球分子的血型糖蛋白A(glycophorin A)阳性的脱核前的细胞。
表达MYC家族基因等癌基因、以及HOXA2基因或BCLXL基因的造血前体细胞，在添加下述物质中的任意一种或者两种以上组合添加的条件下进行培养，例如在基因导入后约4至7天，成为获得高增殖能力的脱核前的红血球前体细胞。即，SCF(10～200ng/ml，例如100ng/ml)、TPO(10～200ng/ml，例如40ng/ml)、FL(10～200ng/ml，例如100ng/ml)、VEGF(10～200ng/ml，例如40ng/ml)、EPO(1～100U/ml，例如6U/ml)等。
作为用于通过从表达MYC家族基因以及BCLXL基因或者HOXA2基因的造血前体细胞获得的红血球前体细胞而分化诱导成熟红血球细胞的适宜的条件，例如可以举出添加下述物质中的任意一种或者两种以上组合添加的条件，即TPO、IL-1α、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO(促红细胞生成素)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、SCF、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、Flt3配体、肝素(heparin)等。尤其红血球细胞时，可以在EPO(2～100U/mL，优选约10U/mL)的存在下，或者在EPO(2～100U/mL，优选约10U/mL)、SCF(10～200ng/mL，优选约50ng/mL)的存在下，培养7～15天左右。作为培养环境，只要是在机体外进行血球细胞的分化诱导时的适宜的环境即可，例如在5％二氧化碳、36～38℃(优选37℃)的条件下进行培养。
本发明的另一种实施方式中包括强制性表达癌基因的期望的分化阶段的血球细胞。在此，作为癌基因，可以使用上述的癌基因，例如可以使用MYC家族基因，尤其优选c-MYC基因。并且，“分化阶段的血球细胞”是指，从完全没有分化的阶段到最终分化的阶段之间出现的血球细胞，指除了完全未分化阶段的细胞以及最终分化阶段的细胞以外的血球细胞。例如，本实施方式的“分化阶段的血球细胞”是指，例如可以举出多核化前的巨核前体细胞等。作为这种分化阶段的血球细胞，例如可以使用从ES细胞或者iPS细胞诱导的细胞等。尤其，优选从(从ES细胞或者iPS细胞制备的)网状结构物(又称作ES-sac或者iPS-sac)获得的血球细胞(尤其是刚从网状结构物分离的细胞)。并且，本实施方式中，还可以包括除了癌基因外，进一步强制性表达上述的polycomb基因的分化阶段的血球细胞。对于癌基因以及polycomb基因的强制性表达而言，如上所述，可以使用诱导型启动子等而实施。
对于在期望的分化阶段的细胞内的癌基因或者polycomb基因的强制性表达而言，可以通过将癌基因或者polycomb基因导入到该“期望的分化阶段的血球细胞”内强制性表达而实现，并且还可以通过向该“期望的分化阶段的血球细胞”的前体细胞内导入这些基因，使这些基因强制性表达，维持其表达的同时进行分化，由此在“期望的分化阶段的血球细胞”内维持这些基因的强制性表达状态而实现。进一步地，还可以通过向该“期望的分化阶段的血球细胞”的前体细胞内导入这些基因，分化为“期望的分化阶段的血球细胞”时，诱导这些基因的强制性表达而实现。例如，作为期望的分化阶段的血球细胞而扩增多核化前的巨核前体细胞时，还可以在其前驱阶段的造血前体细胞中导入癌基因或者polycomb基因，实现强制性表达。
在本实施方式中，例如，多核化前的巨核前体细胞等血球细胞具有即使冷冻保藏后解冻也能维持细胞增殖能力以及分化能力的冷冻解冻耐性。因此，冷冻该血球细胞，可以根据需要进行溶解，制备分化诱导的血球细胞。因此，如果使用本细胞，则不需要从第一步工艺开始进行从ES细胞或iPS细胞制造血球细胞例如血小板的一系列作业。即，通过将本发明的强制性表达癌基因或者癌基因以及polycomb基因的血球细胞作为原料大量配制，并根据需要进行冷冻保藏，由此可以实现制备工序的合理化、效率化，可以建立可迅速供给血小板等多种血球细胞的机制。
使用本发明的多核化前的巨核前体细胞等血球细胞而制造冷冻细胞组合物时，可以由多核化前的巨核前体细胞等血球细胞和冷冻保藏液组成，另外也可以在组成中包含对应需要的添加剂等。
作为冷冻保藏液，可以利用添加有DMSO(二甲基亚砜)的冷冻液等。具体而言，是CELLBANKER(日本全药工业株式会社)或BAMBANKER(日本genetics株式会社)、TC-Protector(DS Pharma Biomedical株式会社)、白蛋白加cp-1(极东制药工业株式会社)等。
本发明中所使用的MYC家族基因、polycomb基因(例如，BMI1基因)、HOXA2基因以及BCLXL基因包括其cDNA序列已经被公开的基因，而且还包含基于这些公知的cDNA序列的同源性而根据现有技术鉴定的同源物(homolog)。
在MYC家族基因中，c-MYC基因的同源物是指，其cDNA序列例如由与序列标识符1表示的核酸序列实质上相同的序列构成的基因。由与序列标识符1表示的核酸序列实质上相同的序列构成的cDNA是指，与由序列标识符1表示的序列构成的DNA具有约60％以上，优选约70％以上，更优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，最为优选约99％的一致性的序列构成的DNA，或者可以在严格条件下与由与序列标识符1表示的核酸序列互补的序列构成的DNA杂交的DNA。由这些DNA编码的蛋白质是对多核化前的巨核前体细胞等分化阶段的细胞的扩增起作用的物质。
并且，在本发明中所使用的BMI1基因的同源物是指，其cDNA序列例如由与序列标识符2表示的核酸序列实质上相同的序列构成的基因。由与序列标识符2表示的核酸序列实质上相同的序列构成的cDNA是指，与由序列标识符2表示的序列构成的DNA具有约60％以上，优选约70％以上，更优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，最为优选约99％的一致性的序列构成的DNA，或者可以在严格条件下与由与序列标识符2表示的核酸序列互补的序列构成的DNA杂交的DNA。由其DNA编码的蛋白质是抑制表达MYC家族基因等癌基因的细胞内出现的癌基因诱导性细胞衰老，促进该细胞的扩增的物质。
在本发明中所使用的HOXA2基因或者BCLXL基因是指，其cDNA序列分别例如由与序列标识符3或序列标识符4表示的核酸序列实质上相同的序列构成的基因。由与序列标识符3或序列标识符4表示的核酸序列实质上相同的序列构成的cDNA是指，分别与由序列标识符3或序列标识符4表示的序列构成的DNA具有约60％以上，优选约70％以上，更优选约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，最为优选约99％的一致性的序列构成的DNA，或者可以在严格条件下与由与序列标识符3或序列标识符4表示的核酸序列互补的序列构成的DNA杂交的DNA。由其DNA编码的蛋白质是具有增殖红血球前体细胞的效果的物质。
在此，严格条件是指，本领域的技术人员容易决定的杂交条件，一般是基于探针长度、清洗温度以及盐浓度的经验实验条件。一般，如果探针长，则适宜的退火温度会上升；如果探针短，则温度会降低。杂交物的形成一般依赖于互补链在比其熔点略低的环境中的再退火能力。
具体而言，例如作为低严格条件，可以举出在杂交后的过滤器的清洗阶段，在37℃～42℃的温度条件下，于0.1×SSC、0.1％SDS溶液中清洗等。并且，作为高严格条件，例如可以举出在清洗阶段，在65℃温度下，于5×SSC以及0.1％SDS中清洗等。通过进一步提高严格条件，能够得到同源性高的多核苷酸。
在本发明的实施方式中，进一步地包括用于制备期望的分化阶段的细胞(例如，多核化前的巨核前体细胞或者红血球前体细胞)、最终制备的特定细胞(例如，巨核细胞、血小板或者红血球细胞)的试剂盒。该试剂盒中，除了包含使癌基因、polycomb基因、BCLXL基因、HOXA2基因等在细胞内表达所必须的表达载体等以及试剂等以外，还包含用于细胞培养的培养基、血清、增殖因子等添加剂(例如，TPO、EPO、SCF、肝素、IL-6、IL-11等)、抗生物质等。除此之外，例如当使用ES细胞或者iPS细胞来源的细胞时，还包含用于鉴定从这些细胞配制的网状结构物的标记确认用抗体(例如，针对Flk1、CD31、CD34、UEA-I凝集素等的抗体)等。试剂盒中所包含的试剂、抗体等可以供给在长期有效地维持构成成分的活性、不会因容器的材质而吸附、不会引起变质的任意一种容器中。
并且，根据本发明而制备的血小板以及红血球细胞还可以以制剂的形态稳定地供给。根据本发明的方法而产生的血小板可以通过以下方法配制，即回收从巨核细胞释放的血小板丰富的培养液的组分(fraction)，使用白血球去除过滤器(例如，可以从TERUMO公司、旭化成医学公司等公司购买)等而去除巨核细胞以及其他的除了血小板以外的血球细胞成分。当配制血液制剂时，还可以添加有助于血小板或红血球细胞的稳定化的其他成分。这种有助于稳定化的成分可以选择本领域的技术人员公知的方法。
进一步具体而言，获得的血小板例如可以通过以下方法制成制剂。
ACD-A液：将FFP(新鲜冷冻血浆(Fresh frozen plasma)：是对从捐献的血液获得的全血液进行调配的血浆，包含除了白蛋白、凝固因子等血液成分以外的所有物质)以1∶10的比率调配，照射15～50Gy的放射线后，在20～24℃下振荡保存。用注射用水将ACD-A液；柠檬酸钠22g、柠檬酸8g以及葡萄糖22g整体调配成1L。
当使用以上的方法时，作为血小板的浓度，例如优选约1×109血小板/mL。
并且，如果添加GM6001(广谱异羟肟酸基质金属蛋白酶抑制剂(abroad-range hydroxamic acid-based metalloprotease inhibitor))(Calbiochem公司，La Jolla，CA，USA)，则可以预防在冷冻保藏以及室温保藏中发生的因血小板功能分子GPIb-V-IX或者GPVI的切割而引起的失活。本发明的发明者们，确认了通过该方法可以预防小鼠ES细胞来源的血小板失活。在此，作为关于使用人类血小板的该血小板失活的机制的参考文献，请参见Bergmeier，W等，Cir Res 95：677-683，2004以及Gardiner，EE等，J Thrombosis andHaemostasis，5：1530-1537，2007。
在此，对于容纳包含血小板的制剂的容器而言，最好避开使用诸如玻璃等使血小板活化的材料的容器。
另一方面，关于红血球细胞的制剂化，可以通过以下的方法进行。
更详细而言，获得的红血球例如可以通过以下的方法制成制剂。
在离心处理培养上清液而浓缩的红血球浓厚液中，加入MAP液(组成参照下述说明)而配制，照射15～50Gy的放射线后，在2～6℃下保存。
使用以上的方法时，作为红血球的浓度，例如优选约1×1010红血球/mL。获得的红血球可以使用例如将D-甘露醇(14.57g)、腺嘌呤(0.14g)、结晶磷酸二氢钠(0.94g)、柠檬酸钠(1.50g)、柠檬酸(0.20g)、葡萄糖(7.21g)、氯化钠(4.97g)，加入注射用水而溶解成总量为1000ml的溶液，作为红血球保藏用添加液(MAP液)。
除此之外，适当选择认为对红血球的制剂化适宜的公知的方法，对于本领域的技术人员来说是容易想到的。
进一步地，本发明中包括本发明的血球细胞的冷冻组合物。本组合物中除了包含血球细胞外，还可以包含保藏该血球细胞所必要的培养基、缓冲液以及冷冻时用于保护细胞的DMSO(二甲基亚砜)、甘油等。除此之外，只要是在细胞冷冻时所必须的通常的物质，可以包含任何物质。或者，在使用市场上销售的细胞冷冻用试剂时，可以包含该试剂包含的物质。
在本说明书中记载的“细胞”的来源，是人类以及不包括人类的动物(例如，小鼠、大鼠、牛、马、猪、绵羊、猴、狗、猫、鸡等)，没有特别限制。尤其，优选人类来源的细胞。
以下，举出实施例，进行更加详细的说明，但是本发明不受实施例的任何限制。
实施例
1.从四种基因来源的iPS细胞和三种基因来源的iPS细胞的巨核细胞产生效率的比较
比较从通过四种基因(Oct3/4，SOX2，KLF-4，c-MYC)建立的iPS细胞(TkDA3-2、TkDA3-4以及TkDA3-5)和通过除了c-MYC的三种基因(OCT3/4，SOX2，KLF-4)建立的iPS细胞(253G1(由京都大学山中伸弥博士提供)和TkDN4-M)以及人类ES细胞(KhES-3，由京都大学中辻宪夫先生提供)产生的巨核细胞的数量(图1)。将在开始培养iPS细胞以及ES细胞后第15天从网状结构物取出的造血前体细胞种植于饲养层细胞上，最终浓度达到15％为止加入FBS的IMDM培养基中，在TPO(100ng/mL)、SCF(50ng/mL)以及肝素(25U/ml)的存在下，进行培养。此后，随时间计数被诱导的CD42b阳性的巨核细胞的数量(图1)。其结果，与三种基因(不包括c-MYC)来源的iPS细胞以及人类ES细胞相比，巨核细胞数在使用的、四种基因(包括c-MYC)来源的iPS细胞的、三株细胞中均有增加。
接着，研究了制备iPS细胞时导入的基因(Oct3/4，SOX2，KLF-4，c-MYC)的未分化iPS细胞中的表达活性，其结果任意一种基因都因沉默机制而其表达被抑制(图2A)。与此相比，在进行分化诱导的培养第25天的巨核细胞中，确认出各导入基因的表达的再活化(图2B)。
从以上内容可以得到以下启示，即为了制备iPS细胞而导入的基因中的任意一种基因的表达的再活化，可能对所产生的巨核细胞数的增加起作用。因此，对参与巨核细胞数的增加的原因基因(causal gene)进行了确认。人类ES细胞(与iPS细胞不同，没有被导入外源性的OCT3/4，SOX2，KLF-4，c-MYC)来源的造血前体细胞中通过逆转录病毒(retrovirus)使各基因单独强制性表达，计数产生的CD42b阳性的巨核细胞的数量。其结果，确认出当导入c-MYC时，与导入其他基因时相比，所产生的CD42b阳性巨核细胞数增加约10倍(图3)。从以上内容可以认为从四种基因来源的iPS细胞的巨核细胞诱导效率高的原因是，c-MYC基因的表达的再活化。
并且，确认出，与从ES细胞或者三种基因来源的iPS细胞诱导的巨核细胞相比，从四种基因来源的iPS细胞诱导的巨核细胞的冷冻解冻后的生存率更高。具体而言，得知了从人类ES细胞(KhES-3)或者三种基因来源的人类iPS细胞(TkDN4-M)诱导的巨核细胞的冷冻解冻后的生存率分别为56.7％、54.5％，停留在约50％左右，但是与此相比，从四种基因来源的人类iPS细胞(TkDA3-4)诱导的巨核细胞的冷冻解冻后生存率为81.0％，达到约8成。从以上内容可以认为，发生了c-MYC基因等癌基因的再活化的巨核前体细胞更适合冷冻保藏，是解冻后容易供给的细胞。
对于血小板的产生数量，通过与巨核细胞相同的方法进行了确认。开始培养iPS细胞以及ES细胞后第15天时，种植从网状结构物取出的造血前体细胞，此后，随时间计数被诱导的血小板的数量，其结果，与巨核细胞相同地，从导入了四种基因的iPS细胞有效地产生了血小板(图4)。
接着，采用血小板产生能力最高的TkDA3-4株，进行在试验管内产生的血小板的输血实验。预先照射放射线而制造血小板减少模型的免疫缺陷小鼠，通过尾静脉而输注iPS细胞来源的血小板(图5A)。在输注后30分钟观察到20％左右的血小板嵌合，在2小时后仍观察到10％左右的血小板嵌合，与人类末梢血来源的新鲜的血小板相同(图5B)。
进一步地，采用延时共焦显微镜(Time-lapse confocal microscopy)对人类iPS细胞来源血小板的机体内血栓形成能力进行了评价。
预先对iPS细胞来源血小板用四甲基罗丹明乙酯(TMRE：红色色素)染色，与血卟啉(Hematoporphyrin)混合，从小鼠尾静脉注射。通过用FITC-dextran(绿色)染色血流(细胞成分以外)，显示出血管内的血液成分，可以从形态和大小确认血球成分。如果在激光作用下血卟啉反应而引起血管内皮功能障碍，则功能障碍内皮或者内皮剥离处出现血小板固体化以及粘集，诱导血栓形成。
如果向小鼠的肠系膜微小动脉照射波长488nm、30mW的激光，则13秒后被染色成红色的iPS细胞来源血小板向功能障碍内皮粘集(图6中，用箭头表示为“iPS来源”的部分)。确认出在20秒后与其他宿主(host)来源的血小板(小鼠血小板)协同而形成血栓，引起血管闭塞，证实了iPS细胞来源的血小板具有在机体内的流血下形成血栓的能力。
从以上内容可以确认，从通过包括c-MYC基因的四种基因的导入而建立且c-MYC基因被再活化的iPS细胞配制的血小板也保持与人类末梢血来源的血小板相同的生理学特征。
从以上分析可以明确，为了从iPS细胞有效地诱导巨核细胞以及血小板，重要的是维持c-MYC基因的表达诱导和其c-MYC基因产物的细胞内效果。因此，从iPS细胞诱导巨核细胞以及血小板时，可以预测到为了在作为未分化巨核前体细胞的单核巨核前体细胞中使c-MYC基因表达，且维持c-MYC基因产物的效果，有效的手段是抑制癌基因诱导性细胞衰老(OIS)。因此，为了抑制OIS，使polycomb群基因与c-MYC基因同时表达，对于其效果进行了研究。
2.从表达c-MYC基因以及BMI1基因的巨核前体细胞产生成熟巨核细胞的效率
通过比较iPS细胞的四种基因建立株和三种基因建立株的巨核细胞产生效率，得知在巨核前体细胞中的、c-MYC基因的再活化，对此后诱导的成熟巨核细胞的数量产生影响。因此，研究了作为没有导入c-MYC基因的多功能干细胞的ES细胞来源的、巨核前体细胞中的c-MYC基因的表达，对于此后的巨核细胞的诱导产生什么样的影响。
从人类ES细胞株(KhES-3)在20ng/ml的VEGF存在下制备网状结构物，在10T1/2细胞上种植从该网状结构物提取的巨核前体细胞(多核化前)直到细胞数达到1×105/孔为止，种植后经过0小时、12小时、24小时时感染具有c-MYC基因(序列标识符1)的逆转录病毒载体。36小时后，变更为不包含逆转录病毒的培养基，继续培养。基于逆转录病毒的基因的导入，使用添加2～3ml的培养基的6孔板，在900rpm、90分钟的条件下，采用离心感染法(Spin infection)进行。采用如下的培养基进行了培养，即在最终浓度达到15％为止添加FBS的IMDM中，添加100ng/ml的SCF、40ng/ml的TPO、100ng/ml的FL、40ng/ml的VEGF以及鱼精蛋白(protamine)(图7)。
在逆转录病毒感染后的第9天，进行了FACS(流式细胞仪)分析，其结果，观察到与对照载体相比，在导入c-MYC的细胞中具有CD41a、CD42b的细胞更占优势地增加(图8A)。并且，采用细胞离心涂片机(CytoSpin)观察了细胞，其结果，虽然在对照对象中观察到正在多核化的细胞，但是c-MYC导入细胞中观察到多核化前的单核细胞(图8B)。从以上的结果，可以得到因c-MYC的强制性表达而增加单核的未成熟巨核细胞的启示。该结果与巨核细胞特异性表达c-MYC的转基因鼠的结果相同(请参见Alexander等，Deregulated expression of c-MYC in megakaryocytes of transgenic mice increasesmegakaryopoiesis and decreases polyploidization.J.Biol.Chem.，1996 Sep20；271(38)：22976-82)。
接着，观察表达c-MYC基因的状态下的细胞的增殖能力，其结果观察到从感染后第14天开始增殖减少(图9)。该现象是对c-MYC等致癌基因的过表达引起的异常增殖信号进行细胞周期停止、细胞衰老、细胞凋亡的细胞的防癌机制，称为癌基因诱导性细胞衰老(oncogene-induced senescence，OIS)(前述)。因此，通过向巨核前体细胞内导入对编码作为癌抑制基因产物的p16以及p19的Ink4a/Arf基因进行负调控的、作为一种polycomb群基因的BMI1，尝试是否防御OIS。根据基于前述的逆转录病毒的基因导入法，向细胞内导入c-MYC基因和BMI1基因(序列标识符2)而使它们表达后，进行了FACS分析。其结果，随着基因导入后的时间的经过，可以得到以指数函数关系稳定地增殖的CD41a阳性CD42b阳性(巨核细胞的标记)细胞群(图10)。可以确认，当向细胞只导入c-MYC基因时，基因导入后第20天，CD41a阳性CD42b阳性细胞减少较多(图10下图的分析结果)，但是与此相比，当导入c-MYC基因和BMI1基因时，CD41a阳性CD42b阳性细胞逐日增加(图10上图的分析结果)。从该结果可以明确，导入了作为一种polycomb基因的BMI1基因的、c-MYC基因导入多核化前的巨核前体细胞，防御OIS，且保持高增殖能力的同时向巨核细胞分化。因此，为了确认在此得到的巨核细胞的特征，通过FACS分析，进一步研究其他的作为巨核细胞特异性功能分子的CD9以及CD42a是否存在于细胞表面(参照图11A)。其结果，可以确认出在导入了c-MYC基因和BMI1基因的细胞株中，存在有CD9以及CD42a(图11B)。
接着，关于c-MYC/BMI1表达细胞的增殖能力做了研究。对于导入了c-MYC基因以及BMI1基因的多核化前的巨核前体细胞，在最终浓度达到15％为止加入FBS的IMDM中添加了100ng/mL的SCF、40ng/mL的TPO、100ng/mL的FL、40ng/mL的VEGF的培养基中，进行了培养，随时间计算细胞数量。其结果，基因导入后第49天，获得了约4×107个CD41a阳性细胞(图12)。进一步地，采用电子显微镜观察从c-MYC/BMI1表达细胞来源的巨核前体细胞释放的血小板，其结果可以确认血小板特征性的、微小管结构、开放管道系统(Open canalicular system)、血小板颗粒(图13)。
3.通过从c-MYC基因导入造血前体细胞获得的红血球前体细胞的红血球的诱导
接着，尝试由从导入了c-MYC基因的造血前体细胞获得的红血球前体细胞产生红血球。与记载于上述2中的c-MYC基因或者BMI1基因的导入相同地，制备c-MYC/HOXA2(序列标识符3)表达细胞以及c-MYC/BCLXL(序列标识符4)表达细胞，进行了FACS分析。其结果，在c-MYC/HOXA2表达细胞中，基因导入后第105天时，确认出作为红血球的标记的CD71以及GlyA阳性细胞群的存在(图14右上)。并且，在c-MYC/BCLXL表达细胞中，也确认出GlyA阳性细胞群的存在(图14右下)。从该结果可以得知，导入了c-MYC基因的造血前体细胞改变组合导入因子，还可以向红血球分化。
4.利用基因的表达诱导系统的功能性血小板的制备
已经明确，为了有效且大量制备巨核细胞、血小板，增加巨核前体细胞数量是有效的。为此，需要在多核化前的巨核前体细胞中同时共表达c-MYC家族基因、polycomb基因，提高该多核化前的巨核前体细胞的增殖能力，但是为了促进巨核细胞的成熟(多核化)，根据情况，优选抑制性调控c-MYC家族基因、polycomb基因的表达。
因此，利用pMX tet off系统，诱导性调控c-MYC基因以及BMI1基因的表达而制造血小板，并对于该血小板的生理功能进行了研究。
4-1.基因调控部载体的功能性的确认
制备在pMX tet off载体(由自治医科大学间野博行教授提供)中整合c-MYC-2A-BMI1的一体式(all in one)载体(“2A”是具有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)来源的自剪切(self cleavage)活性的肽(peptide)，是通过在多个蛋白质之间插入该序列，由此从一个启动子有效地获得多个蛋白质(Hasegawa等，2007 Stem Cells))。pMX tet off c-MYC 2A BMI1载体在雌二醇(estradiol)存在下，表达c-MYC基因以及BMI1基因。另一方面，在四环素(tetracycline)存在下、但雌二醇(estradiol)不存在下，抑制c-MYC基因以及BMI1基因的表达。
使制备的pMX tet off c-MYC 2A BMI1载体在293GPG细胞内表达，通过FACS确认c-MYC基因以及BMI1基因的表达调控的情况。图15示出用抗c-MYC蛋白质抗体对细胞内的c-MYC蛋白质进行染色，然后用Alexa647标记的抗抗体染色，进行FACS分析的结果。可以得知，在整合了pMX tet offc-MYC 2A BMI1的293GPG细胞中，在四环素存在下，表现与对照293GPG细胞相同的c-MYC基因的表达量(图15中，用293gpg以及+四环素表示的图表)；在雌二醇的存在下，促进c-MYC基因的表达(图15，+β-雌二醇)。
从以上结果可以确认，在此基于使用的pMX tet off c-MYC 2A BMI1载体而能够调控目的基因的表达。
4-2.基于基因调控载体的巨核细胞株的制备
采用记载于上述4-1的基因调控载体，使c-MYC基因以及BMI1基因在人类ES细胞株(KhES-3)来源的巨核前体细胞内表达，研究其增殖能力以及分化能力。
对于仅导入了载体的细胞(图16A(a))、分别使pMX c-MYC以及DsamBMI1强制性表达的细胞株(图16A(b))、分别采用pMX tet off c-MYC以及pMX tet off BMI1表达的细胞株(图16A(c))、采用pMX tet off c-MYC 2ABMI1表达的细胞株(图16A(d))以及采用pMX tet off BMI1 2A c-MYC表达的细胞株(图16A(e))进行了研究。在此，(d)和(e)是夹着2A序列而布置c-MYC基因和BMI1基因的顺序不同的结构(construct)。
在图16A中示出这些细胞株的CD41a+细胞的增殖曲线。采用作为巨核细胞标记的抗CD41a抗体以及抗CD42b抗体染色各细胞株，通过流式细胞仪进行了分析。采用pMX tet off c-MYC 2A BMI1制备的细胞株(图16A(d))与分别使pMX c-MYC以及Dsam BMI1强制性表达的细胞株(图16A(b))表现出相同的表现型，几乎所有的集落表达巨核细胞标记(图16B上部板)。进一步地，通过pMX tet offc-MYC 2A BMI1制备的细胞株(图16A(d))与分别导入pMX tet off c-MYC和pMX tet off BMI1的细胞株(图16A(c))以及通过pMX tet off BMI1 2A c-MYC制备的细胞株(图16A(e))相比，表现出更高的增殖能力。
并且，如果采用抗Glycophorin-a抗体以及抗CD41a抗体染色，则分别强制性表达pMX c-MYC以及Dsam BMI1的细胞株中存在作为巨核细胞/成红血球通用标记的CD41a+/Gly-a+的细胞集落(图16B，下部板的左侧)，相对于此，通过pMX tet offc-MYC 2A BMI1制备的细胞株中，Gly-a消失(图16B，下部板的右侧)。该结果表示通过pMX tet offc-MYC 2A BMI1制备的细胞株是，与分别强制性表达pMX c-MYC以及Dsam BMI1的细胞株相比，进一步进行向巨核细胞的分化的细胞株。
4-3.关于巨核细胞的多核化
在β-雌二醇存在下，对于通过pMX tet off c-MYC 2A BMI1载体使c-MYC基因以及BMI1基因强制性表达的细胞株的多核化程度作了研究。表现出，人类来源巨核细胞通常多核化程度达32N左右(图17A)，但是通过pMX tet off c-MYC 2A BMI1载体使c-MYC基因以及BMI1基因强制性表达的细胞株几乎没有进行多核化，达到2N～4N。
4-4.表达c-MYC基因以及BMI1基因的巨核细胞株来源的血小板的功能分析
对来源于表达c-MYC基因以及BMI1基因的巨核细胞株的血小板进行了功能测定。
对照用的人类末梢血来源血小板在ADP(二磷酸腺苷(Adenosinediphosphate)：活化血小板的细胞内因子)存在下，与纤维蛋白原(fibrinogen)结合，表现出血栓形成初期所必须的整合素活化能力(由内到外信号传导(inside-out signal))处于正常水平(图18上部右侧图)。另一方面，pMX tetoff c-MYC 2A BMI1细胞株(雌二醇的存在下)以及pMX c-MYC和DsamBMI1强制性表达株，即使加入ADP，均不与纤维蛋白原结合(图18中部以及下部)。据此，可以得知，如果维持c-MYC基因以及BMI1基因的强制性表达，则不能释放出具有正常功能的血小板。
接着，对于通过pMX tet offc-MYC 2A BMI1载体强制性表达c-MYC基因以及BMI1基因的细胞株，在+四环素以及-β-雌二醇(四环素存在但β-雌二醇不存在)条件下，解除强制性表达后，通过流式细胞仪分析了培养第4天的CD41a+/CD42b+血小板的整合素活化能力(图19)。其结果表示，在ADP存在下与PAC1抗体(活性整合素αII bβ3结合抗体)结合，整合素活化能力(由内到外信号传导(inside-out signal))处于正常水平(图19右侧)。
从以上结果表示，从由于c-MYC基因的强制性表达而增殖的巨核细胞株产生的血小板，存在功能障碍，但是通过解除巨核细胞株的c-MYC基因等的强制性表达，能够产生具有正常功能的血小板。
可以认为，对于上述巨核前体细胞中的c-MYC基因以及BMI1基因的表达调控而言，还可以同样用在红血球前体细胞株建立时所使用的MYC家族基因、BCLXL基因、HOXA2基因上，可以诱导成熟红血球。
MYC以及BMI1表现出在作为巨核细胞/红血球细胞的共同前体细胞的MEP(megakaryocyte-erythroid progenitor)的阶段或者比该细胞进一步分化的巨核前体细胞的阶段，使细胞增殖(图20)。并且，导入了c-MYC基因以及BMI1基因的多核化前的巨核前体细胞可以冷冻保藏，因此需要时可以从冷冻原料(stock)配制巨核细胞、血小板。
通过导入MYC基因、BCLXL基因或者HOXA2基因而制备的红血球前体细胞株同样也可以冷冻保藏，可以在需要时解冻而配置。
并且，上调或下调导入的MYC基因、BMI1基因的表达，由此可以配制充分量的保持生理活性的血小板或者红血球细胞。
产业上的可利用性
本发明提供扩增分化阶段的细胞、并制备进一步分化的特定细胞的方法。本发明的方法例如可以通过应用于血球细胞而大量供给期望的分化阶段的细胞。据此，本发明尤其对医疗领域中的治疗法的发展会作出较大贡献。

Claims (10)

1.一种方法，用于制备成熟巨核细胞，包括：
增殖工序，在造血前体细胞或者多核化前的巨核前体细胞中，使从MYC家族基因中选择的癌基因与多梳基因强制表达，培养该细胞并使其增殖；
分化工序，使增殖的细胞分化成成熟巨核细胞，
在所述分化工序中，解除所述癌基因与所述多梳基因的强制表达，培养所述增殖的细胞，
所述多梳基因是BMI1基因。
2.如权利要求1所述的方法，所述分化工序是如下进行的：通过抑制所述癌基因与所述多梳基因的强制表达，或者通过从所述细胞去除所述癌基因与所述多梳基因，由此培养增殖的细胞。
3.如权利要求1所述的方法，还包括在所述增殖工序之后，冷冻保藏增殖的细胞的工序，
解冻冷冻保藏的细胞后，进行所述分化工序。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，所述癌基因为c-MYC基因。
5.一种方法，用于制备血小板制剂，包括：
通过如权利要求1至4中任意一项所述的方法制备成熟巨核细胞的工序；
从所述成熟巨核细胞的培养液回收血小板组分的工序；
从所述血小板组分中去除血小板以外的血球细胞成分的工序。
6.一种方法，用于制备血液制剂，包括：
通过如权利要求5所述的方法制备血小板制剂的工序；
将所述血小板制剂与其他成分混合而获得血液制剂的工序。
7.一种细胞群，包含从MYC家族基因中选择的癌基因和BMI1基因被强制表达的造血前体细胞或多核化前的巨核前体细胞。
8.如权利要求7所述的细胞群，所述癌基因为c-MYC基因。
9.冷冻了如权利要求7或8所述的细胞群的冷冻细胞组合物。
10.一种表达载体在从造血前体细胞制备多核化前的巨核前体细胞、成熟巨核细胞或者血小板中的应用，该表达载体强制表达从MYC家族基因中选择的癌基因与BMI1基因。
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