CN102643796A - 一种高效提取桑树根围土壤微生物总dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，利用CTAB、溶菌酶、蛋白酶和SDS共同作用以裂解细胞的同时对其反复冻融，获得了良好的细胞裂解效果，利用PVP、CaCl2、BSA去除腐殖酸，PEG8000沉淀DNA，获得的DNA纯度高。所用方法简单方便，不经纯化即可用于后续的PCR分析和DGGE分析。提取的DNA纯度达到直接进行后续分子生物学研究的需要，提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，并可对DGGE谱带的特异条带切胶回收、碱基测序，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成，为今后研究桑树根围土壤微生物群落结构多样性与生态功能奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生态学技术领域，具体涉及一种桑园土壤微生物总DNA的提取方法。
背景技术
长期以来，有关土壤微生物的多样性研究是通过分离培养来实现的。然而，绝大多数微生物种群尚不能实现纯培养，这成为土壤微生物多样性研究的一个限制性因素。随着土壤微生物群落结构研究的不断深入，借助现代分子生物学技术的研究方法如PCR-RFLP、PCR-SSCP、PCR-DGGE等避免了传统研究方法不能全面获取土壤微生物多样性信息的缺陷，可以通过土壤微生物DNA表现出的多样性，真实地反映土壤微生物种群结构情况，而土壤微生物群落基因组总DNA的高效、高品质提取，是从分子生物学水平对土壤微生物群落结构进行研究的前提条件。由于土壤理化成分复杂，常含有腐殖酸、酚类化合物、重金属离子等影响DNA分子操作的物质，土壤样品处理和实验条件较复杂，耗时长，以致从土壤环境中获得高纯度微生物基因组DNA具有一定难度，DNA提取技术创新因此备受关注。目前已经报道了多种土壤微生物总DNA提取方法。从土壤提取微生物总DNA的方法大致分为两类：直接提取法和间接提取法。间接法提取的DNA纯度高，但其缺点是得到的细菌只占总菌群的25％～50％，而直接法提取的DNA超过细菌总DNA的60％。直接法由于能够提取到较全的细菌DNA、省力、DNA产量高，因而发展很快。Tsai等使用SDS和溶菌酶裂解细胞提取总DNA，Tiedje等使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去除腐殖酸，效果很好，Bourrain等人采用该方法从活性污泥中提取了DNA，Reddy等人从堆肥中提取了DNA。
桑园土壤微生物的多样性及生命活动与桑园土壤结构的形成和改良、土壤肥力演变、桑树根部病害的发生、桑树营养物质供给和植株生长发育等密切相关，但目前尚未见应用免培养法研究桑园土壤微生物多样性的报道。
发明内容
本发明是基于建立桑树根围土壤微生物群落结构的分子生态学试验技术体系，借鉴已有的土壤微生物总DNA的提取方法，提供一种高效的可直接用于PCR分析的桑园土壤微生物总DNA提取方法。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术方案：
一.材料选择
供试土壤于2011年3月7日采自湖北省农业科学院经济作物研究所生产桑园(东经114°19′，北纬30°29′，海拔29m)的桑树根围，桑树品种为湖桑32号。采集土壤为黄粘土，采样深度为5～10cm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4℃保存，24h内完成土壤微生物基因组总DNA的提取。
二.试剂选择
本发明采用的主要试剂中：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基磺酸钠(SDS)、聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30)、聚乙二醇8000(PEG8000)、脲、去离子甲酰胺均购自华美生物工程有限公司；溶菌酶、蛋白酶均购自Sigma公司；硝酸银购自中国人民解放军第九五零九工厂；λDNA/HindIII digest DNA Marker、2000DL DNA Marker和Taq HS均购自大连宝生物工程有限公司；16SrDNA通用引物由上海英骏生物工程有限公司合成；土壤提取试剂盒
Soil DNA Kit(50)购自Omega公司。
三.土壤微生物总DNA直接裂解方法
方法一CTAB-蛋白酶-SDS-反复冻融法
取5g土样，向其中加入13.5mL DNA提取液I(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na3PO4 100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB；pH 8.0)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，备用。
方法二PVP预处理-CTAB-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法
取5g土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液(含10g/L PVP-K30；pH 8.5)30mL，摇床振荡15min，8500r/min离心5min，取沉淀，重复洗涤3次；取沉淀，加入13.5mL DNA提取液I(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na3PO4 100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB；pH 8.0)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，备用。
方法三PVP预处理-CTAB、CaCl2、BSA-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法
取5g土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液(含10g/LPVP-K30；pH 8.5)30mL，摇床振荡15min，8500r/min离心5min，取沉淀，重复洗涤3次；取沉淀，加入13.5mL DNA提取液II(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na3PO4 100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl2，1μg/mL BSA；pH 8.0)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min。后续操作与方法二相同。
方法四CTAB、PVP、CaCl2、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS-反复冻融法
取5g土样，加入13.5mL DNA提取液III(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na3PO4 100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl2，1μg/mL BSA，2％PVP；pH 8.0)和少许石英砂，漩涡振荡器震荡3min；加入150μL 100mg/mL溶菌酶、15μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h。后续操作与方法二相同。
方法五CTAB、CaCl2、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS、PVP-反复冻融法
取5g土样，加入13.5mL DNA提取液II(Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na3PO4100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl2，1μg/mL BSA；pH 8.0)和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL、20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；加入1.5mL 10％SDS和0.3g PVP，混匀，65℃水浴1h；反复冻融3次。后续操作与方法二相同。
方法六试剂盒法
采用Omega公司的土壤提取试剂盒
Soil DNA Kit(50)进行提取。
四.土壤微生物总DNA沉淀方法
方法一异丙醇沉淀法
在上清液中加入0.7倍体积异丙醇和0.1倍体积NaAc，-20℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μLTE溶解沉淀，-20℃保存。
方法二PEG8000沉淀法
在上清液中加入0.5倍体积25％PEG 8000和0.1倍体积5mol/LNaCl，4℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μLTE溶解沉淀，-20℃保存。
五.土壤微生物总DNA的质量检测
1.DNA的纯度和定量检测用紫外分光光度计测量DNA溶液的D(230nm)、D(260nm)、D(280nm)值，根据公式dsDNA＝D(260nm)×稀释的倍数×50计算DNA的质量浓度(ng/μL)，换算出每克土提取的DNA量，且根据D(260nm)/D(230nm)、D(260nm)/D(280nm)检测DNA的纯度。同时用1％琼脂糖凝胶电泳检测分析。
2.16SrDNAV3片段PCR 以提取的桑园土壤微生物总DNA为模板直接进行PCR。正、反向引物分别为：GC-F341(5′-CGCCCGCCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGGGCACGGGGG G CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和R518(5′-ATTACC GCG GCT GCTGG-3′)。反应体系：10×PCR buffer(含Mg2+)3μL，2.5mmol/L dNTPs 2.4μL，10μmol/L上、下游引物各0.6μL，Taq酶1U，模板DNA 30ng，最后加ddH2O至30μL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火1min，72℃延伸1min，36个循环(退火温度从65℃～55℃，每一循环降低0.5℃，随后15个循环保持55℃)；72℃最终延伸7min。PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。重复三次。
3.变性梯度凝胶电泳分离16SrDNA V3片段PCR产物应用JY-TD331变性梯度凝胶电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司)分离PCR产物。取15μL PCR产物，加入10μL6×loading buffer进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)，电泳条件：8％聚丙烯酰胺，电泳缓冲液为l×TAE，50％～80％变性剂(尿素和去离子甲酰胺)，温度60℃，电压100V，电泳时间17h。电泳结束后银染显色。
六.结果分析
1.桑树根围土壤微生物总DNA提取方法的初步筛选
采用5种不同的细胞裂解方法和2种DNA沉淀方法进行组合，从而得到8种不同的直接提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，并以试剂盒法提取的桑树根围土壤微生物总DNA为参照，利用紫外分光光度法测定其D(230nm)、D(260nm)、D(280nm)值。以D(260nm)/D(280nm)代表DNA的纯度与质量，以D(260nm)/D(230nm)代表DNA中腐殖酸污染的程度。表1数据显示了不同提取方法的效果。
方法2以CTAB-蛋白酶-SDS-反复冻融裂解细胞，获得DNA产率较高，但是腐殖酸污染严重；方法3、4、5、6在方法2的基础上均采用2％偏磷酸钠缓冲液(含1％PVP-K30；pH8.5)预洗涤，使微生物从土壤中充分释放，以期提高DNA产率，但方法3、6并未达到理想效果，方法4、5效果较好，且对去除腐殖酸则起到了一定作用。其中，方法4和方法5在方法2的基础上进一步采用BSA、CaCl2去除腐殖酸，使得DNA的纯度有所提高，腐殖酸的污染程度有所降低。方法8、9省去了PVP预处理，PVP在其后的裂解步骤中加入，但影响并不大。试剂盒提取的DNA纯度高，腐殖酸污染程度低，但是，DNA产率低，且试剂盒价格昂贵。
由图1可知，不同方法提取的DNA的分子质量都在23kb以上，是基因组DNA，且DNA未被打断，均为大片段DNA，可用于后续的分子生物学分析。综合考虑DNA纯度与质量、腐殖酸污染程度和产率，方法4、5、8、9结合物理、化学、生物3种方法裂解细胞，在DNA提取液中添加PVP、BSA、CaCl2进一步去除腐殖酸，省去繁琐的预洗涤步骤，获得的DNA产率高于11.2μg/g，D(260nm)/D(230nm)大于2.11，D(260nm)/D(280nm)大于1.71，在纯度和腐殖酸污染程度上都达到了直接进行PCR的要求。
表1几种桑树根围土壤微生物总DNA提取方法的比较
以不同方法提取的未经纯化的桑树根围土壤微生物基因组总DNA为模板，直接扩增细菌16S rDNA的V3区，从而判断DNA提取样品中是否存在抑制剂且足以抑制Taq酶活性，致使其不能得到扩增产物。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2。采用方法4、5、8和9提取的总DNA都能成功的扩增出16SrDNA V3片段，而采用方法1、2、3、6、7所提取的模板DNA未能扩增出目的条带，说明DNA模板不纯，含有一定的杂质，抑制了后续的PCR反应。
将方法4、5、8和9提取的总DNA扩增后的产物直接上样，通过变性梯度凝胶电泳检测显示的桑园土壤微生物群落的多样性，从而进一步验证本试验建立桑树根围土壤微生物总DNA提取方法的可行性，结果如图3所示。4种方法提取的总DNA均能得到比较丰富的细菌群落多样性图谱，但方法8、9提取的细菌多样性明显要比方法4、5的高。由此可知，提取高纯度的DNA模板对PCR扩增十分关键。
本发明有如下有益效果：
1.针对桑园土壤的特殊性，利用CTAB、溶菌酶、蛋白酶和SDS共同作用以裂解细胞的同时对其反复冻融进一步破碎细胞，确定了适合桑园土壤的处理CTAB、溶菌酶、蛋白酶、SDS浓度，获得了良好的细胞裂解效果。确定了适合于桑园土壤的反应条件，提高DNA产率。所用方法简单方便，不需经纯化即可用于后续的PCR分析和DGGE分析。
2.针对桑园土壤的特殊性，本法省去了冗长、繁琐的DNA洗涤步骤，节省时间和避免DNA损失，且在DNA提取液中直接添加CaCl2、BSA和PVP，确定了适合桑园土壤的反应条件，使得操作简便，腐殖酸去除效果明显，这是本发明的创新之处。另外，CTAB不仅可用于细胞裂解，还有助于去除腐殖酸。确立的适合于桑园土壤的PEG8000沉淀反应体系使得本发明提取的DNA纯度比现有提取效果最好技术提高7.3％-8.4％，达到直接进行后续分子生物学研究的需要。
3.利用本发明方法提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，并可对DGGE谱带的特异条带切胶回收、碱基测序，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成，为今后研究桑树根围土壤微生物群落结构多样性与生态功能奠定基础。
附图说明
图1不同方法提取桑树根围土壤微生物总DNA的电泳图谱(M.λDNA/HindIII分子标记1～9不同方法提取总DNA，泳道编号与表1编号一致)
图2不同方法提取桑树根围土壤微生物总DNA的16S rDNA PCR扩增结果(M.DL2000DNA分子标记1～9不同方法提取总DNA的16S rDNA扩增结果，泳道编号与表1编号一致)
图3不同方法提取桑树根围土壤微生物总DNA的16S rDNA的DGGE图谱(泳道编号与表1编号一致)
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文结合实施例对本发明做进一步的说明：
实施例1：
PVP预处理-CTAB-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法。取5g土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液(含10g/LPVP-K30；pH 8.5)30mL，摇床振荡15min，8500r/min离心5min，取沉淀，重复洗涤3次；取沉淀，加入13.5mL DNA提取液I和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，在上清液中加入0.7倍体积异丙醇和0.1倍体积NaAc，-20℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，-20℃保存即获得桑园土壤微生物总DNA。
实施例2：
PVP预处理-CTAB、CaCl2、BSA-溶菌酶-蛋白酶-SDS-反复冻融法取5g土样加入20g/L偏磷酸钠缓冲液(含10g/L PVP-K30；pH 8.5)30mL，摇床振荡15min，8500r/min离心5min，取沉淀，重复洗涤3次；取沉淀，加入13.5mL DNA提取液II和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，在上清液中加入0.7倍体积异丙醇和0.1倍体积NaAc，-20℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μLTE溶解沉淀，-20℃保存。即获得桑园土壤微生物总DNA。
实施例3：
CTAB、PVP、CaCl2、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS-反复冻融法。取5g土样，加入13.5mLDNA提取液III和少许石英砂，漩涡振荡器震荡3min；加入150μL 100mg/mL溶菌酶、15μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，在上清液中加入0.7倍体积异丙醇和0.1倍体积NaAc，-20℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，-20℃保存，即获得桑园土壤微生物总DNA。
实施例4：
CTAB、CaCl2、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS、PVP-反复冻融法。取5g土样，加入13.5mLDNA提取液II和少许石英砂，漩涡振荡器振荡3min；加入100mg/mL溶菌酶150μL、20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；加入1.5mL 10％SDS和0.3g PVP，混匀，65℃水浴1h；反复冻融3次；8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，在上清液中加入0.7倍体积异丙醇和0.1倍体积NaAc，-20℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，-20℃保存，即获得桑园土壤微生物总DNA。
实施例5：
CTAB、PVP、CaCl2、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS-反复冻融法。取5g土样，加入13.5mLDNA提取液III和少许石英砂，漩涡振荡器震荡3min；加入150μL100mg/mL溶菌酶、15μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25∶24∶1)抽提，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24∶1)再次抽提，8500r/min离心10min，取上清液，在上清液中加入0.5倍体积25％PEG 8000和0.1倍体积5mol/L NaCl，4℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，-20℃保存。即获得桑园土壤微生物总DNA。
Claims (2)
1.一种高效提取桑树根围土壤微生物总DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用CTAB、PVP、CaCl2、BSA-溶菌酶、蛋白酶-SDS-反复冻融法；取5g桑树根围土样，加入13.5mL DNA提取液III和少许石英砂，漩涡振荡器震荡3min；加入150μL 100mg/mL溶菌酶、15μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃、230r/min摇床中温育1h；再加入20mg/mL蛋白酶K 15μL，混匀，37℃水浴1h；加入1.5mL 10％SDS，65℃水浴1h；反复冻融3次，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提，酚/氯仿/异戊醇体积比25∶24∶1，8500r/min离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇再次抽提，氯仿/异戊醇体积比24∶1，8500r/min离心10min，取上清液；在上清液中加入0.5倍体积25％PEG 8000和0.1倍体积5mol/L NaCl，4℃放置过夜，8500r/min，4℃离心20min，沉淀用70％乙醇洗涤，12500r/min离心10min，沉淀室温晾干，加入200μL TE溶解沉淀，-20℃保存；即获得桑树根围土壤微生物总DNA。
所述DNA提取液III成分为Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L，Na3PO4 100mmol/L，NaCl 1.5mol/L，1％CTAB，2％CaCl2，1μg/mL BSA，2％PVP；pH 8.0；pH 8.0所述的土样，采自采样桑树根围土壤深度为5～10cm表土层，按5点法取样，混匀后放入无菌袋中，4℃保存。
2.如权利要求1所述的提取DNA的方法的用途，其特征在于：该方法在进行16SrDNA的扩增及DGGE图谱分析，与RDP数据库中已有的序列进行比对，或通过建立新的序列探针识别未知菌，从而确定微生物群落结构组成、结构多样性及其生态功能。
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| CN (1) | CN102643796A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1978453A (zh) * | 2005-12-07 | 2007-06-13 | 浙江工业大学 | 一种土壤微生物dna的提取方法 |
| CN102286463A (zh) * | 2011-06-29 | 2011-12-21 | 内蒙古大学 | 一种高效去除腐殖质的环境样品总dna提取方法 |
-
2012
- 2012-04-05 CN CN2012100968371A patent/CN102643796A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1978453A (zh) * | 2005-12-07 | 2007-06-13 | 浙江工业大学 | 一种土壤微生物dna的提取方法 |
| CN102286463A (zh) * | 2011-06-29 | 2011-12-21 | 内蒙古大学 | 一种高效去除腐殖质的环境样品总dna提取方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《应用生态学报》 20061130 李钧敏等 一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法 摘要，第2107页第2节，第2108页左栏第1段、第2.3.4节 1-2 第17卷, 第11期 * |
| 何丽鸿等: "堆肥中微生物总DNA的高效提取", 《微生物学报》 * |
| 李钧敏等: "一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法", 《应用生态学报》 * |
| 蒋云霞等: "不同提取缓冲液对红树林土壤DNA提取品质的影响", 《热带海洋学报》 * |
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