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CN102612652B - 用于分子分析的设备和方法 - Google Patents

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CN102612652B CN201080038285.8A CN201080038285A CN102612652B CN 102612652 B CN102612652 B CN 102612652B CN 201080038285 A CN201080038285 A CN 201080038285A CN 102612652 B CN102612652 B CN 102612652B
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Abstract

提供了用于高速分选在连续流体主体中的物体的系统和方法。物体可在允许物体的特性的同时或时间相关的测量的一个或多个探询容积内被分析。处理器可解释物体的特性并接着测量，且然后使物体定向到多个下游流路中的一个。在一些实施方案中，物体的分选基于物体的两种或更多种特性。可重复分析过程以产生分选事件的网络。

Description

用于分子分析的设备和方法
交叉引用
本申请要求2009年8月6日提交的美国临时申请No.61/231,979、2010年2月24日提交的美国临时申请No.61/307,827、2009年8月6日提交的美国临时申请No.61/231,963、以及2010年6月28日提交的美国临时申请No.61/359,266、以及同此一起提交的在律师客户档案号32497-714.601之下的共同未决的案例的优先权利益，其中每个申请为了所有目的通过引用被全部并入本文。
关于联邦赞助的研究的陈述
在国家健康研究所的合同号R01DA025722和国家科学基金会(NBTC)的合同号ECS-9876771下以美国政府的支持来进行本发明。
发明背景
络合生物分子的混合物的分离是在高通量筛选中的重要要素。分选生物分子的能力在基因组学、蛋白质组学和药物筛选的领域中特别重要。在例如蛋白质组学中，种类繁多(大约10,000种不同的种类)的蛋白质和肽样本需要被分离和分析。蛋白质组学的一个目的是快速鉴定并定量所有在细胞中表达的所有蛋白质或在细胞中表达的与特定的通路或疾病相关的蛋白质的特定子集。在基因组学中类似地，快速分析并分离大量基因组片段的能力是高度合乎需要的。基因组学的一个目的是快速鉴定并定量细胞或任何类似地小的样本实例如激光微观捕获的生物样本中的所有基因组修饰。药物筛选的一个目的是鉴定结合到细胞或细胞外蛋白质的小分子，该细胞或细胞外蛋白质用作治疗介入的目标(例如，药物或气体治疗处理)。结合到目标蛋白质的分子(例如，小有机分子、肽或大分子例如蛋白质和适配子)常常调整其能力。这样的分子本身可用作治疗法或可指导治疗法的设计。当前的分选技术例如柱纯化、免疫沉淀反应或凝胶电泳具有很多深层的缺点，包括低敏感性、低速度和高成本。
因此，仍然相当需要对在基因组学、蛋白质组学、药物筛选和适配子选择中的稳健的高通量应用有用的可选工具。
发明概述
表观遗传状态的单分子研究可能访问使用染色质免疫共沉淀(ChIP)当前不可获得的信息，染色质免疫共沉淀被限制到在使用微克数量的起始原料时的一个表观遗传标志的研究。在ArnabMukhopadhyay，BartDeplancke，AlberthaJMWalhout&HeidiATissenbaum，NatureProtocols3，698-709(2008)中描述了常规CHIP技术。
因此，本发明解决对用于以单分子分辨率分选络合分子的方法和设备的需要。纳流控中的单分子探测可消除对检查多个表观遗传标志所必需的重复连续的准备。每个分子的多色特征可用于同时评估多个标志的存在。这可允许表观遗传标志的复杂互连的作用被理解并在皮可数量的输入材料上被检查。
本发明提供了用于分选物体的系统，其包括：(a)通道，其流体地连接到多个下游流路，所述通道适合于将所述物体保持在所述通道中的连续液体主体中；(b)一个或多个光源，其配置成照亮通道以产生一个或多个探询容积；(c)探测模块，其配置成探测表示在所述一个或多个探询容积中的物体的两种不同的特性的至少两种类型的信号；以及(d)分选模块，其配置成基于所述两种类型的信号使物体定向到所述多个下游流路中的一个。
在一些实施方案中，系统还可包括：(a)一个或多个次级光源，其配置成照亮所述多个下游流路中的一个以产生一个或多个下游探询容积；以及(b)次级探测模块，其配置成探测在所述一个或多个下游探询容积中的至少一种类型的信号。系统还可另外包括次级分选模块，其配置成基于所述一个或多个下游探询容积中的所述两种类型的信号使物体定向到多个次级下游流路中的一个。
在前述实施方案的任一个中，物体选自由核酸分子、蛋白质、染色质、生物分子、细胞、细胞成分、碳水化合物和遗传物质组成的组。所述一个或多个探询容积可小于10、1、0.5、0.2、0.1或0.05飞升(femtoliter)。通道可在分支点处流体地连接到2、3、4或5个下游流路。系统可包括由单个光源照亮的多个探询容积。系统包括沿着直线定位的至少三个探询容积。所述一个或多个光源可产生多个探询容积。通道可以是微流控通道。物体可以由流体携带。通道可包括光学透明的壁。探测模块可包括一个或多个光探测器。物体可通过电动力流经所述连续液体主体。分选模块可包括配置成使物体定向到多个下游流路中的一个的多个电极。分选模块可包括配置成使物体定向到所述多个下游流路中的所述一个的多个电极。分选模块可包括配置成使物体定向到所述多个下游流路中的所述一个的多个电极，其中电极放置成接近切换容积高达大约0.1、1或10mm的距离。分选模块可包括配置成使物体定向到所述多个下游流路中的所述一个的一个或多个阀。分选模块可包括光镊。分选模块可使物体以及不大于大约100、10、1、0.5或0.1飞升的切换流体定向。分选模块可使物体以及不大于大约100、50或10倍于所述一个或多个探询容积的切换流体定向。
在前述实施方案的任一个中，分选模块包括现场可编程门阵列，其配置成接收关于物体的数据和/或返回使物体定向到所述多个下游流路中的一个的指令。现场可编程门阵列可解释数据和/或在小于大约1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6或1×10-7秒内返回指令。
本发明的另一方面提供了用于分选通道中的物体的方法，其包括：(a)使物体流经所述通道，其中用多个标记来标记所述物体；(b)照亮通道以产生一个或多个探询容积，每个探询容积由所述通道的壁和光束限制；以及(c)探测在所述一个或多个探询容积的相同或不同探询容积中的所述多个标记的至少一个标记和另一其它标记，以产生所述第一标记和第二标记的时间相关的分辨率；以及(d)使物体定向到流体地连接到所述通道的多个下游流路中的一个。
在一些实施方案中，方法还包括：(a)照亮下游路径以产生一个或多个下游探询容积；以及(b)探测在所述一个或多个下游探询容积中的所述多个标记的至少一个标记。方法还可包括基于探测到在所述一个或多个下游探询容积中的至少一个标记来使物体定向到多个次级下游流路中的一个。
在前述实施方案的任一个中，物体可选自由核酸分子、蛋白质、染色质、生物分子、细胞、细胞成分、碳水化合物和遗传物质组成的组。通道可被照亮以产生多个探询容积。物体可被标记有多个标记。方法可包括探测多于两个的不同标记。所述一个或多个探询容积可小于大约10、1、0.5、0.2、0.1或0.05飞升。可光学地探测标记。定向步骤由电动力、光镊或阀实现。物体可被分析并在小于大约1、0.5、0.1、0.01、0.001或0.0001秒内被定向。物体可被定向到在分支点处流体地连接到通道的至少2、3、4或5个下游流路中的一个。。可使用小于大约100、50或10倍于所述一个或多个探询容积的切换容积使物体定向到所述多个下游流路中的所述一个。可使用小于大约1000、100、50或10倍于物体的容积的切换容积使物体定向到所述多个下游流路中的所述一个。多个下游流路中的所述一个可由现场可编程门阵列选择，现场可编程门阵列配置成接收关于物体的数据和/或返回使物体定向到所述多个下游流路中的一个的指令。
在一个实施方案中，本发明提供了包括配置成在至少两个限定的方向上移动多个分子的微流控通路的设备，其中所述通路包括亚微米通道区，其中所述亚微米通道区配置成同时探询单分子特性或在所述亚微米通道区内的所述分子的多个分子特性，且其中所述探询提供时间相关的单分子分辨率。亚微米通道可包括小于大约1μm的宽度和/或小于大约1μm的高度。亚微米通道可具有大约5μm和大约500μm的长度。设备可包括亚微米通道，其中所述亚微米通道区的一部分是光学透明的。在前述实施方案的任一个的另一方面中，本发明提供了一种设备，其中所述设备包括熔融硅石或熔融石英。
在前述实施方案的另一方面中，本发明提供了一种设备，其中所述分子包括多核苷酸、蛋白质、胎、适配子、有机分子、小有机分子或候选治疗分子的一个或多个。设备可配置成探测在两个分子或大分子或表观遗传修饰之间的结合。设备还可配置成提供所述多个分子在所述至少两个限定的方向上的电动推进、压力驱动或压力引导的流动。设备还可配置成提供所述多个分子在所述至少四个限定的方向上的电动推进、压力驱动或压力引导的流动。设备还可包括接头，其中所述接头连接两个或更多个、或三个或更多个微流控通路。
设备可配置成检测分子特性，其中所述分子特性选自由电荷、吸光率、荧光性、极化、分子尺寸、分子重量、分子长度、纵横比、磁矩、电偶极矩、折射率、电导率和电容组成的组。在一些实施方案中，分子特性是荧光性。分子特性可以是在第一激发波长和第一发射波长处的荧光性和在第二激发波长和第二发射波长处的荧光性。多个分子特征可包括荧光性，其中所述荧光性可包括至少两种不同的发射波长。
在一些实施方案中，设备包括至少一个激光器。设备可包括两个激光器。设备还可包括激发滤光片、中性密度滤光片、分色镜、荧光发射滤光片和光子探测器中的一个或多个。分色镜可包括单频带分色镜。设备可包括光纤。设备可包括光电探测器。光电探测器可以是光电倍增管或雪崩光电二极管。设备可包括物镜或透镜。物镜或透镜可以是高数值孔径物镜或透镜。在一些实施方案中，设备配置成提供低自体荧光背景。
在一个实施方案中，设备还包括两个激发滤光片、两个中性密度滤光片、两个荧光发射滤光片、两个分色镜、和两个光子探测器中的一个或多个。在另一实施方案中，设备可包括选自光电倍增管或雪崩光电二极管的两个光子探测器。
本发明提供了一种设备，其中两个分色镜的一个包括单频带分色镜，而两个分色镜的另一个包括双频带分色镜。
设备还可包括电启动的切换装置。电启动的切换装置可配置成改变所述多个分子从一个限定的方向到另一限定的方向的运动的方向。电启动的切换装置可配置成电动地改变所述多个分子的至少一个从一个限定的方向到另一限定的方向的运动的方向。电启动的切换装置可通过所述多个分子的多个分子特性的同时探测来启动。
在一些实施方案中，设备还可包括计算机。
在另一实施方案中，本发明提供了一种设备，其包括：流体入口、至少一个流体出口，其中所述设备配置成提供在流体入口和所述至少一个流体出口之间的可变电压电势，亚微米通道包括一个或多个接头、照明源和光电探测器；其中所述设备配置成光学地探询多个分子的一种或多种分子特性的多个，所述多个分子布置在具有单分子分辨率的所述亚微米通道内并穿过所述亚微米通道被电动地推进或压力驱动。
光电探测器可包括一个或多个光电倍增管或雪崩光电二极管。照明源可包括一个或多个激光器。分子特性可选自由电荷、吸光率、荧光性、极化、分子尺寸、分子重量、分子长度、纵横比、磁矩、电偶极矩、折射率、电导率和电容组成的组。设备还可包括逻辑设备，其中所述逻辑设备配置成探测所述多个分子中的两种或更多种分子特性的时间符合，所述多个分子布置在具有单分子分辨率的所述亚微米通道内并穿过所述亚微米通道被电动地推进或压力驱动。设备还可包括分选触发器，其中所述分选触发器配置成分选布置在具有单分子分辨率的所述亚微米通道内并穿过所述亚微米通道被电动地推进或压力驱动的所述多个分子。可通过布置在具有单分子分辨率的所述亚微米通道内的所述多个分子中的两种或更多种分子特性的时间符合探测来启动分选触发器。分选触发器可通过布置在具有单分子分辨率的所述亚微米通道内的所述多个分子中的两种或更多种分子特性的时间符合探测来提供。设备可配置成提供时间符合探测。
在前述实施方案的任一个中，设备还可包括高电压分选执行电路，其中所述高电压分选执行电路配置成改变在流体入口和所述至少一个流体出口的至少一个之间的电压电势。高电压分选执行电路可配置成响应于来自分选触发器的信号而改变在流体入口和所述至少一个流体出口的至少一个之间的电压电势。
通过引用的并入
在本说明书中提到的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其达到的程度如同特别且单独地指明每个单独的出版物或专利申请通过引用并入。
附图简述
在所附权利要求中详细地阐述了本发明的新颖特征。通过参考阐述例证性实施方案的下面详述的描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中本发明的原理被利用，且其中附图：
图1示出本发明的示例性分选设备的流控通道、光和电部件的结构图。廉价的可编程逻辑设备可用于评估光特征并提供电压信号或“触发器”来执行分离。触发信号转变成高电压信号，其接着重定向在流体通道中的分子运动的分子方向。
图2是用于分选的流体通道的光学微观图。该分支的通道在磨光的熔融石英衬底中被蚀刻，且盖子被粘结以密封通道。亚微米宽度的窄区域允许在相对高浓度的溶液中的单分子的隔离和分选。
图3是具有DNA的定向流的流控通道的荧光图。DNA分子穿过设备的定向流动通过在Y形接头的分支之间切换外加电压来实现。时间流逝的成像用于说明超过每分钟1000个分子的分子穿过接头的高速率。
图4是由扫描电子显微镜成像的一个微流控通道的显微照片。通道在宽度和高度上是大约500nm。红圆圈被覆盖以指示由聚焦的激光斑点照亮的大致区域。
图5示出使用场照明来帮助流经流体通道的平行网络的DNA的显象的荧光光学显微照片。左边的图是示出保留在流体通道内的荧光标记的DNA的快照。右边的图是示出在流动和单分子隔离(狭窄的区域)期间同一荧光标记的DNA的显微照片(随着时间消逝)。
图6示出本发明的示例性分选设备的示意图。设备具有双激光器诱导荧光探测模块。
图7示出用于分选单个DNA分子的本发明的两个不同实施方案的示意图。A.电分选方法：荧光标记的染色质从底部流到顶部，并在紧接着在Y形分离室之前的激光检测容积中被鉴定。基于分子的颜色特征，分选触发器控制外加电压。在本实例中，展示主要绿色荧光的染色质被分选到Y劈叉的右边。B.光分选方法：类似于图7A，荧光标记的分子在激光检测容积中被鉴定。基于分选触发器，粒子俘获激光从捕获位置(在Y分支的底部)偏转到左或右分支中，使按需要分子定向。在本实例中，展示主要绿色荧光的染色质-量子点结合物物被分选到Y劈叉的右边，而红色荧光结合物被分选到左边。在一些实施方案中，本发明的设备提供了三色探测(例如，红、绿、黄)，其可提供具有两种颜色(例如，红和绿)的染色质到一个分支的分选以及具有两种颜色(例如，红和黄)的染色质到两个分支的分选。
图8示出通过合并串行(左边)或并行(右边)的额外分支点来提供增加的分选能力的本发明的实施方案。
图9示出本发明的例证性分析和准备设备的显微照片。左边的图是本发明的分析设备的光学显微照片，其中电压梯度可被建立以使染色质从底部移动到顶部或从顶部移动到底部。分选设备的中间光学显微照片，其中分子从底部流到顶部，顶部的两个分叉代表两个可能的流出道。从底部到顶部流经分选设备的TOTO-3标记的DNA的右边长曝光荧光显微照片。在该图像中，流出道的左臂中的电极被充电，使DNA定向到左收集室。注意，在右臂中的电极可由高速开关充电，高速开关被编程为对在恰好在分叉之下的检测容积中进行的观察作出响应。
图10A示出在熔融硅石上的27个流控通道阵列的阵列。
图10B示出流控通道的放大图像。
图10C示出涉及在纳流控通道的横截面内的单分子的激光诱导荧光探测的示例性设置。
图10D示出荧光数据的示例性分析输出。数据是0.25秒时间扫描，其使用绿色标记的组织蛋白到红色标记的DNA的时间符合探测事件来说明纳流控通道中的结合态天然染色质片段。
图11A示出分叉的纳流控通道。
图11B描绘示出进入顶部并被主动分选到左边的分子的分叉通道的图像。满足分选条件的分子由FPGA鉴定并被穿梭到正确的分支。事件的紧凑时间分辨的记录也被分选。
图11C描绘示出分叉通道、探测器、现场可编程门阵列(FPGA)、数据记录器和计算机以及高电压分选执行电路和电连接的示意图。
图12A示出说明使用给出的实验参数的收集效率的表，分子穿过单个分支前后移动，使用吸管收集并接着使用qPCR被量化以展示～25％的分子收集效率。
图12B示出说明来自2和10Kbp片段的混合物的10Kbp片段的探测(输入)、选择(分选)和收集(输出)的时间迹线。150光子/bin的强度被应用以分离片段。说明光子探测的时间迹线是顶部曲线，分选执行是中间曲线，且输出是底部曲线。
图13示出描绘GFP标记的HeLa染色质和野生型HeLa染色质的恢复的曲线(左)以及描绘MBD甲基化DNA的未甲基化DNA的恢复的曲线(右)。左边的曲线说明染色质上的结合核小体与存在的GFP-HeLa染色质的量成比例地被探测到。右边的曲线说明MBD甲基化DNA的结合络合物在不相关的分子的恒定水平的背景上被探测到。
图14示出描绘探测流量的表。
图15示出用于分选分子的概念布局。
图16示出说明本发明的处理顺序的流程图。
图17示出分叉流控网络的电表示。
图18示出确定分叉网络的电特性的示例性方程和计算。
图19示出外部电阻器的平行网络的例证性覆盖图。
图20示出包括10μm(左)的微流控通道的不同设备的尺寸标度的级数。
图21是利用可变电阻器的两个网络的示意图。
图22示出使用流控网络来分离2、8和10kbpDNA的实验(右)和作为脉冲群强度的函数的DNA片段的相应频率(左)的示意图。
图23示出本发明的示例性分子分选硬件的示意图。固定电阻器和可变电阻器用于便于分选。探测器和可编程逻辑设备用于提供实时分选触发器。分选硬件还包括数据记录器和计算机、高电压分选执行电路以及电连接。
图24示出10秒分选的例子。分选条件如下：100μsbin，外加的50伏，每激光光斑280μW，分选阈值＞150光子/bin以及RC时间常数～1毫秒。具有＞150ph/bin的分子的结果如下：观察到的26个分子(输入)，满足分选阈值的实时鉴定的23个分子(分选)，被分选的9个分子(输出)。
图25示出簧片继电器与固态继电器的比较。
图26示出具有弓形通道的示例性分选设备。
图27示出具有弓形通道和三个检测容积的示例性分选设备。检测容积由单个光束照亮。
图28示出具有弓形通道的示例性分选设备的明视场光学显微照片。标度线是40微米。
图29示出包含8KbpDNA的溶液的荧光显微照片，该溶液添加有流经弓形通道的YOYO-1并使用宽视场荧光显微照片被观察到。
图30示出通道电阻特征的示例性计算和实验测量。
图31示出观察到的作为触发延迟的函数的8Kbp分子的曲线。
图32示出时间相关的分选的例子。顶部曲线是在被分选的输出中测量的光子，中间曲线是在输入中测量的光子，且顶部曲线是分选触发器的启动。
图33示出作为时间偏移的函数的50毫秒bin中的相关事件的曲线。
图34示出高速分选的例子。顶部曲线是在被分选的输出中测量的光子，中间曲线是在输入中测量的光子，且顶部曲线示出分选触发器的启动。
发明的详细描述
本发明提供了用于选定的分子和/或物体的自动分选的系统、设备和方法。主题发明一般利用流控系统来基于可鉴定信号分选给分子。这样的可鉴定信号包括但不限于电、频谱、光、荧光、电导率、极化、尺寸、纵横比、折射率、磁矩和电偶极矩。本发明的设备可基于例如荧光标记的探测来分选来自一集合的单独分子。本文的方法和设备对分选和分析分子有广泛的效用，所述分子通过其结合特别给出的标记或其它可探测的特征的能力来鉴定。
本文提供的设备和方法对用于鉴定具有对目标分子的亲和性的核酸分子的其它应用也是有用的。此外，本文提供的设备和方法对鉴定用于筛选例如药物筛选的化学库的结合部件可能是有用的。例如，本文提供的设备和方法对鉴定结合到目标例如治疗目标(例如，酶、激酶、蛋白酶、蛋白质、生长因子、碳水化合物等)的核酸、适配子、小有机分子或蛋白质可能是有用的。这可允许例如选择潜在的药物例如选择性地结合治疗目标的适配子分子、结合剂例如选择性地结合治疗目标的蛋白质或抗体、或小有机分子或用于从络合混合物提取特定的分子或粒子用于进一步的分析的新的更有效的方法。
系统、设备和方法对分析和/或分选物体特别有用。术语“物体”可指本文所述的任何分子、单分子、络合物、细胞、细胞成分或珠子。例如，系统、设备和方法可用于分选分子，包括但不限于遗传物质、核酸(例如，DNA、RNA及其混合物)、核酸片段、蛋白质、蛋白片段、适配子、碳水化合物、脂质、核酸-蛋白质络合物、蛋白质-蛋白质络合物及其任何组合。物体也可以是细胞、细胞成分或细胞片段。例如，系统、设备和方法可用于分选其它分子，包括聚合物、有机分子、小有机分子、药物、药物目标和化合物。分选器也可分选粒子，例如珠子、囊泡和脂囊泡。在一些情况下，本文提供的系统、设备和方法可用于分选具有特定的结合蛋白质或改变的化学状态的核酸，用于表观遗传分析。在一些情况下，本发明提供对染色质的分选，染色质包括整体染色质和染色质片段和/或组织蛋白。待分选的物体可以具有各种尺寸。例如，待分选的物体一般具有小于在分选系统中的通道的尺寸、直径或宽度的尺寸。在一些实施方案中，物体的所有尺寸可以大于通道的宽度，例如细长的核酸。如本文所述的，待分选的物体可针对内在特性被测量，或可使用与物体络合的另一分子来被标记。这样的标记的例子包括荧光染料，例如任选地配对到核酸探针的量子点。可以利用的其它标记包括添加染料，例如YOYO-1、TOTO-3、SyberGreen、溴化乙啶。
物体或样本中的遗传物质可被络合、预处理或与一个或多个标记混合。在一个实施方案中，遗传物质被标记有多个标记，其中至少一个标记特别与所述遗传物质上的表观遗传标志物络合，而至少一个其它标记与所述遗传物质的蛋白质和/或核苷络合。标记包括荧光染料、量子点、磁性粒子、金属粒子和有色染料。在本文描述染料的例子。染料或标记可被配对到结合部分，例如抗体、核酸、蛋白质、适配子、亲和钳、肽、天然出现的蛋白质和结合到所关注的目标蛋白质的蛋白质结构域。结合部分可以是特定或一般的。在一些实施方案中，一个结合部分是表观遗传标志所特有的，而第二个结合部分一般结合到核酸、蛋白质或生物分子。
分选的物体接着被收集、再次分选和/或进一步分析。例如，分选的核酸分子可被恢复并具有其序列或化学特征，其使用例如DNA测序、质量光谱测定法、ELISA、免疫沉淀反应、杂交技术(例如，微阵列杂交)或PCR来被进一步分析。
设备
本发明提供了用于分选物体的系统和设备。主题系统一般包括下面的部件：通道，其流体地连接到多个下游流路，所述通道适合于将所述物体保持在所述通道中的连续液体主体中；一个或多个光源，其配置成照亮通道以产生一个或多个探询容积；探测模块，其配置成探测表示在所述一个或多个探询容积中的物体的两种不同的特性的至少两种类型的信号；以及分选模块，其配置成基于所述两种类型的信号使物体定向到所述多个下游流路中的一个。
图1示出了示例性设置。例如，分选系统可包括流控端口或入口，其通到在分支点处连接到多个下游流路或通道的通道。下游流路或通道可通到另外的流控端口或出口。一个或多个探测区可位于分支点的上游和/或下游。探测系统可利用本领域已知的各种探测技术。在本发明的一些实施方案中，探测系统可利用测量光、电、放射性、声、物理(例如，尺寸、密度、导热率、弹性、粘性和强度)和/或磁特性的探测器。光学特性可包括发光性、荧光性、颜色、吸收性、反射比、共振和光散射。可在变化或不同的波长或频谱处测量这些光学特性的每个。电特性可包括电导系数、电阻、电偶极子、电荷、阻抗或电容。也可在频域中测量电特性。探测器可配置成测量探询容积内的信号。探测器可将所测量的信号传输到可编程逻辑设备，其可解释和/或分析信号。可编程逻辑设备可向分选执行电路提供指令，如图1所示，使得物体可被适当地分选。可编程逻辑设备还可向数据记录器和/或计算机报告光子计数和关于物体的分选的信息。
分选的物体可在下游流路中被探测和/或分析，或在收集之后被探测和/或分析。在下游流路中的探测和分析可用于检验适当的分选，或提供关于如何进一步分选物体并将物体定向到多个次级下游流路的信息。图8(左)示出包括可允许物体的重复分选的多个分支点或分叉的通道的布置。在下游流路中的探测和分析可类似于在上面描述的上游通道中执行的探测和分析。探测技术可以是相同或不同的，且物体的相同或不同特性可被测量。在下游流路中的探测器可将所探测的信号传输到同一可编程逻辑设备，或不同的可编程逻辑设备。来自可编程逻辑设备的指令可以传输到可在任何或所有分支点控制物体的分选的同一分选执行设备，或可传输到可在下游的和/或相邻于探测器的分支点控制物体的分选的不同分选执行设备。
物体的分选可重复以产生1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个分选事件。可使用初级、次级、三级、四级、五级、六级、七级、八级或更多通道、探测区、分支点和下游流路来执行重复的分选。
通道
如上所述，分选设备可包括一个或多个通道或流路。可使用各种技术——包括微制造和纳米制造技术——来制造通道。通道可由各种衬底——包括但不限于硅石、镜抛熔融硅石、硅、石英、玻璃或聚合材料(例如，PDMS、塑料)制成。通道可被蚀刻、烧蚀、模制到衬底中。通道或流路可被涂覆。涂层可改变通道的特性，并可被图案化。例如，涂层可以是疏水的、亲水的、磁性的、顺磁性的、传导的或功能化的，取决于待分选的物体。涂层或络合、配对或结合到涂层的材料可展示对一种或多种类型的物体的亲和性。涂层或结合到涂层的材料可减小物体对通道的粘附性。涂层材料的例子包括PTFE。通道可具有形成为像圆、椭圆、矩形、方形、梯形、三角形、五角形或任何其它形状一样的横截面。通道可具有一个或多个横截面尺寸，例如高达大约、小于大约或大约10、20、30、40、60、80、100、200、250、400、500、550、600、700、800、900、1000、1250、1500或3000纳米的直径、宽度和/或高度。通道的尺寸可被选择成高达大约、大于大约或小于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75或100倍于待分选的物体的宽度。
一个或多个通道可在一个或多个分支点处彼此流体地连接。一个或多个通道允许在连续液体主体中或以可逆的方式(如上所述)分选物体。分支点可以是分叉，其中单个上游通道在分叉点处连接到两个下游流路或通道。如图8(左边)所示，分选设备可具有多个分叉点。在本发明的其它实施方案中，一个或多个通道可在分支点处流体地连接到多于两个的下游流路或通道。如图8(右边)所示，分选设备可包括在分支点处流体地连接到四个下游流路或通道的上游通道。在本发明的一些实施方案中，设备具有多个分支点，每个分支点具有两个、三个、四个、五个或更多下游流路或通道。分支点可具有相同或不同数量的下游流路。分支点可以是T形、Y形或其任何变形。通道可以是直的或弯曲的。通道可位于两个或三个维度中，使得所有通道在同一平面中，或相同的通道在不同平面中。
通道——包括下游流路和通道——可具有相同或不同的尺寸。下游流路或通道可具有与上游通道比较相同、更高或更低的横截面区域。通道的尺寸可被选择成维持通道内的流体粘性。在一个例子中，上游通道在分叉点处流体地连接到两个下游通道，且每个下游通道的横截面是上游通道的横截面的一半。
在本发明的一些实施方案中，通道可从熔融硅石晶片蚀刻以产生具有27个流控通道阵列的堆栈，如图10A所示。流控通道可具有500nm的宽度和250nm的深度，如图10B所示。通道可以是微流控或纳流控通道。
通道和分选系统的其它例子可在美国专利No.2009/0050542和2009/0234202、美国专利No.6,927,065、7,405,434和6,833,242以及PCT公布No.WO/2010/044932中找到，每个专利通过引用被全部并入本文。
可使用外部压力源、内部压力源、动电学、磁学或其某种组合使携带物体的流体或仅仅物体穿过通道而定向。外部或内部压力源可以是泵，例如蠕动泵、注射泵或气动阀泵。
电动力可通过使用放置成与通道电相通的电极而施加到物体或携带物体的流体。电渗透和压力驱动的流是流控制的方法或系统的例子，也就是说，操纵分子细胞、粒子或试剂在一个或多个方向上或进入本发明的一个或多个通道的流动。也可使用其它方法，例如电泳和介电电泳。在本发明的某些实施方案中，流在例如从入口区穿过主通道和分支通道到达出口区的一个“前向”方向上移动。在其它实施方案中，流的方向是双向的。根据本发明的这些技术的应用提供了用于分选的更快速和准确的设备和方法，部分地因为分选出现在可在探测区处或紧接着之后放置的分支点处或中。这提供了分子或细胞移动的更短距离，它们可更快速地且以较小的湍流移动，并可在单个文件中，即，一次一个被更容易地移动、检查和分选。在另一实施方案中，可在不能恢复地将分子或细胞交付到出口或特定的分支通道之前例如通过反转和减慢流以重新读取或重新分选分子或细胞(或其多个)来避免潜在的分选错误。
在没有被任何理论束缚的情况下，电渗透被认为通过在两个或更多个电极之间施加微分电压或电荷梯度而在包含离子的流例如液体如缓冲剂中产生运动。中性(不带电的)分子或细胞可由该流携带。电渗透特别适合于快速改变流的路线、方向或速度。电泳被认为产生流体中的带电物体朝着相反电荷的一个或多个电极和远离相似电荷的一个或多个电极的运动。由于其带电性质(对每个基本对有2个电荷)，DNA可方便地通过适当PH的缓冲剂中的电泳来移动。
在没有被任何理论束缚的情况下，电泳被认为产生介电物体的运动，介电物体没有净电荷，但有相对于彼此带正电或负电的区域。在存在粒子例如分子、细胞或珠子的情况下交变的非均匀电场使它们变成电极化的，因此经受介电泳力。根据粒子和悬浮介质的介电极性，介电粒子可朝着高场强或低场强的区域移动。例如，活细胞的极性取决于其成分、形态学和表型，并高度依赖于所施加的电场的频率。因此，不同类型的和在不同生理状态中的细胞通常拥有明显不同的介电特性，其可例如通过微分介电泳力来提供对细胞分离的基础。见例如Fiedler等人(S.Fiedler等人AnalyticalChemistry70，1909-1915(1998))。
操纵也可依赖于具有悬浮介质的粒子的介电常数(介电性质)。因此，聚合物粒子和活细胞在水中以高场频率显示负介电电泳。例如，由水中的0.5MV/m场(对于20微米电极间隙是10V)中的胶乳球经受的介电泳力被预测为对于3.4微米胶乳球为0.2皮牛顿(pN)到对于15微米胶乳球为15pN(Fiedler)。这些值大部分大于在流中的球经受的液体动力(对于3.4微米球为0.3pN而对于15微米球为1.5pN)。因此，单独的细胞或粒子的操纵可在流动流体中例如在细胞分选器设备中使用介电电泳来完成。使用常规半导体技术，电极可被微制造到衬底上以控制在本发明的微制造的分选设备中的力场。介电电泳特别适合于移动是电导体的物体。AC电流的使用是优选的，以防止离子的永久取向。兆赫频率适合于提供净取向、吸引力和在相对长的距离上的运动。例如Benecke(Benecke等人的美国专利No.5,454,472(1995))。
在本发明的一些实施方案中，通道可布置成使得在分支点的上游和下游的通道具有平行的部分。图26中示出示例性实施方案。在图26中，一个输入通道可通到分支点，而两个输出通道可在分支点处连接到输入通道。输出通道可以是弓形的，使得输出通道的下游部分平行于输入通道。在本发明的其它实施方案中，通道可布置成使得在分支点的上游和下游的一个或多个通道在彼此的大约或小于大约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或75微米内。这些布置可允许穿过通道的物体的有效的设置、照明和探测。图28示出这样的布置的示例性明视场图像。图29示出分选系统的示例性实施方案的荧光图像。
在图26中，流入和流出道可以是40微米宽。增加道的宽度可减小达到特定的分子计数率所必须的外加电压。在一些实施方案中，10伏电势可用于达到每分钟500-1000个分子的计数率，这可允许使用具有10倍快的开关速度的固态继电器，该开关速度可以在系统的脉冲响应的数量级上。
探测模块和光源
分选系统可包括配置成测量相应于待分选的物体的特性的信号的一个或多个探测模块。本文所述的探测模块可利用各种探测技术。探测模块可探测光、电、放射性、物理(例如，尺寸、密度、导热率、弹性、粘性和强度)和/或磁特性。探测模块可探询或检测限定的容积内的物体。限定的容积可称为探询容积，其与术语“检测容积和探测容积”可互换地使用。在一些实施方案中，探测容积是其中光信号被探测的光学容积。探测容积一般由照到通道上的光束的给定波长和被照通道的壁的特性限制。探测模块可测量来自物体的一、二、三、四、五、六种或更多种特性或信号。例如，物体可具有根据物体的状态而改变的不同的可测量的特性。这些可测量的特性可以是物体内在的，或可由与物体络合的一个或多个标记给予。可与物体络合的标记的例子包括与包含核酸的染色质上的表观遗传标志物络合的荧光标记的抗体。
探测器的选择可取决于所使用的标记的类型。例如，光探测器可用于探测荧光标记，且电导仪或电探测器可用于探测金属标记。在通过引用被全部并入本文的PCT公布No.WO/2010/044932中描述了电探测系统的例子。电探测器可包括放置在探测区域附近的电线、纳米线、纳米管、晶体管或电容器。电探测器可由碳、硅、碳/硅或其它半导体材料制成。
利用物体的特性的光学探测的探测模块可包括光探测器或光电探测器。光探测器可以是CCD、CMOS阵列、光电倍增管、雪崩光电二极管(APD)、单光子计数模块、光敏电阻器、光伏电池、光敏晶体管、LED和其任何组合。
探测模块可包括一、二、三、四或更多个光源。光源可包括激光器、LED、荧光灯、白炽灯、卤素灯、气体放电灯和/或高强度放电灯。一个或多个光源可发射照亮一个或多个通道内的一个或多个区域或容积的一个或多个光束。光束可由光学部件例如高数值孔径物镜聚焦。照亮通道的光束可产生由通道的壁和光束限定的一个或多个检测容积。光束和通道的尺寸可限定检测容积的尺寸，如图10C所示。检测容积可具有大约、高达大约、或大于大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.75、1、5、10、25、50、75或100飞升的容积。术语“检测容积”也可称为探询容积、光学容积或探测容积。
光源可在探询容积内产生高达大约、大约或大于大约0.1、1、5、10、50、100、200、280、300、500、750、1000或2000μW的光束。
在一些实施方案中，多个光束将不同频谱或波长的光发射到通道中的相同或不同位置上。光束可产生重叠的探寻容积或不同的探寻容积。光束可具有大约、小于大约或大于大约通道的宽度的直径。在一些实施方案中，光束可比通道的宽带宽大约、高达大约或大于大约1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。光束的宽度可被选择成使得通道内的光实质上是均匀的。
探测模块还可包括一个或多个光学部件。例如，探测模块可包括一个或多个高数值孔径物镜或透镜、光纤、反射镜、分色镜、光栅和共焦孔径。光源、探测器和光学部件的布置可允许一、二、三、四、五、六或更多个信号的探测。该探测可以是同时的或时间相关的。时间相关的分辨率和/或精确度可以高达大约或大约0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500或1000毫秒。
本发明的设备可配置成使得多个检测容积可由单个光源照亮。作为例子，图27的设备可包括沿着直线定位的至少三个检测容积。作为例子，图27示出包括由单个光束照亮的三个平行通道的设备。单个光束可由椭圆透镜改变来产生椭圆光束。穿过这三个检测容积的物体可接着由一、二、三、四或更多个探测器测量。在一些实施方案中，每个检测容积由单个探测器测量。在一些实施方案中，两个或更多个检测容积由单个光束照亮，且每个检测容积由单个探测器监控。
如图27所示的设备可具有w形或弓形通道。这可允许输入和输出的同时或时间相关的探测。这可提供分选性能的原位检验，并可提供反转流并校正不适当的分选出现的情况的能力。在一些实施方案中，允许同时或时间相关的探测的这样的通道可具有斜角或锐角分叉、带有多个分支点的蛇形通道、以及圆对称的输入通道。圆对称的输入通道可便于检测容积的Cd播放器型读出。
沿着公共轴和/或维持每个检测容积之间的小距离的多个检测容积例如二、三、四或更多个检测容积的布置可减小在自由空间光学设置中的光束与通道调准时间和容差。紧凑结构减小对旋转中的未调准和流控设备在x或y(平面中)方向上相对于共焦检测容积(或光学设置)的机械偏移的敏感性。这可允许提高的调准稳定性、信噪比中的系统化变化的减小、以及较长的持续时间实验。本发明的设备可布置成使得稳定的测量可在大约或大于大约1、5、10、15、25、30、35、50、60、90、180、270、360、480或960分钟的过程内进行。
在本发明的一些实施方案中，光源和/或探测器可与流控设备集成。集成的光源和探测器可包括集成的波导、LED、激光二极管或等离子聚焦蝴蝶领结。在其它实施方案中，探测是电的，并可包括可位于流控通道内或背面附近的集成电极。
一个或多个探测器可配置成将关于一个或多个所探测的信号的信息传输到处理器。处理器可以是可编程逻辑设备、计算机、或可记录或解释信号的任何其它部件。处理器可以是本文所述的分选模块的部件。
如图1所示，探测激光器可恰好位于分支点的上游。探测激光器可照亮通道以产生检测容积。
如图1所示，高速光电探测器可探测从探询区发射的光并将光转换成光子计数。光子计数可传输到可编程逻辑设备。可编程逻辑设备可解释光子计数并确定物体如何基于光子计数来分选。
分选模块
分选系统可包括分选模块，其解释由探测模块测量的一个或多个信号和/或使物体定向到多个下游通道或流路的一个。由探测模块或探测器传输的信息可由处理器接收。处理器可以是计算机或可编程逻辑设备，例如现场可编程门阵列(FPGA)、PAL、GAL或CPLD。处理器可在大约、高达大约或大于大约15、25、50、60、75、100、200、500、1000或2000Hz、MHz或GHz处操作。在一些实施方案中，处理器是可解释数据并在小于大约1×10-2、2×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6或1×10-7秒内返回指令的FPGA。处理器可被编程为接收所测量的信号并使物体定向到多个下游流路中的一个。用于将物体分选到一个路径或另一个的条件可由用户经由计算机系统或另一设备上的用户界面编程到处理器中。用于分选物体的条件可包括二、三、四、五、六或更多个信号的同时或时间相关的探测。在预先选择的阈值之上的多于一、二、三、四、五、六或更多个信号的探测可用于区别物体。在一些实施方案中，信号相应于物体的光、电、磁、放射性或物理特性。所测量的信号可表示物体的不同特性。
处理器可解释数据以确定如何分选物体并将指令传输到分选执行器。处理器可解释在位于上游通道中的一个探询容积处获得的数据，并将指令提供到分选执行器以在一、二、三、四、五或更多个分支点处使物体定向到多个下游流路中的一个。处理器可解释在一个探询容积处获得的数据，并将指令返回到分选执行器以在紧邻探询容积和/或在探询容积下游的分支点处使物体定向到多个下游流路中的一个。分支点可以是远离探询容积的已知的距离、容积或时间。在探询容积和分支点之间的距离、容积或时间的精确知识可允许物体的准确和/或精确的分选。在探询容积和分支点之间的距离、容积或时间的减小可增加分选的精确度和/或准确度。
分选执行器可通过改变物体的轨迹或流路来执行物体的分选。分选执行器也可改变物体或携带物体的流体的轨迹或流路。分选执行器可通过物理地改变通道内的流路和下游流路或通过传递磁性、电或光学力来分选物体。在一些实施方案中，分选执行器可包括传递在物体上的电动力的一个或多个电极。可选地，分选执行器可包括改变携带物体的流体的流路的一个或多个阀。阀可以是气动阀、机械阀、磁性阀、旋转阀、液压阀、压电阀、梭式阀、弹性阀和电阀。在一些实施方案中，电极也可用于改变携带物体的流体的流路。静电学可用于改变物体的流路。光镊也可用于通过将物体放置在一位置上以沿着多个下游流路中的一个流动或使物体朝着多个下游流路中的一个偏转来改变物体的流路。光镊可在本发明中用于使用聚焦的光束例如激光器来俘获和移动物体，例如分子或细胞。
图1示出了利用电动力的分选系统。每个电极可位于分支点的大约、小于大约或大于大约0.01、0.5、1、2、5、10、20、50、75、100、200或300mm内。在一些实施方案中，电极位于探询容积和/或切换容积之外。一组电极可用于使物体沿着通道定向，而第二组电极可用于使物体选择性地定向到多个下游流路中的一个。第二组电极可放置成极接近于分支点，或可位于仅仅一个分支点周围。特定电极的使用可允许利用多个串行放置的分支点来分选系统中的物体。
除了由通道内的流体提供的电连接以外，分选物体还可包括电极之间的电连接。例如，外部电阻器可放置在流控通道的入口和出口之间，如图23所示。外部电阻器的使用可允许在分选物体时增加的精确度和准确度。外部电阻器还可减小分选物体所需的电压。
在本发明的一些实施方案中，分选模块可包括继电器。继电器可以是固态继电器和/或簧片继电器。继电器可用于切换施加在多对电极对的一对之间的电压。如图25所示，簧片继电器和固态继电器具有相关的优点。
在本发明的一些实施方案中，处理器可包括滤波功能。滤波功能可减小噪声并便于数据解释。滤波功能可以是求和或卷积滤波器。在一些实施方案中，求和或卷积滤波器使用大约、小于大约或大于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10bin的窗口。bin可以是大约、小于大约或大于大约1、5、10、25、50、100、150、200、250、500、750或1000微秒、毫秒或秒的时间帧。求和滤波器可对在5bin的窗口内的所关注的大约1bin的信号求和。其它滤波器可对在5bin的窗口内的所关注的大约1bin的信号求和并被bin的数量除。
分选系统的电子设备可包括可调节分选执行继电器。可调节分选执行继电器可在分选应出现时便于通过允许用户调节时间来分选物体，而不改变探询容积的位置。这可对涉及静态配置中的光学器件和流控的实验设置是重要的。继电器可被编程为在一范围之间。该范围可以在0到3、6、9、10、12、12.8、15、18或更多毫秒之间。增量可以是大约、小于大约或大于大约0.01、0.1、1、5、10、20、25、50、75、100、125、150、175、200、250、500、750或1000微秒。
计算机系统
分选系统可以可操作地连接到具有用户界面的计算机，用户界面用于控制分选系统(例如，探测模块和分选模块)、给可编程逻辑设备编程并显示结果。计算机可以是主题分选系统的整体部分或分离的部分。用户界面可以是图形用户界面。用户界面可通过探测器显示测量、物体的分析和物体的分选，这可以是实时的。用户界面可允许选择操作条件，例如电压梯度、分选条件、信号阈值、总分选时间、光源功率和探测器校准。操作条件可使用键盘、鼠标或其它输入设备来输入。
在本发明的一些实施方案中，分选系统包括用于分选在分选期间由处理器和/或探测器传输的数据的存储模块。存储模块可在分选期间或在分选之后被访问以取回在分选期间收集的数据。
方法
本发明提供了用于基于物体的一个或多个特性来分选物体的方法。特性可以是本文所述的特性的任一个。待分选的物体流到主题系统的通道中。当测量物体的一个或多个特性时，物体基于所测量的一个或多个特性被自动选择并定向到多个下游流路中的一个。物体的分选可在物体悬浮在可被可逆地分选的连续流体主体中时出现。可使用本文所述的相应类型的测量来执行特性的测量。例如，可使用光探测系统来测量光学特性的测量，并使用电探测系统来测量电特性。在通过引用被全部并入本文的PCT公布No.WO/2010/044932中描述了电探测系统的例子。可在探询容积内执行物体的特性的测量。在一些实施方案中，探询容积通过通道的照明来产生并由光束的尺寸和通道的壁来限定。物体的分选可基于物体的一、二、三、四、五、六或更多个不同的特性。在一些实施方案中，分子可通过串行地放置的多个分支点来分选，分支点由也串行地放置的多个探询容积创建。分子的准确分选也可使用放置在分支点的下游的探询容积来检验。
包含待分选的物体和其它材料的样本可被认为是分选系统的输入贮库。物体的浓度可以是大约、高达大约或大于大约1、5、10、20、50、100、200、30、500、750或1000纳摩尔、微摩尔或毫摩尔。在一些实施方案中，样本可以被稀释到一浓度，使得在预先选择的时间段内在探询容积内的分子的期望值是0.5、1、2、5或10。预先选择的时间段可以是0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500或100毫秒。
样本中的物体可被络合、预处理、或与一个或多个标记混合。标记包括荧光染料、量子点、磁性粒子、金属粒子和有色染料。本文描述了染料的例子。染料可被配对到结合部分，例如抗体、核酸、蛋白质或适配子。结合部分可以是特定或一般的。在一些实施方案中，一个结合部分是表观遗传标志所特有的，而第二个结合部分一般结合到核酸、蛋白质或生物分子。
在一些实例中，可使用相应于第一种特性的两种一般染料和一种特定染料。这可考虑自由染料、没有第一特性的物体和有第一特性的物体之间的区别。在其它实施方案中，可使用两中一般染料和两种特定染料，其中第一特定染料相应于第一特性，而第二特定染料相应于第二特性。除了探测自由染料、没有第一特性的物体和有第一特性的物体之外，这还可允许既没有第一特性也没有第二特性的物体、有第二特性的物体、没有第二特性的物体以及有第一特性和第二特性的物体的探测。
在一些实施方案中，样本由分选系统处理，而不移除自由染料和/或自由标记。可适当地由分选系统通过使用多种特性的时间相关的或同时的探测来分选自由染料和/或自由标记。在本发明的其它实施方案中，在分选之前从样本移除自由染料和/或自由标记。在样本中的自由染料和/或自由标记的浓度可以是与物体络合的自由染料和/或自由标记的浓度的大约、小于大约或大于大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、9、10、15、30、50倍。
探测
在一些实施方案中，本发明提供了可以是微流控或纳流控的设备，其对各种分子特性——包括但不限于荧光例如量子点荧光特征——的同时或时间相关的探测是有用的。如本文所述的，可使用各种探测技术来测量物体的特性。探测模块可探测光、电、放射性、物理(例如，尺寸、密度、导热率、弹性、粘性和强度)和/或磁特性。在一些情况下，本发明提供了适合于分析目的的纳流控设备。荧光特征可被实时地观察到，且事实上被用作触发事件来控制如本文提供的分选方法。
可用同时或时间相关的方式探测物体的特性。同时探测可通过在时间上的一个时刻测量物体的一种或多种特性而出现。例如，可在单个探询容积或重叠的探询容积中测量相应于两个不同的标记的光的两个波长。可选地，可在不同的时间测量物体的两个或更多个特性。这可被执行，如果在通道内的物体在沿着通道移动时的位置可被知道、预测或估计。例如，可在位于第二探询容积的上游的第一探询容积处测量第一特性，在第二探询容积处物体的第二特性被测量。来自第一探询容积和第二探询容积的信号的相关性可基于物体穿过通道的速度和在两个通道之间的距离。以这种方式，物体的2、3、4、5、6、7、8、9种或更多种特性可同时地或以时间相关的方式来测量。
在本发明的其它实施方案中，可反转物体的流动。这可允许对单个探询容积内的物体进行多于一次的测量。可选地，多个探询容积可放置在分支点之前的通道中，以便在分选事件之前对物体执行相同特性的多次测量。例如，二、三、四、五、六、七或更多个探询容积可位于分支点的下游，从而允许用于确定如何分选物体的相同的二、三、四、五或更多种特性的多次测量。
分选
物体的探测和实时评估和/或物体的收集可由本发明的分选模块执行。物体的分选可基于在探测期间测量的一、二、三、四、五种或更多种特性。可同时或以时间相关的方式来测量特性。处理器可用于解释对物体收集的数据并确定物体的期望流路。
频谱或其它单个分子特征的探测和实时评估和/或这些特定分子的分离和收集可由本发明的分选模块执行。在一些实施方案中，本发明的设备和方法提供在设备的高度限制的结构(流控通道、钠米孔或其它方面)内检查的在时间和频谱上符合的特征的联机评估。使用这些符合特征的单分子分离可提供显著的特征，例如分离与蛋白质结合的特定序列的核酸或在其它生物种类或伪荧光污染的存在下分离分子的能力，都具有极其低的假阳性探测率。
这样的实现的一个例子是鉴定对在染色质中结合的组织蛋白的罕见表观遗传修饰。本发明的设备提供了穿过通道移动的序列的明确鉴定，并提供通过分离对这些分子的选择，即使在存在其它细胞碎片和常常伴随染色质链的蛋白质的情况下。
在一些实施方案中，在本发明的设备中可一次分析、分选、并检验一个物体。例如，一个物体可进入上游检测容积，被探测、分选到多个下游通道的一个，并接着在随后的物体进入上游检测容积之前在下游通道中被检验。在其它实施方案中，可一次分析、分选并检验多于一个的物体。例如，第一个物体可进入上游检测容积，而第二个物体可在第一个物体被分选或检验之前进入同一上游检测容积。一次分析单个物体可称为同步探测，而一次分析多个物体可称为异步探测。异步探测可增加分选的速率。
物体可单独地或连同携带物体的流体一起被分选，也称为切换容积。在设备利用阀来控制携带物体的流体的流动的情况下，阀选择性地将物体分选到多个下游流路之一的定时可改变连同物体一起被分选的流体的量。当流体经过分支点被发送到下游流路时，切换容积可以与物体一起被分选。切换容积可不大于大约0.2、1、5、7.5、10、25、50、75、100、200、300、500、750、1000、2500、5000或10000飞升。切换容积可不大于物体的容积的大约1、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000倍。切换容积可不大于探询容积的容积的大约1、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000倍。如果物体已知在大约100飞升的流体的容积内，则切换容积可以是100飞升。如果物体已知在大约10飞升的流体的容积内，则切换容积可以是10飞升。如果物体被定向到多个通道之一而不移动周围的流体，则切换容积可以是大约或小于大约0、0.001、0.005或0.01飞升。
在本发明的一些实施方案中，分选可增加物体的浓度。浓度可增加大约或大于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多的量级。物体的增加的浓度可通过使用低切换容积来获得。例如，如果样本包含在1mL溶液中的待分选的1000个物体且切换容积是100飞升，100个待分选的物体将被分选，每个有100飞升。因此，将在具有相应于8个数量级的浓度的10000飞升或1×10-8mL的贮库中收集100个物体。
常规分选方法常常涉及以数十毫秒时间尺度或更慢的速率移动的阀和门。然而，本发明提供了超过2×103个分子/min、3×103个分子/min、5×103个分子/min、2×104个分子/min、5×104个分子/min、1×106个分子/min、2×106个分子/min、6×106个分子/min、7×106个分子/min、1×107个分子/min或更高的高流量探测。因此，本发明的一个优点是提供所探测的分子或事件的高速分选的能力。本发明提供对分子的电和光轨迹施加控制的两种高速分选方法。这些分选方法可使用用于分选的分岔或Y形分离室在纳流控和/或微流控通道中实现。在一些情况下，本发明的设备合并串行或平行的额外的分支点，如果需要，进一步增加分选能力(图8)。
在本发明中，展示了超过2,000个分子/min的高流量计数，且这可更进一步地增加。因此，高速分选方法是根本的。至少两种高速分选方法可用于对分子的轨迹施加控制，那些轨迹是电和光的。这些分选方法可使用用于分选的分岔(例如，Y形)分离室中在纳流控通道中实现。可合并串行或平行的额外的分支点，如果需要，进一步增加分选能力。
在本发明的一个实施方案中，分子例如核酸穿过Y形通道被电动地驱动，Y形通道提供分选和收集特定的分子的机会。对分子分选所需的设备和方法实质上是不同的，如对单独分子的快速检测和分选所需的。如本文所示的，本发明提供了用于制造和使用可被电启动的设备的方法，该设备使染色质穿过分选室流动。在一些情况下，两种不同的荧光染料的符合探测可用于鉴定所关注的分子。在一些情况下，本发明的方法规定使用一种染料或标记来标记分子例如DNA，以及使用另一染料或标记来标记特定蛋白质、甲基化状态或所关注的其它标志或修饰。在其它情况下，使用一种标记来标记治疗目标，而使用另一标记来标记包含小分子、肽、蛋白质或适配子(其中一些可结合到该目标)的用于药物筛选的化学库。两种不同标记的符合探测可用于鉴定结合到治疗目标的来自化学库的分子。被鉴定为结合到目标的这样的分子可接着被鉴定为用于治疗发展的候选治疗法或候选导联。
在这些修饰中，对通过本发明的设备和方法的探测、分选和分析有用的是DNA甲基化和各种组蛋白改变，包括标记沉默基因的组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)的三甲基化、以及组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)的三甲基化。DNA甲基化在以小鼠植入前胚胎开始的发展期间被生动地重塑。关于H3K27和H3K4甲基化状态如何在胚胎中变化知道得很少，然而使用ES细胞的工作提议，这两种标记同时存在于染色质上是干细胞的基本特征，且当区分细胞时，保留一个标志或另一标志。
本发明提供了纳米制造的设备，其可分选在尺寸上超过50kbp的单独的DNA片段，在多色(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多)荧光显微镜下分析它们，并收集揭示以大约100bp的分辨率的沿着DNA链的荧光信号强度的数据。这些方法可例如用于表征在小鼠植入前胚胎中的染色质状态。在一些实施方案中，染色质可被隔离、对照RNA聚合酶II被标记有荧光抗体、三甲基化H3K27和三甲基化H3K4。可接着针对这些蛋白质的存在和空间位置使用本文提供的方法和设备来分析单独染色质模板。本文的方法和设备规定以空前的敏感度和分辨率确定在整个基因组和在小鼠植入前胚胎中转录的悬着的基因处的染色质状态。
本发明的方法提供了可调节分析执行延迟的调节。改变可调节分选延迟或触发延迟的响应的例子在图31中示出。在图31中，2和8Kpb片段的混合物被输送到输入通道。在稳定的设置中在大约25分钟的时间段内测量片段的分选。分选阈值是300，且脉冲宽度是10毫秒。在分选中存在过渡(这里是大约3-4ms)的点可依赖于分叉区和继电器开关时间。
在一些实施方案中，可基于与进入输入通道的物体比较的在每个通道中分选的物体的测量来测量分选模块的准确度。被分选的物体可按照下游探询容积来测量，且进入输入通道的物体可按照上游探测容积来测量。上游和下游对于将输入通道连接到两个或更多个下游通道的分支点是相对的。在一些实施方案中，物体中的损失或增益可以是大约或小于大约0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、5、6、7、9或10％。
电分选
在本发明的一些实施方案中，电分选用于基于事件或分子特性的探测来分选分子。本发明提供了可快速切换施加到分岔流体通道的电压以将所关注的分子分离到收集容积中的设备。流体系统电切换的适当设计允许快速探询在分选系统中的大量分子。
在一些情况下，电分选可在本发明的方法和设备中用于基于多个事件的同时探测来分选。例如，两个不同的荧光发射的同时(即，时间符合)探测可触发所关注的分子的分选。在一些情况下，两种不同的荧光发射的时间符合探测可用于电分选染色质或其它络合生物分子。例如，可使用施加到设备的贮库的电压电动地引起染色质穿过纳流控设备的流动。可在宽范围内以极好的准确度来控制在这些设备内部的分子的流速。流速可被控制到大约或好于大约0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1000、5000或10,000fL/s或μL/s的准确度。流速可以是大约。小于大约或大于大约0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1000、5000或10,000fL/s或μL/s。这不仅提供增加分子(例如，DNA或染色质)流量的速率的机会，而且允许使用用于快速单子分选的电方法。Y形分离室(即，接头)可放置在紧接着探测区——公认的“道路中的岔路”——之后。流速可增加，并通过暂时增加岔路的相应部分中的电压偏置来优先被定向到岔路的一个分支或另一分支。以这种方式，分子朝着期望路径被分选，用于可能的再捕获。该控制方法可应用于任何带电的分子，例如核酸，包括DNA或染色质片段。例如，该方法可应用于结合到抗体交联的荧光团的DNA或染色质片段，抗体交联的荧光团报告表观遗传状态，例如交联到对特定的甲基化蛋白质(例如甲基化组蛋白)或DNA序列的抗体或对如本文提供的RNApolII的抗体的荧光团。图7示出了使用电分选的设备的设计。
图1示出利用电动力的分选模块。如图1所示，电极与通道的流体入口和出口电接触。分选执行器可切换施加到在(a)入口和第一出口以及(b)入口和第二出口之间的通道的电压。如果分选系统具有多个分支点，如图8(左)所示，分选执行器可切换施加到在入口和四个下游出口之一之间的通道的电压。在一些实施方案中，电压梯度可施加到入口和多于一个的出口。可基于待分选的物体的有效电荷来选择电压梯度的方向。可基于期望的物体速度、物体的有效电荷、物体的尺寸、围绕物体的流体或缓冲剂的条件以及电极之间的距离来选择电压梯度的幅值。
电执行的分选的操作或速度限制可取决于通道的电阻和电容。图30和图18中给出了通道的电特性的示例性计算和测量。双层效应可影响给定系统的测量电阻和理论电阻。在弓形流控设备中，如图26所示，可施加在输入流控贮库处的电压脉冲，且可使用电流前置放大器来测量在输出流控贮库之一处的电流响应。在1×10-7安培/伏特的增益设置处，观察到的稳态离子电流可为大约或近似120pA。电容限制的开关时间可以是大约40微秒。在一些实施方案中，可以通过改变设备和将电压梯度施加到设备的电部件的电特性来改变电容限制的开关时间。例如，前置放大器可具有30微秒上升时间限制。开关时间可以是大约或小于大约0.0001、0.001、0.01、0.01、0.1、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100微秒。前置放大器可具有大约或小于大约0.01、0.1、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100微秒的上升时间限制。
光分选
光分选涉及使用强激光束来保持或“钳出”在介质例如气体或液体中的一个或多个粒子。使用强红外激光器，为了最小化对所探询的粒子或分子例如核酸(例如DNA或RNA)或蛋白质以及高数值孔径光学器件的光损坏，为了产生紧密约束的光学电势壁，荧光团(例如，量子点)-分子结合物可被捕获。该技术可在本发明的设备内部由本发明的方法应用。例如，光分选技术可在Y形分离室内部被应用，且激光位置可被偏转以控制粒子轨迹用于分选。可通过本发明的方法在本发明的纳流控设备中的单分子水平处使用荧光团、粒子或量子点的介电特性来执行光分选。在一些情况下，可使用恒定施加的电压对在限定的方向上经过激光器的分子流执行该分选技术。该分选技术提供极快的分选——具有可只由流体力而不是分选激光偏转限制的速度。在光潜在俘获中的力按照常规为大约1-1000pN，且在这种情况下横穿流动方向而被施加。在高流量条件下在本发明的设备中的流动速度在20nm直径的粒子上标称地传递大约10pN的斯托克斯曳力。这指示在流存在时量子点或类似尺寸的粒子的偏转是可能的，特别是因为偏转到适当的方向只需要可能的俘获力的一小部分。偏转速度可扩展到兆赫范围中。本发明的方法允许在流控结构内以接近基本限制的速率的极快分选控制。图7示出使用光分选的设备的示例性设计。
以电或光分选方法利用的本发明的分支的分离室可在所关注的特定分子——包括本文提供的任何分子例如DNA、RNA、染色质、适配子、蛋白质或肽——的恢复中提供空前水平的纯度和速度。在一些实施方案中，对该分选方法的触发事件可基于在激光检测容积中的激发期间产生的荧光团(例如，量子点)颜色特征。可使用高速超灵敏雪崩光电探测器例如光电二极管(APD)或光电倍增管来观察所发射的荧光，高速超灵敏雪崩光电探测器输出代表所观察的光子的数量的数字信号。为了诱发实时分选触发信号，可编程高速硬件单元可用于执行快速决策过程。现场可编程门阵列(FPGA)或本领域已知的其它逻辑设备——包括数字信号处理器或集成电路——可被提供来合并几个操作以作出最终的分选决定。代表荧光的输入信号可使用积分器操作来收集，并接着被缓存到比较器以决定单分子事件是否已出现。可同时对每个荧光颜色和相应的光电探测器来执行该操作。当用户指定的用于分选的条件被满足时，分选触发器可被输出到可调节电源(电分选方法)或使红外激光偏转的相控阵(光分选方法)。
在另一实施方案中，本发明提供了用于通过探测和分选以单分子分辨率准备分子(例如，DNA、RNA、蛋白质、肽、适配子等)的准备设备。在一些情况下，本发明的准备设备可在分子例如染色质片段被分析时合并允许分子例如染色质片段的分选的特征。在一些情况下，携带一组标志(例如荧光特征)的染色质可被定向到室中，在该室中它们可被恢复用于随后的分析，而缺少那些标志的染色质可被定向到分离的室中。在本发明的准备设备的一些实施方案中，在设备的亚微米通道内的接头可提供设备内的分叉的流出道。包括接头的提供分叉的流出道的该设备可通过给流出道的两个分叉之一上的电极充电来提供定向分子流动。例如，通过在期望的流出道施加正电荷可沿着流出道的两个分叉的一个或另一个来使DNA(例如，染色质片段)定向。在本发明的一些实施方案中，提供了高速电路以实时地并响应于在检测容积中的材料的荧光特性来切换电荷，检测容积恰好位于分叉之前。在单分子水平处的高速实时探测和分选被提供来实现用于研究DNA的基因组数量的设备。
实施例
实施例1：探测
微流控和/或纳流控提供用于探测从单分子发射的荧光的良好平台。流控通道使用单光刻步骤在熔融硅石中被构造，并覆盖有硅石，如图10A和10B所示。通道横截面的近似均匀的照明允许探测穿过检测容积(～150aL)的每个被标记的分子，如图10C所示。我们在低浓度(＜10nM)样本中实现高信噪比探测，如图10D所示。直到最近，单分子荧光使用“自制”软件在实验后被记录和分析。
实施例2：主动分选和收集
为了代替基于软件的单分子探测(SMD)，实现了廉价的现场可编程门阵列(FPGA)，如图11C所示。使用在50MHz处操作的专用AlteraFPGA，硬件水平的算法以微秒时间尺度评估单分子荧光。单独的分子基于参数例如荧光强度和颜色在分叉的纳流控通道内被主动分选和实时地分离，如图11A和图11B所示。
图12A示出示例性分选实验的参数和结果。图12B示出来自由纳流控通道分选的分子的结果。图12B示出通过使用5.7Kbp线性化质粒测试分子穿过分选设备的运动并测量使用吸管重新收集它们的效率来产生的结果。样本穿过Y形接头的1个分支被电动地输送，使用吸管在输出口处被收集，并接着使用qPCR被放大。qPCR的结果对照已知浓度标准被检测以评估“所收集的量”。在整个实验中不时地，使用激光诱导的荧光在Y形通道中测量单分子事件的速率，以便“估计流量”。基于“所估计的流量”和“所收集的量”的质量，我们导出收集效率。
可使用各种技术——包括功能化膜、滤纸、涂有琼脂糖的电极、吸收材料——或使用额外的管道来收集分子。额外的管道可通到片外位置。
实施例3：对表观遗传分析的应用
在真核细胞内的染色质包括DNA和在DNA上聚集到核小体中的组织蛋白。DNA序列携带遗传代码并控制特性的遗传，然而，对特定DNA序列及其相关组蛋白的可逆共价修饰可影响下层的DNA如何被利用，并可因此也控制特性。这些被称为表观遗传状态的修饰。表观遗传状态由DNA甲基化和与DNA结合的组蛋白的很多修饰来管理。这些状态对适当发展的调节的基因表达是必要的，并在很多疾病中被干扰。存在对鉴定表观遗传标志放置全基因组和理解这些标志如何在细胞类型当中变化的极大兴趣，有在环境中的或根据健康和疾病状态的变化。存在很多修饰，包括在核小体内的四个核心组蛋白的30个氨基酸残留物处出现的甲基化、乙酰化、核糖基化、磷酸化、Sumo化、泛素化和瓜氨酸化。给出表观遗传机制在正常发展、环境响应中起的基本作用以及它们的干扰如何影响疾病状态，存在致力于表征人类表观基因组的增加的努力。
染色质穿过纳流控通道的流动可便于表观遗传分析。我们首先演示以纳米尺度的单染色质分析(SCAN)以研究在天然染色质片段中的核小体的结合状态。来自HeLa细胞的染色质——野生型和表达eGFP-H2B——以变化的比例混合。展示绿色组蛋白标志和红色DNA染剂的事件用于在流动期间检验完整无损的染色质结构。第二个实验使用对表观遗传标志的现有探针证明SCAN的能力。使用绿色标记的甲基化结合域(MBD)蛋白质和红色DNA染剂，我们鉴定出DNA甲基化——一种表观遗传标志。
图14示出特征化本文所述的分选系统的实施方案的探测流量的表。
我们演示了SCAN，一种基于纳流控的SMD方法，其用于研究核小体对天然染色质的结合状态，并用于使用结合的MBD-DNA络合物来探询表观遗传状态。该技术可提供优于常规ChIP的明显改进，实现在单分子上的多个表观遗传标志的同时探测。SCAN可进一步使用分叉通道设计和专用FPGA来增强，以实现实时单分子探测和分选。我们证明了分离、收集和放大(qPCR)所分选的材料的能力。本发明还提供了用于使用SCAN-分选以大约10Mbp/min的初始流量在单个流控通道中执行快速表观遗传分析的完整系统。
实施例4：单分子分选
如本文所述的，系统被设计成扩展基于流控的单分子技术以提供与特定的轮廓或分子“特征”匹配的单独分子的快速选择。使用下面牢记的原则来设计系统：实时地收集和鉴定单分子的“特征”，如从荧光或其它可探测的手段测量的；决定分子的特征是否匹配用户定义的分选或选择标准；执行收集模式匹配的分子的物理过程；以及收集这些分子用于随后的分析(即，PCR、测序等)。
系统可具有下面可能的应用：具有特定的表观遗传标志(SCAN-分选)的染色质片段的收集、具有最高结合亲和性(SELEX-FAAS)的适配子探针的纯化、药物发现和蛋白质或DNA库的集合、以及对凝胶电泳的备选方案和恢复选定的片段的切除。图15示出概念布局的示意图。图16示出分选子系统和速率确定步骤。图17示出分叉的流控网络的线路模型。流控网络可引导并物理地分离分子。图18示出确定通道的电阻特性的方程和计算。图19示出用于控制分叉的流控网络的方式。使用外部电阻器的平行网络可减小有效电阻。这也可允许对流动特性的增加的控制。在一些实施方案中，电阻可减小，同时占用热损耗的增加。
图20通过移动到单层光刻术示出在流控网络的设计中的改进。这可减小设备阻塞，并消除电阻网络失衡。
图21示出使用可变电阻器来调节电阻网络的一种方法。图22示出2kbpDNA片段从2、8和10kbp片段的混合物的移除。在这里，可通过使用YOYO-1嵌入剂标记所有片段并使用荧光强度的差异鉴定较大的片段来执行实验。
图23示出利用可变电阻器的分子分选硬件的示意图。
图24示出使用在本实施例中所述的硬件来进行分选的例子。
图25示出固态继电器和簧片继电器的相关优点。在一些实施方案中，可调节流控通道尺寸，且可使用固态继电器。固态继电器的使用可减小操作电压和/或允许较快的继电器的使用。
实施例5：在输入和输出探询容积之间的时间相关性
在输入探询容积和输出探询容积之间经过的物体被探测。图33示出作为时间偏移的函数的在50毫秒bin内的相关事件的数量。如图33所示，在输入和输出探询容积之间的时间偏移是大约17ms。
实施例6：时间相关的分选
包括2和8Kbp片段的混合物的样本流经分选设备。片段使用+20V梯度流动。如图32所示，在输入处使用每bin300个光子的阈值探测到95个分子。78个分子由分选触发器使用大于17ms的触发脉冲来鉴定。76个分子在分选输出处被收集。
实施例7：高速分选
使用分选设备来执行高速分选。包括2和8Kbp片段的混合物的样本被输送到输入通道。使用+20V梯度驱动样本。在阈值(在每bin25-300个光子之间)之上的1023个分子在输入处被探测到。757个分子由分选触发器使用大于25ms的触发脉冲来鉴定。1063个分子在分选输出处被收集。
长触发脉冲持续时间可连接快速连续出现的分子。在本实施例中，实现了满足阈值的所有分子的完全或几乎完全的收集，但这33个中只有28个在触发信号迹线中被鉴定出，因为当多个分子出现在触发窗口内时算法不发出新的脉冲。
虽然在本文示出和描述了本发明的优选实施方案，对本领域技术人员来说很明显，这样的实施方案仅作为例子来提供。本领域技术人员将现在将想到很多变更、变化和替换，而不偏离本发明。应理解，可在实践本发明时使用对本文所述的发明的实施方案的各种备选方案。意图是下面的权利要求限定本发明的范围，且在这些权利要求及其等效形式的范围内的方法和结构由此被涵盖。

Claims (40)

1.一种用于分选物体的系统，包括：
(a)通道，其流体地连接到多个下游流路，所述通道适合于将所述物体保持在所述通道中的连续液体主体中；
(b)一个或多个光源，其配置成照亮所述通道以产生一个或多个探询容积，所述一个或多个探询容积小于0.5飞升；
(c)探测模块，其配置成探测表示在所述一个或多个探询容积中的所述物体的两种不同的特性的至少两种类型的信号；以及
(d)分选模块，其配置成基于所述至少两种类型的信号使所述物体定向到所述多个下游流路中的一个，其中所述分选模块包括配置成使所述物体定向到所述多个下游流路中的所述一个的多个电极，并且其中电动力通过与通道电相通的所述电极而被施加到所述连续液体主体中的物体。
2.如权利要求1所述的系统，还包括：
(a)一个或多个次级光源，其配置成照亮所述多个下游流路中的一个以产生一个或多个下游探询容积；以及
(b)次级探测模块，其配置成探测在所述一个或多个下游探询容积中的至少一种类型的信号。
3.如权利要求2所述的系统，还包括次级分选模块，所述次级分选模块配置成基于所述一个或多个下游探询容积中的所述至少一种类型的信号使所述物体定向到多个次级下游流路中的一个。
4.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述物体是细胞或细胞成分。
5.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述物体是生物分子。
6.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述物体是遗传物质。
7.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述物体是染色质。
8.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述物体选自由核酸分子、蛋白质和碳水化合物组成的组。
9.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述一个或多个探询容积小于0.2、0.1或0.05飞升。
10.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述通道在分支点处流体地连接到2、3、4或5个下游流路。
11.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述系统包括由单个光源照亮的多个探询容积。
12.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述系统包括沿着直线定位的至少三个探询容积。
13.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述一个或多个光源产生多个探询容积。
14.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述通道是微流控通道。
15.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述物体由流体携带。
16.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述通道包括光学透明的壁。
17.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述探测模块包括一个或多个光探测器。
18.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述电极放置成接近切换容积高达0.1、1或10mm的距离。
19.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述分选模块使所述物体与不大于100、10、1、0.5或0.1飞升的切换流体一起被定向。
20.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述分选模块使所述物体与不大于100、50或10倍于所述探询容积的切换流体一起被定向。
21.如权利要求1-3的任一项所述的系统，其中所述分选模块包括现场可编程门阵列，所述现场可编程门阵列配置成接收关于所述物体的数据和/或返回使所述物体定向到所述多个下游流路中的一个的指令。
22.如权利要求21所述的系统，其中所述现场可编程门阵列解释所述数据和/或在小于1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6或1×10-7秒内返回指令。
23.一种用于分选通道中的物体的方法，包括：
(a)使所述物体流经所述通道，其中用多个标记来标记所述物体；
(b)照亮所述通道以产生一个或多个探询容积，每个探询容积由所述通道的壁和光束限制，所述探询容积小于0.5飞升；以及
(c)探测在相同或不同的所述探询容积中的所述多个标记的至少一个标记和另一其它标记，以产生所述至少一个标记和所述另一其它标记的时间相关的分辨率，其中所述至少一个标记和所述另一其它标记表示所述物体的两种不同的特性；以及
(d)使所述物体定向到流体地连接到所述通道的多个下游流路中的一个，其中所述分选模块包括配置成使所述物体定向到所述多个下游流路中的所述一个的多个电极，并且其中电动力通过与通道电相通的所述电极而被施加到所述通道中连续液体主体中的物体。
24.如权利要求23所述的方法，还包括：
(a)照亮下游路径以产生一个或多个下游探询容积；以及
(b)探测在所述一个或多个下游探询容积中的所述多个标记的至少一个标记。
25.如权利要求24所述的方法，还包括：
基于探测到在所述一个或多个下游探询容积中的至少一个标记来使所述物体定向到多个次级下游流路中的一个。
26.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体是细胞或细胞成分。
27.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体是生物分子。
28.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体是遗传物质。
29.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体是染色质。
30.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体选自由核酸分子、蛋白质和碳水化合物组成的组。
31.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中照亮所述通道以产生多个探询容积。
32.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中用多个标记来标记所述物体。
33.如权利要求23-25的任一项所述的方法，包括探测多于两个的不同标记。
34.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述一个或多个探询容积小于0.2、0.1或0.05飞升。
35.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中光学地探测所述标记。
36.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体被分析并在小于1、0.5、0.1、0.01、0.001或0.0001秒内被定向。
37.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体被定向到在分支点处流体地连接到所述通道的至少2、3、4或5个下游流路中的一个。
38.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体与小于100、50或10倍于所述探询容积的切换容积一起被定向到所述多个下游流路中的所述一个。
39.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述物体与小于1000、100、50或10倍于所述物体的容积的切换容积一起被定向到所述多个下游流路中的所述一个。
40.如权利要求23-25的任一项所述的方法，其中所述多个下游流路中的所述一个由现场可编程门阵列选择，所述现场可编程门阵列配置成接收关于所述物体的数据和/或返回使所述物体定向到所述多个下游流路中的一个的指令。
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