CN102578079A

CN102578079A - 马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法

Info

Publication number: CN102578079A
Application number: CN2012100263934A
Authority: CN
Inventors: 荣美洁; 邹志刚; 张志鹏
Original assignee: Qingdao Deray Junfa Biologictechnology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Deray Junfa Biologictechnology Co Ltd
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2012-02-08
Publication date: 2012-07-18

Abstract

本发明公开了一种马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法，其中，基础液包括A液和脱脂奶，A液包括葡萄糖、棉子糖、D-乳糖单水合物、柠檬酸三钠、柠檬酸钾和HEPES。基础液的配制方法为：称取A液的各种组分放入无菌烧杯中，加双蒸水溶解后，定容、过滤、分装、灭菌、密封，即得A液，向A液加入等量的脱脂奶混合均匀。还可以向基础液中加入青霉素和双氢链霉素，或者青霉素、双氢链霉素、蛋黄和甘油，其适用于马属动物精液稀释、精液常温保存、低温保存及冷冻保存。本发明的有益效果是：配制简单，使用方便，马属动物精液的保存效果好，并且一液多用，省时省力，适于规模化生产和应用。

Description

马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法

技术领域

本发明涉及动物精液保存的技术领域，特别涉及一种马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法。

背景技术

精液稀释是向精液中加入适宜精子体外存活并保持精子活力的稀释保护液，其目的在于扩大精液的容量，延长精子的存活时间，保证精子的活率和精子顶体完整率，增强受精能力，充分提高精液的利用率和优良公畜配种的效率。精液稀释应在采集后尽快进行，不经稀释的精液不利于精子存活，特别是精液处于温度较低时（20℃以下），精子受低温打击，易出现冷休克。只有经过稀释的精子才适于保存、运输及输精等，所以精液稀释处理是动物人工授精中的一个重要技术环节。

目前，我国马属动物的繁育主要以自然交配和人工辅助两种方式进行，但是在自然交配或人工辅助交配的情况下，一般一匹种公马只能配20-30匹母马，优秀种公马的利用率严重受限。因此，精液稀释、保存和人工授精技术的发展和应用就显得非常重要。

近年来，家畜精液稀释液的研究不断取得可喜的成果，尤其是在牛、羊等反刍动物方面。马属动物精液稀释液的研究也日渐成效，但是仍然存在诸多弊端，主要表现在精液稀释液对精子活力的保存时间短，比如常温保存时间不足24小时（活率低于0.3），低温保存时间不足96小时（活率低于0.3）；受胎率低；精液稀释液需新鲜，必须现用现配，所以操作繁琐复杂。因此开发出保存时间长，保存效果好，成本低，受胎效果好的精液稀释液对人工授精而言有重要的经济效益。

发明内容

为了解决传统的精液稀释液对精子活力的保存时间短、受胎率低及现用现配等问题，本发明提供了一种马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种马属动物精液稀释基础液，所述基础液包括A液和脱脂奶，所述A液包括葡萄糖、棉子糖、D-乳糖单水合物、柠檬酸三钠、柠檬酸钾和HEPES。

其中，所述A液和所述脱脂奶的混合体积比例优选为1:1。

每500ml的所述A液中，各组分的含量为：葡萄糖22~26g、棉子糖1.5~1.7g、D-乳糖单水合物1.5~1.7g、柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 0.2~0.25g、柠檬酸钾0.35~0.45g、HEPES 4.6~4.8g。

每500ml的所述A液中，各组分的含量为：葡萄糖22~26g、棉子糖1.5~1.7g、D-乳糖单水合物1.5~1.7g、柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·5H₂O 0.25~0.3g、柠檬酸钾0.35~0.45g、HEPES 4.6~4.8g。

所述葡萄糖为无水葡萄糖，其分子式为C₆H₁₂O₆；所述棉子糖的分子式为C₁₈H₃₂O₆·5H₂O；所述D-乳糖单水合物的分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·H₂O；所述柠檬酸钾的分子式为K₃C₆H₅O₇·H₂O；所述HEPES的分子式为C₈H₁₈N₂O₄S。

本发明还提供了上述任意一种马属动物精液稀释基础液的配制方法，所述配制方法包括：

（1）称取所需要量的葡萄糖、棉子糖、D-乳糖单水合物、柠檬酸三钠、柠檬酸钾和HEPES ，放入无菌烧杯中，加双蒸水溶解后，定容、过滤、分装、灭菌、密封，即得A液；

（2）将经过严格灭菌、密封的A液标记配制时间，置于0~5℃保存，随用随取；

（3）取所需要量的A液加入适量的脱脂奶混合均匀后，即得基础液。

本发明还提供了一种马属动物精液稀释基础液的使用方法，其特征在于，将所述基础液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，对马属动物新鲜精液进行稀释，用于鲜精的人工授精。

本发明又提供了一种马属动物精液稀释基础液的使用方法，当精液需要常温或低温保存时，所述基础液的使用方法为：

（1）向所述基础液中分别按1000单位/ml的量添加青霉素和1000ug/ml的量添加双氢链霉素，混合均匀后得到稀释液；

（2）将所述步骤（1）中得到的稀释液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，对马属动物新鲜精液进行稀释，然后将稀释后的精液常温保存或低温保存；所述稀释液与精液的体积比例优选为1:1~1:10。

本发明还提供了一种马属动物精液稀释基础液的使用方法，当精液需要冷冻保存时，所述基础液的使用方法为：

（1）将所述基础液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，对马属动物新鲜精液进行第一次稀释，稀释后经过离心去掉基础液；

（2）向所述基础液中分别按1000单位/ml的量添加青霉素、1000ug/ml的量添加双氢链霉素、2.5~3.5%的量添加蛋黄和2.5~3.5%的量添加甘油，混合均匀后得到稀释液；

（3）将所述步骤（2）中得到的稀释液置于22℃恒温水浴锅中1小时，然后对所述步骤（1）中经第一次稀释后的精液进行第二次稀释，将稀释后的精液冷冻保存；所述稀释的体积比例优选为1:1~1:10。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的基础液能够直接用于马属动物新鲜精液的稀释，适用于鲜精的人工授精；当需要对马属动物的新鲜精液进行常温或低温保存时，向基础液中适量加入青霉素和双氢链霉素，即可用于马属动物精液的稀释，稀释后能够对精液进行常温保存或低温保存；当需要对马属动物的新鲜精液进行冷冻保存时，向基础液中适量加入青霉素、双氢链霉素、蛋黄和甘油，即可用于马属动物精液的稀释，稀释后能够对精液进行冷冻保存；且在常温保存、低温保存或是冷冻保存的条件下，使用本发明马属动物精液稀释基础液进行精液的稀释保存，效果明显优于传统的稀释液，马属动物精液的保存效果好，延长了稀释精液中精子的存活时间，保证精子的活率和精子顶体完整率，增强受精能力，充分提高了精液的利用率和优良公畜配种的效率；本发明的基础液配制简单，使用方便，可置于0-5℃保存，随用随取且可一液多用，省时省力，适于规模化生产和应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

称取葡萄糖24g、棉子糖1.6g、D-乳糖单水合物1.6g、柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 0.24g、柠檬酸钾0.4g和HEPES 4.7g，放入无菌烧杯中，加双蒸水溶解后，定容、过滤、分装、灭菌、密封，即得A液；将经过严格灭菌、密封的A液标记配制时间，置于0~5℃保存，随用随取；取适量的A液加入等量体积的脱脂奶混合均匀后，得到本实施例1的基础液。

向基础液中分别按1000单位/ml的量添加青霉素和1000ug/ml的量添加双氢链霉素混合均匀后，得到本实施例1的稀释液。

对比试验1

将传统的稀释液葡萄糖-卵黄稀释液（对照组1）和牛奶稀释液（对照组2），与实施例1的稀释液（实施例组1）分别稀释马的精液。其中，将实施例1的稀释液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，按体积比1:5对马的新鲜精液（活率≥0.8）进行稀释，然后将稀释后的精液置于常温（15~25℃）下保存。在0~48小时内观察对照组1、对照组2和实施例组1的精子活力，每隔12个小时测定精子的活率，结果如表1所示。

表1：不同稀释液常温保存（15~25℃）精液对马精子活率的影响

组别	0h 活率	12h 活率	24h 活率	36 h 活率	48h 活率
						对照组1	0.85±0.02	0.55±0.03	0.25±0.04	0	0
对照组2	0.85±0.03	0.40±0.04	0.10±0.02	0	0
						实施例组1	0.85±0.02	0.75±0.02	0.65±0.03	0.50±0.03	0.4±0.04

由表1的数据可知，在常温保存的条件下，与传统精液稀释液相比，利用本发明的马属动物精液稀释液保存的精子活率明显较高，保存时间显著延长，保存48h时精子的活率仍维持在0.4左右。

实施例2

称取葡萄糖23g、棉子糖1.7g、D-乳糖单水合物1.5g、柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·5H₂O 0.27g、柠檬酸钾0.35g和HEPES 4.6g，放入无菌烧杯中，加双蒸水溶解后，定容、过滤、分装、灭菌、密封，即得A液；将经过严格灭菌、密封的A液标记配制时间，置于0~5℃保存，随用随取；取适量的A液加入等量体积的脱脂奶混合均匀后，得到本实施例2基础液。

向基础液中分别按1000单位/ml的量添加青霉素和1000ug/ml的量添加双氢链霉素混合均匀后，得到本实施例2的稀释液。

对比试验2

将传统的稀释液葡萄糖-卵黄稀释液（对照组3）和葡萄糖-酒石酸甲钠-卵黄稀释液（对照组4），与实施例2的稀释液（实施例组2）分别稀释马的精液。其中，将实施例2的稀释液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，按体积比1:10对马的新鲜精液（活率≥0.8）进行稀释，然后将稀释后的精液置于低温（0~5℃）下保存。在0~120小时内观察对照组4、对照组5和实施例组2的精子活力，每隔24个小时测定精子的活率，结果如表2所示。

表2 不同稀释液低温保存（0~5℃）精液对马精子活率的影响

组别

0h活率

24h活率

48h活率

72h活率

96 h活率

120h活率

对照组3

0.85±0.02

0.70±0.04

0.60±0.02

0.40±0.03

0.20±0.02

0.05±0.02

对照组4

0.85±0.03

0.75±0.02

0.60±0.02

0.45±0.03

0.30±0.03

0.15±0.02

实施例组2

0.85±0.02

0.75±0.03

0.70±0.03

0.60±0.02

0.55±0.02

0.45±0.03

由表2的数据可知，在低温保存的条件下，与传统精液稀释液相比，利用本发明的马属动物精液稀释液保存的精子活率明显较高，保存时间显著延长，保存120h时精子的活率仍维持在0.45左右。

实施例3

称取葡萄糖25g、棉子糖1.5g、D-乳糖单水合物1.7g、Na₃C₆H₅O₇·5H₂O 0.3g、柠檬酸钾0.45g和HEPES 4.8g，放入无菌烧杯中，加双蒸水溶解后，定容、过滤、分装、灭菌、密封，即得A液；将经过严格灭菌、密封的A液标记配制时间，置于0~5℃保存，随用随取；取适量的A液加入等量体积的脱脂奶混合均匀后，得到本实施例3的基础液。

向部分基础液中分别按1000单位/ml的量添加青霉素、1000ug/ml的量添加双氢链霉素、2.5~3.5%的量添加蛋黄和2.5~3.5%的量添加甘油，混合均匀后，得到本实施例3的稀释液。

对比试验3

将传统的稀释液乳糖-卵黄-甘油稀释液（对照组5）和乳糖-EDTA-柠檬酸钠-卵黄-甘油稀释液（对照组6），与实施例3的稀释液（实施例组3）分别稀释驴的精液。

其中，将基础液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，对马属动物新鲜精液（活率≥0.75）进行第一次稀释，稀释后经过离心去掉基础液；将稀释液置于22℃恒温水浴锅中1小时后，对经过第一次稀释后的精液进行第二次稀释，使最终精子密度达到1×10⁸个/ml，然后将稀释后的精液冷冻保存。观察对照组5、对照组6和实施例组3冷冻前后的精子活力，结果如表3所示。

表3 不同稀释液冷冻保存精液对驴精子活率的影响

组别	冷冻前精子活率	冷冻后精子活率
			对照组5	0.82±0.03	0.35±0.01
对照组6	0.80±0.02	0.40±0.02
			实施例组3	0.80±0.02	0.55±0.02

由表3的数据可知，在冷冻保存的条件下，与传统精液稀释液相比，利用本发明的马属动物精液稀释液保存的精子活率明显较高。

综上，无论在常温保存、低温保存还是冷冻保存的条件下，使用本发明马属动物精液稀释基础液进行精液的稀释保存，效果明显优于传统的稀释液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.马属动物精液稀释基础液，其特征在于，所述基础液包括A液和脱脂奶，所述A液包括葡萄糖、棉子糖、D-乳糖单水合物、柠檬酸三钠、柠檬酸钾和HEPES。

2.根据权利要求1所述的马属动物精液稀释基础液，其特征在于，所述A液和所述脱脂奶的混合体积比例为1:1。

3.根据权利要求1所述的马属动物精液稀释基础液，其特征在于，每500ml的所述A液中，各组分的含量为：葡萄糖22~26g、棉子糖1.5~1.7g、D-乳糖单水合物1.5~1.7g、柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 0.2~0.25g、柠檬酸钾0.35~0.45g、HEPES 4.6~4.8g。

4.根据权利要求1所述的马属动物精液稀释基础液，其特征在于，每500ml的所述A液中，各组分的含量为：葡萄糖22~26g、棉子糖1.5~1.7g、D-乳糖单水合物1.5~1.7g、柠檬酸三钠Na₃C₆H₅O₇·5H₂O 0.25~0.3g、柠檬酸钾0.35~0.45g、HEPES 4.6~4.8g。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的马属动物精液稀释基础液，其特征在于，所述葡萄糖为无水葡萄糖，其分子式为C₆H₁₂O₆；所述棉子糖的分子式为C₁₈H₃₂O₆·5H₂O；所述D-乳糖单水合物的分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·H₂O；所述柠檬酸钾的分子式为K₃C₆H₅O₇·H₂O；所述HEPES的分子式为C₈H₁₈N₂O₄S。

6.一种如权利要求1-5任意一项所述的马属动物精液稀释基础液的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括：

（1）称取所需要量的葡萄糖、棉子糖、D-乳糖单水合物、柠檬酸三钠、柠檬酸钾和HEPES，放入无菌烧杯中，加双蒸水溶解后，定容、过滤、分装、灭菌、密封，即得A液；

（2）将经过严格灭菌、密封的A液标记配制时间，置于0~5℃保存；

7.一种如权利要求1-6任意一项所述的马属动物精液稀释基础液的使用方法，其特征在于，将所述基础液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，对马属动物新鲜精液进行稀释，用于鲜精的人工授精。

8.一种如权利要求1-6任意一项所述的马属动物精液稀释基础液的使用方法，其特征在于，当精液需要常温或低温保存时，所述基础液的使用方法为：

（2）将所述步骤（1）中得到的稀释液置于37℃恒温水浴锅中1小时后，对马属动物新鲜精液进行稀释，然后将稀释后的精液常温保存或低温保存。

9.一种如权利要求1-6所述的马属动物精液稀释基础液的使用方法，其特征在于，当精液需要冷冻保存时，所述基础液的使用方法为：

（3）将所述步骤（2）中得到的稀释液置于22℃恒温水浴锅中1小时，然后对所述步骤（1）中经第一次稀释后的精液进行第二次稀释，将稀释后的精液冷冻保存。