CN102552340A - 银杏萜类内酯单体及银杏总黄酮的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明为银杏萜类内酯单体及银杏总黄酮的制备方法，解决已有制备方法工艺复杂，生产效率低，成本高的问题。本发明以银杏标准提取物(EGB761)为起始原料。制备工艺包括银杏萜类内酯单体（银杏内酯A、B、C及白果内酯）的纯化和银杏总黄酮的纯化，本发明和公开的方法相比，增加了阴离子交换树脂、中压制备柱以及钠滤等现代分离纯化技术，提高了产品质量，而且更适合于生产应用。

Description

银杏萜类内酯单体及银杏总黄酮的制备方法

技术领域：

本发明涉及银杏总黄酮和银杏萜类内酯单体的制备方法，尤其涉及应用结晶、中压制备柱、阴离子交换树脂和钠滤等现代纯化技术的制备方法。

技术背景：

    银杏（Ginkgo biloba L.）是冰川时期存活在地球上的孑遗植物，属于裸子植物，素有“活化石“之称，主要分布在中国、朝鲜、日本等国，我国银杏种植资源极其丰富，全国银杏叶产量在2万吨以上，占世界总量的70%以上；早在60年代初，德国Dr Willar Schwabe(魏玛.史瓦伯)首次从银杏叶获得银杏提取物（EGb761）,用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病具有显著的疗效，且无明显的副作用；而且该提取物（EGb761）标准一度成为各国药典标准的依据，该标准的提出对银杏作为药用具有里程碑的意义。

现代研究发现，银杏叶中含有大量的极性和非极性化合物，主要为黄铜类化合物、萜类内酯，以及有机酸、烷基酚、甾提化合物及微量元素等，其中药理活性较强的为黄酮类和萜类内酯，其中银杏黄酮具有增加脑血管流量降低脑血管阻力，改善脑血管循环功能、抗氧化等作用，常用于心血管疾病的治疗，银杏内酯天然的血小板活化因子(PAF)受体特异拮抗剂，对治疗哮喘，内毒素休克，器官移植排斥反应，心脑血管疾病及多种炎症疾病均有较好的效果，而白果内酯具有神经保护作用，常用于神经系统障碍以及脑细胞缺氧性损伤等疾病的治疗；目前对银杏提取物有效成分的药理研究已很明确，在临床需求量大，随着人们对医疗水平要求的提高，对药用物质基础的明确化要求更高，所以对银杏总黄酮、银杏萜类内酯的纯化并作为原料药用于临床具有重要的意义。

 目前对于银杏萜内酯、银杏总黄酮纯化的报道很多，但普遍存在工艺复杂，收率不高，不能综合利用，造成了资源浪费，如申请号为200610038797.X，名称为“一种精制银杏黄酮的方法”，采用了β—环糊精包合黄酮的方式来精制银杏黄酮，其他成分也可能通过包合带入后工序，而且引入了β—环糊精，该法得到的黄酮纯度不高，由于银杏提取物溶液中由于多种水溶性成分的助溶作用，导致银杏萜类内酯的溶解性增加，不经过萃取或树脂纯化很难将萜内酯和黄酮类成分分开；如公开号为CN101134758A，名称为“从银杏叶中提取分离银杏内酯A、B、C、J及白果内酯单体的方法”，该方法采用大孔树脂纯化、结晶、硅胶柱层析的工序制备单体，所得萜内酯单体纯度在98%以上，虽然该方法所得单体纯度较高，但制备工艺复杂，使用硅胶柱应用于单体分离，生产周期长，不易于产业化生产。

发明内容：

本发明的目的是提供一种制备工艺简单，成本低，生产速度高，所用试剂和助剂基本可重复利用，利用同种起始原料银杏提取物（EGb761）能得到高纯度银杏总黄酮，也能得到各种银杏萜内酯单体的银杏萜内酯单体及银杏总黄酮的制备方法。

本发明是这样实现的：

本发明银杏萜内酯单体及银杏总黄酮的其特征在于：

（1）银杏标准提取物EGB761使用体制积百分浓度10%—100%乙醇溶解，过聚酰胺树脂纯化处理，回收乙醇，0—5℃冷藏1—10天；

（2） 将步骤1中的冷藏液通过双层滤纸或微孔滤膜过滤，分别收集沉淀及滤液；

（3）将步骤2中沉淀使用以下方法之一进行精制：

（a）将沉淀加纯化水加热溶解再使用有机溶剂萃取或直接使用有机溶剂提取，收集有机相，浓缩至干，再使用1—10倍量体积的体积百分比浓度15—50%乙醇加热溶解，常温放置或0—5℃冷藏1—2天，结晶，得到白色晶体，分离白色晶体，真空干燥，得到银杏内酯A、B、C三种银杏内酯。含量在95%以上的白色粉末，母液减压浓缩至干，再使用1—10倍量体积的体积百分比浓度1—10%乙醇按加热溶解，放置或冷藏结晶，得白果内酯，真空干燥，得到纯度在95%以上白色粉末；

 （b）将沉淀加纯化水加热溶解再使用有机溶剂萃取或直接使用有机溶剂提取，收集有机相，浓缩至干，然后使用1/4—1/8倍量体积的乙酸乙酯或乙醇溶解完全，然后加入5—20倍量体积正己烷或乙醚，常温放置或0—5℃冷藏，得到白色晶体，分离白色晶体，60℃真空干燥，得到银杏内酯A、B、C及白果内酯混合物总含量在95%以上的白色粉末；

   （c）将（a）中混合物结晶粉末或（b）中混合物结晶粉末通过中压制备柱纯化，使用有机溶剂洗脱，分段收集洗脱液，依次得到银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B或白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B；洗脱液分别合并后浓缩，干燥，即得，所得内酯单体纯度均在98%以上；

（4）将步骤2中滤液及步骤3中（a）或（b）中结晶后母液合并，使用体积百分比浓度1%—10%NaOH溶液或体积百分比浓度1%—10%Na₂CO₃溶液或体积百分比浓度1%—10%NaHCO₃溶液调PH至3—8，通过阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤，弃去洗脱液，然后使用碱液或盐溶液或醇溶液洗脱，洗脱液使用体积百分比浓度1—10%盐酸溶液调PH至3—5得酸液；

（5）将步骤4中酸液使用分子量150—250道尔顿有机复合膜钠滤设备除去盐及小分子杂质，收集未透过液，最后浓缩、真空干燥得到含量在90%以上的银杏总黄酮；

步骤3中所述的有机溶剂是乙酸乙酯或正丁醇或2—丁醇。

步骤3中（C）所述的中压制备柱为C₁₈反相柱或MCI树脂柱。

步骤3中（C）所述的洗脱溶剂为乙腈—水9：1—4：6，v/v或水—甲醇9：1—5：5，v/v。

步骤4中所述的阴离子交换树脂是D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂或D280大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或201×7强酸性苯乙烯系阴离子交换树脂。     步骤4中所述的碱液是PH值为8—12的稀氨水或氢氧化钠溶液；盐溶液为0.1mol/L—2mol/L的氯化钠溶液；醇溶液为体积百分比浓度30%—90%乙醇溶液。

 

本发明通过以下步骤实现：

1、银杏叶通过常规方法提取制备银杏标准提取物（EGB761）

2、从银杏标准提取物（EGB761）制备银杏总黄酮

a.聚酰胺纯化处理：

             10%—100%乙醇         聚酰胺树脂         减压浓缩

银杏标准提取物                 醇溶物         流出液     浓缩液

                   搅拌溶解                              至无醇味

冷藏          过滤

             冷藏液            滤液和沉淀

滤纸或滤膜

所得滤液主要含有银杏总黄酮，含量大于65%，沉淀主要含有银杏萜内酯，银杏内酯A、B、C及白果内酯总含量大于40%。

b.萜类内酯的纯化可以通过以下几种方法进行

工艺路线一

      纯化水          有机溶剂       减压浓缩         10%—50%乙醇

沉淀           水溶液          有机相         干浸膏          醇溶液

       加热溶解           萃取                              加热溶解

结晶                            减压          1%—10%乙醇       

         白色晶体Ⅰ（分离）、母液           浸膏           白色晶体Ⅱ、母液

常温或冷藏                      浓缩          结晶        

         中压制备柱

白色晶体Ⅰ             银杏萜内酯单体

        混合溶剂洗脱

工艺路线二

     有机溶剂       减压浓缩      10%—50%         结晶

沉淀         有机相        干浸膏         醇溶液         白色晶体和母液

      提取                            加热溶解        常温或冷藏

      减压          1%—10%乙醇       

母液           浸膏           白色晶体、母液

       浓缩          结晶        

         中压制备柱

白色晶体             银杏萜内酯单体

        混合溶剂洗脱

工艺路线三

      纯化水          有机溶剂       减压浓缩     乙酸乙酯或乙醇

沉淀           水溶液          有机相         干浸膏           溶液

       加热溶解           萃取                              溶解

正己烷或乙醚         结晶

             浑悬液           白色晶体和母液

搅拌加入           常温或冷藏

             中压制备柱

白色晶体             银杏萜内酯单体

            混合溶剂洗脱

工艺路线四

有机溶剂      减压浓缩     乙酸乙酯或乙醇      正己烷或乙醚

沉淀          有机相        干浸膏           溶液

       提取                                溶解            搅拌加入

         结晶

浑悬液           白色晶体和母液 

       常温或冷藏

        中压制备柱

白色晶体             银杏萜内酯单体

        混合溶剂洗脱

上述得到的银杏萜内酯单体为白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B，纯度均在95%以上。

C.银杏总黄酮的纯化

                   碱液            阴离子交换树脂             酸液

滤液及结晶后母液              上柱液                 洗脱液           酸液

                 调PH至3—8      碱液或盐液或醇液洗脱      调PH至3—5

钠滤                        浓缩

收集未为透过液            棕黄色干浸膏

150—250道尔顿              真空干燥

所得棕黄色干浸膏为银杏总黄酮含量为90%以上的原料。

    从银杏标准提取物使用体积百分比浓度10%—100%乙醇水溶液溶解，使用聚酰胺树脂纯化，使用洗脱液为体积百分比浓度10%—100%乙醇水溶液，收集流出液及洗脱液，浓缩冷藏，冷藏液使用双层滤纸或0.45um微孔滤膜过滤，所得沉淀用于制备银杏萜内酯单体，滤液用于制备银杏总黄酮；沉淀使用有机溶剂如乙酸乙酯、正丁醇、2—丁醇取，提取液浓缩至干然后使用体积百分比浓度15%—50%乙醇水溶液、体积百分比浓度1%—10%乙醇水溶液或乙酸乙酯—乙醚或乙酸乙酯—正己烷结晶，得到银杏萜内酯晶体，所得白色结晶物通过中压制备柱纯化，得到银杏萜内酯单体，纯度均在95%以上；上述冷藏滤液和结晶后母液合并，并用体积百分比浓度1%—10%NaOH溶液或体积百分比浓度1%—10%Na₂CO₃溶液或体积百分比浓度1%—10%NaHCO₃溶液调PH至3—8，然后过阴离子交换树脂如D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂、D280大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂、201×7强酸性苯乙烯系阴离子交换树脂等纯化处理，使用纯化水洗涤树脂至流出液无色，然后使用碱液（PH值为8—12的氨水或氢氧化钠溶液）或盐溶液（0.1—2mol/L的氯化钠溶液）或体积百分比浓度30%—90%乙醇溶液为洗脱液，收集色带部分为洗脱液，使用1%—10%盐酸溶液调节洗脱液PH为3—5，所得酸液使用钠滤膜（分子量150—250道尔顿有机复合膜）设备循环过滤，压力0.05—0.8Mpa，温度10—60℃，滤除小分子杂质，收集未透过液，减压浓缩，60℃真空干燥，得银杏总黄酮原料。

银杏萜内酯使用HPLC—ELSD检测，色谱参数：流动相为正丙醇—四氢呋喃—水 (1∶30∶6 9) (V/V/V)为流动相，色谱柱为Hypersil C₁₈柱（5um，250×4.6mm），柱温为40℃，检测器参数：漂移管温度为105℃，载气（N₂）流速为2.6L/min，理论塔板数以白果内酯峰计不低于3000，进样量为10ul；银杏总黄酮使用HPLC—UV检测，色谱参数：色谱柱为Agilent C₁₈柱（5um，250×4.6mm），流动相为甲醇：0.4%磷酸溶液（50：50），检测波长360nm，柱温为室温，理论塔板数以槲皮素峰计不低于2500，进样量10ul。

和传统工艺相比，本发明在精制银杏总黄酮工艺中使用了阴离子交换树脂，该工序对银杏总黄酮在离子状态下的离子交换吸附是定向吸附，去除了多余的中性成分及阳离子成分，同时使用钠滤技术对洗脱液进行分离，除去了无机盐等小分子物质，使银杏总黄酮含量更高，达到90%以上，而且工艺各个环节均能产业化；同时在本发明在工艺中也能得到中间产品高纯度银杏总萜类内酯（银杏内酯A、B、C及白果内酯总含量在95%以上），在制备银杏萜类内酯单体中应用了中压柱层析技术，大大提高了效率，使用的填料为C₁₈和MCI树脂，这两种填料均能重复利用，更适合于生产应用。

本发明与现有技术相比，从银杏标准提取物（EGB761）纯化得到银杏萜内酯单体（白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B）含量在95%以上以及银杏总黄酮含量90%以上，生产设备简单，工艺路线易操作，生产成本低，生产效率高，可进行工业化生产。

具体实施方式：

以下是提供最佳实施例对本发明作进一步说明，但并非限制本发明。

实施例1：

A、取银杏标准提取物（EGB761，银杏总黄酮24%以上，银杏萜内酯6%以上）500g，加入体积百分比浓度80%乙醇500ml搅拌溶解完全，上聚酰胺树脂柱，使用3倍柱体积体积百分比浓度80%乙醇洗脱，收集流出液及洗脱液，减压浓缩至无醇味，加入500ml纯化水，常温放置2天，底部沉淀明显，使用双层滤纸抽滤，分离沉淀和滤液，沉淀60℃真空干燥；

B、取沉淀，加入100ml正丁醇回流提取1小时，提取三次，合并提取滤液，减压浓缩至干，加入100ml体积百分比浓度40%乙醇，加热溶解完全，5℃冷藏1天，底部有白色晶体析出，过滤，分离出晶体12.4g，为银杏内酯A、B、C，三种内酯总含量95.7%；母液减压浓缩至干，加入体积百分比浓度5%乙醇50ml加热溶解完全，5℃冷藏1天，底部有白色晶体析出，过滤，分离出晶体10.4g，为白果内酯，纯度为95.6%；将银杏内酯A、B、C混合物通过已处理好的中压制备柱（填料为C₁₈），使用乙腈—水（50：50,v/v）系统洗脱，依次得到银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B，将洗脱液减压回收溶剂，浓缩，即得单体，其中银杏内酯C含量为体积百分比浓度98.4%，银杏内酯A含量为98.7%，银杏内酯B含量为99.1%。

C、取A中最后滤液和B中最后结晶母液，合并，使用体积百分比浓度5%NaOH溶液调PH值为3.6，上已处理好的D301弱碱性阴离子交换树脂，使柱体积纯化水洗涤树脂，至流出液无色，再用3倍柱体积的0.5mol/LNaCl溶液洗脱，收集色带部分为洗脱液，使用体积百分比浓度5%盐酸溶液调PH为3.1；将酸液通过钠滤设备循环过滤，压力0.2MPa，温度40℃，收集未透过液，减压浓缩，真空干燥，得棕黄色干浸膏108g，银杏总黄酮含量为90.7%。

实施例2：

A、取银杏标准提取物（EGB761，银杏总黄酮24%以上，银杏萜内酯6%以上）500g，加入体积百分比浓度20%乙醇500ml搅拌溶解完全，上聚酰胺树脂柱，使用3倍柱体积体积百分比浓度50%乙醇洗脱，收集流出液及洗脱液，减压浓缩至无醇味，加入500ml纯化水，常温放置2天，底部沉淀明显，使用双层滤纸抽滤，分离沉淀和滤液，沉淀60℃真空干燥；

B、取沉淀，加入100ml纯化水加热溶解，向水溶液中加入100ml乙酸乙酯萃取三次，分离有机相，合并，减压浓缩至干，加入100ml体积百分比浓度30%乙醇，加热溶解完全，5℃冷藏1天，底部有白色晶体析出，过滤，分离出晶体13.8g，为银杏内酯A、B、C，三种内酯总含量96.1%；母液减压浓缩至干，加入体积百分比浓度8%乙醇50ml加热溶解完全，5℃冷藏1天，底部有白色晶体析出，过滤，分离出晶体9.8g，为白果内酯，纯度为96.2%；将银杏内酯A、B、C混合物通过已处理好的中压制备柱（填料为MCI树脂），使用甲醇—水（65：35,v/v）系统洗脱，依次得到银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B，将洗脱液减压回收溶剂，浓缩，即得单体，其中银杏内酯C含量为98.2%，银杏内酯A含量为99.4%，银杏内酯B含量为98.1%。

C、取A中最后滤液和B中最后结晶母液，合并，使用体积百分比浓度5%NaOH溶液调PH值为7.1，上已处理好的D315弱碱性阴离子交换树脂，使柱体积纯化水洗涤树脂，至流出液无色，再用3倍柱体积的体积百分比浓度90%乙醇溶液洗脱，收集色带部分为洗脱液，使用体积百分比浓度5%盐酸溶液调PH为4.6，减压浓缩至无醇味，纯化水定容至500ml；将酸液通过钠滤设备循环过滤，压力0.15MPa，温度20℃，收集未透过液，减压浓缩，真空干燥，得棕黄色干浸膏97g，银杏总黄酮含量为91.6%。

实施例3：

A、取银杏标准提取物（EGB761，银杏总黄酮24%以上，银杏萜内酯6%以上）500g，加入体积百分比浓度10%乙醇500ml搅拌溶解完全，上聚酰胺树脂柱，使用3倍柱体积体积百分比浓度90%乙醇洗脱，收集流出液及洗脱液，减压浓缩至无醇味，加入500ml纯化水，常温放置2天，底部沉淀明显，使用双层滤纸抽滤，分离沉淀和滤液，沉淀60℃真空干燥；

B、取沉淀，加入100ml纯化水加热溶解，向水溶液中加入100ml2—丁醇萃取三次，分离有机相，合并，减压浓缩至干，加入体积百分比浓度100ml20%乙醇，加热溶解完全，室温放置1天，底部有白色晶体析出，过滤，分离出晶体11.2g，为银杏内酯A、B、C，三种内酯总含量97.4%；母液减压浓缩至干，加入体积百分比浓度5%乙醇50ml加热溶解完全，室温放置1天，底部有白色晶体析出，过滤，分离出晶体9.2g，为白果内酯，纯度为95.9%；将银杏内酯A、B、C混合物通过已处理好的中压制备柱（填料为C₁₈），使用乙腈—水（60：40,v/v）系统洗脱，依次得到银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B，将洗脱液减压回收溶剂，浓缩，即得单体，其中银杏内酯C含量为98.8%，银杏内酯A含量为98.2%，银杏内酯B含量为99.6%。

C、取A中最后滤液和B中最后结晶母液，合并，使用体积百分比浓度5%NaHCO₃溶液调PH值为5.8，上已处理好的D280强碱性阴离子交换树脂，使用纯化水洗涤树脂，至流出液无色，再用3倍柱体积的PH为10.8氨水洗脱，收集色带部分为洗脱液，使用体积百分比浓度2%盐酸溶液调PH为4.1；将酸液通过钠滤设备循环过滤，压力0.21MPa，温度20℃，收集未透过液，减压浓缩，真空干燥，得棕黄色干浸膏116g，银杏总黄酮含量为93.9%。

Claims (6)

1.银杏萜类内酯单体及银杏总黄酮的制备方法，其特征在于：

（1）银杏标准提取物EGB761使用体积百分浓度10%—100%乙醇溶解，过聚酰胺树脂纯化处理，回收乙醇，0—5℃冷藏1—10天；

（2） 将步骤1中的冷藏液通过双层滤纸或微孔滤膜过滤，分别收集沉淀及滤液；

（3）将步骤2中沉淀使用以下方法之一进行精制：

（a）将沉淀加纯化水加热溶解再使用有机溶剂萃取或直接使用有机溶剂提取，收集有机相，浓缩至干，再使用1—10倍量体积的体积百分比浓度15—50%乙醇加热溶解，常温放置或0—5℃冷藏1—2天，结晶，得到白色晶体，分离白色晶体，真空干燥，得到银杏内酯A、B、C三种银杏内酯，含量在95%以上的白色粉末，母液减压浓缩至干，再使用1—10倍量体积的体积百分比浓度1—10%乙醇按加热溶解，放置或冷藏结晶，得白果内酯，真空干燥，得到纯度在95%以上白色粉末；

 （b）将沉淀加纯化水加热溶解再使用有机溶剂萃取或直接使用有机溶剂提取，收集有机相，浓缩至干，然后使用1/4—1/8倍量体积的乙酸乙酯或乙醇溶解完全，然后加入5—20倍量体积正己烷或乙醚，常温放置或0—5℃冷藏，得到白色晶体，分离白色晶体，60℃真空干燥，得到银杏内酯A、B、C及白果内酯混合物总含量在95%以上的白色粉末；

    （c）将（a）中混合物结晶粉末或（b）中混合物结晶粉末通过中压制备柱纯化，使用有机溶剂洗脱，分段收集洗脱液，依次得到银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B或白果内酯、银杏内酯C、银杏内酯A、银杏内酯B；洗脱液分别合并后浓缩，干燥，即得，所得内酯单体纯度均在98%以上；

（4）将步骤2中滤液及步骤3中（a）或（b）中结晶后母液合并，使用体积百分比浓度1%—10%NaOH溶液或体积百分比浓度1%—10%Na₂CO₃溶液或体积百分比浓度1%—10%NaHCO₃溶液调PH至3—8，通过阴离子交换树脂吸附，先用纯化水洗涤，弃去洗脱液，然后使用碱液或盐溶液或醇溶液洗脱，洗脱液使用体积百分比浓度1—10%盐酸溶液调PH至3—5得酸液；

（5）将步骤4中酸液使用分子量150—250道尔顿有机复合膜钠滤设备除去盐及小分子杂质，收集未透过液，最后浓缩、真空干燥得到含量在90%以上的银杏总黄酮。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤3中所述的有机溶剂是乙酸乙酯或正丁醇或2—丁醇。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤3中（C）所述的中压制备柱为C₁₈反相柱或MCI树脂柱。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤3中（C）所述的洗脱溶剂为乙腈—水9：1—4：6，v/v或水—甲醇9：1—5：5，v/v。

5.根据权利要求1所述制备的方法，其特征是步骤4中所述的阴离子交换树脂是D301大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂或D280大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或201×7强酸性苯乙烯系阴离子交换树脂。

6.  根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤4中所述的碱液是PH值为8—12的稀氨水或氢氧化钠溶液；盐溶液为0.1mol/L—2mol/L的氯化钠溶液；醇溶液为体积百分比浓度30%—90%乙醇溶液。