CN102492630A - 生产黑色素的诱变菌株出芽短梗霉及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生产黑色素的诱变菌株出芽短梗霉及其培养方法和应用，本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株大量产生黑色素的诱变菌株出芽短梗霉及其培养方法。出芽短梗霉CGMCC No.3337的培养方法，包括如下步骤：菌种活化：将出芽短梗霉CGMCC No.3337转接PDA斜面培养基，于恒温培养箱中，25℃培养2～4d；种子培养：选择生长良好的活化斜面菌种接种于种子培养基中，于25℃，200r/min下培养2～3d；发酵培养：种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于25℃，200r/min下培养4～6d。其短梗霉黑色素生产能力更高，且发酵的时间短，并由此能够有效提高黑色素的产率，降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一株大量产生黑色素的诱变菌株出芽短梗霉及其培养方法。
背景技术
黑色素是一种广泛存在于动植物和微生物中的色素。黑色素的形成是通过酪氨酸酶催化L-酪氨酸成多巴，再经过一系列聚合反应合成的。Nicolaus等人提出，可将其分成三类：(1)真黑色素(eumelanins)，含氮不含硫原子，主要是黑色和褐色的色素，是酪氨酸在酪氨酸酶的催化下被羟化，接着在一系列的氧化和聚合反应中形成；(2)棕黑色素(phaeomelanins)，含氮和硫原子，常呈棕色、红色甚至黄色，和真黑素的合成途径类似，但有谷胱甘肽或半胱氨酸等的参与；(3)异黑色素(allomelanins)，不含氮，常呈棕色或黑色，主要存在与植物体内，通过多酚氧化酶将多酚氧化聚合而成。2000年Sigma公司多巴黑色素样品的价格是150.6美元/克，2003年是197美元/克，总体呈增长趋势，十分昂贵。
黑色素在工农业上，可以作为吸收紫外线的化妆品成分、天然染发剂的成分、阳离子螯和剂、作为无定形的半导体以及生物杀虫剂的光保护剂；此外黑色素在医学上也具有很广的应用范围，具有清除自由基、阻止心磷脂脂质体的氧化、抗辐射及抗氧化、对病理学和分类学的研究具有重要意义、作为新型的天然药物载体、用来治疗某些与黑色素缺乏相关的神经性疾病、一些可溶性黑色素在体外具有抑制艾滋病病毒感染宿主细胞的作用，因此有可能成为一种有效的药物。
目前黑色素的生产多是通过化学合成或从动、植物体进行提取。化学合成黑色素反应过程多，且具有一定的毒害性；从动、植物体提取黑色素存在样品来源的问题。利用微生物生产黑色素具有反应条件温和、成本低、操作简单、无需大量的样品等优点。
因为黑色素的应用价值十分广泛，目前，研究微生物产黑色素及其应用的文献日益增多。近年来国内在微生物发酵生产黑色素的研究也在不断增加，其中2004年报道，筛选到一株坚强芽孢杆菌(Bacilis firmus)，产量达到3.25g/L。
发明内容
本发明提供生产黑色素的诱变菌株出芽短梗霉及其培养方法；
出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)，CGMCC No.3337，能够生产黑色素。
本发明菌种使用天津科技大学申请中菌种，申请号为CN200910071018，发明名称为一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法，公开日期是2011.02.23。该专利中公开了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，菌种保藏号为CGMCC3337，2009年10.14日保藏。该菌株于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)。
CGMCC No.3337的培养方法为：
(1)菌种活化：将出芽短梗霉CGMCC No.3337转接至PDA斜面培养基，25℃培养3～5d；
(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约107个/mL的孢子悬浮液，按8％(v/v)接种量接种装有50mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，25℃，200r/min条件下培养2～3d，制得种子液；
(3)液态发酵：将(2)中的种子培养液以5～10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，在24～30℃下，200r/min振荡培养7～10d；
出芽短梗霉CGMCC No.3337所用到的培养基为：
(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH 4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(2)种子培养基：葡萄糖8％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K2CO3 0.04％，KH2PO4 0.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 2％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(3)发酵培养基：葡萄糖10％，丁二酸铵0.3％，丁二酸0.2％，K2CO30.04％，KH2PO4 0.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 3％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；
本发明与现有技术相比，有益效果是：采用该诱变方法降低了筛选的盲目性，有效简化了筛选过程，同时优化了高产菌株的发酵培养条件，大大提高了诱变育种的工作效率。
本发明的诱变菌株CGMCC No.3337与常规短梗霉黑色素生产菌相比，其短梗霉黑色素生产能力更高，且发酵的时间短，并由此能够有效提高黑色素的产率，降低生产成本。培养基优化提高短梗霉黑色素的产量，有效降低了生产成本，实现了短梗霉黑色素的工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限制性的，不能以此限定本发明的保护范围。
CGMCC No.3337的特性
(1)菌体形态：主要为酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，数个菌体可连成杆状，芽分生孢子。
(2)菌落形态：最初粘稠，乳白色，很快转变为淡绿色，最终为黑色。菌落质地粘稠湿润，圆滑，色泽黑亮，菌落边缘呈些微的根状。
(3)培养特征：25℃，180～200r/m下振荡培养4～6d，发酵液颜色稳定为黑色，不产普鲁兰多糖和聚苹果酸。
(4)可以利用的碳源：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、琥珀酸、柠檬酸其中之一。
(5)可以利用的氮源：酵母粉、牛肉膏、硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵及玉米浸提液。
上述氮源可单独使用也可复合使用。
(6)可以分别以琥珀酸、柠檬酸、酪氨酸为唯一碳源进行生长，并生长良好；
实施例1 CGMCC No.3337的培养
1.培养基的配制
(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(2)种子培养基：葡萄糖10％，丁二酸铵1％，丁二酸0.2％，K2CO3 0.04％，KH2PO4 0.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 2％(单独灭菌)，pH 4.5，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(3)发酵培养基：丁二酸铵0.3％，丁二酸8％，K2CO3 0.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
2.菌种活化
将出芽短梗霉CGMCC No.3337转接PDA斜面培养基，于恒温培养箱中，25℃培养2～4d；
3.种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25℃，200r/m下培养2～3d；
4.液态发酵
将3中制得的种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于25℃，200r/m下培养4～6d；
检测结果：实施例1在发酵培养基发酵生产短梗霉黑色素产量为7±1.2g/L.
实施例2 CGMCC No.3337的培养
1.培养基的配制
(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)种子培养基：葡萄糖3％，丁二酸5％，K2CO3 0.04％，KH2PO4 0.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 2％(单独灭菌)，pH 6.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(3)发酵培养基：蔗糖3％，丁二酸铵0.3％，丁二酸5％，K2CO3 0.04％，KH2PO4 0.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.05％，pH 6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
2.菌种活化
将出芽短梗霉CGMCC No.3337转接PDA斜面培养基，于恒温培养箱中，25℃培养2～4d；
3.种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25℃，200r/m下培养2～3d；
4.液态发酵
将3中制得的种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于25℃，200r/m下培养4～6d；
检测结果：实施例2在发酵培养基发酵生产短梗霉黑色素产量为8±1.3g/L.
实施例3 CGMCC No.3337的培养
1.培养基的配制
(1)菌种活化培养基：土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH4.0～4.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；
(2)种子培养基：葡萄糖8％，丁二酸5％，K2CO3 0.04％，KH2PO4 0.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 6×10-4％，玉米浸出液0.05％，CaCO3 2％(单独灭菌)，pH 6.0，121℃高压蒸汽灭菌15min；
(3)发酵培养基：丁二酸铵0.3％，丁二酸8％，K2CO3 0.04％，KH2PO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，ZnSO4·7H2O 5×10-4％，玉米浸出液0.1％，pH6.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；
2.菌种活化
将出芽短梗霉CGMCC No.3337转接PDA斜面培养基，于恒温培养箱中，25℃培养2～4d；
3.种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有上述1中制得的种子培养基的三角瓶中，于25℃，200r/min下培养2～3d；
4.液态发酵
将3中制得的种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于25℃，200r/min下培养4～6d；
检测结果：实施例3在发酵培养基发酵生产短梗霉黑色素产量为6±1.1g/L。
Claims (3)
1.生产黑色素的出芽短梗霉(Aureobasidium，Pullulan)，CGMCC No.3337。
2.出芽短梗霉CGMCC No.3337的培养方法，包括如下步骤：菌种活化：
将出芽短梗霉CGMCC No.3337转接PDA斜面培养基，于恒温培养箱中，25℃培养2～4d；种子培养：选择生长良好的活化斜面菌种接种于种子培养基中，于25℃，200r/min下培养2～3d；发酵培养：种子培养液以10％(v/v)接种量接种于发酵培养基中，于25℃，200r/min下培养4～6d。
3.出芽短梗霉CGMCC No.3337在生产黑色素中的应用。
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