CN102482696A - 进行扩增子挽救多重pcr的装置 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种盒子，用于PCR扩增和DNA扩增子的检测，所述盒子具有可在盒子内垂直及水平移动的盒式吸液管，至少一个试剂室和至少一个检测器，例如微阵列，用于检测PCR扩增步骤中扩增的DNA。

Description

进行扩增子挽救多重PCR的装置

相关申请的交叉引用

本申请要求申请于2009年5月14日的美国临时专利申请号61/178，111的优选权，该申请的全部内容通过引用合并至此。

技术领域

本申请大体上涉及扩增核酸的机器与方法。更具体地，本申请涉及通过聚合酶链反应实现多核酸序列扩增的机器与方法。

背景技术

聚合酶链反应（PCR）的发展实现了DNA扩增在多种用途中的应用，包括分子诊断测试。但是，用于分子鉴别诊断（MDD）试验的PCR的应用面临着一些挑战。然而，PCR利用特定引物或引物组、温度条件和酶。PCR反应容易受到污染，引物结合随引物的不同需要不同的条件，为了只扩增靶序列引物需为该靶序列定制，等等。这导致从单一样本扩增多序列时更高的难度。

在过去，为找出一种或多种致病物质（agent）的临床样本的诊断测试需要将微生物进行隔离和培养。但这可能需要好几天，而在许多情况下，为了挽救病人的生命，必须在几小时内就做出诊断。目标是在大约几小时内对临床样本中的一种或多种致病物质做出鉴定，而已有开发的方法可以更好地实现该目标。例如，已经开发出多重PCR法可在一个样本中扩增多个核酸以产生足量的DNA/RNA来实现多种生物体的检测和鉴定。然而多重PCR也存在缺陷。例如，多重PCR反应中每个靶标的扩增都需要与其对应的最优的反应条件，所以增加靶标数目则要求每个单独的靶标的反应条件都达不到最优情况。此外，一个系统中高浓度引物的多种组系经常产生引物二聚体或给予非特异性的背景扩增。该特异性的缺乏还要求另外的PCR后清洁步骤以及杂交后的多次洗涤步骤。稠密的引物由于需要可用的酶以及消耗底物降低了扩增效率。扩增效率上的差异可导致扩增子产率的显著差异。例如，某些基因座可能很有效率的扩增，而其他的可能非常无效率的扩增或是根本不扩增。这种不均衡扩增的潜在性还使精确进行终点定量分析变得困难甚至不可能。

一种克服了多重PCR多种难题的方法是靶标富集多重PCR（tem-PCR）。在tem-PCR过程中，初始PCR循环期间，使用极低浓度的嵌套基因特异性引物来富集靶标。随后，使用超级引物（SuperPrimer）扩增所有靶标。在此过程中，嵌套引物增加了基因座间的兼容性并减少了背景扩增，还增加了引物可结合的最优条件的范围。Tem-PCR方法的明显优势在于其易用性。全部反应在一个管内进行，不要求另外的PCR循环，且不要求专门仪器，只需有规律的热循环仪就能进行。

多重和tem-PCR技术为单一样品一次进行多种试验提供了可能，但目前需牺牲很大的灵敏度，所述灵敏度通过使用单一组系的靶标特异性引物进行的单一扩增反应中获得。仍需要改进技术以使诊断测试具有更高的灵敏度以及更短的诊断时间。还需要整合扩增与检测步骤以消除开管杂交步骤从而减少由PCR产物的携带污染造成的假阳性。

发明内容

本申请涉及自容式盒，用于进行DNA和/或RNA的扩增子挽救多重PCR扩增（ARM-PCR）以及由此得到的DNA扩增子的检测。其可对来自一份样品的多种不同生物体成功地进行扩增和检测，所述样品中可能含有一种或多种致病因子，例如多种细菌、病毒和真菌。所述盒子包含所有面均被至少一种屏障材料所包围的基本密闭的环境，所述屏障材料使盒子内部的内容物与外部环境分隔开来，从而形成腔体，在外部底座单元控制下可在盒子内垂直及水平移动的盒式吸液管，用于至少一项PCR扩增反应的至少一种试剂，用于包含该至少一种试剂的至少一个试剂室，以及至少一个检测室，所述检测室含有至少一个用于检测PCR扩增产生的DNA的微阵列。试剂可包括从特定种类微生物中扩增DNA所必需的适宜的引物，且一个或多个相应的微阵列也可与包括在盒子内的引物配对以提供检测板，其能够有效检测出引发例如呼吸系统疾病、胃肠道疾病、性传播疾病或其他系统特异性疾病的物质。

在某些方面，本申请包含一个盒子，其含有在外部底座单元控制下可在盒子内可垂直及水平移动的盒式吸液管；用于第一扩增反应的至少一对靶特异性引物，其与盒子进行DNA/RNA扩增，以靶特异性的方式产生至少一个扩增子；用于第二扩增反应的至少一对靶独立性的引物，其在盒子内以靶独立的方式扩增至少一个扩增子的DNA，以从至少一对共用引物中产生至少一个扩增子；以及至少一种检测工具以检测和鉴定扩增子。本申请，在某些方面，还提供试剂盒，其包含至少一个本申请所述的盒子、至少一对靶特异性引物、至少一个共用引物和至少一个微阵列，选择所述至少一对的靶特异性引物和至少一个的微阵列以提供目标组的靶物质的的扩增和检测。在某些方面，例如，靶物质的目标组可包括公知的引起呼吸系统疾病的细菌和/或病毒，公知的引起胃肠道疾病的细菌和/或病毒，常与败血症相关联的细菌，等等。

附图说明

图1是本申请提供的盒子及其组成部件的正视图。

图2a是图1中的盒子的分解图。

图2b是图1中的盒子的另一分解图。

图2c是图1中的盒子的又一分解图。

图3是图1中的盒子的分解右视图。

图4a是图1中盒子的前部分解图。

图4b是图1中盒子的前部截面图。

图5是图1中的盒子的分解左视图。

图6是图1中的盒子的分解后视图。

图7是图1中的盒子的俯视图。

图8是图1中的盒子的室盖的俯视图。

图9是图1中的盒子的底座的俯视图。

图10是图1中的盒子移除了底座与室盖的仰视图。

图11是室盖的仰视图。

图12是图1中的盒子的底座的仰视图。

图13a是图1中的盒子的顶部的左视图。

图13b是图13a中所示盒子顶部的左视图，显示了活动位置的弹簧。

具体实施方式

本申请涉及对获取自临床样本的DNA和/或RNA进行PCR扩增的盒子。这样的样本可含有一个或多个致病因子，例如，细菌、病毒和真菌。该盒子还包含用于检测和鉴定由盒子内进行的PCR扩增反应产生的DNA的至少一种检测工具。盒子能够进行扩增子挽救多重PCR（ARM-PCR），该技术之前在美国专利申请号 12/418，532和PCT申请号PCT/US09/39552中有过描述。为提供ARM-PCR必需的试剂，盒子还包含适宜的用于第一、靶特异性扩增反应的嵌套、靶特异性的引物以及用于第二、靶独立性扩增反应的共用引物。这些扩增反应可在相同或不同的试剂室中进行。术语“由...构成”和/或“主要由...构成”在本文中使用时可替换成术语“包含”。

简单地说，ARM-PCR是一种从诸如临床、环境或食物样本的样本中产生可检测数量的靶多聚核苷酸的方法，所述方法包含在第一扩增反应中使用嵌套引物扩增一个或多个靶标多聚核苷酸，以产生扩增子，嵌套引物的至少一部分包含附加的核苷酸以在产生的扩增子中并入至少一个公共引物的结合位点；从第一扩增反应中一个或多个未用的引物里挽救第一扩增反应的扩增子；在第二扩增中使用共用引物扩增上述具有至少一个共用引物结合位点的第一扩增反应的扩增子。盒子包含在扩增和检测研究方案期间能在盒子内垂直和水平移动的盒式吸液管，其通过外部底座单元的操控可吸入和/或释放流体，以向盒子的试剂室中移入或从盒子的试剂室移出试剂。盒子还包含DNA提取和PCR扩增反应必需的试剂（例如，酶、缓冲液、dNTPs，等)，这些试剂装于一个或多个（即，至少一个）试剂室内，和含有至少一个微阵列的至少一个检测室，其用于检测反应期间扩增的DNA。在本申请中，检测室含有至少一个DNA微阵列。

试剂室可排列成任意模式——例如直线形，圆形等，且至少一个试剂室还可用作进行聚合酶链反应扩增的至少一个反应室。试剂室可以是相同或相似的深度，但也可以是不同深度以使一个试剂室深于另一个。这尤其可以是试剂室用作反应室的情况。试剂可以包括，并优选包括，从特定种类的微生物中扩增DNA所必需的适宜的引物，以及一个或多个相应的微阵列可与盒子中所包括的引物配对。例如，盒子可含有引物和对对多种微生物具有特异性的一个或多个微阵列，所述微生物已知地与呼吸系统感染相关，以使从有呼吸系统感染症状的病人身上获得的临床样本可通过使用单一的盒子对是否存在任何一种所述微生物进行检测。

盒子可插入到底座机器（“底座单元”）上，可操作地与盒子相互连接以提供一系列部件的必需的移动，部件设计成提供上下的垂直移动以及水平的往返移动，以及盒式吸液管进行的流体处理，所述盒式吸液管在由盒子的顶部、底部、末端和侧面所限制的区域的界限内进行操作，这些部件被分别称为凸轮杆、丝杆和吸液管泵组件。本申请还提供允许盒式吸液管在x-y-z平面内任意方向上移动，或贯穿封闭盒子进行圆形/旋转移动的机械装置。

现在参照附图，盒式吸液管20可操作地连接至可旋转的凸轮杆16以使杆16的旋转导致吸液管20在垂直方向的向上和/或向下的相应运动。吸液管支架28支撑并引导盒式吸液管20的上下运动，吸液管支架28由盒子1支撑并在其中可滑动地放置。丝杆24位于盒子1内且可操作地连接至吸液管支架28，以至于丝杆24的旋转使吸液管支架28产生相应的横向移动，从而形成一种方法，使扩增/检测过程的每个阶段时吸液管20都位于适宜的流体孔49的上方。

盒子1的底座4包含至少一个样品室42，以及至少一个容纳试剂的试剂室49（未示出）。试剂室49可以是相同、相似或不同尺寸、形状及深度，并可在盒子1的底座4中按各种位置排列。合适的试剂（未示出）置于适宜的试剂室49中以使盒式吸液管20可随着盒子内过程的进行而收集提取和两步、两引物组扩增中所需要的试剂。试剂室49可预装载并优选在运输前密封，使用的密封材料包含这样的材料，其在运输与存储期间能够保持完好，但当盒式吸液管20为打开试剂室49以取回内容物时能够轻松地被盒式吸液管向下运动的作用力刺穿。适合于密封试剂室的，以单独或是群组的，这种材料是铝箔薄板（未示出）。本申请的试剂室中有两个分别含有靶特异性的引物与共用的非靶特异性的引物的试剂室。这些引物用于第一与第二扩增反应，第一扩增为靶特异性的，以提供表示样本中得到的各种靶标的DNA和/或RNA的扩增子，而第二扩增使用共用引物催发（prime）以允许对第一扩增得到的扩增子进行半定量非特异性扩增。在这个两步的过程中，由靶特异性引物催发的第一扩增提供特异性，而由共用引物催发的第二扩增增加灵敏度。

盒子1的底座4中还装配有检测室48，其含有微阵列44，用于检测两步ARM-PCR研究方案期间扩增的DNA。微阵列是本领域中已知的并且制备靶特异性微阵列的方法为本领域技术人员所公知。

附图表示了本申请盒子的侧视图，其具有顶部2，底座4，第一端6，第二端7，第一侧面11，第二侧面13，注入口盖12，注入口14，凸轮杆16，O形环密封91、92，凸轮杆促动器18，盒式吸液管20，吸液管弹簧22，丝杆24，吸液管支架28，包含推杆8、气缸32、活塞34、管子36、弹簧38的吸液管泵组件41和任选的盒式通风孔（未示出）。底座4包含样品室42和保存进行PCR反应所必需的各种试剂与流体的一系列试剂室49。举例来说，在本申请的某些方面，本申请的盒子1可包含一系列试剂室49以至于第一试剂室含有PCR1试剂（使用嵌套引物的第一PCR反应需要的引物、缓冲液等），第二试剂室含有把PCR反应混合物顶部物质堆积成层的矿物油，第三试剂室含有捕获探针，第四试剂室含有磁珠，第五试剂室包含废弃物室，第六试剂室包含PCR2试剂（使用至少一种公共引物的第二PCR反应需要的引物、缓冲液等)，第七试剂室含有杂交液，以及第八试剂室含有冲洗液。至少一个试剂室还可充当检测室48，其包含至少一个微阵列44。此外，检测室48还可含有至少一个检测器门（未示出），所述检测器门具有检测器门闩（未示出）和门弹簧（未示出），以避免微阵列44被使用者（未示出）碰触或污染。室盖50可置于底座4上方并由此置于试剂室49上方。

使用者可通过盒子顶部的注入口14将盒子外部环境中的吸液管（未示出）插入到样品室42中。可在盒子1内形成清晰的塑料窗以使使用者能看见其吸液管尖端（未示出）插入到盒子1以存放待分析的样品（未示出）。在一个实施方式中，所述清晰的观察窗构造成能经受盒子的极限温度。可选地，盒子1的整个外壳（enclosure）可由透明或半透明塑料构成，允许使用者能看见盒子内部的操作。

在一个实施方式中，位于盒子顶部的注入口盖12是一次性操作的盖子，意味着一旦所述盖子在样品插入后密封了就不能再打开，从而保持密封的完整并保持系统密闭。在另一个实施方式中，可利用滑动门10，以致一旦样品（未示出）引入盒子1内，滑动门10可沿箭头72（图3）的方向滑动并锁定。滑动门10可通过突出部(未示出)进行锁定，所述突出部形成在滑动门10上，与铸造在顶部2上的凹槽（未示出）相匹配，仅允许单向的运动，以致一旦滑动门10经过某特定点，凹槽（未示出）中止以防止滑动门10反向运动回其初始位置。注入口盖12将注入口14密封。在一个实施方式中，注入口14最小内径为0.3英寸以使20μl吸液管通过其插入到样品室42。在本申请的其他实施方式中注入口14还可为其他尺寸。

盒式吸液管20垂直的上下方式的运动是由凸轮杆16实现的，所述凸轮杆16通过固定地结合在其上的机械接口18连接至外部底座单元（未示出），以使盒式吸液管20的运动受底座单元（未示出）的控制。在一个实施方式中，机械接口18为旋钮，而其他实施方式中使用的机械接口亦可为其他形式。如图4b中所示，凸轮杆16从其原位置（如图4a中所示）沿箭头74指出的逆时针方向旋转使凸轮杆16沿箭头76指出的方向运动并按下吸液管的顶部，将吸液管下推并进入样品室42或一个试剂室49中。当凸轮杆16旋回其原位置时，可操作地连接在凸轮杆16与盒式吸液管20之间的吸液管弹簧22将吸液管20从样品室42或试剂室49中移除并将其送回其原位置。在原位置上时，凸轮杆16含有开口82（图2c），使样品通过注入口14插入到样品室42，而无需受使用者所用吸液管（未示出）尺寸合适与否的干扰。凸轮杆16与机械接口18的旋转最大角度使盒式吸液管20尖端位于试剂室49（或样品室42）的底部，而旋转最小角度则将凸轮杆16置于原位置，将盒式吸液管20的尖端置于试剂室49（或样品室42）顶部的上方。在此位置，当盒式吸液管20在盒子1内横向反复移动时，其不应与盒子1的任何内表面发生接触。吸液管弹簧22通常是具备足够弹簧常数的压缩弹簧，以使吸液管跟随凸轮杆16的运动，同时一直与其保持接触。弹簧22可由金属和/或塑料制成。在一个实施方式中，弹簧22的材料允许吸液管20尖端与试剂室49或样品室42之间的轻微错位而不干扰吸液管20的整体运动。

盒式吸液管20由吸液管支架28支撑和固定在适当的位置。吸液管支架28可滑动地沿盒子1的长度被收纳。吸液管支架28可通过铸造在盒子1的侧面11与13上的第一与第二导轨（未示出）沿盒子1的同一侧面保留。这种导轨可平行于彼此垂直地放置，并水平地位于盒子的第一端6与第二端17之间。吸液管支架28可操作地连接至丝杆24。丝杆24以在丝杆24和吸液管支架28之间的阳-阴螺纹配对的方式旋入吸液管支架件28中。机械接口40固定地连接至丝杆24上，可如箭头79（图3）所示进行顺时针和逆时针的旋转。机械接口40的旋转转动丝杆24，吸液管支架28随着丝杆24的螺纹在沿盒子1的长度沿丝杆24水平移动。颠倒丝杆24的旋转方向引发吸液管支架28相应的反向运动。通过控制丝杆28的旋转次数与旋转方向，吸液管可精确的定位于底座4上任一试剂室49或样品室42的上方。在一个实施方式中，机械接口40为旋钮，而其他实施方式中还可使用其他类型的机械接口。

在一个实施方式中，丝杆24由塑料和/或金属构造成。然而，在其他实施方式中丝杆24也可由其他材料或材料的类型制成。丝杆24的螺距应选择为能优化平移运动的速度以及吸液管支架28的定位精度。在一个实施方式中，丝杆24不是柔软的、可弯曲的或可固定的以阻碍其产生吸液管支架28水平运动的能力。在一个实施方式中，丝杆24的总长可使吸液管到达底座4上的所有试剂室49和样品室42。低摩擦的O形环密封91环绕盒子开口，丝杆24通过盒子开口接合盒子1，该O形环密封维持盒子1内部相对无污染的环境。在一个实施方式中，考虑到用于DNA/RNA扩增的盒子使用热循环反应条件，丝杆24需构造成能够耐受盒子的极限温度。

室内部吸液管支架28的位置可通过丝杆24的旋转次数光学、磁力学或算术地测得。若采用光学，盒子1的侧面11、13需足够的半透明或透明以使用本领域已知的标准光学传感器进行检测。若磁力学地检测吸液管支架28的位置，可在吸液管支架28的背部嵌入磁体（未示出），通过位于底座单元上的一系列霍耳效应设备进行检测，而盒子1插入到底座单元（未示出）中以进行所需的化学反应以及检测过程。随着吸液管支架28及附属于其上的磁体（未示出）沿着导轨（未示出）移动，在盒子1外部同时又置于底座单元（未示出）中的霍耳效应设备（未示出）对准着每个试剂室49的位置以检测有无磁场存在。当吸液管20垂直对准试剂室49或样品室42时，该位置特定的霍耳效应设备（未示出）将检测磁场的存在。在一个实施方式中，对应其他试剂室49的其他霍耳效应设备未检测到磁场即表示不存在磁场。霍耳效应设备的任何输出信号（未显示）均被位于底座单元中的相应探测器检测，以确认盒式吸液管20的位置。

盒式吸液管20流动地连接至吸液管泵组件41上，吸液管泵组件41包含推杆8、气缸32、活塞34、管子36和弹簧38。在一个实施方式中，管子36是柔软的，在一个实施方式中，管子36包含被称为“平管”的管子36类型。管子还包括螺旋套（spiral wrap）53，当吸液管支架28贯穿盒子1活动时，其防止管子36干扰盒子1的侧面11、13。吸液管泵组件41可操作地连接于底座单元（未示出）上，以使底座单元（未示出）的可移动部件（未示出）将推杆8和活塞34压入吸液管泵组件41的气缸32中，并且由此压缩产生的压力差通过管子36传递进入吸液管20，推杆8和活塞34在气缸32内的运动产生合适的真空以从试剂室49或样品室42中将流体吸入盒式吸液管20中，或产生合适的空气力以将盒式吸液管中的内容物排入到反应室49或检测室48中。相应地，在这个实施方式中，从活塞34至管子36的吸液管泵组件41以至吸液管20的尖端都保持流体连通。

气缸32和活塞34的推杆侧应与盒子1外部的空气相通，防止活塞的背部增压。在一个实施方式中，气缸32的内部容量足以产生吸液管的流体容量的运动。随着活塞34在推杆8的力量在于气缸32内部移动以改变其气室容积，气缸中的空气被活塞34置换，引发空气压力变化，该空气压力变化经由管子36传递至吸液管20。因此，活塞34在气缸32壁的内部形成低摩擦、基本不透气的密封。该密封在气缸内气压增加或降低时可保持，并且活塞34的移动也不会影响该密封，因此可以精确控制吸液管移取的流体的量。活塞34的内部运动足以允许所需的吸液管流体量的运动。

管子36流动地连接于活塞34上，以使空气在与活塞34的动作相关的管子内移动。管子36有足够的内部体积或内径将气缸32内的压力变化在最佳的时间量内传递至吸液管20。使用平管（未示出）可控制吸液管20前后上下移动时平管的运动，因为所述管子在任何情况下均不会干扰吸液管的运动。在一个实施方式中，管子36紧靠在外壳的内侧壁上，随着盒式吸液管20自由移动而不会对盒式吸液管20的运动产生阻碍。

吸液管泵组件41的弹簧38形成部件位于推杆8和盒子1的第二端17之间，这使得当来自底座单元（未示出）的力移除后推杆8能回到其原位置。在一个实施方式中，弹簧38是由金属和/或塑料制成的压缩弹簧。在本申请的其他实施方式中弹簧38还可由其他材料或材料类型制成。

盒式吸液管20的尖端具有足够窄的圆周以使其容易地进入试剂室49，检测室48或样品室42到达这种室的底部。在一个实施方式中，形成盒式吸液管尖端的设计与材料应使吸液管尖端在刺穿密封（未示出）或从室通过由刺穿密封 （未示出）而形成的开口移除时，均不会与可置于室上的密封（未显示）产生缠绕。盒式吸液管20与吸液管支架28间的接口应有足够的活动自由，以容许吸液管20尖端与流体孔之间的小错位。在一个实施方式中，如图中所示可在盒子1中使用100微升的吸液管。但是，生物技术领域的技术人员完全能够修改试剂室49、样品室42、检测室48的尺寸以及试剂的体积。因此，本申请的各种实施方式中也可使用其他容量的吸液管。吸液管20的总容量应足够大以使吸液管泵组件41的最大冲程期间也不会有流体被吸入管子36。在一个实施方式中，盒式吸液管20由塑料构造成且盒式吸液管20由经得起盒子1的极限温度的材料制成，并对所使用的化学药品与试剂是相对惰性的。

盒子底座4通过大体上不透气的密封连接至盒子1的端6、17和侧面11、13。在一个实施方式中，底座4和侧面11、13通过在侧面11、13上的开口96和在底座4上的突出部98连接，从而使得当底座4如图1所示连接时突出部98与开口96啮合。小的盒子通风孔（未示出）和过滤器（未示出）可以包括在沿端6、17和侧面11、13的任何位置以形成在盒子1的内部和外部之间的连接，使得内部压力和外部气压在一种可控方式下平衡。该过滤器（未示出）可以是干燥的或潮湿的，抑制污染颗粒的进入并使得盒子和外部环境之间的气压均衡。

本申请的盒子1装在一个底座单元内（未显示）并可操作地与此连接。该底座单元（未示出）预先确定成调整运动并提供凸轮杆16、丝杆24和吸液管泵组件4的运动1，以便控制盒式吸液管的上下和水平运动，以及通过盒式吸液管20移除或添加试剂到适当的试剂室49、检测室48或样品室42。当盒子1插入到底座单元（未示出）时，试剂室49可以用作扩增反应室与底座单元（未示出）联接，与底座单元加热器（未示出）接触。底座单元加热器（温度循环器）（未示出）循环温度以进行所需的PCR反应。

当盒式吸液管20沉淀在检测室48中的PCR2反应的反应产物（未显示）时，盒子底座4进一步包含至少一个检测室48，该检测室48含有1个或多个DNA微阵列44和进行所需杂交的试剂。 检测室48被构造使得其上印有检测微阵列的玻璃盖玻片（未示出）可以在盒子1的完成和装运前插入。玻璃盖玻片（未示出）可以是，例如，1平方厘米的玻璃片。在这一实施方式中，室48的底部边缘形成用于接受玻璃片和用于形成检测室48的材料由融合玻璃盖玻片的材料组成。在一个实施方式中，检测室48的底部是平的并与底座4的底部表面平行。如果利用检测室48，则其可以凹进底座4中使得检测器门正确的操作。如果使用，检测器门（未示出）保护玻璃盖玻片（未示出）的底部表面或微阵列44在操作期间免受损坏，例如指纹、灰尘和划痕造成的损坏。检测器门（未示出）一旦安装进入底座单元机（未示出）中便可以滑出。检测器门（未显示）是不会由正常的操作触发的，但是容易通过在盒子1插入到底座单元（未示出）上时通过连接底座单元（未示出）而触发。

当盒子1插入到基座单元（未示出）时，检测室48与底座单元（未示出）协调的放置以接触底座单元的杂交加热器（未示出）和光检测器（未示出）。如果检测器门（未示出）被利用，盒子1插入到底座单元（未示出）脱扣检测室48的检测器门闩（未示出）并打开门（未示出）使得门弹簧（未示出）拉出检测器门（未示出）--提供通路给在检测室48的底部内的微阵列44上的玻璃盖玻片（未示出）。在检测室48的周围可以存在材料环（未示出），材料环可沿其外围移除以产生热风焊盘，使得从加热器（未示出）转移到微阵列44中的热量不会丧失在底座4中。在一个实施方式中，试剂室49被设计成使得吸液管20尖端的轻微错位仍然允许吸液管20进入试剂室49内部的流体（未示出）中。因此，在这一实施方式中，室盖50可以设计有锥形的开口55以指引吸液管20进入试剂室49、检测室48或样品室42中。

可以通过在杂交期间产生在微阵列44中捕获的DNA的荧光数字图象进行检测。微阵列44是一种印刷点网格，其含有选作结合特定的DNA靶标的特定的DNA捕获探针。通过将这些捕获探针放置到一个已知的模式中，与定向标记物和阳性和阴性对照点一起，未知的DNA靶标可以被检测并鉴定是否其起源于微阵列上所代表的生物体之一。含有印刷阵列的玻璃盖玻片（未示出）的侧面密封在检测室48上，并允许印刷阵列（未示出）接触杂交流体（未示出）。玻璃盖玻片（未示出）应当对检测室48的底部边缘产生空气和流体密封，通过极限温度保持其完整性，盒子1在PCR过程中在极限温度下暴露。用于密封玻璃片（未显示）至检测室48上的材料应当对放置在检测室48中的化学药品是惰性的。微阵列44印在玻璃盖玻片（未示出）的内表面上，因此底座单元的激发光源是通过玻璃片（未示出）的底部被向上引导，激发DNA产品上的荧光标记。位于底座单元（未示出）中的外部杂交加热器（未显示）的下方的一个数码相机（未示出）或光电倍增管（未示出）捕获在微阵列44上的荧光模式的图像。玻璃盖玻片（未示出）的光学完整性应该在这个过程中自始至终保持，因为微阵列44是由许多直径只有几微米的许多印刷点组成。

至少一个在底座4中的试剂室49可以形成PCR反应室从而进行所需的PCR1和PCR2反应。该反应室可以构造成与其他试剂室相比不同的直径、深度、和壁厚。例如，反应室优选薄壁室以有助于在位于底座单元中的外部温度循环器和在反应室中的流体之间的热传导。壁应该是锥形的以便容易地放进温度循环器并使得温度循环器的热接触不附着在其表面。反应室应该具有允许流体体积位于温度循环器内部的深度和形状。PCR室的深度应该与盒式吸液管的垂直运动相配。优选地，室还可接近使用者的吸液管尖端如果吸液管尖端通过盒子的注入口14插入室中并且用于形成PCR室的材料可以是光学透明的使得使用者可以看到何时吸液管尖端到达室的底部。

已经在成对扩增和检测的实时PCR和通常在单独的检测程序之前进行扩增步骤的多重PCR发现了缺点。使用单一反应管是一个有吸引力的选择，因为其提供了限制污染的机会。但是，这也限制了用户进行更加敏感的和定量或半定量分析样品的能力。本申请提供一种自动进行结合检测的多重PCR，减少在过程期间污染可能性的方法。通过在此描述的盒子和ARM-PCR的两个扩增步骤、两个引物组研究方案的ARM-PCR程序的结合所提供的ARM-PCR程序提供了高灵敏度、高特异性、半定量的扩增和检测多靶标（例如，20、30、40等），而在扩增反应或检测杂交程序中没有污染的风险。盒子是单一使用的、一次性使用的盒子并且可以装载需要检测多个不同靶标存在的引物，例如各种细菌、真菌、病毒等。盒子可以提供给医院和临床实验室的使用者，例如，快速筛选临床样品以检测可能导致呼吸道、胃肠或其他疾病的物质的存在。本发明可通过如下非限制性的实施例做进一步的描述。

实施例

使用者打开盒子上的注入盖并通过注入口向盒子中插入吸液管尖端存放5微升样品入PCR室。然后取出吸液管并密封注入盖。盒子卡入底座单元中。

盒子的安装使盒子部件接触凸轮杆旋转接口、泵推杆直线运动接口、以及丝杆旋转接口。脱扣检测器盖门闩，松开盖门（如果利用），因此其可以滑出，对底座单元露出盒子的微阵列。当底座单元检测到盒子，其自动读取盒子上的条形码标签。底座单元会验证已经装载用于进行测试类型的正确的盒子。底座单元然后接合用于PCR热循环仪的加热器单元对和用于杂交和检测的光学/加热器。加热器通过底座单元向上移动以热接触PCR室的底部和盒子的检测室。

ARM研究方案包含两个系列的PCR步骤，其根据系列和步骤数如下指定：

PCR1-1.  底座单元机的光学或磁性传感器验证吸液管的位置。

PCR1-2.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的空气。

PCR1-3.  凸轮杆旋转并降低了吸液管。

PCR1-4.  吸液管刺穿PCR1试剂室上的箔密封。

PCR1-5.  吸液管继续向下进入试剂室中。

PCR1-6.  松开泵推杆。

PCR1-7.  流体进入吸液管尖端。

PCR1-8.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-9.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开试剂室。

PCR1-10. 旋转丝杆并移动吸液管到PCR室的上方的位置。

PCR1-11.  底座单元机的光学或磁性传感器验证了该运动。

PCR1-12.  凸轮杆旋转并降低吸液管到PCR室的底部。

PCR1-13.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR1-14.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-15.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开PCR室。

PCR1-16.  旋转丝杆并移动吸液管到矿物油试剂室的上方。

PCR1-17.  底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR1-18.  凸轮杆旋转并降低吸液管。

PCR1-19.  吸液管刺穿矿物油试剂室上的箔密封。

PCR1-20.  吸液管继续向下进入试剂室中。

PCR1-21.  松开泵推杆。

PCR1-22.  流体进入吸液管尖端。

PCR1-23.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-24.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开试剂室。

PCR1-25.  旋转丝杆并移动吸液管到PCR室的上方。

底座单元机的光学或磁性传感器验证了该运动。

PCR1-26. 凸轮杆旋转并降低吸液管到PCR室的底部。

PCR1-27.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR1-28.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-29.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开PCR室。

PCR1-30.  底座单元进行所有PCR温度循环。

PCR1-31.  底座单元机保持PCR室在55摄氏度。

PCR1-32.  旋转丝杆并移动吸液管到捕获探针流体孔的上方。底座单元机的光学或磁性传感器验证了该运动。

PCR1-33.  凸轮杆旋转并降低吸液管。 

PCR1-34.  吸液管刺穿捕获探针试剂室上的箔密封并继续向下进入试剂室中。

PCR1-35.  松开泵推杆。

PCR1-36.  流体进入吸液管尖端。

PCR1-37.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-38.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开试剂室。

PCR1-39.  旋转丝杆并移动吸液管到PCR室的上方。

底座单元机的光学或磁性传感器验证了该运动。

PCR1-40.  凸轮杆旋转并降低吸液管到PCR室的底部。

PCR1-41.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR1-42.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-43.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开PCR室。

PCR1-44.  现在捕获探针捕获在PCR1反应中产生的PCR产物。

PCR1-45.  旋转丝杆并移动吸液管到磁珠试剂室的上方。底座单元机的光学或磁性传感器验证了该运动。

PCR1-46.  凸轮杆旋转并降低吸液管。

PCR1-47.  吸液管刺穿磁珠试剂室上的箔密封。

PCR1-48.  吸液管继续向下进入流体室中。

PCR1-49.  松开泵推杆。

PCR1-50.  流体进入吸液管尖端。

PCR1-51.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-52.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开试剂室。

PCR1-53.  旋转丝杆并移动吸液管到PCR室的上方。

底座单元上的磁性传感器验证了该运动。

PCR1-54.  凸轮杆旋转并降低吸液管到PCR室的底部。

PCR1-55.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR1-56.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-57.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开PCR室。

PCR1-58.  底座单元温度循环器升高PCR室的温度至80摄氏度。

PCR1-59.  现在磁珠捕获到了捕获探针。

PCR1-60.  底座单元移动磁体到PCR室的底部并且磁珠被吸到壁上并保持在那里。

PCR1-61.  凸轮杆旋转并降低吸液管到PCR室。

PCR1-62.  松开泵推杆。

PCR1-63.  流体进入吸液管尖端。磁珠停留在室的侧壁上。

PCR1-64.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-65.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开试剂室。

PCR1-66.  旋转丝杆并移动吸液管到废料室的上方。

底座单元的光学或磁性传感器验证了该运动。

PCR1-67.  凸轮杆旋转并降低吸液管到废料室的底部。

PCR1-68.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR1-69.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-70.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开室。

PCR1-71.  旋转丝杆并移动吸液管到PCR2试剂流体孔的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR1-72.  凸轮杆旋转并降低吸液管。

PCR1-73.  吸液管刺穿PCR2试剂流体孔上的箔密封。

PCR1-74.  吸液管继续向下进入流体室中。

PCR1-75.  松开泵推杆。

PCR1-76.  流体进入吸液管尖端。

PCR1-77.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-78.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开了其内部保持流体的流体孔。

PCR1-79.  旋转丝杆并移动吸液管到PCR室的上方。

底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR1-80.  凸轮杆旋转并降低吸液管到PCR室的底部。

PCR1-81.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR1-82.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR1-83.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开PCR室并且

底座单元准备进行PCR2。

第二个PCR系列扩增来自PCR1的扩增子，来自PCR1的扩增子通过使用保持在PCR室侧壁上的磁珠得以挽救。 

PCR2-1.  底座单元从室侧壁上移走磁体。

PCR2-2.  底座单元使用在溶液中自由移动的珠子进行3个PCR循环。

PCR2-3.  保持在珠子上的挽救的DNA在这三个循环期间掉落。

PCR2-4.  现在底座单元机将磁体放回到侧壁上。

PCR2-5.  磁珠被吸到壁上并保持在那里。

PCR2-6.  底座单元机进行剩下的PCR循环。

PCR2-7.  旋转丝杆并移动吸液管到杂交流体孔的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-8.  凸轮杆旋转并降低吸液管。

PCR2-9.  吸液管刺穿杂交流体孔上的箔密封。

PCR2-10.  吸液管继续向下进入流体室中。

PCR2-11.  松开泵推杆。

PCR2-12.  流体进入吸液管尖端。

PCR2-13.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-14.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开了其内部保持流体的流体孔。

PCR2-15.  旋转丝杆并移动吸液管到检测室的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-16.  凸轮杆旋转并降低吸液管到检测室。

PCR2-17.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR2-18.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-19.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开室。

PCR2-20.  底座单元机开始加热检测室至55摄氏度。

PCR2-21.  旋转丝杆并移动吸液管到PCR室的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-22.  凸轮杆旋转并降低吸液管到PCR室中。

PCR2-23.  松开泵推杆。

PCR2-24.  流体进入吸液管尖端。

PCR2-25.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-26.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开了其内部保持流体的流体孔。

PCR2-27.  旋转丝杆并移动吸液管到检测室的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-28.  凸轮杆旋转并降低吸液管到检测室中。

PCR2-29.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR2-30.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-31.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开室。

PCR2-32.  底座单元机保持检测器在55摄氏度并让微阵列发生杂交。

PCR2-33.  凸轮杆旋转并降低吸液管到检测室中。

PCR2-34.  松开泵推杆。

PCR2-35.  流体进入吸液管尖端。

PCR2-36.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-37.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开了其内部保持流体的流体孔。

PCR2-38.  旋转丝杆并移动吸液管到废料室的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-39.  凸轮杆旋转并降低吸液管到废料室中。

PCR2-40.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入废料室中。

PCR2-41.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-42.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开室。

PCR2-43.  旋转丝杆并移动吸液管到洗涤流体孔的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-44.  凸轮杆旋转并降低吸液管。

PCR2-45.  吸液管刺穿洗涤流体孔上的箔密封。

PCR2-46.  吸液管继续向下进入流体室中。

PCR2-47.  松开泵推杆。

PCR2-48.  流体进入吸液管尖端。

PCR2-49.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-50.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开了其内部保持流体的流体孔。

PCR2-51.  旋转丝杆并移动吸液管到检测室的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-52.  凸轮杆旋转并降低吸液管到检测室。

PCR2-53.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR2-54.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-55.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开室。

PCR2-56.  凸轮杆旋转并降低吸液管到检测室中。

PCR2-57.  松开泵推杆。

PCR2-58.  流体进入吸液管尖端。

PCR2-59.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-60.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开了其内部保持流体的流体孔。

PCR2-61.  旋转丝杆并移动吸液管到废料室的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-62.  凸轮杆旋转并降低吸液管到废料室中。

PCR2-63.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入废料室中。

PCR2-64.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-65.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开室。

PCR2-66.  旋转丝杆并移动吸液管到洗涤流体孔的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-67.  凸轮杆旋转并降低吸液管。

PCR2-68.  吸液管继续向下进入流体室中。

PCR2-69.  松开泵推杆。

PCR2-70.  流体进入吸液管尖端。

PCR2-71.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-72.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开了其内部保持流体的流体孔。

PCR2-73.  旋转丝杆并移动吸液管到检测室的上方。底座单元机的磁性传感器验证了该运动。

PCR2-74.  凸轮杆旋转并降低吸液管到检测室中。

PCR2-75.  压下泵推杆置换出吸液管尖端的流体并进入室中。

PCR2-76.  凸轮杆旋转回到原位置。

PCR2-77.  吸液管弹簧升高吸液管尖端离开室。

一些步骤可以进行额外的两次或多次，洗涤检测器阵列并移除那些显示为在检测器中背景读取中的非杂交的DNA。

如上描述以及相关附图所示，本申请描述了一种进行扩增子挽救多重PCR的装置。虽然本申请的特别实施方式已经描述，但是，应当理解的是，本申请并不限于此，因为本领域技术人员可以进行修改，尤其根据前述的教导。因此，预期通过附加权利要求覆盖任何这些修改，这些修改包含体现本申请实质和范围的那些特征或那些改进。

Claims (16)

1.一种盒子，包含

a) 基本封闭的腔体；

b) 盒式吸液管，其可移动地连接至腔体并处在腔体内，以使其在所述基本封闭的腔体内可垂直和水平地移动；

c) 与腔体结合的底座；

d) 至少一个室，其在形成于底座上的腔体内；以及

e) 至少一个检测室。

2.如权利要求1所述的盒子，进一步包含可旋转地连接至腔体的凸轮杆，其中所述凸轮杆的旋转使吸液管移入及移出室。

3.如权利要求1所述的盒子，进一步包含可旋转地连接至腔体的丝杆，其中所述丝杆的旋转使固定地连接至吸液管的吸液管支架在所述基本封闭的环境内水平移动。

4.如权利要求1所述的盒子，进一步包含吸液管泵组件，其中所述泵组件的激活在吸液管内产生真空。

5.如权利要求1所述的盒子，进一步包含位于腔体内的注入口。

6.如权利要求5所述的盒子，进一步包含注入口盖。

7.如权利要求6所述的盒子，进一步包含可滑动地结合至腔体的门，用于覆盖注入口盖。

8.如权利要求1所述的盒子，进一步包含连接至检测室的微阵列。

9.如权利要求8所述的盒子，进一步包含可滑动地结合至腔体的检测器门，用于覆盖微阵列。

10.一种盒子，包含：

a) 基本封闭的腔体；

b) 可在腔体内垂直和水平移动的吸液管支架；

c) 连接至吸液管支架的吸液管；

d) 在腔体底座上的至少一个室；

e) 可旋转地连接至腔体的凸轮杆，其中所述凸轮杆的旋转使吸液管移入及移出室；

可旋转地连接至腔体的丝杆，其中所述丝杆的旋转使吸液管支架在所述基本封闭的腔体内移动；以及

f) 吸液管泵组件，其中所述泵组件的激活在吸液管内产生真空。

11.如权利要求10所述的盒子，进一步包含将吸液管组件与吸液管相连的管子。

12.如权利要求11所述的盒子，其特征在于，所述管子进一步包含螺旋套。

13.如权利要求10所述的盒子，进一步包含位于外壳内的注入口。

14.如权利要求13所述的盒子，进一步包含注入口盖。

15.如权利要求14所述的盒子，进一步包含可滑动地结合至外壳的门，用于覆盖注入口盖。

16.一种盒子，包含：

a) 外壳；

b) 吸液管支架；

c) 位于吸液管支架内的吸液管；

d) 至少一个室；以及

e) 控制吸液管和吸液管支架在外壳内水平及垂直位移使吸液管进入室的工具。

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