CN102481354A

CN102481354A - 肺炎球菌RrgB分化枝的组合物

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Publication number: CN102481354A
Application number: CN2010800310544A
Authority: CN
Inventors: V·马西格纳尼; M·A·巴罗基; M·莫斯切奥尼; P·鲁格洛
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2009-06-01
Filing date: 2010-06-01
Publication date: 2012-05-30
Also published as: ZA201109046B; CA2764022A1; AU2010255356A1; EP2437777A1; WO2010140119A1; US20110020385A1; CO6470864A2; RU2011154363A; ES2531115T3; JP2015227376A; MX2011012854A; BRPI1011857A2; SG176285A1; KR20120035168A; IL216696A0; US8609106B2; JP6008741B2; JP2012528848A; US20120076814A1; EP2437777B1

Abstract

肺炎球菌菌毛亚基RrgB具有至少3种分化枝。针对给定分化枝的血清对表达该RrgB分化枝的肺炎双球菌有活性，但对表达另外2种分化枝之一的菌株无活性，即存在分化枝内交叉保护，但没有分化枝间交叉保护。因此，免疫原性组合物可包括至少2种不同RrgB分化枝以改善针对含菌毛肺炎双球菌的菌株覆盖率。所述多种分化枝可作为单独多肽存在于免疫原性组合物中或可作为单一多肽链融合。

Description

肺炎球菌RrgB分化枝的组合物

技术领域

本发明涉及针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌(pneumococcus))的免疫领域。

发明背景

肺炎链球菌(S.pneumoniae)具有称为菌毛-1的菌毛，其由14kb岛(P1-1)编码，具有以下7个编码基因：R1rA转录调控因子、含LPXTG型细胞壁分选信号的3种菌毛亚基、参与菌毛聚合物合成和掺入辅助菌毛成分的3种分选酶。RrgB是形成所述结构骨架的主要亚基，而另2个菌毛蛋白(RrgA、RrgC)是辅助结构蛋白[1-4]。RrgA是主要的菌毛-1粘附素；缺乏RrgA的细菌对上皮细胞的粘附低于野生型生物。

发明概述

本发明涉及免疫原性组合物，其包括以下物质中至少两种：

(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：1具有至少90％序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO：1的至少7个连续氨基酸的片段组成；

(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少90％序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO：2的至少7个连续氨基酸的片段组成；和/或

(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少90％序列相同性和/或(ii)由来自SEQID NO：3的至少7个连续氨基酸的片段组成。

本发明还涉及包括以下至少两种的多肽：

(a)第一氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：1具有至少90％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO：1的至少7个连续氨基酸的片段组成；

(b)第二氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少90％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO：2的至少7个连续氨基酸的片段组成；和/或

(c)第三氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少90％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO：3的至少7个连续氨基酸的片段组成。

本发明还涉及含有以下氨基酸序列的多肽：

A-{-X-L-}_n-B

其中各X是如权利要求1定义的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N末端氨基酸序列；B是可选的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整数。可选地，所述多肽含有如权利要求1定义的第一、第二和第三多肽中的至少2种。

在具体实施方式中，本发明的多肽含有选自SEQ ID NO：11、13、15、17、19和21的氨基酸序列。

本发明也涉及表达以下至少两种的细菌：

附图简要说明

图1显示用5个RrgB嵌合体和对照的细菌研究结果。图为CFU/ml。各标记显示单个小鼠的数据。

图2显示用5个RrgB嵌合体和对照的死亡率研究结果。图为存活天数。各标记显示单个小鼠的数据。

图3显示有4条泳道的凝胶。所述泳道从左至右含有：分子量标记物；I-II-III嵌合体；I-II-III嵌合体；BSA标准。箭头指示214kDa的分子量。

图4显示被动保护数据，使用针对TIGR4RrgB的4种mAb，或盐水对照。Y轴显示24小时菌血症的CFU/ml。图4B显示用4种针对TIGR4RrgB的mAb的死亡率研究结果。

图5和6显示使用针对TIGR4序列(图5)或6B序列(图6)的mAb的蛋白质印迹。泳道从左至右为：标记物；RrgB I-II-III；RrgB II-I-III；RrgBII-III-I；RrgB III-I-II；RrgB III-II-I；RrgB TIGR4；RrgB 6B；RrgB 23F；BSA对照。

图7显示用铝佐剂I-II-III嵌合体、III-II-I嵌合体、TIGR4或单用铝免疫后的(A)菌血症和(B)死亡率数据。图7A中数据为CFU/ml而图7B中数据为存活天数。

图8显示针对TIGR4菌株的OPKA结果，显示随血清稀释变化的OPKA杀伤％。菱形表示阳性对照血清；实心方格是预免疫血清，近x轴可见；另5条线是针对5种嵌合体的血清。

图9显示基于SEQ ID NO：1-3和85-96相同性％的树形。标记是SEQID。

图10显示针对肺炎链球菌血清型6B的OPKA结果，显示随血清稀释变化的杀伤％。

图11显示针对肺炎链球菌血清型6B的OPKA结果，显示随稀释至多1/131220的血清稀释变化的杀伤％。

图12显示用III-II-I嵌合体以不同剂量免疫后的(A)菌血症和(B)死亡率数据。图12A中数据为CFU/ml而图12B中数据为存活天数。

图13显示用20μg RrgB III-II-I嵌合体免疫后的(A)菌血症和(B)死亡率数据。图13A中数据为CFU/ml而图13B中数据为存活天数。

图14表明用MF59佐剂的III-II-I RrgB嵌合体具有保护性。菱形表示有佐剂的RrgB嵌合体，圆圈表示单独的MF59佐剂。

图15显示用RrgB III-II-I嵌合体皮下免疫后的(A)菌血症和(B)死亡率数据。图15A中数据为CFU/ml而图15B中数据为存活天数。

图16显示24小时菌血症试验中，与正常兔血清(NRS)对照相比，RrgB III-II-I嵌合体在被动保护研究中引起功能性抗体生成。

图17显示针对(A)TIGR4和(B)ST35B的OPKA结果，显示随血清稀释变化的杀伤％。菱形表示抗T4，圆圈表示RrgB III-II-I嵌合体，正方形表示NSK。

图18显示针对TIGR4菌株的OPKA结果，表明OPA活性由抗RrgBIII-II-I嵌合体的抗体特异性引起。

图19显示单一RrgB结构域赋予的体内保护。三角形表示RrgB嵌合体，菱形表示D1结构域，正方形表示D4结构域，圆圈表示铝。

图20是不同RrgB结构域(单一结构域D1、D2、D3和D4，多个结构域片段D1-3、D2-4、D3-4)的蛋白质印迹分析，测试其与4种针对TIGR4RrgB的保护性mAb的结合。

图21显示用结合于经胰蛋白酶消化RrgB的单克隆抗体23F8/C10进行的蛋白质印迹分析。

图22(A)是RrgB结构域D1氨基酸序列在化脓性链球菌(S.pyogenese)菌毛骨架Spy0128结构域1晶体结构上的模型。(B)是肺炎链球菌RrgB晶体结构(D2-D3)和模型D1结构域。(C)是肺炎链球菌菌毛的3D重建电子密度图。

图23显示用RrgB III-II-I嵌合体结合其他多肽抗原不同组合(20μg抗原)进行腹膜内免疫后针对6B-芬兰菌株(静脉攻击)的(A)48小时菌血症和(B)死亡率数据。图23A中数据为CFU/ml而图23B中数据为存活天数。(A)和(B)中：第1列显示spr0057、spr0096和spr2021的组合；第2列显示SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第3列显示RrgB III-II-I嵌合体；第4列显示RrgB III-II-I嵌合体与spr0057、spr0096和spr2021的组合；第5列显示RrgB III-II-I嵌合体与SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第6列显示铝对照。

图24显示用RrgB III-II-I嵌合体结合其他多肽抗原不同组合(20μg抗原)进行腹膜内免疫后针对35B-SME15菌株(静脉攻击)的(A)48小时菌血症和(B)死亡率数据。图24A中数据为CFU/ml而图24B中数据为存活天数。(A)和(B)中：第1列显示spr0057、spr0096和spr2021的组合；第2列显示SP2216-1、SP 1732-3和PsaA的组合；第3列显示RrgB III-II-I嵌合体；第4列显示RrgB III-II-I嵌合体与spr0057、spr0096和spr2021的组合；第5列显示RrgB III-II-I嵌合体与SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第6列显示铝对照。

图25显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签III-II-I嵌合体和铝对照的(A)24小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR42.1E+02CFU/小鼠进行腹膜内攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图26显示在BALB/c小鼠中用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体的24小时菌血症试验，与以下作比较：(i)无标签III-II-I嵌合体，(ii)spr0057、spr0096和spr2021的组合，(iii)spr0057、spr0096和spr2021的组合，进一步联合无标签III-II-I嵌合体和(iv)铝对照(腹膜内免疫，用TIGR41.6E+02CFU/小鼠进行腹膜内攻击)。

图27显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签III-II-I嵌合体和铝对照的(A)48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用35B-SME154.6E+07CFU/小鼠进行静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图28显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签III-II-I嵌合体和铝对照的(A)48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用6B芬兰129.4E+07CFU/小鼠进行静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图29显示用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体相较无标签III-II-I嵌合体和铝对照的(A)48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR46.3E+05CFU/小鼠进行静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图30显示用20μg III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A)48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR4静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图31显示用20μg III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A)24小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR4腹膜内攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图32显示用20μg III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A)24小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用35B-SME15静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图33显示用20μg III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A)24小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用6B芬兰12静脉攻击)。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图34显示用III-II-I嵌合体相较铝对照免疫后的(A)48小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR4静脉攻击)，用过量表达菌毛的TIGR4菌株(T4+)攻击与菌毛表达量很低的TIGR4菌株(T4-)作比较。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图35显示用II-I-III和III-II-I嵌合体免疫后的48小时菌血症试验，其中(A)用过量表达菌毛的6B芬兰12菌株攻击(腹膜内免疫，用过量表达菌毛的6B芬兰127.0E+09CFU/小鼠进行静脉攻击)和(B)用菌毛表达量很低的6B芬兰12菌株攻击(腹膜内免疫，用菌毛表达不足的6B芬兰127.3E+09CFU/小鼠进行静脉攻击)。(A)和(B)都显示以下的数据：spr0057、spr0096和spr2021的组合；6B芬兰-CRM197偶联物；和铝。(A)中数据为CFU/ml而(B)中数据为存活天数。

图36是MLST数据库的计算机模拟分析，显示急性中耳炎肺炎链球菌分离物集合，相较易受抗生素影响的菌株，菌毛-1在耐受抗生素(红霉素耐受、青霉素耐受和多药耐受)的菌株中更普遍。

发明详述

RrgB菌毛亚基具有至少3个分化枝。所述3个分化枝的参比氨基酸是本文的SEQ ID NO：1、2和3。所述分化枝在其N和C末端较好保守，但在中间偏离。SEQ ID NO：1和2有46％的相同性；SEQ ID NO：1和3有51％的相同性；SEQ ID NO：2和3有65％的相同性。

已发现针对给定RrgB分化枝的血清对表达该分化枝的肺炎双球菌(pneumococci)有活性，但对表达另外2种分化枝之一的菌株无活性，即存在分化枝内交叉保护，但没有分化枝间交叉保护。因此，根据本发明，免疫原性组合物包括至少2种不同RrgB分化枝。这些可能以单独多肽形式存在于免疫原性组合物中，或可融合为单一多肽链。将多个RrgB分化枝纳为疫苗成分改善免疫原性组合物抵御含菌毛肺炎双球菌的菌株覆盖率。此外，观察到在菌毛-1存在和抗生素耐受间存在显著相关性；此发现提示用含多个RrgB分化枝的免疫原性组合物免疫会具有抵御耐受抗生素处理的肺炎双球菌的额外优势。

因此，本发明提供免疫原性组合物，其包括以下至少2种：

(a)含第一氨基酸序列的第一多肽，其中所述第一氨基酸序列包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：1具有至少a％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ IDNO：1的至少x个连续氨基酸的片段组成；

(b)含第二氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二氨基酸序列包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少b％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ IDNO：2的至少y个连续氨基酸的片段组成；和/或

(c)含第三氨基酸序列的第三多肽，其中所述第三氨基酸序列包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少c％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ IDNO：3的至少z个连续氨基酸的片段组成。

本发明还提供包括以下至少两种的多肽：

(a)第一氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：1具有至少a％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段组成；

(b)第二氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2具有至少b％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段组成；和/或

(c)第三氨基酸序列，其包括的氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：3具有至少c％序列相同性和/或(ii)由来自SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段组成。

本发明还提供含有以下氨基酸序列的多肽：

A-{-X-L-}_n-B

其中：X是如上定义的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N末端氨基酸序列；B是可选的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整数(例如2、3、4、5、6等)。可选地，所述多肽含有如权利要求1定义的第一、第二和第三多肽中的至少2种。通常，n是2或3，X部分选自下列：

N	X₁	X₂	X₃
				2	第一氨基酸序列	第二氨基酸序列
2	第二氨基酸序列	第一氨基酸序列
				3	第一氨基酸序列	第二氨基酸序列	第三氨基酸序列
3	第一氨基酸序列	第三氨基酸序列	第二氨基酸序列
				3	第二氨基酸序列	第三氨基酸序列	第一氨基酸序列
3	第二氨基酸序列	第一氨基酸序列	第三氨基酸序列
				3	第三氨基酸序列	第二氨基酸序列	第一氨基酸序列
3	第三氨基酸序列	第一氨基酸序列	第二氨基酸序列

本发明也提供表达以下至少两种的细胞(通常为细菌，如肺炎球菌)：

第一、第二和第三氨基酸序列

a的值至少为75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。b的值至少为75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。c的值至少为75，例如80、85、90、92、94、95、96、97、98、99或更大。a、b和c的值可以相同或不同。在一些实施方式中，a、b和c相同。通常，a、b和c为至少90，例如至少95。

x的值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。y的值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。z的值至少为7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250)。x、y和z的值可以相同或不同。在一些实施方式中，x、y和z相同。

片段优选包括来自各SEQ ID NO：序列的表位。其他有用的片段缺少来自各SEQ ID NO：的C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留其至少一个表位。在N末端截断20-25个氨基酸较方便，例如取出任意SEQ IDNO：1-3的氨基酸1-23(或SEQ ID NO：85-96中任意一种)。

RrgB蛋白可在其前导肽和LPXTG锚之间分成4个结构域(D1到D4)。这4个结构域在SEQ ID NO：1-3中如下，其他RrgB序列中对应于这些残基的位置易通过比对鉴定：

	D1	D2	D3	D4
					1	31-184	185-326	327-446	447-627
2	31-185	186-318	319-434	435-606
					3	31-184	185-319	320-445	446-616

基于被动保护研究，有用的RrgB片段可保留来自至少D1和/或D4结构域的表位。如图20所示，产生结合结构域D1、结构域D4和含结构域D2-D4的片段的抗体。因此，优选的片段包括结构域D1、结构域D4和含结构域D2-D4的片段。

SEQ ID NO：1的一个合适片段是SEQ ID NO：4。

SEQ ID NO：2的一个合适片段是SEQ ID NO：5。

SEQ ID NO：3的一个合适片段是SEQ ID NO：6。

来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段不应也存在于SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3内。类似地，来自SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段不应也存在于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3内。类似地，来自SEQID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段不应也存在于SEQ ID NO：1或SEQID NO：2内。因此，在一些实施方式中，SEQ ID NO：1的片段优选来自SEQID NO：1的氨基酸31-614；SEQ ID NO：2的片段优选来自SEQ ID NO：2的氨基酸31-593；SEQ ID NO：3的片段优选来自SEQ ID NO：3的氨基酸31-603。来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段也可存在于SEQID NO：85、88和/或89中任意一种。类似地，来自SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段也可存在于SEQ ID NO：86、90、91、94和/或96中任意一种。类似地，来自SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段也可存在于SEQ ID NO：87、92、93和/或95中任意一种。在一些实施方式中，来自SEQ ID NO：1-3之一的片段作为连续序列与另2种SEQ ID NO进行比对，所述片段与另2种SEQ ID NO间的相同性各小于75％，例如小于60％、小于50％、小于40％、小于30％。

基于表位图研究，鉴定了SEQ ID NO：1残基32和141间的SEQ ID NO：1表位，更具体在SEQ ID NO：1的残基55和89间。因此，有用的SEQ ID NO：1片段包括SEQ ID NO：1的残基32-141和SEQ ID NO：1的残基55-89。

将含所述第一氨基酸序列的多肽给予对象时会引起抗体反应，所述抗体反应包括与具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型肺炎球菌蛋白(菌株TIGR4)结合的抗体。在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的野生型肺炎球菌蛋白或具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的野生型肺炎球菌蛋白。

将含所述第二氨基酸序列的多肽给予对象时会引起抗体反应，所述抗体反应包括与具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的野生型肺炎球菌蛋白(菌株芬兰^6B-12)结合的抗体。在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型肺炎球菌蛋白或具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的野生型肺炎球菌蛋白。

将含所述第三氨基酸序列的多肽给予对象时会引起抗体反应，所述抗体反应包括与具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的野生型肺炎球菌蛋白(菌株台湾^23F-15)结合的抗体。在一些实施方式中，这些抗体不结合具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的野生型肺炎球菌蛋白或具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的野生型肺炎球菌蛋白。

尽管第一、第二和第三氨基酸序列具有一些共同的序列，总体上它们有不同的氨基酸序列。

本发明仅使用2种RrgB分化枝时，组合物或多肽可包括以下2种：(a)如上定义的第一氨基酸序列；和(b)如上定义的第二氨基酸序列。在另一实施方式中，所述组合物包括以下2种：(a)如上定义的第一氨基酸序列；和(b)如上定义的第三氨基酸序列。在另一实施方式中，所述组合物包括以下2种：(a)如上定义的第二氨基酸序列；和(b)如上定义的第三氨基酸序列。

本发明使用的氨基酸序列与SEQ ID NO：1、2或3相比，可包括一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)保守性氨基酸取代，即一个氨基酸被具有相关侧链的另一氨基酸取代。基因编码的氨基酸一般分成4个家族：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时一起分类为芳族氨基酸。一般，这些家族内的单个氨基酸置换对生物活性没有重大作用。所述多肽可相对参比序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)单氨基酸缺失。所述多肽也可相对参比序列具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)插入(例如各1、2、3、4或5个氨基酸)。

本发明所用多肽可包括的氨基酸序列为：

(a)与SEQ ID NO：1、2或3相同(即100％相同)；

(b)与SEQ ID NO：1、2或3具有序列相同性；

(c)相较序列(a)或(b)，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多)单一氨基酸改变(缺失、插入、置换)，所述改变可处于分开的位置或可以连续。

(d)使用逐对比对算法对齐SEQ ID NO：1、2或3时，从N末端到C末端各x个氨基酸的移动窗口(从而对于延伸至p个氨基酸的比对时有p-x+1个这类窗口，其中p＞x)具有至少xy个相同的对齐氨基酸。其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；如果xy不是整数，则舍入成最接近的整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[5]，使用默认参数(例如缺口开放罚分＝10.0，缺口延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)。

此算法可方便地由EMBOSS包[6]的needle工具执行。

(c)组中，缺失或置换可以在N末端和/或C末端，或可以在这2个末端之间。因此，截断是缺失的一个示例。截断可包括在N末端和/或C末端缺失多达40个(或更多)氨基酸。

一般，当本发明的多肽所含序列与来自SEQ ID NO：1-3的完整肺炎球菌序列不同时(例如当它包括的序列表与其序列相同性＜100％时，或当它包括其片段时)，各单独情况中优选能引发识别该完整肺炎球菌序列的抗体的多肽。

为了参考，SEQ ID NO：1-3和85-96是在45个不同菌株中鉴定的15个独特RrgB序列。任意这些序列能用于完成本发明。因此，例如，本发明使用的第一多肽可包括下组(1)所列的任意一种SEQ ID NO；本发明使用的第二多肽可包括下组(2)所列的任意一种SEQ ID NO；本发明使用的第三多肽可包括下组(3)所列的任意一种SEQ ID NO。组(1)-(3)如下：

(1)SEQ ID NO：1、85、88、89

(2)SEQ ID NO：2、86、90、91、94、96

(3)SEQ ID NO：3、87、92、93、95

杂合多肽

本发明所用不同RrgB分化枝不必作为单独多肽存在，但可表达为单一多肽链(‘杂合’多肽或‘嵌合体’)。杂合多肽提供2个主要优势：首先，不稳定或自身表达弱的多肽可通过加入合适杂交伴侣加以协助来克服该问题；第二，商业生产得以简化，因为仅需使用一次表达和纯化以生成2种抗原上有效的多肽。

杂合多肽可包括仅来自RrgB抗原的序列，但在其他实施方式中可包括非RrgB抗原(通常为肺炎球菌非RrgB抗原)，如其他菌毛亚基。如果存在非RrgB抗原，它们可位于任意2种RrgB序列的N末端，或任意2种RrgB序列的C末端，或可在2种RrgB序列之间。

不同的杂合多肽可在单一制剂中混合一起。杂合体可与非杂交RrgB抗原或其他非RrgB抗原联用。

杂合多肽可表示为式NH ₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH。

如果-X-部分在其野生型中有前导肽序列，可在杂合蛋白中纳入或省略该序列。在一些实施方式中，可删去除位于该杂合蛋白N末端-X-部分的前导肽以外的前导肽，即保留X₁的前导肽，但省略X₂...X_n的前导肽。这相当于删去所有前导肽而用X₁的前导肽作为-A-部分。

对于各n情况下的{-X-L-}，接头氨基酸序列-L-可存在或缺失。例如，n＝2时，所述杂合体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等。接头氨基酸序列-L-通常较短(例如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。示例包括促进克隆的短肽序列、多甘氨酸接头(即包括Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)、组氨酸标签(即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其他合适的接头氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。一个有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：7)或GSGSGGGG(SEQ ID NO：8)，Gly-Ser二肽形成自BamHI限制性位点，因此有助于克隆和操作，(Gly)₄四肽是典型的多甘氨酸接头。特定用作最终L_n的其它合适接头是Leu-Glu二肽或Gly-Ser。接头通常含有至少一个甘氨酸残基以促进结构挠性，例如-L-部分可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多甘氨酸残基。可排列这些甘氨酸以将至少2个连续甘氨酸纳入Gly-Gly二肽序列或更长的寡Gly序列即Gly_n，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。

-A-是可选的N末端氨基酸序列。它通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。示例包括指导蛋白质运输的前导序列，或促进克隆或纯化的短肽序列(例如组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其他合适的N末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。如果X₁缺乏其自身N末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，例如Met-Ala-Ser，或单个Met残基。在一个新生多肽中，-A-部分可提供多肽的N末端甲硫氨酸(细菌中为甲酰甲硫氨酸，fMet)。然而，可从新生-A-部分的N末端切割一个或多个氨基酸，从而本发明成熟多肽的-A-部分不必需包括N末端甲硫氨酸。

-B-是可选的C末端氨基酸序列。它通常较短(例如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸)。示例包括指导蛋白质运输的前导序列，或促进克隆或纯化的短肽序列(例如包括组氨酸标签，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大，如SEQ ID NO：9)，或提高蛋白稳定性的序列。其他合适的C末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见，如谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、金黄色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A的14kDa片段、生物素化肽、麦芽糖结合蛋白、肠激酶标签等。

优选-A-、-B-和-L-序列不包括与人多肽序列共有10个或更多连续氨基酸的序列。

在一些实施方式中，-L-部分包括非RrgB抗原。在一些实施方式中，-A-部分包括非RrgB抗原，在一些实施方式中，-B-部分包括非RrgB抗原。

本发明也提供编码本发明杂合多肽的核酸。

在各种A、B、X和L部分中，有用的组合包括但不限于：

*数字表示SEQ ID NO：

本发明的杂合体示例所含多肽包括选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：11(由SEQ ID NO：12编码)；SEQ ID NO：13(由SEQ ID NO：14编码)；SEQ ID NO：15(由SEQ ID NO：16编码)；SEQ ID NO：17(由SEQ ID NO：18编码)；SEQ ID NO：19(由SEQ ID NO：20编码)；SEQ ID NO：21(由SEQID NO：22编码)。

本发明提供的多肽含有与SEQ ID NO：11、13、15、17、19或21中任意一种序列相同性至少为i％的氨基酸序列。i的值可选自50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或更大。

多肽

本发明使用的多肽可以多种方法制备，例如通过化学合成(全部或部分)、用蛋白酶消化更长的多肽、从RNA翻译、从细胞培养物(例如来自重组表达)或从生物本身(例如在细菌培养后，或直接来自患者)纯化等。生成长度＜40个氨基酸的肽的优选方法涉及体外化学合成[7，8]。特别优选固相肽合成，如基于tBoc或Fmoc[9]化学的方法。也可部分或全部使用酶合成[10]。作为化学合成的替代方法，可使用生物合成，例如可通过翻译生成多肽。这可在体外或体内完成。生物方法一般限于以L氨基酸为基础的多肽合成，但翻译机制(例如氨酰基tRNA分子)的操作能用于引入D氨基酸(或其他非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮高丙氨酸等)[11]。然而，当包括D氨基酸时，优选使用化学合成。多肽可在C末端和/或N末端具有共价修饰。

多肽可采用各种形式(例如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂质化、非脂质化、磷酸化、非磷酸化、豆蔻酰化、非豆蔻酰化、单体、多聚体、微粒、变性等)。

多肽优选以纯化或基本纯化形式提供，即基本不含其他多肽(例如没有天然产生的多肽)，特别是没有其他肺炎球菌或宿主细胞多肽，且一般至少约50％纯(重量)，通常至少约90％纯，即组合物的小于约50％且更优选小于约10％(例如5％或更少)由其他表达多肽组成。

多肽可结合于固体支持物。多肽能包括可检测标记(例如放射性或荧光标记，或生物素标记)。

术语“多肽”指任意长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或分支，其可包括修饰的氨基酸，可被非氨基酸中断。此术语也涵盖天然或经介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作或修饰，如与标记成分偶联。所述定义也包括例如含一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及其他本领域已知修饰。多肽可作为单链或相连链存在。多肽可以是天然或非天然糖基化(即多肽具有的糖基化模式与对应的天然产生多肽中发现的糖基化模式不同)。

本发明提供生成本发明多肽的方法，包括在诱导多肽表达的条件下培养本发明的宿主细胞。尽管多肽表达可在链球菌(Streptococcus)中发生，本发明通常使用异源宿主用于表达。所述异源宿主可以是原核(例如细菌)或真核的。它通常是大肠杆菌(E.coli)，但其他合适宿主包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、乳糖奈瑟球菌(Neisserialactamica)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis))、酵母等。

本发明也提供生成本发明多肽的方法，其中所述多肽部分或全部用化学方法合成。

本发明也提供含两种或更多本发明多肽的组合物。

核酸

本发明也提供含编码本发明杂合多肽的核苷酸序列的核酸。本发明还提供所含核苷酸序列与这类核苷酸序列有序列相同性的核酸。这些核酸包括用替代密码子编码同一氨基酸的核酸。

本发明也提供可与这些核酸杂交的核酸。杂交反应能在不同“严谨性”条件下进行。增加杂交反应严谨性的条件在本领域熟知且已发表。相关条件的示例包括(为了增加严谨性)：孵育温度为25℃、37℃、50℃、55℃和68℃；缓冲液浓度为10x SSC、6x SSC、1x SSC、0.1x SSC(其中SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐缓冲液)和其使用其他缓冲体系的等价物：甲酰胺浓度为0％、25％、50％和75％；孵育时间为5分钟-24小时；1、2次或更多洗涤步骤；洗涤孵育时间为1、2或15分钟；洗液为6x SSC、1xSSC、0.1x SSC、或去离子水。杂交技术及其优化在本领域熟知[例如参见参考文献12和239等]。

本发明包括所含序列与这些序列互补的核酸(例如用于反义或探针，或用作引物)。

根据本发明所述的核酸可采用不同形式(例如单链、双链、载体、引物、探针、带标记等)。本发明的核酸可以是环状或分支，但一般为线性。除非另有说明或要求，本发明的任何实施方式采用的核酸可使用双链形式和形成所述双链形式的2种互补单链形式中的每一种。引物和探针一般为单链，反义核酸也为单链。

本发明的核酸优选以纯化或基本纯化形式提供，即基本不含其他核酸(例如没有天然产生的核酸)，特别是没有其他肺炎球菌或宿主细胞核酸，一般至少约50％纯(重量)，通常至少约90％纯。本发明的核酸优选是肺炎球菌核酸。

本发明的核酸可以多种方法制备，例如通过全部或部分化学合成(例如亚磷酰胺合成DNA)、用核酸酶(例如限制性酶)消化更长的核酸、连接较短的核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、来自基因组或cDNA库等。

本发明的核酸可结合于固体支持物(例如珠、板、滤器、薄膜、玻片、微阵列支持物、树脂等)。本发明的核酸可带标记，例如用放射性或荧光标记，或生物素标记。当核酸用于检测技术时这特别有用，例如当所述核酸是引物或探针时。

术语“核酸”包括一般意义上任何长度的核苷酸聚合形式，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和/或其类似物。它包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体。它也包括DNA或RNA类似物，如含有修饰主链(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸)或修饰碱基。因此，本发明包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、探针、引物等。本发明的核酸采用RNA形式时，它可具有或没有5’帽。

本发明的核酸可以是载体的一部分，即设计用于转导/转染一个或多个细胞类型的核酸构建物的一部分。载体可以是例如，设计用于分离、增殖和复制所插入核苷酸的“克隆载体”，设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的“表达载体”，设计用于引起重组病毒或病毒样颗粒生成的“病毒载体”，或包括一种以上载体属性的“穿梭载体”。“宿主细胞”包括单独细胞或细胞培养物，其可以是或已经是外源核酸的受体。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，由于天然、偶然或人为突变和/或改变，所述子代不必与初始亲代细胞完全相同(在形态或总DNA互补上)。宿主细胞包括用本发明核酸体内或体外转染或感染的细胞。

核酸是DNA时，应理解RNA序列中的“U”可由DNA中的“T”取代。类似地，核酸是RNA时，应理解DNA序列中的“T”可由RNA中的“U”取代。

术语“互补”或“互补性”用于核酸时，指沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对。因此，C的互补物是G，G的互补物是C，A的互补物是T(或U)，T(或U)的互补物是A。例如，也可用碱基如I(肌苷嘌呤)互补嘧啶(C或T)。

本发明的核酸可用于例如：体外或体内生成多肽；作为杂交探针用于检测生物样品中的核酸；产生额外的核酸拷贝；生成核酶或反义寡核苷酸；作为单链DNA引物或探针；或作为三链形成寡核苷酸。

本发明提供生成本发明核酸的方法，其中所述核酸全部或部分用化学方法合成。

本发明提供含本发明核苷酸序列的载体(例如克隆或表达载体)和用这类载体转化的宿主细胞。

免疫原性组合物

本发明的混合物和杂合多肽用作免疫原性组合物中的活性成分。这类免疫原性组合物可用作疫苗。这些疫苗可以是预防性(即用于防止感染)或治疗性(即用于治疗感染)，但通常是预防性。

因此，组合物可以是药学上可接受的。它们通常包括抗原以外的成分，例如其常包括一种或多种药物运载体和/或赋形剂。关于这类成分的详尽讨论参见参考文献234。

组合物一般以水性形式给予哺乳动物。然而，所述组合物在给予前可以是非水性形式。例如，尽管一些疫苗以水性形式生产，随后的填装、配送和给予也是水性形式，其他疫苗在生产期间冻干并在使用时复溶成水性形式。因此，本发明的组合物可以干燥的，如冻干制剂。

所述组合物可包括防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，优选疫苗应基本不含(即小于5μg/ml)汞物质，例如没有硫柳汞。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。

为控制张力，优选包括生理盐水，如生理性盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以1-20mg/ml存在，例如约10±2mg/ml NaCl。其他可存在的盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。

组合物的渗透压一般为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选240-360mOsm/kg，更优选290-310mOsm/kg。

组合物可包括一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是具有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂通常在5-20mM范围内。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或7.0-7.8。

所述组合物优选无菌。所述组合物优选无热原，例如含＜1EU(内毒素单位，标准测量)/剂，优选＜0.1EU/剂。所述组合物优选不含谷蛋白。

所述组合物可包括用于单次免疫的材料，或可包括用于多次免疫的材料(即‘多剂量’药盒)。在多剂量配置中优选纳入防腐剂。作为在多剂量组合物中纳入防腐剂的替代(或补充)，所述组合物可纳入具有无菌接头以排出材料的容器。

人类疫苗通常以约0.5ml的剂量体积给予，尽管可给予儿童半剂(即约0.25ml)。

本发明的免疫原性组合物也可包括一种或多种免疫调节剂。一种或多种免疫调节剂优选包括一种或多种佐剂，例如2、3、4种或更多佐剂。所述佐剂可包括下文详述的TH1佐剂和/或TH2佐剂。

可用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：

A.含矿物质的组合物

适用作本发明佐剂的含矿物质组合物包括矿物盐，如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如参见参考文献13的第8与9章]、或不同无机化合物的混合物，具有任何适当形式的化合物(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附。含无机物的组合物也可制成金属盐颗粒。

称作“氢氧化铝”的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常是至少部分晶体。羟基氧化铝可由式AlO(OH)表示，可通过红外(IR)光谱法与其他铝化合物如氢氧化铝Al(OH)₃区分，具体是通过1070cm^-1处的吸收带和3090-3100cm^-1处的强肩的存在[参考文献13的第9章]。半高衍射带宽(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，弱晶体颗粒由于晶体尺寸较小而显示更大的谱线加宽。表面积随着WHH增加而增加，发现具有较高WHH值的佐剂对抗原吸附力更大。纤维形态(例如在透射电子显微图上所见)对于氢氧化铝佐剂是典型的。氢氧化铝佐剂的pI通常约为11，即佐剂本身在生理pH带正表面电荷。已报道氢氧化铝佐剂在pH7.4的吸附力为1.8-2.6mg蛋白/mg Al⁺⁺⁺。

称为“磷酸铝”的佐剂一般是羟基磷酸铝，通常也含有少量硫酸盐(即羟基磷酸铝硫酸盐)。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响盐中磷酸根对羟基的取代程度。羟基磷酸盐的PO₄/Al摩尔比通常为0.3-1.2。可通过是否存在羟基来区分羟基磷酸盐和严格的AlPO₄。例如，3164cm^-1处的IR谱带(例如当加热至200℃时)表明结构羟基的存在[参考文献13的第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常为0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95±0.1。磷酸铝一般无定形，特别是羟基磷酸盐。典型的佐剂是无定形羟基磷酸铝，PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92，以0.6mg Al³⁺/ml纳入。此磷酸铝通常是微粒(例如透射电子显微图中所见的板样形态)。抗原吸附后，颗粒的典型直径为0.5-20μm(例如约5-10μm)。已报道磷酸铝佐剂在pH7.4的吸附力为0.7-1.5mg蛋白/mg Al⁺⁺⁺。

磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根对羟基的取代程度负相关，该取代程度可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。PZC也可通过改变溶液中游离磷酸根离子浓度(更多磷酸根，更酸性的PZC)或通过加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC更为碱性)来改变。根据本发明使用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选5.0-6.5，例如约5.7。

用于制备本发明组合物的铝盐悬液可包含缓冲液(例如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)，但这不总是必需的。所述悬液优选无菌且无热原。悬液可包括游离的水性磷酸根离子，例如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。所述悬液也可包括氯化钠。

在一个实施方式中，佐剂成分可包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在此情况中，磷酸铝可多于氢氧化铝，例如重量比为至少2∶1，例如≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选的范围为0.3-1mg/ml。优选最大＜0.85mg/剂。

B.油乳液

适用作本发明佐剂的油乳液组合物包括鲨烯-水乳液，如MF59[参考文献13的第10章；也参见参考文献14](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，用微流化床制成亚微米颗粒)。也可使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

已知各种合适的水包油乳液，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂可生物降解(可代谢)和生物相容。乳液中的油滴直径一般小于5μm，优选乳液包括亚微米直径的油滴，这些小尺寸可用微流化床获得以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

本发明可使用的油诸如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。也可使用获自例如霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适材料制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，它们不是种籽油中天然产生的。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。由动物来源获得纯油必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程在本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鲸油是可以用于本文的多种鱼油的代表例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。其它优选油是生育酚(见下)。特定优选包含鲨烯的水包油乳液。可以使用油的混合物。

表面活性剂可以通过其HLB(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAX^TM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，吐温80等去污剂可有助于下文实施例所述的热稳定性。

可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂的用量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特定是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特定是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特定是0.1-1％或约0.5％。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[15-17]，参考文献18的第10章和参考文献19的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，随后使该混合物微流体化来制备这一类乳液。所得乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。

·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。

·含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸盐)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸盐)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。

·鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克^TM L121”)的乳液。可以用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制所述乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂[20](0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂[21](5％鲨烯、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。

·含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[22]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基多糖苷。这类乳液可冻干。

·含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献23所述，优选的磷脂成分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献24所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[25]。

·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[25]。

·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)联成螺旋胶束的乳液[26]。

通常在传递给患者时混合组合物中的抗原和佐剂。可以在生产期间或在递送时临时将该乳液与抗原混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。所述抗原通常是水性形式，以便最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。

C.皂苷制剂[参考文献13的第22章]

皂苷制剂也可用作本发明的佐剂。皂苷是在广泛植物物种的树皮、叶、茎、根和甚至花中发现的固醇糖苷和三萜糖苷的异质组。来自皂皮树(Quilaja saponaria)树皮的皂苷被广泛作为佐剂研究。皂苷也可商业获取自墨西哥菝葜(Smilax ornata)(菝契)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以Stimulon^TM市售。

皂苷组合物用HPLC和RP-HPLC纯化。用这些技术鉴定了特定纯化部分，其包括QS7、QS17、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选是QS21。参考文献27公开了QS21的生成方法。皂苷制剂也包括固醇，如胆固醇[28]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合体(ISCOM)的独特颗粒[参考文献13的第23章]。ISCOM通常也包括磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知皂苷可用于ISCOM。ISCOM优选包括QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。ISCOM进一步描述于参考文献28-30。可选地，ISCOM可以没有额外的去污剂[31]。

对基于皂苷的佐剂开发的综述参见参考文献32和33。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种来自病毒的蛋白，可选结合或用磷脂配制。它们一般是非致病、非复制的，通常不含有任何天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。适用于病毒体或VLP的这些病毒蛋白包括从流感病毒(如HA或NA)、乙肝病毒(如核心或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德毕斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺瓦克病毒、人乳头瘤病毒、HIV、RNA噬菌体、Qβ噬菌体(如外壳蛋白)、GA噬菌体、fr噬菌体、AP205噬菌体、和Ty(如逆转录转座子Ty蛋白p1)衍生的蛋白。参考文献34-39进一步讨论了VLP。例如，参考文献40进一步讨论了病毒体。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠杆菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激寡核苷酸和ADP核糖基化毒素和其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰MPL(3dMPL)。3dMPL是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。参考文献41公开了3-脱-O-酰化单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式。这种“小颗粒”3dMPL小到足以经0.22μm膜无菌过滤[41]。其他无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨烷基氨基葡糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529[42，43]。

脂质A衍生物包括来自大肠杆菌(Escherichia coli)如OM174的脂质A衍生物。例如，OM174描述于参考文献44和45。

适用作本发明佐剂的免疫刺激寡核苷酸包括含CpG基序(含未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列，通过磷酸键与鸟苷相连)的核苷酸序列。含回文或poly(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示为免疫刺激性。

CpG可包括核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸修饰，且可以是双链或单链。参考文献46、47和48公开了可能的类似物置换，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献49-54进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂效应。

CpG序列可针对TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT[55]。CpG序列可特定诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或其可更特定诱导B细胞反应，如CpG-B ODN。CpG-A和CpG-B ODN讨论于参考文献56-58。CpG优选是CpG-A ODN。

优选构建CpG寡核苷酸，使得5’末端易为受体识别。可选地，2种CpG寡核苷酸序列可在其3’末端结合以形成“免疫聚体”。参见例如参考文献55和59-61。

一种基于免疫刺激寡核苷酸的特别有用的佐剂称为IC-31^TM[62]。因此，本发明使用的佐剂可包括以下的混合物：(i)含至少一个(且优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连以形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含至少一个(且优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(例如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是含26聚体序列5’-(IC)₁₃-3’(SEQ ID NO：80)的脱氧核苷酸。所述聚阳离子聚合物可以是含11聚体氨基酸序列KLKLLLLKLK(SEQ ID NO：81)的肽。

细菌ADP核糖基化毒素和其脱毒衍生物可用作本发明的佐剂。所述蛋白优选衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱(“CT”)或百日咳(“PT”)。参考文献63描述了使用脱毒的ADP核糖基化毒素作为粘膜佐剂且参考文献64描述了使用其作为胃肠外佐剂。所述毒素或类毒素优选以全病毒形式，包括A和B亚基。A亚基优选包含脱毒突变；B亚基优选不突变。佐剂优选是脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。使用ADP核糖基化毒素和其脱毒衍生物，特定是LT-K63和LT-R72作为佐剂可参见参考文献65-72。一种有用的CT突变体是CT-E29H[73]。氨基酸置换的数字编号优选基于参考文献74所列ADP核糖基化毒素的A和B亚基比对，所述文献特别通过引用全文纳入本文。

F.人免疫调节剂

适用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[75]等)[76]、干扰素(例如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。

G.生物粘附剂和粘膜粘附剂

生物粘附剂和粘膜粘附剂也可用作本发明的佐剂。合适的生物粘附剂包括酯化透明质酸微球[77]或粘膜粘附剂如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素的交联衍生物。壳聚糖和其衍生物也可用作本发明的佐剂[78]。

H.微粒

微粒也可用作本发明的佐剂。微粒(即颗粒直径为～100nm-～150μm，更优选直径～200nm-～30μm，最优选直径～500nm-～10μm)由可生物降解和无毒性物质(例如聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选(丙交酯-乙交酯)共聚物，可选进行处理以具有带负电表面(例如用SDS)或带正电表面(例如用阳离子去污剂，如CTAB)。

I.脂质体(参考文献13的第13和14章)

适用作本发明佐剂的脂质体制品的示例描述于参考文献79-81。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[82]。这类制剂进一步包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇的组合[83]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种额外非离子型表面活性剂如辛苯聚醇的组合[84]。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂描述于例如参考文献85和86。

L.胞壁酰肽

适用作本发明佐剂的胞壁酰肽的示例包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。

M.咪唑喹诺酮化合物

适用作本发明佐剂的咪唑喹诺酮化合物的示例包括咪喹莫特和其同源物(例如“雷西莫特3M”)，如参考文献87和88进一步所述。

本发明也包括上述一种或多种佐剂方面的组合。例如，下列佐剂组合物可用于本发明：(1)皂苷和水包油乳液[89]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)[90]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(可选+固醇)[91]；(5)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合[92]；(6)SAF，其含有10％鲨烷、0.4％吐温80^TM、5％普流罗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化成亚微米乳液或振荡以产生较大颗粒尺寸乳液；(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)，(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种选自下组的细菌细胞壁成分：单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；(8)一种或多种矿物盐(如铝盐)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)。

参考文献13的第7章公开了其他用作免疫刺激剂的物质。

使用氢氧化铝和/或磷酸铝佐剂有效，特别是用于儿童，抗原通常吸附于这些盐。也优选水包鲨烯乳液，特别是用于年长者。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和铝或雷西莫特和铝。可使用磷酸铝和3dMPL的组合。

本发明的组合物可引起细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答。

通常认为2种T细胞即CD4和CD8细胞对于起始和/或增强细胞介导的免疫和体液免疫是必需的。CD8T细胞可表达CD8共受体且通常称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8T细胞能识别MHC I型分子展示的抗原或与之相互反应。

CD4T细胞可表达CD4共受体且通常称为T辅助细胞。CD4T细胞能识别结合MHC II型分子的抗原肽。与MHC II型分子相互作用时，CD4细胞可分泌因子如细胞因子。这些分泌的细胞因子能激活B细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞、和其他参与免疫应答的细胞。T辅助细胞或CD4+细胞可进一步分成2个功能上不同的亚组：TH1表型和TH2表型，其细胞因子和效应功能不同。

活化的TH1细胞增强细胞免疫(包括抗原特异性CTL生成的增加)并因而对响应胞内感染有特定价值。活化的TH1细胞可分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β中的一种或多种。TH1免疫应答可通过激活巨噬细胞、NK(自然杀伤)细胞和CD8细胞毒性T细胞(CTL)引起局部炎症反应。TH1免疫应答也可通过用IL-12刺激B和T细胞生长来扩大免疫应答。TH1刺激的B细胞可分泌IgG2a。

活化的TH2细胞提高抗体生成并因而对响应胞外感染有价值。活化的TH2细胞可分泌一种或多种IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。TH2免疫应答可引起IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成以用于未来的保护。

增强的免疫应答可包括增强的TH1免疫应答和TH2免疫应答中的一种或多种。

TH1免疫应答可包括CTL增加、与TH1免疫应答相关的一个或多个细胞因子增加(如IL-2、IFN-γ和TNF-β)、活化的巨噬细胞增加、NK活性增加、或IgG2a生成增加中的一种或多种。增强的TH1免疫应答优选包括IgG2a生成增加。

可用TH1佐剂引发TH1免疫应答。TH1佐剂通常引起IgG2a生成水平相对无佐剂的抗原免疫增加。适用于本发明的TH1佐剂可包括例如皂苷制剂、病毒体和病毒样颗粒、肠杆菌脂多糖(LPS)的无毒衍生物、免疫刺激寡核苷酸。免疫刺激寡核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸是用于本发明的优选TH1佐剂。

TH2免疫应答可包括与TH2免疫应答相关的一个或多个细胞因子增加(如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)，或IgG1、IgE、IgA和记忆B细胞生成增加中的一种或多种。增强的TH2免疫应答优选包括IgG1生成增加。

可用TH2佐剂引发TH2免疫应答。TH2佐剂通常引起IgG1生成水平相对无佐剂的抗原免疫增加。适用于本发明的TH2佐剂可包括例如含矿物的组合物、油乳液、ADP核糖基化毒素和其脱毒衍生物。含矿物的组合物如铝盐是用于本发明的优选TH2佐剂。

组合物可包括TH1佐剂和TH2佐剂的组合。这类佐剂优选引起增强的TH1和增强的TH2反应，即IgG1和IgG2a生成相对无佐剂的免疫都增加。更优选地，相对用单一佐剂的免疫(即相对用单独TH1佐剂免疫或用单独TH2佐剂免疫)，含TH1和TH2佐剂组合的组合物引起增强的TH1和/或增强的TH2免疫应答。

免疫应答可以是TH1免疫应答和TH2免疫应答之一或两者。免疫应答优选提供增强的TH1和增强的TH2反应之一或两者。

增强的免疫应答可以是全身和粘膜免疫应答之一或两者。免疫应答优选提供增强的全身和增强的粘膜免疫应答之一或两者。粘膜免疫应答优选是TH2免疫应答。粘膜免疫应答优选包括IgA生成增加。

肺炎球菌感染可影响机体的多个区域，因此本发明的组合物可以不同形式制备。例如，所述组合物可制备为液体溶液或混悬液形式的注射剂。也可制备适用于在注射前溶入或混悬入液体载剂的固体形式(例如冻干组合物或喷雾冷冻干燥组合物)。可制备所述组合物用于外用给药，例如作为油膏剂、乳膏剂或粉剂。可制备所述组合物用于口服给药，例如作为片剂、胶囊、喷剂或糖浆(可选调味)。可制备所述组合物用于肺部给药，例如作为使用细粉或喷雾的吸入剂。所述组合物可制备成栓剂或阴道栓剂。可制备所述组合物用于经鼻、经耳或经眼给药，例如作为滴剂。所述组合物可以药盒形式设计，从而混合组合物在临给予患者前复溶。这种药盒可包括一种或多种液体形式的抗原和一种或多种冻干抗原。

组合物在使用前临时制备(例如一种成分是冻干形式)且采用药盒形式时，所述药盒可包括2个药瓶，或其可包括1个已装填针筒和1个药瓶，针筒内含物用于在注射前活化药瓶内含物。

用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫有效量的抗原，以及任何其他所需成分。“免疫有效量”指将该量以单剂或系列的一部分给予个体时对治疗或预防有效。该量的变化取决于待治疗个体的健康和身体情况、待治疗个体的年龄、分类群(例如非人灵长类、灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需保护程度、疫苗配制、主治医生对医疗情况的评估、和其他相关因素。预期所述量在能用常规试验确定的相对较宽范围内。

核酸免疫

上述免疫原性组合物包括来自肺炎链球菌的多肽抗原。然而，在所有情况中，所述多肽抗原可由编码这些多肽的核酸(通常是DNA)取代以产生基于核酸免疫的组合物、方法和用途[93-100]。

所述编码免疫原的核酸在递送给患者后体内表达，表达的免疫原随后刺激免疫系统。活性成分通常采用核酸载体形式，其包含：(i)启动子；(ii)编码免疫原的序列，其与启动子可操作连接；和可选的(iii)可选择标记。优选的载体还可包括(iv)复制起点；和(v)位于(ii)下游并与之可操作连接的转录终止子。一般，(i)和(v)是真核的且(iii)和(iv)是原核的。

优选的启动子是病毒启动子，例如来自巨细胞病毒(CMV)。所述载体也可在启动子以外包括与该启动子功能上相互作用的转录调节序列(例如增强子)。优选的载体包括立即早期CMV增强子/启动子，更优选的载体也包括CMV内含子。所述启动子与编码免疫原的下游序列可操作连接，从而编码免疫原的序列表达处于启动子控制下。

使用标记时，优选在微生物宿主(例如原核生物、细菌、酵母)中起作用。标记优选是原核的可选择标记(例如在原核启动子控制下转录)。方便起见，典型的标记是抗生素抗性基因。

载体优选是自主复制的游离体或染色体外载体，如质粒。

载体优选包括复制起点。优选所述复制起点在原核生物而不是真核生物中有活性。

因此，优选的载体包括用于选择载体的原核标记、原核复制起点、推动免疫原编码序列转录的真核启动子。因此，所述载体(a)在原核宿主中扩增和选择而没有多肽表达，但(b)在真核宿主中表达而没有扩增。此配置对于核酸免疫载体是理想的。

载体可包括在编码序列下游的真核转录终止序列。这可提高转录水平。当编码序列自身没有聚腺苷酸序列时，所述载体优选包括聚腺苷酸序列。优选的聚腺苷酸序列来自牛生长激素。

载体可包括多克隆位点。

除了编码免疫原和标记的序列外，载体可包括第二真核编码序列。所述载体也可包括所述第二序列上游的IRES以从与免疫原相同的转录物翻译第二真核多肽。或者，所述免疫原编码序列可在IRES下游。

载体可包括未甲基化CpG基序，例如未甲基化DNA序列，其在鸟苷前都有胞嘧啶，侧接2个5’嘌呤和2个3’嘧啶。已证明这些DNA基序的未甲基化形式是许多免疫细胞种类的潜在刺激物。

载体可以靶向方式递送。例如，参考文献101-106描述了受体介导的DNA递送技术。含核酸的治疗组合物以约100ng-约200mg DNA范围给予，用于基因治疗方案的外用给药。也可在基因治疗方案中使用约500ng-约50mg、约1μg-约2mg、约5μg-约500μg、约20μg-约100μg DNA的浓度范围。考虑影响最终功效所需剂量的因素，如作用方法(例如用于提高或抑制所编码基因产物的水平)和转化及表达效力。需要在更大组织区域有更高表达时，可能需要更大量的载体或在连续给药操作中以相同量重给予，或多次给予不同的毗邻或紧贴组织部分，以产生积极治疗结果。在所有情况下，临床试验的常规实验会确定最优治疗效果的特定范围。

可用基因递送载剂传递载体。基因递送载剂可以是病毒或非病毒来源(参见参考文献107-110)。

用于递送所需核酸并在所需细胞内表达的基于病毒的载体在本领域熟知。基于病毒的示范性载体包括但不限于重组逆转录病毒(例如参考文献111-121)、基于甲病毒的载体(例如辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)；罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCCVR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；VR-1249；VR-532)；也可使用这些病毒的杂合体或嵌合体)、痘病毒载体(例如牛痘、鸡痘、金丝雀痘、改良型安卡拉痘苗病毒等)、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体(例如参见参考文献122-127)。也可使用与杀伤腺病毒相连的DNA给予[128]。

也可使用非病毒递送载剂和方法，包括但不限于：与单独的杀伤腺病毒相连或不连的聚阳离子浓缩DNA[例如128]、配体相连的DNA[129]、真核细胞递送载体细胞[例如参考文献130-134]和与细胞膜核电荷中和或融合。也可使用裸露DNA。示范性裸露DNA引入方法描述于参考文献135和136。能用作基因递送载剂的脂质体(例如免疫脂质体)描述于参考文献137-141。其他方法描述于参考文献142和143。

其他适用的非病毒递送包括机械递送系统如参考文献143所述方法。此外，可通过光聚合水凝胶物质沉淀、或使用电离辐射[例如参考文献144和145]递送编码序列和这类表达产物。其他能用于递送编码序列的常规基因递送方法包括例如使用手持式基因转移粒子枪[146]或使用激活转移基因的电离辐射[144和145]。

用PLG{(丙交酯-乙交酯)共聚物}微粒递送DNA是一种特别优选的方法，例如通过吸附于微粒，其可选进行处理以具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。

疫苗处理和给予方法

本发明也提供了在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明免疫原性组合物的步骤。所述免疫应答优选具有保护性且优选包括抗体和/或细胞介导的免疫。所述方法可引起增强的反应。

本发明也提供至少2种不同RrgB分化枝联用作为药物，例如用于在哺乳动物中引起免疫应答。

本发明还提供至少2种不同RrgB分化枝在引起哺乳动物中免疫应答用药物制备中的用途。

通过这些应用和方法引起哺乳动物免疫应答，可保护哺乳动物抵御肺炎球菌疾病和/或感染，例如抵御肺炎球菌性脑膜炎(pneumococcalmeningitis)。

本发明也提供预装填本发明免疫原性组合物的递送装置。

哺乳动物优选是人。疫苗用于预防性用途时，人优选是儿童(例如幼童或婴儿)或青少年；疫苗用于治疗性用途时，人优选是青少年或成人。用于儿童的疫苗也可给予成人，例如用于评估安全性、剂量、免疫原性等。

一种检测治疗性处理功效的方法包括给予本发明组合物后监控肺炎球菌感染。一种检测预防性处理功效的方法包括在标准试验中测试免疫后血清，例如可在调理吞噬杀伤试验(OPKA)中测试血清，调理细菌的能力表示保护功效。另一种检测预防性处理功效的方法包括在肺炎球菌感染动物模型如豚鼠或小鼠中进行免疫后攻击。一种此类模型描述于参考文献147。另一种评估本发明组合物免疫原性的方法是重组表达多肽以通过免疫印迹和/或微阵列筛选患者血清或粘膜分泌物。所述多肽与患者间的阳性反应表明该患者对测试多肽已有免疫应答。此方法也可用于鉴定免疫显性抗原和/或抗原内的表位。

本发明的组合物一般直接给予患者。可通过胃肠外注射(例如皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内、或组织间隙)、或粘膜如经直肠、口服(例如片剂、喷剂)、阴道、外用、透皮或经皮、鼻内、经眼、经耳、肺部或其他粘膜给药来完成直接递送。

本发明可用于引起全身和/或粘膜免疫，优选引起增强的全身和/或粘膜免疫。

增强的全身和/或粘膜免疫优选反映在增强的TH1和/或TH2免疫应答中。所述增强的免疫应答优选包括IgG1和/或IgG2a和/或IgA生成增加。

剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或增强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如胃肠外初次免疫和粘膜增强免疫、粘膜初次免疫和胃肠外增强免疫等。多剂量通常间隔至少1周给予(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)。在一个实施方式中，多剂量可在出生后约6周、10周和14周给予，例如在6周、10周和14周龄时给予，如世界卫生组织扩大免疫计划(“EPI”)中所用。在另一实施方式中，2个初免剂量相隔约2个月给予，例如相隔约7、8或9周，然后在第二初免剂量后约6个月到1年，例如第二初免剂量后约6、8、10或12个月，给予一个或多个增强剂量。在进一步的实施方式中，3个初免剂量相隔约2个月给予，例如相隔约7、8或9周，然后在第三初免剂量后约6个月到1年，例如第三初免剂量后约6、8、10或12个月，给予一个或多个增强剂量。

根据本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成人。因此，人类患者可小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受所述疫苗的优选患者为老年人(例如≥50岁、≥60岁和优选≥65岁)、年轻人(例如≤5岁)、住院患者、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病患者、或免疫缺陷患者。然而，所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的人群。

可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(例如在向健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的b型流感嗜血杆菌(H.influenzae)疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗等基本同时给药。

组合

用于免疫的组合物包括至少2种作为杂合多肽或单独多肽的RrgB分化枝。另外，组合物可包括：(i)引起针对肺炎球菌蛋白特别是RrgB以外肺炎球菌蛋白的抗体反应的一种或多种其他多肽；(ii)来自肺炎球菌的荚膜糖；和/或(iii)引起识别非肺炎球菌生物表位的抗体反应的一种或多种其他免疫原。如上所详述，含有这些组合的本发明组合物包括可任选含有一种或多种佐剂，例如2种或更多佐剂。合适的佐剂包括矿物盐如铝盐，以及鲨烯-水乳液如MF59。

与其他多肽抗原的组合[148]

来自一个或多个分化枝的RrgB多肽可联用选自下组的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或全部13种)多肽抗原：(1)spr0057抗原；(2)spr0565抗原；(3)spr1098抗原；(4)spr1416抗原；(5)spr1418抗原；(6)spr0867抗原；(7)spr1431抗原；(8)spr1739抗原；(9)spr2021抗原；(10)spr0096抗原；(11)spr1707抗原；(12)spr1875抗原；和/或(13)spr0884抗原；

类似地，来自一个或多个分化枝的RrgB多肽可联用选自下组的一种或多种(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或全部20种)多肽抗原：(1)ClpP；(2)LytA；(3)PhtA；(4)PhtB；(5)PhtD；(6)PhtE；(7)ZmpB；(8)CbpD；(9)CbpG；(10)PvaA；(11)CPL1；(12)PspC；(13)PspA；(14)PsaA；(15)PrtA；(16)Spl33；(17)PiaA；(18)PiuA；(19)CbiO；和/或(20)30S核糖体蛋白S8。

这些其他抗原可作为单独多肽加入。或者，它们可作为杂合体加入，例如spr0057-spr0096杂合体或spr0096-spr2021杂合体、spr0565-PhtD杂合体等。再或者，它们可融合RrgB多肽序列以提供杂合多肽，例如RrgB-spr0057杂合体。

例如，含有2或3个RrgB分化枝的嵌合RrgB多肽可联用：(a)spr0057、spr0096和spr2021的混合物；(b)spr0057、spr0565和spr2021的混合物；(c)spr0057、spr0096和spr0565的混合物；(d)spr0057、spr0096、spr0565和spr2021的混合物；(e)spr1418、spr0884和spr0096的混合物；(f)spr1418、spr0884和spr2021的混合物；(g)spr1418、spr0884、spr0096和和spr2021的混合物；(h)spr0884、spr1416和spr0057的混合物；(h)spr0884、spr1416和spr0096的混合物；(h)spr0884、spr1416、spr0057和spr0096的混合物；或(i)spr1418、spr1431和spr0565的混合物。这些混合物同时包括spr0057和spr0096时，可使用杂合蛋白，例如含有SEQ ID NO：82(参见参考文献148的SEQ ID NO：200)或含有SEQ ID NO：83。这些混合物同时包括spr0096和spr2021时，可使用杂合蛋白，例如含有SEQ ID NO：84(参见参考文献148的SEQ ID NO：205)。

在另一个实施例中，含有2或3个RrgB分化枝的嵌合RrgB多肽可联用含有spr2021(也称为SP2216)抗原、SP1732抗原和可选PsaA抗原的肺炎球菌免疫原。此分类的合适肺炎球菌免疫原是参考文献159所公开的免疫原，其包括抗原“SP2216-1”(参考文献159的SEQ ID NO：1；本文中的SEQ ID NO：97)、“SP1732-3”(参考文献159的SEQ ID NO：2；本文中的SEQ ID NO：98)和可选的PsaA(参考文献159的SEQ ID NO：3；本文中的SEQ ID NO：99)。含有这些SEQ ID NO免疫原性片段的多肽可用于替代实际公开的SEQ ID NO，例如含有至少一个来自各SEQ ID NO97和98的免疫原性片段。含有spr2021(SP2216)、SP1732和可选PsaA变体的多肽也能用于替代实际公开的SEQ ID NO，例如含有至少一个来自各SEQ IDNO 97和98的变体。此组合的示例包括参考文献159所示肺炎球菌免疫原与下面详述含有嵌合体II-I-III(例如SEQ ID NO：21)或嵌合体III-II-I(例如SEQ ID NO：15)的嵌合RrgB多肽的组合。其他抗原可作为单独多肽加入。或者，它们可作为杂合体加入，例如spr2021-SP1732杂合体或spr2021-SP1732-PsaA杂合体。再或者，它们可融合RrgB多肽序列如嵌合RrgB多肽以提供杂合多肽，例如RrgB-spr2021-SP1732杂合体。如上详述，含有这些组合的本发明组合物可任选包括一种或多种佐剂。合适的佐剂包括矿物盐如铝盐，以及鲨烯-水乳液如MF59。

任意这些组合也可包括一种或多种肺炎球菌荚膜糖，其通常偶联于运载体蛋白。下文提供了关于这些糖和偶联的进一步信息。

初始‘spr0057’序列在参考文献149中标注为‘β-N-乙酰-己糖胺酶前体’(参见GI：15902101)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0057的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：23给出。本发明使用的优选spr0057多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：23具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：23的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr0057蛋白包括SEQ ID NO：23的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：23的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：23 C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：23的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一个合适片段是省略天然前导肽和分选酶识别序列的SEQ ID NO：38。另一个合适片段是具有N末端和C末端截断的SEQ ID NO：24。SEQ ID NO：27是基于不同野生型菌株的SEQID NO：24变体且是用于本发明的有效spr0057序列。

初始‘spr0565’序列在参考文献149中标注为‘β-半乳糖苷酶前体’(参见GI：15902609)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0565的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：25给出。本发明使用的优选spr0565多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：25具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：25的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr0565蛋白包括SEQ ID NO：25的变体(例如SEQ ID NO：45；见下)。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：25的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：25C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：25的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一个合适片段是省略天然前导肽和分选酶识别序列的SEQ ID NO：42。另一个合适片段是SEQ ID NO：43和44。这些spr0565截短形式特别有用，因为所述天然多肽很长(＞2000个氨基酸)。

一个spr0565变体形式是本文中的SEQ ID NO：45。参考文献150报道了使用此变体形式(其中的SEQ ID NO：178)免疫。因此，有用的spr0565多肽可包括氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：45具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：45的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些多肽包括SEQ ID NO：45的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：45的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：45C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：45的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献150的表1指出了SEQID NO：45的免疫原性片段。

初始‘spr1098’序列在参考文献149中标注为‘分选酶’(参见GI：15903141)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1098的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：26给出。本发明使用的优选spr1098多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：26具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：26的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1098蛋白包括SEQ ID NO：26的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：26的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：26C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：26的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一个合适片段是省略天然前导肽序列的SEQ ID NO：46。

初始‘spr1416’序列在参考文献149中标注为‘假拟蛋白’(参见GI：15903459)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1416的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：28给出。本发明使用的优选spr1416多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：28具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：28的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1416蛋白包括SEQ ID NO：28的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：28的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：28C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：28的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

初始‘spr1418’序列在参考文献149中标注为‘假拟蛋白’(参见GI：15903461)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1418的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：29给出。本发明使用的优选spr1418多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：29具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：29的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1418蛋白包括SEQ ID NO：29的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：29的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：29C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：29的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

初始‘spr0867’序列在参考文献149中标注为‘内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶’(参见GI：15902911)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0867的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：30给出。本发明使用的优选spr0867多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：30具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：30的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr0867蛋白包括SEQ ID NO：30的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：30的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：30C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：30的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一个合适片段是省略天然前导肽序列的SEQ ID NO：48。

初始‘spr1431’序列在参考文献149中标注为‘1，4-β-N-乙酰胞壁酸酶’(参见GI：15903474)。它也称为‘LytC’，参考文献171报道了其免疫用途。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1431的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：31给出。本发明使用的优选spr1431多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：31具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：31的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1431蛋白包括SEQ ID NO：31的变体。优选的(b)片段包括来自SEQID NO：31的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：31C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：31的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一个合适片段是省略天然前导肽序列的SEQ ID NO：49。

‘spr1739’多肽是肺炎球菌溶血素(例如参见GI：15903781)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1739的氨基酸序列在本文中作为SEQ IDNO：32给出。本发明使用的优选spr1739多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQID NO：32具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：32的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1739蛋白包括SEQ ID NO：32的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：32的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：32C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：32的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。用于疫苗用途的突变肺炎球菌溶血素形式在本领域已知[183，151-156]，本发明可使用这些突变形式。可通过C末端截断来脱毒(例如参见参考文献157)，例如删去34个氨基酸、45个氨基酸、7个氨基酸[158]等。根据SEQ ID NO：32编号的更多突变包括Pro325→Leu(例如SEQID NO：50)和/或Trp433→Phe(例如SEQ ID NO：51)。这些突变可联合C末端截断，例如Pro325→Leu突变联合7聚体截断(例如SEQ ID NO：52)。

初始‘spr2021’序列在参考文献149中标注为‘通用应激蛋白GSP-781’(参见GI：15904062)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr2021的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：33给出。本发明使用的优选spr2021多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：33具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：33的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr2021蛋白包括SEQ ID NO：33的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：33的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：33 C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：33的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一个合适片段是省略天然前导肽序列的SEQ ID NO：53。参考文献150将spr2021标注为与GbpB同源的分泌45kDa蛋白并公开其作为免疫原的用途(其中的SEQ ID NO：243；SP2216)。参考文献150的表1(第73页)指出了spr2021的免疫原性片段。另一种有用的spr2021片段公开为参考文献159的SEQ ID NO：1(本文中SEQ ID NO：33的氨基酸28-278；此有用的spr2021片段在本文中作为SEQ ID NO：97提供；SP2216-1)。

初始‘spr0096’序列在参考文献149中标注为‘假拟蛋白’(参见GI：15902140)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0096的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：34给出。本发明使用的优选spr0096多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：34具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：34的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr0096蛋白包括SEQ ID NO：34的变体(例如SEQ ID NO：54；见下)。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：34的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：34C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：34的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

spr0096的一个变体形式是本文中的SEQ ID NO：54，其相对SEQ IDNO：34在C末端附近有一个插入物。参考文献150报道了此变体的免疫用途(其中的SEQ ID NO：150)，其中该变体标注为LysM结构域蛋白。因此，本发明使用的优选spr0096可包括氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：54具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：54的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些多肽包括SEQ ID NO：54的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：54的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：54C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQID NO：54的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献150的表1指出了SEQ ID NO：54的免疫原性片段。

spr0096多肽可以二聚体例如同源二聚体形式使用。

初始‘spr1707’序列在参考文献149中标注为‘ABC转运蛋白-底物结合蛋白-寡肽转运’(参见GI：15903749)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1707的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：36给出。本发明使用的优选spr1707多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：36具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：36的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1707蛋白包括SEQ ID NO：36的变体(例如SEQ ID NO：55；见下)。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：36的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：36C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：36的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

spr1707的一个变体形式是本文中的SEQ ID NO：55，其与SEQ ID NO：14差异4个氨基酸。参考文献150报道了SEQ ID NO：55(其中的SEQ IDNO：220)的免疫用途。因此，本发明使用的优选spr1707可包括氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：55具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：55的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些多肽包括SEQ ID NO：55的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ IDNO：55的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：55C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：55的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献150的表1指出了SEQ ID NO：55的免疫原性片段。

初始‘spr1875’序列在参考文献149中标注为‘假拟蛋白’(参见GI：15903916)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr1875的氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO：35给出。本发明使用的优选spr1875多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：35具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：35的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1875蛋白包括SEQ ID NO：35的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：35的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：35C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：35的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

‘spr0884’是肽基脯氨酰异构酶，也称为蛋白酶成熟蛋白。出于参比目的，全长spr0884的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：37。本发明使用的优选spr0884多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：37具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ IDNO：37的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr0884蛋白包括SEQ ID NO：37的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：37的表位。其他优选片段缺少来自SEQID NO：37C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：37的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一个合适片段是省略天然前导肽序列的SEQ ID NO：56。参考文献160报道了spr0884的免疫用途。

ClpP是ATP依赖性Clp蛋白酶蛋白水解亚基。出于参比目的，全长ClpP的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：58。在R6基因组中ClpP是spr0656[149]。本发明使用的优选ClpP多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：58具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：58的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些ClpP蛋白包括SEQ ID NO：58的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：58的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：58C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：58的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献161和162报道了ClpP的免疫用途。ClpP优选与PspA和PsaA和/或PspC联用[161]。

LytA是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(自溶素)。出于参比目的，全长LytA的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：59。在R6基因组中，LytA是spr1754[149]。本发明使用的优选LytA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：59具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：59的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些LytA蛋白包括SEQ ID NO：59的变体(例如GI：18568354)。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：59的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：59C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：59的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献163报道了LytA的免疫用途，特别是含与异源混杂T辅助表位融合的LytA胆碱结合域的形式的应用。

PhtA是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白A。出于参比目的，全长PhtA前体的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：60。在R6基因组中，PhtA是spr1061[149]。本发明使用的优选PhtA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：60具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：60的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PhtA蛋白包括SEQ ID NO：60的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：60的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：60C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：60的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献164和165报道了PhtA的免疫用途。

PhtB是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白B。出于参比目的，全长PhtB前体的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：61。残基578处的Xaa可以是赖氨酸。本发明使用的优选PhtB多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：61具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：61的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PhtB蛋白包括SEQ ID NO：61的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：61的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：61C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：61的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献164、165和166报道了PhtB的免疫用途。

PhtD是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白D。出于参比目的，全长PhtD前体的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：62。在R6基因组中，PhtD是spr0907[149]。本发明使用的优选PhtD多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：62具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：62的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PhtD蛋白包括SEQ ID NO：62的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：62的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：62C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：62的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献164、165和167报道了PhtD的免疫用途。

PhtE是肺炎球菌组氨酸三联体蛋白E。出于参比目的，全长PhtE前体的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：63。在R6基因组中，PhtE是spr0908[149]。本发明使用的优选PhtE多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：63具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：63的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PhtE蛋白包括SEQ ID NO：63的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：63的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：63C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：63的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献164和165报道了PhtE的免疫用途。

ZmpB是锌金属蛋白酶。出于参比目的，全长ZmpB的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：64。在R6基因组中，ZmpB是spr0581[149]。本发明使用的优选ZmpB多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：64具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：64的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些ZmpB蛋白包括SEQ ID NO：64的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：64的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：64C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ IDNO：64的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

CbpD是胆碱结合蛋白D。出于参比目的，全长CbpD的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：65。在R6基因组中，CbpD是spr2006[149]。本发明使用的优选CbpD多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：65具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：65的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些CbpD蛋白包括SEQ ID NO：65的变体(例如SEQ ID NO：66；见下)。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：65的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：65C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：65的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献171报道了CbpD的免疫用途。

SEQ ID NO：65的一个变体是本文中的SEQ ID NO：66。参考文献150报道了SEQ ID NO：66(其中的SEQ ID NO：241)的免疫用途。因此，本发明使用的优选CbpD多肽可包括氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：66具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：66的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些CbpD蛋白包括SEQ ID NO：66的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：66的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：66C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：66的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献150的表1指出了SEQ ID NO：66的免疫原性片段。

CbpG是胆碱结合蛋白G。出于参比目的，全长CbpG的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：67。在R6基因组中，CbpG是spr0350[149]。本发明使用的优选CbpG多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：67具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：67的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些CbpG蛋白包括SEQ ID NO：67的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：67的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：67C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：67的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献171报道了CbpG的免疫用途。

PvaA(肺炎链球菌肺炎球菌疫苗抗原A)也称为sp101。出于参比目的，全长PvaA的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：68。在R6基因组中，PvaA是spr0930[149]。本发明使用的优选PvaA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：68具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：68的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PvaA蛋白包括SEQ ID NO：68的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：68的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：68C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：68的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献168和169报道了PvaA的免疫用途。

CPL1是肺炎球菌噬菌体CP1溶菌酶。出于参比目的，全长CPL1的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：69。本发明使用的优选CPL1多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：69具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：69的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些CPL1蛋白包括SEQ ID NO：69的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ IDNO：69的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：69C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：69的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献163报道了PvaA的免疫用途，特别是含与异源混杂T辅助表位融合的CPL1胆碱结合域的形式的应用。

PspC是肺炎球菌表面蛋白C[170]，也称为胆碱结合蛋白A(CbpA)。参考文献168和171报道了它的免疫用途。在R6菌株中，PspC是spr1995，出于参比，全长spr1995的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：57。本发明使用的优选PspC多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：57具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：57的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些spr1995蛋白包括SEQ ID NO：57的变体(例如SEQ ID NO：71；见下)。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：57的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：57C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：57的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

PspC的一个变体称为‘Hic’。它与PspC类似，如参考文献172的图1所示，其中报道了该变体结合H因子(fH)。出于参比目的，全长Hic的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：71。本发明可使用Hic蛋白作为PspC多肽的补充或替代。本发明使用的优选Hic多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：71具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：71的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些Hic蛋白包括SEQ ID NO：71的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：71的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：71C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：71的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。PspC和/或Hic可有利地与PspA和/或PsaA联用。

PspA是肺炎球菌表面蛋白A。出于参比目的，全长PspA的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：72。在R6基因组中，PspA是spr0121[149]。本发明使用的优选PspA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：72具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：72的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PspA蛋白包括SEQ ID NO：72的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：72的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：72C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：72的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献173等报道了PspA的免疫用途。PspA可有利地与PspC联合给予。

PsaA是肺炎球菌表面粘附素。出于参比目的，全长PsaA的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：73。本发明使用的优选PsaA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：73具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：73的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PsaA蛋白包括SEQ ID NO：73的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID

NO：73的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：73C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：73的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。一种有用的PsaA片段在参考文献159中公开为SEQ ID NO：3(对应于本文中SEQ ID NO：73的氨基酸21-309；此有用的PsaA片段在本文中作为SEQ ID NO：99提供)。参考文献174报道了PsaA的免疫用途。PsaA可与PspA和/或PspC联用。

PrtA是细胞壁相关丝氨酸蛋白酶。它也称为sp128和sp130，且是枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。出于参比目的，全长PrtA前体的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：74。在R6基因组中，PrtA是spr0561[149]。本发明使用的优选PrtA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：74具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：74的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PrtA蛋白包括SEQ ID NO：74的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：74的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：74C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：74的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献175和176以及参考文献168报道了PrtA的免疫用途。

Sp 133是保守的肺炎球菌抗原。出于参比目的，全长Sp133的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：75。在R6基因组中，Sp133是spr0931[149]。本发明使用的优选Sp133多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：75具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：75的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些Sp133蛋白包括SEQ IDNO：75的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：75的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：75C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：75的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献177报道了Sp133的免疫用途。

PiaA是参与肺炎球菌获取铁的膜蛋白酶。出于参比目的，全长PiaA的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：76。在R6基因组中，PiaA是spr0935[149]。本发明使用的优选PiaA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：76具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：76的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PiaA蛋白包括SEQ ID NO：76的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：76的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：76C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：76的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献178、179和180报道了PiaA的免疫用途，特别是与PiuA联用。

PiuA是用于三价铁转运的ABC转运蛋白底物结合蛋白。它也称为FatB。出于参比目的，全长PiuA的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：77。在R6基因组中，PiuA是spr1687[149]。本发明使用的优选PiuA多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：77具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：77的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些PiuA蛋白包括SEQ ID NO：77的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ IDNO：77的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：77C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：77的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。参考文献178-180报道了PiuA的免疫用途，特别是与PiaA联用。

CbiO标注为钴转运蛋白ATP结合亚基。出于参比目的，全长CbiO的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：78。参考文献181报道了CbiO[其中的‘ID2’]的免疫用途。在R6基因组中，CbiO是spr2025[149]。本发明使用的优选CbiO多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：78具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：78的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些CbiO蛋白包括SEQ ID NO：78的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：78的表位。其他优选片段缺少来自SEQID NO：78C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：78的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

出于参比目的，30S核糖体蛋白S8的氨基酸序列是本文中的SEQ IDNO：79。在R6基因组中，S8亚基是spr0203[149]。本发明使用的优选S8多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：79具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：79的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些S8蛋白包括SEQ ID NO：79的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：79的表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：79C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：79的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

SP1732是膜相关丝氨酸/苏氨酸激酶StkP。含659个氨基酸的SP1732序列在参考文献150中鉴定为SEQ ID NO：214。称为“SP1732-3”的此序列示范性片段在参考文献159中鉴定为SEQ ID NO：2。出于参比目的，SP1732-3的氨基酸序列是本文中的SEQ ID NO：98。本发明使用的优选SP1732多肽包括的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：98具有60％或更高相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ IDNO：98的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’为7或更大(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更大)。这些SP1732蛋白包括SEQ ID NO：98的变体。优选的(b)片段包括来自SEQ ID NO：98的表位。其他优选片段缺少来自SEQID NO：98C末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)和/或N末端的一个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25个或更多)，但保留SEQ ID NO：98的至少一个表位。其他片段省略一个或多个蛋白结构域。

与肺炎球菌糖的组合

来自一个或多个分化枝的RrgB多肽可联合一种或多种肺炎球菌荚膜糖，其通常偶联于运载体蛋白。因此，本发明提供免疫原性组合物，其包括以下的组合：

(1)上述至少2种RrgB分化枝的组合，作为混合物或杂合体；和

(2)一种或多种肺炎球菌荚膜糖。

用于此组合物中成分(2)的糖理想上作为含糖部分和运载体蛋白部分的偶联物。所述偶联物中的运载体部分可以是单一RrgB多肽、杂合RrgB多肽、非RrgB肺炎球菌多肽、或非肺炎球菌多肽。

所述糖来自肺炎球菌的荚膜糖。所述糖可以是在从细菌纯化该糖时的大小，或可以是这种多糖片段化获得的寡糖。例如，在7价PREVNAR^TM产品中，6种糖是完整多糖而1种(18C血清型)是寡糖。

组合物可包括来自一种或多种以下肺炎球菌血清型的荚膜糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。组合物可包括多个血清型，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或更多血清型。7价、9价、10价、11价和13价偶联组合在本领域已知，23价未偶联组合也已知。

例如，10价组合可包括来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖。11价组合还可包括来自血清型3的糖。12价组合可在10价混合物中加入：血清型6A和19A；6A和22F；19A和22F；6A和15B；19A和15B；r22F和15B；13价组合可在11价混合物加入：血清型19A和22F；8和12F；8和15B；8和19A；8和22F；12F和15B；12F和19A；12F和22F；15B和19A；15B和22F等。一种有用的13价组合包括来自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19、19F和23F的糖。如果包括糖，则优选包括血清型1、5和14中的1、2或3种。

偶联物中的运载体蛋白可以是或不是(1)中RrgB抗原之一。如果它不是RrgB抗原，则可以是不同的肺炎球菌抗原，如spr0057、spr0096和spr2021等，或是肺炎球菌溶血素[182]或其无毒衍生物[183]，或肺炎球菌表面蛋白PspA[184]。但在一些实施方式中，运载体不是肺炎球菌抗原，其可以是例如细菌毒素或类毒素。典型的运载体蛋白是白喉或破伤风类毒素或其突变体。CRM₁₉₇白喉毒素突变体[185]有用，其是PREVNAR^TM产品中的运载体。其他合适运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningtidis)外膜蛋白复合体[186]、合成肽[187，188]、热激蛋白[189，190]、百日咳蛋白[191，192]、细胞因子[193]、淋巴因子[193]、激素[193]、生长因子[193]、人工蛋白，含来自不同病原体衍生抗原的多种人CD⁴⁺T细胞表位的人工蛋白[194]，如N19[195]、来自流感嗜血杆菌的蛋白D[196-198]、铁吸收蛋白[199]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[200]、重组铜绿假单胞菌(P.aerginosa)胞外蛋白A(rEPA)[201]等。

组合物包括大于1种偶联物时，各偶联物可使用相同运载体蛋白或不同运载体蛋白。参考文献202描述了在多价肺炎球菌偶联疫苗中使用不同运载体蛋白的潜在优势。

在一些实施方式中，单一偶联物可携带来自多个血清型的糖[203]。然而，通常各偶联物包括来自单个血清型的糖。

偶联物可具有过量运载体(w/w)或过量糖(w/w)。在一些实施方式中，偶联物可包括相等重量的糖和运载体。

运载体分子可直接或经接头共价偶联运载体。例如，可通过如参考文献204和205所述糖与运载体间的还原氨化实现蛋白的直接连接。糖首先需要激活，例如通过氧化。可用任何已知方法例如参考文献206和207所述方法形成经接头基团的连接。优选的连接类型是己二酸接头，其形成可通过将游离-NH₂基团(例如通过氨化引入葡聚糖)偶联于己二酸(用例如二酰亚胺激活)，然后将蛋白偶联于所得糖-己二酸中间物[208，209]。另一种优选的连接类型是羰基接头，其可通过糖CD1的游离羟基反应[210，211]，然后与蛋白反应以形成氨基甲酸酯连接而形成。其他接头包括β-丙酰胺[212]、硝基苯-乙胺[213]、卤代酰基卤化物[214]、糖苷键[215]、6-氨基己酸[216]、ADH[217]、C₄-C₁₂部分[218]等。也可使用碳二亚胺缩合[219]。

与非肺炎球菌抗原的组合

RrgB分化枝组合可与非肺炎球菌抗原联用。因此，因此，本发明提供免疫原性组合物，其包括以下的组合：

(1)上述至少2种RrgB分化枝的组合，作为混合物或杂合体；和

(2)一种或多种选自下组的抗原：白喉类毒素；破伤风类毒素；一种或多种百日咳抗原；乙型肝炎病毒表面抗原；脊髓灰质炎病毒灭活抗原；来自B型流感嗜血杆菌荚膜糖抗原的偶联物；来自C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖抗原的偶联物；来自Y群脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖抗原的偶联物；来自W135群脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖抗原的偶联物；来自A群脑膜炎奈瑟球菌荚膜糖抗原的偶联物。

可通过处理(例如使用甲醛)来自白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)的白喉毒素获得白喉类毒素。例如，参考文献220的第13章更详细公开了白喉类毒素。

可通过处理(例如使用甲醛)来自破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风毒素获得破伤风类毒素。参考文献220的第27章更详细公开了破伤风类毒素。

疫苗中的百日咳抗原是细胞(全细胞，Pw)或非细胞组成(Pa)。本发明可使用任一类的百日咳抗原。细胞百日咳抗原的制备已有详尽记载(例如参见参考文献220的第21章)，例如其可通过热灭活百日咳鲍特菌(B.pertussis)I期培养物而获得。

无细胞百日咳抗原包括特定纯化的百日咳鲍特菌抗原，其从天然细菌纯化或在重组宿主中表达后纯化。通常使用大于一种无细胞抗原，因此组合物可包括1、2或3种以下熟知且充分鉴定的百日咳鲍特菌抗原：(1)脱毒百日咳毒素(百日咳类毒素，或‘PT’)；(2)丝状血凝素(‘FHA’)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为‘69kD外膜蛋白’)。FHA和百日咳杆菌粘附素在根据本发明使用前可用甲醛处理。可用甲醛和/或戊二醛处理来使PT脱毒，但作为此化学脱毒方法的替代，PT可以是突变型PT，其中通过突变降低酶活性[221]。可使用的其他无细胞百日咳抗原包括菌毛(例如凝集原2和3)。

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒衣壳的主要成分。它可通过在酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中重组表达而方便生成。

脊髓灰质炎病毒灭活(IPV)抗原从细胞培养物上生长的病毒中制备，然后灭活(例如使用甲醛)。由于如参考文献220的第24章所述，脊髓灰质炎可由三种脊髓灰质炎病毒之一引起，组合物可包括3种脊髓灰质炎病毒抗原：脊髓灰质炎病毒1型(例如Mahoney株)，脊髓灰质炎病毒2型(例如MEF-1株)和脊髓灰质炎病毒3型(例如Saukett株)。

组合物的成分(2)中包括白喉类毒素、破伤风类毒素或无细胞百日咳抗原时，其通常包括所有3种，即成分(2)包括D-T-Pa组合。

组合物的成分(2)中包括白喉类毒素、破伤风类毒素或细胞百日咳抗原时，其通常包括所有3种，即成分(2)包括D-T-Pw组合。

特别感兴趣的免疫原性组合物包括：(i)上述作为混合物或杂合体的至少2种RrgB分化枝、白喉类毒素、破伤风类毒素、全细胞百日咳抗原、B型流感嗜血杆菌荚膜糖偶联物、和HbsAg的组合；(ii)上述作为混合物或杂合体的至少2种RrgB分化枝、白喉类毒素、破伤风类毒素、无细胞百日咳抗原、B型流感嗜血杆菌荚膜糖偶联物、和HbsAg的组合；(iii)上述作为混合物或杂合体的至少2种RrgB分化枝和来自A、C、W135和Y群脑膜炎球菌的一种或多种偶联物的组合；(iv)上述作为混合物或杂合体的至少2种RrgB分化枝和来自所有A、C、W135和Y群脑膜炎球菌偶联物的组合；以及(v)上述作为混合物或杂合体的至少2种RrgB分化枝和B群脑膜炎球菌抗原如外膜囊泡抗原的组合和/或参考文献222所公开的组合。

抗体

针对肺炎球菌的抗体可用于被动免疫[223]。因此，本发明提供抗体组合用于同时、单独或连续给予，其中所述组合包括以下至少2种：(a)识别如上所述第一氨基酸序列的抗体；(b)识别如上所述第二氨基酸序列的抗体；和/或(c)识别如上所述第三氨基酸序列的抗体；

本发明也提供这类抗体组合在治疗上的应用。本发明也提供这类抗体组合在生产药物上的应用。本发明还提供治疗哺乳动物的方法，包括将有效量的这类组合给予哺乳动物的步骤。如上面关于免疫组合物所述，这些方法和应用可保护哺乳动物抵御肺炎球菌感染。

术语“抗体”包括完整免疫球蛋白分子以及其能结合抗原的片段。这些包括杂合(嵌合)抗体分子[224，225]；F(ab’)2和F(ab)片段和Fv分子；非共价异二聚体[226，227]；单链Fv分子(sFv)[228]；二聚和三聚抗体片段构建物；小体[229，230]；人源化抗体分子[231-233]；和获自这些分子的任何功能片段，以及通过非常规方法获得的抗体，如噬菌体展示。所述抗体优选是单克隆抗体。获得单克隆抗体的方法在本领域熟知。优选人源化或全人源抗体。

概述

除非另有说明，本发明实践使用本领域技术范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药学的常规方法。这些技术在文献中已有详述。参见例如参考文献234-241等。

“GI”编号如上使用。GI编号，或者“基因信息识别号(GenInfo Identifier)”是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

本发明涉及“表位”时，此表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位。这类表位可凭经验鉴定(例如使用PEPSCAN[242，243]或类似方法)，或可进行预测(例如使用Jameson-Wolf抗原指数[244]、基于矩阵的方法[245]、MAPITOPE[246]、TEPITOPE[247，248]、神经网络[249]、OptiMer和EpiMer[250，251]、ADEPT[252]、Tsites[253]、亲水性[254]、抗原指数[255]或参考文献256-260所公开的方法等)。表位是由抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并与之结合的抗原部分，它们也可称为“抗原决定簇”。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

术语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，术语“基本上”可从本发明定义中省略。

与数值x相关的术语“约”是可可选的并表示例如x±10％。

除非另有说明，包括混合两种或更多组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序对组分进行混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将合并的组分再与第三种组分混合等。

抗体一般对其靶标有特异性。因此，它们对靶标的亲和性高于不相关的对照蛋白，如牛血清白蛋白。

2种氨基酸序列间序列相同性百分数指比对时2种比较序列中相同氨基酸的百分数。此比对和百分比同源性或序列相同性可用本领域已知软件程序确定，例如参考文献261的7.7.18部分所述。通过Smith-Waterman同源性搜索算法采用仿射缺口搜索测定优选比对，缺口开放罚分为12且缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。参考文献262公开了Smith-Waterman同源性搜索算法。

具体实施方式

RrgB嵌合体的构建

肺炎球菌中已鉴定了2种不同菌毛[2]：PI-1和PI-2。敲除研究显示缺失PI-2影响较小，但缺失PI-1降低了菌株定殖的能力，并因而导致菌血症减少且洗肺效价降低。因此，阻断PI-1对抵御肺炎球菌疾病的预期优于阻断PI-2。

PI-1RrgB蛋白有3种不同分化枝。在45种不同菌株中发现了15种不同的RrgB氨基酸序列，图9显示其关系。野生型序列在各分化枝内≥98％保守。发现RrgB蛋白引起抵御同源菌株(分化枝内)的免疫应答，但不能抵御来自不同分化枝的RrgB(分化枝间)。因此，需要将多个RrgB分化枝结合到单个组合物内，从而增加菌株覆盖谱。

SEQ ID NO：1、2和3是来自菌株TIGR4、芬兰^6B-12和台湾^23F-15的RrgB的全长编码序列。为构建这3种蛋白的嵌合体，截断其N和C末端以产生SEQ ID NO：4、5和6。此方法使用限制性酶NheI、BamHI和XhoI。为连接这些片段以产生嵌合体，使用接头SEQ ID NO：8和10，其由后接SEQID NO：7的Gly-Ser或Leu-Gly二肽组成。这些接头提供便捷的限制性位点用于片段连接。所述嵌合体的N末端是Met-Ala-Ser，C末端是Leu-Gly二肽后接促进纯化的6His标签(SEQ ID NO：9)。

构建了6个嵌合体，以下简称为：

RrgB I-II-III＝SEQ ID NO：11

RrgB I-III-II＝SEQ ID NO：13

RrgB III-II-I＝SEQ ID NO：15

RrgB III-I-II＝SEQ ID NO：17

RrgB II-III-I＝SEQ ID NO：19

RrgB II-I-III＝SEQ ID NO：21

除了I-III-II嵌合体(SEQ ID NO：13)，所表达嵌合体的分子量为205kDa，能在大肠杆菌中以可溶性形式表达，并从可溶性蛋白中纯化。例如，图3显示1.6mg/ml的I-II-III嵌合体凝胶，纯度为90％。

效力测试

使用不同肺炎球菌疾病模式系统测试嵌合体效力。

在腹膜内感染的小鼠模式中，腹膜内给予抗原并进行腹膜内攻击。在第0、14和28天对6周龄、无特定病原体的雌性BALB/c或CD1小鼠进行腹膜内免疫。用单独重组蛋白(20μg/小鼠)或其组合(各10μg/小鼠)以及氢氧化铝或弗氏佐剂完成免疫。对照接受相同进程的盐水与佐剂。然后，用致死剂量的TIGR4(通常攻击剂量为～1x10²CFU/小鼠)、芬兰^6B-12(～2x10⁴CFU/小鼠)或35B-SME15(～1x10⁴CFU/小鼠)腹膜内攻击小鼠。这3种菌株分别表达RrgB分化枝I、II或III，TIGR4菌株毒力强。通过评估接种对菌血症(在感染后5和/或24小时)和死亡率(细菌攻击后监控至少10天)的效果来测试免疫功效。

在静脉内感染的小鼠模式中，腹膜内给予抗原并进行静脉内攻击。在第0、14和28天对5周龄CD1或BALB/c小鼠进行腹膜内免疫。用单独重组蛋白(20μg/小鼠)或其组合(各10μg/小鼠)以及弗氏佐剂完成免疫。对照接受相同过程的盐水与佐剂。然后，用致死剂量的TIGR4(通常攻击剂量为～5x10⁶CFU/小鼠)、芬兰^6B-12(～2x10⁷CFU/小鼠)或35B-SME15(～5x10⁷CFU/小鼠)静脉内攻击小鼠。通过评估接种对菌血症(在感染后48小时)和死亡率(细菌攻击后监控10天或更长，取决于感染菌株)的效果来测试候选疫苗的功效。

例如，CD 1小鼠用嵌合体免疫且随后用TIGR4攻击。图1显示攻击后的菌血症。如下为CFU的几何平均数，以及与对照组的U检验比较：

嵌合体	I-II-III	II-III-I	II-I-III	III-I-II	III-II-I	对照
							CFU/ml	170	66	780	88	59	74000
U检验	0.014	0.004	0.056	0.007	0.004	-

图2显示攻击后的死亡率。存活天数中值如下：

嵌合体	I-II-III	II-III-I	II-I-III	III-I-II	III-II-I	对照
							存活	10.5	10.5	10.5	10.5	10.5	4
U检验	0.07	0.006	0.048	0.003	0.003	-

图30-33显示用20μg III-II-I嵌合体腹膜内免疫小鼠的菌血症和死亡率试验的结果。图30显示用TIGR4静脉内攻击的数据，图31显示用TIGR4腹膜内攻击的数据，图32显示35B-SME15静脉内攻击的数据，图33显示用6B芬兰12静脉内攻击的数据。

下表概括了用3种不同菌株攻击的2个不同模型所得结果，所述菌株分别表达RrgB分化枝I、II或III：

+++＝相对对照P＜0.01；++＝P＜0.05；+＝P＜0.1

因此，不同RrgB分化枝的组合针对肺炎球菌株的覆盖比单一RrgB抗原广。

在进一步的测试中，RrgB嵌合体用铝作为佐剂并测试对TIGR4腹膜内攻击的保护。嵌合体I-II-III和III-II-I对菌血症有高保护性，III-II-I嵌合体也在存活方面有保护性(图7)。

用4种不同嵌合体(I-II-III、III-II-I、II-III-I、II-I-III)之一进行腹膜内免疫后，进一步的测试使用鼻内攻击。所有嵌合体在鼻内TIGR4攻击后显示降低菌血症的效力或倾向。II-III-I嵌合体在T4攻击后使菌血症良好减少而对增加存活的倾向不显著。按菌血症或死亡率所测，PsaA对照几乎没有显示效力，而II-III-I嵌合体减少菌血症并增加存活。图13显示BalB/c小鼠中RrgB III-II-I嵌合体的24小时菌血症测试(图13A)和死亡率试验(图13B)结果，所述小鼠用20μg嵌合体腹膜内免疫(0-14-28天)并用TIGR4鼻内攻击。

也发现针对所有5种RrgB嵌合体的抗体体外调节OPKA中的肺炎双球菌杀伤。例如，图8显示针对TIGR4菌株的结果。图10显示OPKA试验中针对肺炎链球菌血清型6B的结果(用100μg的各嵌合体在第0、21和35天皮下免疫兔)，结果表明在所述5种嵌合体间没有观察到杀伤百分数的差异且嵌合体显示的杀伤与偶联疫苗PCV7相当。图11显示杀伤是特异性的且取决于抗体浓度，表明随着稀释增至多达1/131220，测试嵌合体曲线中杀伤百分数的减少与阳性对照类似。

图12显示使用不同嵌合体剂量(2μg和20μg)时，用III-II-I嵌合体的48小时菌血症(图12A)和死亡率(图12B)试验(腹膜内免疫和用35B-SME15腹膜内攻击)相当。

图14显示BalB/c小鼠中使用MF59佐剂的RrgB III-II-I嵌合体具有保护性，所述小鼠用20μg嵌合体腹膜内免疫(0-14-28天)并鼻内攻击。

图15显示使用RrgB III-II-I嵌合体皮下免疫BalB/c小鼠后具有保护性，所述小鼠皮下免疫并用TIGR4(130CFU/小鼠)腹膜内攻击。

图15A显示24小时菌血症试验且图15B显示死亡率试验。

图16显示24小时菌血症试验中，RrgB III-II-I嵌合体在被动保护研究中引起功能性抗体生成，与正常兔血清(NRS)对照对比。

图17显示抗体在OPA中对3种分化枝菌株有作用，图18显示OPA活性由于针对RrgB III-II-I嵌合体的抗体而具有特异性。

图19显示同属RrgB结构域赋予的体内保护。具体地，数据显示用RrgBD 1结构域或RrgB D4结构域免疫的BalB/c小鼠的存活％(腹膜内免疫20μg，0-14-28天；用TIGR4100CFU腹膜内攻击)。

图23显示用III-II-I嵌合体联合其他多肽抗原不同组合的48小时菌血症(图23A)和死亡率(图23B)试验(20μg抗原与铝；腹膜内免疫并用6B-芬兰1.2E+08CFU/小鼠进行静脉内攻击)。(A)和(B)中：第1列显示spr0057、spr0096和spr2021的组合；第2列显示SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第3列显示RrgB III-II-I嵌合体；第4列显示RrgB III-II-I嵌合体与spr0057、spr0096和spr2021的组合；第5列显示RrgB III-II-I嵌合体与SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第6列显示铝对照。这些数据显示SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合与RrgB嵌合体联用时，其功效显著增加。

图24显示用III-II-I嵌合体联合其他多肽抗原不同组合的48小时菌血症(图24A)和死亡率(图24B)试验(20μg抗原与铝；腹膜内免疫并用35B-SME155.2E+07CFU/小鼠进行静脉内攻击)。(A)和(B)中：第1列显示spr0057、spr0096和spr2021的组合；第2列显示SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第3列显示RrgB III-II-I嵌合体；第4列显示RrgB III-II-I嵌合体与spr0057、spr0096和spr2021的组合；第5列显示RrgB III-II-I嵌合体与SP2216-1、SP1732-3和PsaA的组合；第6列显示铝对照。这些数据显示RrgB III-II-I嵌合体、RrgB III-II-I嵌合体与其他抗原的组合都具有保护性。

图25显示BALB/c小鼠中用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体与无标签III-II-I嵌合体和铝对照相比的(A)24小时菌血症试验和(B)死亡率数据(腹膜内免疫，用TIGR42.1E+02CFU/小鼠进行腹膜内攻击)。这些数据显示有组氨酸标签和无标签嵌合体在菌血症和存活方面都显著抵御TIGR4，无标签嵌合体显示最显著的保护。图26显示类似数据，即在BALB/c小鼠24小时菌血症试验中用含多组氨酸标签的III-II-I嵌合体，与无标签III-II-I嵌合体和铝对照作比较，进一步与spr0057、spr0096和spr2021抗原的组合，spr0057、spr0096和spr2021抗原与无标签III-II-I嵌合体的组合作比较(腹膜内免疫，用TIGR41.6E+02CFU/小鼠进行腹膜内攻击)。图27和28显示用35B-SME15(图27)和6B芬兰12(图28)静脉内攻击的数据，表明无标签III-II-I嵌合体对35B-SME15和6B芬兰12静脉内攻击的保护功效与有组氨酸标签的III-II-I嵌合体相同。类似地，图29显示无标签和有组氨酸标签的III-II-I嵌合体对TIGR4静脉内攻击都有保护性。

图34显示III-II-I嵌合体的48小时菌血症和死亡率试验结果，比较过量表达菌毛的TIGR4攻击菌株与菌毛表达量很低的攻击菌株。这些数据显示菌毛过量表达时以及菌毛仅以很低水平存在时，保护性都很好。图35显示III-II-I和II-I-III嵌合体的类似菌血症数据，比较过量表达菌毛的6B芬兰12攻击菌株(图35A)与菌毛表达不足的6B芬兰12攻击菌株(图35B)。所述嵌合体显示对过量表达菌毛的菌株和菌毛表达不足的菌株都有显著保护性。

抗微生物剂耐药性

图36显示菌毛-1在耐受抗生素(红霉素耐受、青霉素耐受和多药耐受)的菌株中比在易受抗生素影响的菌株中更普遍。菌毛-1的存在与抗生素耐受性之间有显著关联。在多耐受性PMEN菌株集合中也观察到抗生素耐受菌株中菌毛-1的存在增加(数据未显示)。这些数据提示使用含多个RrgB分化枝的免疫原性组合物时针对菌毛-1的免疫具有的额外优势是抵御耐受抗生素处理的肺炎双球菌，例如红霉素耐受菌株、青霉素耐受菌株和多耐受性菌株。

单克隆抗体

产生针对来自TIGR4的RrgB的单克隆抗体。更详细研究4种mAb(名为23B8/B6、23F8/10、23E1/A9和30A8/A8)。23B8/B6和23F8/10结合来自TIGR4的全长RrgB、D1结构域片段以及D1-D2-D3片段，但不结合D4片段。相反，23E1/A9结合全长蛋白以及D4结构域片段，但不结合D1-D2-D3片段、或D4片段。30A8/A8结合全长RrgB蛋白，但不结合任何结构域片段。mAb不结合来自芬兰^6B-12或23F菌株的RrgB蛋白，但它们结合表达的所有5种嵌合体。结合结果见图5且证实RrgB在其杂合形式中保留表位。

如图4A所示，4种测试的抗TIGR4mAb各自能在被动保护试验中减少菌血症，最佳结果来自23F8/10。4种测试的抗TIGR4mAb也能在死亡率试验中显著(除23B8/B6的P＝0.021外，所有MAb的p＜0.01)增加存活(图4B)。

为确定4种保护性MAb各自识别的表位，克隆了不同的RrgB结构域，作为单个结构域(D1、D2、D3、D4)或作为多个结构域片段(D1-3、D2-4、D3-4)，在大肠杆菌中表达为有His标签的多肽并通过His捕获高性能柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上的亲和层析成功地以可溶形式纯化。然后，该重组蛋白在针对MAb的蛋白质印迹中探测重组蛋白，分别使用TL RrgB分化枝1和BSA作为阳性和阴性对照。

如图20所示，结果表明单克隆抗体对重组蛋白具有不同和特异反应性。mAb 23F8/10和mAb 23B8/B6都能特异性识别N末端结构域D1，mAb23E1/A9识别C末端D4，而30A8/A8仅能检测D2-4，表明识别D2与D4间的构象表位。此后通过ELISA确认这些数据(数据未显示)。

也产生针对来自芬兰^6B-12的RrgB的单克隆抗体。2个特定mAb(2A5/29、3A5/19)结合来自芬兰^6B-12的全长RrgB，但不结合来自TIGR4或23F菌株的RrgB蛋白。所述mAb也结合表达的所有5种嵌合体。结合结果见图6。

保护性mAb 23F8/10的表位图

为对含mAb 23F8/10所识别保护性表位的D1结构域上的区域作图，联用质谱分析、蛋白质印迹检测和限制性蛋白水解重组蛋白。此方法可概括成4个主要步骤：(1)酶促或化学部分切割蛋白，(ii)通过在SDS-PAGE分离后进行MS分析来确定所产生片段的序列覆盖率，(iii)所产生片段的蛋白质印迹分析，(iv)比较蛋白质印迹中的正和负条带以定位表位。

第一步是从全长RrgB获得显著量的多肽，显示SDS-PAGE分离后的较好分解模式。这些实验选用的蛋白酶是胰蛋白酶，其在精氨酸(R)和赖氨酸(K)残基的C末端侧切割蛋白。消化20μg的全长RrgB，用SDS-PAGE分离消化产物(5μg的全长蛋白，和12μg的消化产物)。如上所述并如图20所示，单克隆抗体23F8/10识别全长重组RrgB和RrgB D1，而用胰蛋白酶切割全长蛋白获得的大量多肽也识别。鉴定蛋白质印迹分析中的正和负条带(就同一考马斯染色样品)对于表位鉴定重要。用单克隆抗体23F8/C10的蛋白质印迹见图21。从凝胶中切出约20个考马斯染色蛋白水解片段，兼有蛋白质印迹(用MAb 23F8/C10免疫印迹)正(绿色箭头)和负(红色箭头)条带，用胰蛋白酶O/N原位消化并用MALDI-TOF/TOF质谱分析，从而确定其各自的序列覆盖。各分析片段所得序列覆盖限定在PMF谱(肽质量指纹)中鉴定的最“N末端”和最“C末端”胰蛋白酶肽之间。与蛋白质印迹结果关联产生获自全长RrgB的胰蛋白酶产物电泳模式的序列覆盖示意图。此分析提示23F8/10表位在全长RrgB的氨基酸32和氨基酸141之间。

然后对N末端结构域D1使用相同策略，从而缩短含MAb 23F8/C10识别表位的区域。消化20μg的D1，用SDS-PAGE分离消化产物(5μg的全长蛋白，和12μg的消化产物)。与全长消化RrgB不同，此实验中的单克隆抗体23F8/10仅识别全长D1和一些获自胰蛋白酶D1消化的多肽。之后，正和负条带均考虑用于进一步的分析。从凝胶中切出约10个考马斯染色肽片段，其中包括正和负条带，用胰蛋白酶O/N原位消化并用MALDI-TOF/TOF质谱分析，从而确定其各自的序列覆盖。各分析片段所得序列覆盖限定在PMF谱(肽质量指纹)中鉴定的最“N末端”和最“C末端”胰蛋白酶肽之间。如先前所确立与蛋白质印迹结果相关联，获自RrgBD1结构域的胰蛋白酶产物电泳带的序列覆盖提示含保护性表位的MAb23F8/10识别区域是RrgB的氨基酸残基55-氨基酸残基89。将D1氨基酸序列(尚无结构数据)建模在化脓性链球菌菌毛骨架Spy0128(总体同源性为约27％)结构域1晶体结构上。数据提示为表位的残基(氨基酸55-89)在所述模型上作图(图22A)。在RrgB D1-4结构刚体拟合所得的菌毛3D重建电子密度图中，显示此表位表面暴露(图22B和22C)。

RrgB嵌合体作为运载体蛋白

除作为疫苗成分之外，RrgB嵌合体适用作糖-运载体偶联物中的运载体蛋白。I-II-III和III-II-I嵌合体与糖免疫原偶联，然后通过ELISA测量针对所述糖的IgG反应(GMT)。将结果与一些其他肺炎球菌蛋白以及作为阳性对照的N19和CRM197作比较。研究VI/VII的结果如下：

CRM197	N19	I-II-III	III-II-I	1287	LRP	1875
							2688	1004	638	133	25	114	114

应理解仅以举例方式描述了本发明，可对之进行修改而仍保留在本发明的范围和构思内。

参考文献

[1]Barocchi等(2006)PNAS USA 103：2857-62

[2]Bargnoli等(2008)J Bacteriol.190(15)：5408-92

[3]WO2007/116322

[4]LeMieux等(2006)Infect Immun 74：2453-6

[5]Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48，443-453

[6]Rice等(2000)Trends Genet16：276-277

[7]Bodanszky(1993)Principles of Peptide Synthesis(《肽合成原理》)(ISBN：0387564314)

[8]Fields等(1997)Meth Enzymol 289：Solid-Phase Peptide Synthesis(《固相肽合成》)ISBN：0121821900

[9]Chan和White(2000)Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.(《Fmoc固相肽合成》)ISBN：0199637245

[10]Kullmann(1987)Enzymatic Peptide Synthesis(《酶促肽合成》)ISBN：0849368413

[11]Ibba(1996)Biotechnol Genet Eng Rev 13：197-216

[12]美国专利5,707,829

[13]Vaccine Design...(《疫苗设计...》，1995)Powell和Newman编.ISBN030644867X.普莱南出版公司(Plenum).

[14]WO90/14837

[15]WO90/14837

[16]Podda和Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2：197-203

[17]Podda(2001)Vaccine 19：2673-2680

[18]Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(《疫苗设计：亚基和佐剂法》，Powell和Newman编)普莱南出版公司(Plenum Press)1995(ISBN 0-306-44867-X)

[19]Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols(《疫苗佐剂：制备方法和研究方案》)(Methods in Molecular Medicine series(《分子药物方法丛书》)第42卷ISBN：1-59259-083-7.O’Hagan编

[20]Allison和Byars(1992)Res Immunol 143：519-25

[21]Hariharan等(1995)Cancer Res 55：3486-9

[22]US-2007/014805

[23]WO95/11700

[24]美国专利6,080,725

[25]WO2006/113373

[26]WO2005/097181

[27]US 5,057,540

[28]WO96/33739

[29]EP-A-0109942

[30]WO96/11711

[31]WO00/07621

[32]Barr等(1998)A dvanced Drug Delivery Reviews 32：247-271

[33]Sjolanderet等(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：321-338

[34]Niikura等(2002)Virology 293：273-280

[35]Lenz等(2001)J Immunol 166：5346-5355

[36]Pinto等(2003)J Infect Dis 188：327-338

[37]Gerber等(2001)J Virol 75：4752-4760

[38]WO03/024480

[39]WO03/024481

[40]Gluck等(2002)Vaccine 20：B10-B16

[41]EP-A-0689454

[42]Johnson等(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278

[43]Evans等(2003)Expert Rev Vaccines 2：219-229

[44]Meraldi等(2003)Vaccine 21：2485-2491

[45]Pajak等(2003)Vaccine 21：836-842

[46]Kandimalla等(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400

[47]WO02/26757

[48]WO99/62923

[49]Krieg(2003)Nautre Medicine 9：831-835

[50]McCluskie等(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32：179-185

[51]WO98/40100

[52]US 6,207,646

[53]US 6,239,116

[54]US 6,429,199

[55]Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions(《生化学会汇刊》)31(第3部分)：654-658

[56]Blackwell等(2003)J Immunol 170：4061-4068

[57]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65

[58]WO01/95935

[59]Kandimalla等(2003)BBRC 306：948-953

[60]Bhagat等(2003)BBRC 300：853-861

[61]WO03/035836

[62]Schellack等(2006)Vaccine 24：5461-72

[63]WO95/17211

[64]WO98/42375

[65]Beignon等(2002)Infect Immun 70：3012-3019

[66]Pizza等(2001)Vaccine 19：2534-2541

[67]Pizza等(2000)Int J Med Microbiol 290：455-461

[68]Scharton-Kersten等(2000)Infect Immun 68：5306-5313

[69]Ryan等(1999)Infect Immun 67：6270-6280

[70]Partidos等(1999)Immunol Lett 67：209-216

[71]Peppoloni等(2003)Expert Rev Vaccines 2：285-293

[72]Pine等(2002)J Control Release 85：263-270

[73]Tebbey等(2000)Vaccine 18：2723-34

[74]Domenighini等(1995)Mol Microbiol 15：1165-1167

[75]WO99/40936

[76]WO99/44636

[77]Singh等(2001)J Cont Release 70：266-276

[78]WO99/27960

[79]US 6,090,406

[80]US 5,916,588

[81]EP-A-0626169

[82]WO99/52549

[83]WO01/21207

[84]WO01/21152

[85]Andrianov等(1998)Biomaterials 19：109-115

[86]Payne等(1998)Adv Drug Delivery Review 31：185-196

[87]Stanley等(2002)Clin Exp Dermatol 27：571-577

[88]Jone(2003)Curr Opin Investing Drugs 4：214-218

[89]WO99/11241

[90]WO94/00153

[91]WO98/57659

[92]欧洲专利申请0835318、0735898和0761231

[93]Donnelly等(1997)Annu Rev Immunol 15：617-648

[94]Strugnell等(1997)Immunol Cell Biol 75(4)：364-369

[95]Cui(2005)Adv Genet 54：257-89

[96]Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunol(《免疫学研讨文集》)9：271-283

[97]Brunham等(2000)J Infect Dis 181增刊3：S538-43

[98]Svanholm等(2000)Scand J Immunol 51(4)：345-53

[99]DNA Vaccination-Genetic Vaccination(《DNA免疫接种-基因接种》，1998)Koprowski等编.(ISBN 3540633928)

[100]Gene Vaccination：Theory and Practice(《基因免疫接种：理论和实践》，1998)Raz编.(ISBN 3540644288)

[101]Findeis等Trends Biotechnol(1993)11：202

[102]Chiou等Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct GeneTransfer(《基因治疗：直接基因转移的方法和应用》)Wolff编

[103]Wu等J Biol Chem(1988)263：621

[104]Wu等J Biol Chem(1994)269：542

[105]Zenke等Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655

[106]Wu等J Biol Chem(1991)266：338

[107]Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51

[108]Kimura，Human Gene Therapy(1994)5：845

[109]Connelly，Human Gene Therapy(1994)1：185

[110]Kaplitt，Nature Genetics(1994)6：148

[111]WO90/07936

[112]WO94/03622

[113]WO93/25698

[114]WO93/25234

[115]美国专利5,219,740

[116]WO93/11230

[117]WO93/10218

[118]美国专利4,777,127

[119]GB专利号2,200,651

[120]EP-A-0345242

[121]WO91/02805

[122]WO94/12649

[123]WO93/03769

[124]WO93/19191

[125]WO94/28938

[126]WO95/11984

[127]WO95/00655

[128]Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147

[129]Wu，J.Biol.Chem.(1989)264：16985

[130]美国专利5,814,482

[131]WO95/07994

[132]WO96/17072

[133]WO95/30763

[134]WO97/42338

[135]WO90/11092

[136]美国专利5,580,859

[137]美国专利5,422,120

[138]WO95/13796

[139]WO94/23697

[140]WO91/14445

[141]EP-0524968

[142]Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411

[143]Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：11581

[144]美国专利5,206,152

[145]WO92/11033

[146]美国专利5,149,655

[143]Zwijnenburg等(2001)J Infect Dis 183：1143-6

[148]WO2009/016515

[149]Hoskins等(2001)J.Bacteriol.183：5709-5717

[150]WO2004/092209

[151]Kirkham等(2006)Infect Immun.74(1)：586-93

[152]WO2005/108580

[153]Berry等(1999)Infect Immun.67(2)：981-5

[154]US-6716432

[155]WO90/06951

[156]WO99/03884

[157]Baba等(2002)Infect Immun 70：107-113

[158]US-7217791

[159]WO2008/061953

[160]WO01/12219

[161]Cao等(2007)Vaccine 25(27)：4996-5005

[162]WO2005/063283

[163]WO2003/104272

[164]WO00/37105

[165]Adamou等(2001)Infect Immun.69(2)：949-58

[166]Ogunnity等(2007)Infect Immun.75(1)：350-7

[167]WO98/18930

[168]WO02/22168

[169]Wizemann等(2001)Infect Immun.69：1593-8

[170]WO99/53940

[171]WO02/22167

[172]WO02/08426

[173]Briles等(2000)J Infect Dis 182：1694-1701

[174]Talkington等(1996)Microb Pathog 21(1)：17-22

[175]WO00/76540

[176]Bethe等(2001)FEMS Microbiol Lett.205(1)：99-104

[177]WO01/81380

[178]Brown等(2001)Infect Immun 69：6702-6

[179]Whalan等(2005)FEMS Immunol Med Microbiol 43：73-80

[180]Jomaa等(2006)Vaccine.24(24)：5133-9

[181]WO00/06738

[182]Kuo等(1995)Infect Immun 63：2706-13

[183]Michon等(1998)Vaccine.16：1732-41

[184]WO02/091998

[185]Research Disclosure(《研究披露》)，453077(2002年1月)

[186]EP-A-0372501

[187]EP-A-0378881

[188]EP-A-0427347

[189]WO93/17712

[190]WO94/03208

[191]WO98/58668

[192]EP-A-0471177

[193]WO91/01146

[194]Falugi等(2001)Eur J Immunol 31：3816-3824

[195]Baraldo等(2004)Infect Immun 72(8)：4884-7

[196]EP-A-0594610

[197]Ruan等(1990)J Immunol 145：3379-3384

[198]WO00/56360

[199]WO01/72337

[200]WO00/61761

[201]WO00/33882

[202]WO2007/071707

[203]WO99/42130

[204]美国专利4,761,283

[205]美国专利4,356,170

[206]美国专利4,882,317

[207]美国专利4,695,624

[208]Mol.Immunol.，1985：22，907-919

[209]EP-A-0208375

[210]Bethell G.S.等J.Biol.Chem.，1979，254，2572-4

[211]Hearn M.T.M.，J.Chromatogr.，1981，218，509-18

[212]WO00/10599

[213]Gever.等Med.Microbiol.Immunol，165：171-288(1979)

[214]美国专利4,057,685

[215]美国专利4,673,574；4,761,283；4,808,700

[216]美国专利4,459,286

[217]美国专利4,965,338

[218]美国专利4,663,160

[219]WO2007/000343

[220]Vaccines.(《疫苗》，Plotkin和Orenstein).第4版，2004，ISBN：0-7216-9688-0

[221]Rappuoli.等(1991)TIBTECH 9：232-238

[222]Giuliani等(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(29)：10834-9

[223]Brandt等(2006)J Antimicrob Chemother.58(6)：1291-4.2006年10月26日电子出版

[224]Winter等(1991)Nature 349：293-99

[225]US 4,816,567

[226]Inbar等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2659-62

[227]Ehrlich等(1980)Biochem 19：4091-96

[228]Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5897-83

[229]Pack等(1992)Biochem 131，1579-84

[230]Cumber等(1992)J.Immunology 149B，120-26

[231]Riechmann等(1988)Nature 332，323-27

[232]Verhoeyan等(1988)Science 239，1534-36

[233]GB 2,276,169

[234]Gennaro(2008)Remington：The Science and Practice of Pharmacy.(《雷明顿：药物科学和实践》)第20版，ISBN：0683306472

[235]Methods In Enzymology.(《酶学方法》，S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社公司(Academic Press，Inc.))

[236]Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackewell编，1986，布莱克威尔科学出版公司(Blackwell Scientific Publications))

[237]Sambrook等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第3版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))

[238]Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(《表面和胶体化学手册》，Birdi，K.S.编，CRC出版公司(CRC Press)，1997)

[239]Ausubel等(编)(2002)Short protocols in molecular biology(《精编分子生物学实验指南》，第5版(Current Protocols(《实验室指南》))

[240]Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course(《分子生物学技术：密集实验室课程》，Ream等编，学术出版社)

[241]PCR(Introduction to Biotechniques Series)(《PCR(生物技术入门丛书)》)，第2版(Newton和Graham编，1997，施普林格出版公司(Springer Verlag))

[242]Geysen等(1984)PNAS USA 81：3998-4002

[243]Carter(1994)Methods Mol Biol 36：207-23

[244]Jameson，BA等(1988)，CABIOS 4(1)：181-186

[245]Raddrizzani和Hammer(2000)Brief Bioinform 1(2)：179-89

[246]Bublil等(2007)Proteins 68(1)：294-304

[247]De Lalla等(1999)J.Immunol.163：1725-29

[248]Kwok等(2001)Trends Immunol 22：583-88

[249]Brusic等(1998)Bioinformatics 14(2)：121-30

[250]Meister等(1995)Vaccine 13(6)：581-91

[251]Roberts等(1996)AIDS Res Hum Retroviruses 12(7)：593-610

[252]Maksyutov和Zagrebelnaya(1993)Comput Appl Biosci 9(3)：291-7

[253]Feller和de la Cruz(1991)Nature 349(631)：720-1

[254]Hopp(1993)Peptide Research 6：183-190

[255]Welling等(1985)FEBS Lett 188：215-218

[256]Davenport等(1995)Immunogenetics 42：392-297

[257]Tsurui和Takahashi(2007)J Pharmacol Sci.105(4)：299-316

[258]Tong等(2007)Brief Bioinform.8(2)：96-108

[259]Schirle等(2001)J Immunol Methods.257(1-2)：1-16

[260]Chen等(2007)Amino Acids 33(3)：423-8

[261]Current Protocols in Molecular Bilogy(《新编分子生物学实验指南》，F.M.Ausubel等编，1987)增刊30

[262]Smith和Wateman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489

Claims

1.一种免疫原性组合物，所述组合物包括以下至少两种：

2.一种多肽，所述多肽包括以下至少两种：

3.一种多肽，所述多肽含有氨基酸序列：

A-{-X-L-}_n-B

其中：各X是如权利要求1定义的第一多肽、第二多肽或第三多肽的氨基酸序列；L是可选的接头氨基酸序列；A是可选的N末端氨基酸序列；B是可选的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整数。

4.如权利要求2或3所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有选自SEQID NO：11、13、15、17、19和21的氨基酸序列。

5.一种细菌，所述细菌表达以下至少两种：

6.一种含有氨基酸序列SEQ ID NO：83的多肽。