CN102453707A - 一种固定化纤维素酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种固定化纤维素酶的制备方法，涉及一种酶的固定化方法。该方法首先是将脱乙酰度为90％的壳聚糖与乙酸溶液混合后注入2％的三聚磷酸钠溶液中，过滤冲洗后得到中性球状的壳聚糖-聚乙二醇载体，然后用戊二醛溶液活化载体，再与纤维素酶进行固定化反应，过滤洗涤，即得固定化纤维素酶。按本方法制得的固定化纤维素酶具有机械强度高，酶稳定性好，酶活力高和酶与载体之间的结合力强、固定化率高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物催化剂的固定化方法，更确切的说是一种纤维素酶的固定化方法，属于生物试剂制备技术领域。
背景技术
天然纤维素是地球上最丰富的可再生的有机物质，在全世界通过光合作用产生的植物物质每年约高达10000亿吨，其中89％目前未被人类利用，从人类利用自然资源角度看，这无疑是一巨大的浪费。随着世界人口骤长，未解决日益加剧的食品和能源危机，纤维素资源的利用引起了世界各国的极大关注和高度重视。
一般生物不能直接利用纤维素材料作为食物，只有将纤维素水解成葡萄糖才能被利用。纤维素水解成葡萄糖的一般方法有酸水解法和酶水解法。纤维素和目前广泛应用于发酵工业的淀粉原料相比，其酸水解能力大约低400倍，酶水解能力低100-1000倍。酸水解对设备的腐蚀作用大，但应条件剧烈，同时产生大量的酸废水，因此这种方法的发展和应用受到很大的限制。纤维素的酶水解反应条件温和，易于控制、产物质量高而备受关注。利用纤维素酶的催化反应带地高温、高雅的化学反应可节约能源、降低生产成本和提高原料的利用率，在净化环境和开辟系能源等方面具有重要的意义。但是纤维素酶及其作用的底物非常复杂，影响因素繁多，水解速度缓慢，酶的利用率低，酶解效率不高，影响纤维素酶的广泛应用，因此探求利用纤维素酶高效水解纤维素材料具有非常重要的理论和实际意义。
固定化酶催化反应技术具有能回收、易分离、反复多次使用等优点，为提高纤维素酶的使用效率、降低生产能本提供了可能性，因此纤维素酶的固定化研究长期以来备受关注。但是目前应用传统的固定化方法进行的固定化纤维素酶具有机械强度差、稳定性不好、酶与载体之间的结合力弱，在使用过程中酶分子易从载体上脱落等缺陷。因此，现在亟待探索和建立一种新的固定化纤维素酶的制备方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决传统的固定方法具有机械强度差、稳定性不好、酶与载体之间的结合力弱，在使用过程中酶分子易从载体上脱落等缺陷而提供的一种纤维素酶固定化方法。
固定化纤维素酶的制备方法按以下步骤实现：：：一、称取2.0-4.0g脱乙酰度为90％的壳聚糖，0.6-0.8g PEG6000溶于100ml 2％的乙酸溶液中，于35-45℃共混1.5-2.5h；二、用注射器将共混溶液注入2％三聚磷酸钠溶液中，静止2.5-3.5h；三、过滤洗涤得中性球状的壳聚糖-聚乙二醇载体；四、称取9-11g载体，加入100ml 5％戊二醛溶液，45-55℃活化5.5-6.5h；五、过滤后用丙酮和蒸馏水洗至中性；六、称取1.5-2.5g活化后的载体，加入20ml纤维素美容液与17-19℃进行固定化反应15-17h；七、过滤后冲洗固定化酶数次，即得固定化纤维素酶。
本发明具有如下优点：(1)本发明利用天然高分子载体改性的方法首次利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性后作为固定化纤维素酶的载体，具有安全无毒副作用的优点，并解决了其只溶于酸性水溶液的限制；(2)利用聚乙二醇对壳聚糖进行改性后作为固定化载体制备的固定化纤维素酶具有良好的机械强度、酶活性高和稳定性好的优点；(3)本发明采用共价结合法将改性的壳聚糖与纤维素酶进行结合，使得酶与载体之间的结合力强，具有固定化率高的优点。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式固定化纤维素酶的制备方法按以下步骤实现：：一、称取2.0-4.0g脱乙酰度为90％的壳聚糖，0.6-0.8g PEG6000溶于100ml2％的乙酸溶液中，于35-45℃共混1.5-2.5h；二、用注射器将共混溶液注入2％三聚磷酸钠溶液中，静止2.5-3.5h；三、过滤洗涤得中性球状的壳聚糖-聚乙二醇载体；四、称取9-11g载体，加入100ml 5％戊二醛溶液，45-55℃活化5.5-6.5h；五、过滤后用丙酮和蒸馏水洗至中性；六、称取1.5-2.5g活化后的载体，加入20ml纤维素美容液与17-19℃进行固定化反应15-17h；七、过滤后冲洗固定化酶数次，即得固定化纤维素酶。
本实施方式中壳聚糖、三聚磷酸钠溶液、乙酸溶液、戊二醛溶液和丙酮均为市售的常规试剂。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中准确称取3.0g脱乙酰度为90％的壳聚糖，0.75gPEG6000溶于100ml 2％的乙酸溶液中，于40℃共混2h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中采用pH＝8.2的2％三聚磷酸钠溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中用6号注射器将共混液注入2％三聚磷酸钠溶液中，静止3h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中过滤后用蒸馏水洗涤出去多余的三聚磷酸钠。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中采用pH＝10.0的戊二醛溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤四中称取10g载体，加入100ml5％戊二醛溶液，50℃活化6h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式八：木实施方式与具体实施方式一不同的是步骤六中称取2.0g活化后的载体，加入20ml纤维素酶于18℃进行固定化反应16h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤七中过滤后用乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗固定化酶数次。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式十：本实施方式固定化纤维素酶的制备方法按以下步骤实现：一、准确称取3.0g脱乙酰度为90％的壳聚糖，0.75gPEG6000溶于100ml 2％的乙酸溶液中，于40℃共混2h；二、用6号针头的注射器将共混溶液注入pH＝8.2的2％三聚磷酸钠溶液中，静止3h；三、过滤后用蒸馏水洗涤出去多余的三聚磷酸钠，得中性球状的壳聚糖-聚乙二醇载体；四、称取10g载体，加入100mpH＝10.0的5％戊二醛溶液，50℃活化6h；五、过滤后用丙酮和蒸馏水洗至中性；六、称取2.0g活化后的载体，加入20ml纤维素酶于18℃进行固定化反应16h；七、过滤后用乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗固定化酶数次，即得固定化纤维素酶。
Claims (9)
1.一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于：固定化纤维素酶的制备方法按以下步骤实现：一、称取2.0-4.0g脱乙酰度为90％的壳聚糖，0.6-0.8gPEG6000溶于100ml 2％的乙酸溶液中，于35-45℃共混1.5-2.5h；二、用注射器将共混溶液注入2％三聚磷酸钠溶液中，静止2.5-3.5h；三、过滤洗涤得中性球状的壳聚糖-聚乙二醇载体；四、称取9-11g载体，加入100ml 5％戊二醛溶液，45-55℃活化5.5-6.5h；五、过滤后用丙酮和蒸馏水洗至中性；六、称取1.5-2.5g活化后的载体，加入20ml纤维素美容液与17-19℃进行固定化反应15-17h；七、过滤后冲洗固定化酶数次，即得固定化纤维素酶。
2.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤一中准确称取3.0g脱乙酰度为90％的壳聚糖，0.75gPEG6000溶于100ml2％的乙酸溶液中，于40℃共混2h。
3.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤二中采用pH＝8.2的2％三聚磷酸钠溶液。
4.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤二中用6号注射器将共混液注入2％三聚磷酸钠溶液中，静止3h。
5.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤三中过滤后用蒸馏水洗涤出去多余的三聚磷酸钠。
6.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤四中采用pH＝10.0的戊二醛溶液。
7.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤四中称取10g载体，加入100ml5％戊二醛溶液，50℃活化6h。
8.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤六中称取2.0g活化后的载体，加入20ml纤维素酶于18℃进行固定化反应16h。
9.根据权利要求1所述的一种固定化纤维素酶的制备方法，其特征在于步骤七中过滤后用乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗固定化酶数次。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120516 |