CN102448979A

CN102448979A - 纯化重组促卵泡激素的方法

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Publication number: CN102448979A
Application number: CN2010800226811A
Authority: CN
Inventors: C·谢克曼; D·艾兴格; S·阿诺德
Original assignee: Biogenerix GmbH
Current assignee: Ty Hamax Headquarters Uk Ltd
Priority date: 2009-04-01
Filing date: 2010-04-01
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2030-04-01
Also published as: UA106369C2; PT2414380E; HRP20151086T1; AU2010234028A1; WO2010115586A2; EA028065B1; DK2414380T3; ES2552055T3; CY1116963T1; JP2016027050A; US20120135928A1; BRPI1012647B1; US9096683B2; US20150353599A1; ZA201106800B; RS54318B1; JP5845170B2; JP2012522736A; IL215234A; SI2414380T1

Abstract

本发明涉及纯化重组促卵泡激素(FSH)或者重组FSH变体的方法。该方法包括将含有重组FSH或者重组FSH变体的液体进行阴离子交换层析、疏水作用层析和染料亲和层析，其中这些层析可以以任意顺序进行，并且其中该方法既不包括弱的阴离子交换层析又不包括反相层析。此纯化的方法得到高产量的重组促卵泡激素，其具有期望程度的纯度。得到的促卵泡激素在预防和治疗病症和医学适应症中尤其有用，在所述病症和医学适应症中认为促卵泡激素制剂是有用的药物。

Description

纯化重组促卵泡激素的方法

促卵泡激素(FSH)由垂体前叶的促性腺激素细胞产生并被释放到循环系统中。促卵泡激素与黄体生成素(LH)在控制雌性中卵母细胞的成熟和雄性中的精子发生中一起作用。促卵泡激素与黄体生成素都属于异源二聚体的糖蛋白家族，其由分离的基因编码的两条非共价键连接的α链和β链组成。α链和β链都被糖基化。α亚基由92个氨基酸残基组成，而β亚基由111个氨基酸残基组成，每条亚基都含有两个潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点。

人促卵泡激素用于治疗不能排卵的妇女，用于刺激多卵泡的发育(超排卵)和如IVF，ICSI，GIFT或者CIFT等的协助受孕的准备。此外，人促卵泡激素用于在具有低的或者没有促卵泡激素产生的妇女中刺激卵泡的成熟，并且在少精液症男性中刺激精子发生。

在诱导排卵的典型的治疗方案中，患者在大约6至大约12天中每天注射FHS或者其变体(每天大约75-450IU FSH)。在受控的卵巢过度刺激的典型治疗方案中，患者在大约6至大约12天中每天注射FSH或者其变体(大约每天150-600IU FSH)。

为了刺激精子发生，一种方案将每周三次150IU FSH和每周两次2.500IU hCG联合使用，此方案已经在患有低促性腺激素性性腺功能减退的男性中成功的实现了精子数量的增加。

直到20世纪80年代，人促卵泡激素主要的来源是从育龄妇女的尿液中分离出来的尿源促卵泡激素。在20世纪90年代引进了高纯度的尿源促卵泡激素的进一步纯化类型，并且从1998年以来最终开发了重组的促卵泡激素并被广泛使用。随着重组DNA技术的到来，在转染了编码α链和β链的核酸序列的细胞培养物中产生人促卵泡激素变得可能。例如在WO88/10270，WO 86/04589和EP 0 735 139中公布了编码α链和β链的DNA序列和生产重组促卵泡激素的方法。

目前，在德国市场上有两种商业的重组人促卵泡激素产品，GONAL-f

和Puregon

，这两种产品都是通过在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达编码人野生型的α链和β链的DNA序列生产的。

由于促卵泡激素在治疗生育病症中的重要性，提供高纯度和高比活性的重组促卵泡激素是所希望的。促卵泡激素治疗需要重复注射。高度纯化的促卵泡激素制剂可以通过皮下施用，其允许患者自己施用，因此增加了患者的便利和依从性。

Ares Trading S.A的国际专利申请WO 2006/051070 A1描述了一种纯化重组促卵泡激素的方法，其包括以下步骤：1)染料亲和层析，2)疏水作用层析；和3)反相层析。WO 2006/051070 A1进一步公开了一种纯化促卵泡激素的方法，其包括将促卵泡激素进行1)阴离子交换层析，2)染料亲和层析，3)疏水作用层析，4)反相层析和5)阴离子交换层析的步骤。

Ares Trading S.A的国际专利申请WO 2005/063811 A1涉及一种纯化重组促卵泡激素的方法，其包括(1)离子交换层析；(2)固定化的金属离子层析；和(3)疏水作用层析(HIC)的步骤。

Ares Trading S.A的WO 2007/065918 A2描述了一种纯化促卵泡激素的方法，其包括层析步骤：染料亲和层析，弱的阴离子交换层析，疏水作用层析以及强的阴离子交换层析，这些层析可以以任意顺序进行。

持续需要纯化重组促卵泡激素以及其变体的新方法。特别地，需要避免使用反相层析步骤的纯化方法。进一步的，不依赖于免疫亲和层析但是可以在没有这种成本密集型的步骤的情况下进行的纯化方法是所希望的。

按照本发明，通过主权利要求的特征解决了这些和进一步的问题。在从属权利要求中限定了有利的实施方案。

本发明的目的是提供一种纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的有利的新方法。

一方面，本发明提供一种从含有粗制的促卵泡激素的溶液中纯化重组人促卵泡激素或者其变体的方法，其包括以下步骤：

-阴离子交换层析，

-疏水作用层析，和

-染料亲和层析，

这些层析可以以任意顺序进行，

其中所述方法避免任何弱的阴离子交换层析以及任何反相层析。

在另一个实施方案中，不同的层析步骤按照以下顺序进行：(1)阴离子交换层析，(2)疏水作用层析，和(3)染料亲和层析。阴离子交换层析(AEC)依赖于样品中蛋白质和固定在树脂上电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阴离子交换层析中，蛋白质的结合离子是带负电，而固定的官能团是带正电。通常使用的阴离子交换树脂是Q-树脂，季铵和DEAE树脂(二乙基氨基乙烷)。然而，一般阴离子交换层析步骤可以使用所有的通常商业上可得到的阴离子交换树脂或者膜进行。阴离子交换树脂可以以预装柱的形式使用。备选地，可以自己准备层析柱。与其他普通的层析注相比，这种层析柱没有容积和形状的具体限制。本领域技术人员知道使用的阴离子交换树脂的量取决于捕获步骤中应用于层析柱的细胞培养液或者其它液体，例如，前面层析步骤的洗脱液中的总体蛋白质含量。

可用于本发明的目的的典型的强阴离子交换柱树脂包括官能团如：季铵基乙基(QAE)部分，树脂包括例如Toyopearl QAE(从TosohBioscience，德国购买)，Selectacel QAE(纤维素的一种季铵基乙基衍生物，从Polysciences Inc.，美国宾夕法尼亚州购买)和其他的；季铵(Q)部分，树脂包括例如，Q Sepharose XL，Q Sepharose FF，Q Sepharose HP(从GE Healthcare，德国购买)，Resource Q(从GE Healthcare，德国购买)，Macro Prep High Q(从Bio-Rad，美国加利福尼亚州购买)，Toyopearl SuperQ(从Tosoh Bioscience，德国获得)，UNOsphere Q(从Bio-Rad，美国加利福尼亚州购买)，和三甲基铵乙基(TMAE)基团，树脂包括例如，FractogelEMD TMAE(从Merck，德国购买)。

阴离子交换层析优选地是强阴离子交换层析，其使用具有N⁺(CH₃)₃官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。

可用于本发明目的的强阴离子交换树脂优选的实例是季铵强阴离子交换树脂，其在本领域已知为UNOsphere Q，Q Sepharose HP和其他的具有季铵(Q)部分的树脂。

强阴离子交换树脂UNOsphere Q的特征如下：

强阴离子交换树脂Q Sepharose HP的特征如下：

优选的避免使用弱的阴离子交换树脂，如基于二乙基氨基乙基(DEAE)或者二甲基氨基乙基(DMAE)作为官能团的那些树脂。

阴离子交换层析步骤优选的使用具有弱碱性pH，例如约pH 7.0至约9.0，或者约7.5至约8.5的缓冲液进行。合适的缓冲液包括，例如，硼酸盐缓冲液，三乙醇胺/亚氨基二乙酸Tris，乙酸铵，tricine，N-二(羟乙基)甘氨酸，TES，HEPES，TAPS。优选地使用Tris缓冲液。通常通过加入盐，优选氯化钠增加流动相的电导率完成从阴离子交换树脂上的洗脱。

本发明方法的疏水作用层析(HIC)可以使用HIC树脂进行，其具有相对温和的疏水表面(与反相树脂更强的疏水表面相比)。具有疏水表面性质的蛋白质被吸引到这些通常具有醚，苯基，丁基，或己基的树脂上。

HIC可以使用所有常见的通过商业途径可获得的HIC树脂进行。为本发明的目的使用的HIC树脂包含基质如丁基、苯基、丙基或者辛基琼脂糖，SOURCE 15(都可以从GE Healthcare，德国购买)，Macro-Prep Methyl或者叔丁基HIC支持体(Bio-Rad，Germany)，或者具有丙基或苯基配体的Fractogel EMD(Merck AG，Germany)，Toyopearl HIC树脂，如Toyopearl Butyl 650M和类似的HIC树脂(Tosoh Bioscience)。

在优选的实施方案中，疏水作用层析使用由用苯基、丁基或者辛基衍生的交联琼脂糖珠组成的树脂或者具有类似特征的树脂进行。PhenylSepharose 6FF(从GE Healthcare购买)的特征如下：

在HIC树脂上的结合在高导电性的溶液中完成，其通过加入盐(例如NaCl，(NH₄)₂SO₄或者Na₂SO₄)得到。通常HIC步骤中的洗脱通过减少流动相的导电性进行(例如降低盐浓度)，使用pH值约5至约9，更优选的约6至约8，最优选的约7至约8的缓冲液。

平衡、洗涤、洗脱缓冲液可以包含通常用于HIC的所有缓冲液类型。因此，缓冲试剂包含磷酸钠，乙酸钠，Tris/HCl，HEPES或者其他缓冲试剂。此外，依据缓冲液是用于平衡、洗涤或者洗脱，缓冲液可含有0.5mM至3mM的NaCl，KCl或者其他合适的盐。平衡和洗涤缓冲溶液比洗脱缓冲液含有更高浓度的前述盐。

在HIC步骤中特别优选的缓冲液是包含有NaCl的Tris/HCl缓冲液。

本发明方法的染料亲和层析可以使用本领域技术人员众所周知的具有固定的配体染料化合物的树脂，即Cibacron Blue F3G-A进行。本领域技术人员完全理解术语“固定的”，并且其指配体化学连接到树脂的意义上，配体是经衍生的。

在优选的实施方案中，染料亲和层析以Cibacron Blue F3G-A作为配体进行的，该配体共价偶联到任何基质上，如琼脂糖基质。优选地，染料亲和层析使用已知称作Blue Sepharose FF(可以从GE Healthcare，德国购买)的树脂进行。Blue Sepharose FF的技术特征如下给出：

可理解本发明方法中染料亲和层析可以用具有类似特征的备选树脂进行。备选树脂实例包括：Toyopearl AF-blue-HC-650M(TosohBiosciences)，Blue Cellthru BigBead(Sterogene)，SwellGel Blue(Pierce)，Cibachrome blue 3GA-agraose 100(Sigma)，Affi-Gel Blue(Bio-Rad)，Econo-Pac blue cartridges(Bio-Rad)，Cibacron Blue 3GA(Sigma)。

固定的染料亲和层析步骤中的洗脱优选地使用Tris/HCl缓冲液或者磷酸盐缓冲液进行。最优选的是含有氯化钠的Tris/HCl缓冲液。洗脱剂的pH值优选的是约7至约9，最优选的pH值是7至8。

在另一方面，按照本发明纯化重组的促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将含有所述促卵泡激素或者其变体的液体进行

-阴离子交换层析，

-疏水作用层析，

-染料亲和层析，和

进一步的阳离子交换层析的步骤，这些层析可以以任意顺序进行，

在一个实施方案中，按照以下顺序进行步骤：(1)阴离子交换层析，(2)疏水作用层析，(3)染料亲和层析，和(4)阳离子交换层析。

阳离子交换层析(CEC)依赖于样品中的蛋白质和固定在树脂上的电荷之间的电荷-电荷相互作用。在阳离子交换层析中，蛋白质的结合离子是带正电的，固定的官能团是带负电的。通常使用的阳离子交换树脂是S-树脂、硫酸衍生物和CM(羧甲基)树脂、羧化衍生的离子。

然而，通常阳离子交换层析步骤可以用所有常用的通过商业途径可得到的阳离子交换树脂或者膜进行。阳离子交换树脂可以以预装柱或者膜的形式使用，其上固定有官能团例如磺酸。备选地，可以自己制备层析柱。至于层析柱的容积和形状，与其他普通的层析柱相比没有特别的限制。本领域的技术人员了解使用的阳离子交换树脂的量取决于细胞培养液或者其它液体(例如，在前的层析步骤的洗脱液)中的总体蛋白质含量。

可用于本发明目的的典型的阳离子交换树脂可以从GE Healthcare和其他的离子层析配件和层析柱的制造商中购买。通常，使用pH值4至7的缓冲液进行阳离子交换层析。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法的阳离子交换步骤以膜阳离子交换进行。优选地，阳离子交换步骤用固定在膜上的强酸性阳离子交换剂磺酸或者具有类似特征的交换剂进行。

本发明的阳离子交换步骤中使用的合适的膜吸附剂是众所周知的并且可以从一些供应商购买。例如，本发明方法的阳离子交换层析方法可以使用从再生纤维素制成的膜进行，并且其具有在纤维素骨架上形成的磺酸的层析基质。一种有用的膜吸附剂的实例是Sartorius出售的Sartobind S膜吸附剂。Sartobind S膜吸附剂的技术数据给出如下：

阳离子交换层析步骤可以按照制造商的方案进行。例如，可以使用pH7.0的Tris-HCl缓冲液。

发现阳离子交换层析，优选的阳离子膜吸收剂步骤清除所有分子大小的宿主细胞蛋白质而保持短的处理时间。产量约95％是非常有利的，因为在pH 7.0时促卵泡激素不与吸附剂结合。

一般来说，发现层析膜形式的阳离子交换层析在纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体中非常有用。因此，另一方面，本发明涉及阳离子膜吸附剂在纯化FSH或者FSH变体方法中的用途。在一个优选的实施方案中，阳离子膜吸附剂是阳离子交换吸附剂，优选的强阳离子交换吸附剂，其由再生纤维素制成，并且具有在纤维素骨架上形成的磺酸的层析基质。

在另一方面，按照本发明纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行

-阴离子交换层析，

-疏水作用层析，

-染料亲和层析，

-任选的阳离子交换层析，和

进一步额外的阴离子交换层析步骤，这些层析可以以任意顺序进行，其中所述方法避免弱的阴离子交换层析以及反相层析。

在一种实施方案中，步骤按照以下顺序进行：第一次阴离子交换层析、疏水作用层析、染料亲和层析、任选的阳离子交换层析、和第二次阴离子交换层析。

第二次阴离子交换层析可以使用上面提到的与第一次阴离子交换层析相联系的典型的阴离子交换树脂进行。第二次阴离子交换层析优选地是强阴离子交换层析，其使用具有-N⁺(CH₃)₃官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。可用于本发明目的的强阴离子交换树脂的优选的实例是季铵强阴离子交换树脂，其在本领域已知为UNOsphere Q，QSepharose HP和其他的具有季铵(Q)部分的树脂。强阴离子交换剂UNOsphere Q和Q Sepharose HP的特征在上面在第一次阴离子交换层析方面给出。在第二次阴离子交换层析步骤中，也优选的避免使用弱的阴离子交换树脂，如基于以二乙基氨基乙基(DEAE)或者二甲基氨基乙基(DMAE)作为官能团的那些树脂。

阴离子交换层析步骤优选的使用弱碱性pH，例如约pH 7.0至约9.0，或者约7.5至约8.5的缓冲液进行。合适的溶液包括，例如，硼酸盐缓冲液，三乙醇胺/亚氨基二乙酸，Tris，乙酸铵，tricine，N-二(羟乙基)甘氨酸，TES，HEPES，TAPS。优选地使用Tris缓冲液。通常通过加盐，优选的氯化钠增加流动相的电导率实现从阴离子交换树脂上的洗脱。

在一个实施方案中，第二次阴离子交换层析使用pH 7.0至9.0的Tris-HCl/NaCl缓冲液作为洗脱剂进行。

在另一方面，按照本发明纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将含有所述FSH或FSH变体的液体进行步骤

-阴离子交换层析，

-疏水作用层析，和

染料亲和层析，

所述步骤可以以任意顺序进行，

其中该方法避免了弱的阴离子交换层析以及反相层析，并且

其中该方法进一步包括大小排阻层析。

在另一方面，按照本发明纯化重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法包括将含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行步骤

-阴离子交换层析，

-疏水作用层析，

-染料亲和层析，

任选的阳离子交换层析，

任选的进一步的阴离子交换层析，和

大小排阻层析，

这些层析可以以任意顺序进行，

其中所述方法避免弱的阴离子交换层析以及反相层析。

在一个实施方案中，步骤按照以下顺序进行：阴离子交换层析，疏水作用层析，染料亲和层析，任选的阳离子交换层析，任选的进一步的阴离子交换层析和大小排阻层析。

在一个优选的实施方案中，本发明包括以下顺序的以下步骤：第一次阴离子交换层析，疏水作用层析，染料亲和层析，任选的阳离子交换层析，任选的第二次阴离子交换层析和大小排阻层析。

大小排阻层析(SEC)，也已知为凝胶过滤层析，是一种层析方法，其中颗粒例如蛋白质和其他的生物分子基于它们的大小分开。SEC典型的凝聚介质是聚丙烯酰胺，葡聚糖，琼脂糖或者其混合物。SEC基质可以从许多层析配件和层析柱制造商中购买，例如从Tosoh Bioscience LLC或者GE Healthcare购买。

大小排阻层析优选的使用交联琼脂糖和葡聚糖的球形复合材料的基质进行。

大小排阻层析基质的有用的实例是现有技术中已知为Superdex 75pg，例如可以从GE Healthcare购买的基质。Superdex 75pg柱允许根据大小高分辨率分离蛋白质，多肽和其他的生物分子。一般，大小排阻柱在纯化程序中是理想的精制步骤。

Superdex 75pg基质的技术细节如下：

SEC步骤可以按照制造商的方案进行。例如，可以使用pH 6至8的磷酸钠缓冲液，优选的pH值约7.0。

在本发明优选的实施方案中，本发明方法包括以下顺序的以下步骤：第一次阴离子交换层析，疏水作用层析，染料亲和层析，阳离子交换层析，第二次阴离子交换层析和大小排阻层析。

在一个优选的实施方案中，本发明方法中的阳离子交换层析步骤以膜阳离子交换进行。优选地，阳离子交换步骤用固定在膜上的强酸性阳离子交换剂磺酸或者具有类似特征的交换剂进行。

进一步的，本发明的方法包括一种或多种超滤和/或纳米过滤步骤。超滤是膜过滤的形式，其中静水压力推动液体穿过半透膜。悬浮的固体和大分子量的溶质被截留，而水和小分子量的溶质穿过膜。超滤是纯化和浓缩大分子溶液、特别是蛋白质溶液常用的分离方法。超滤和纳米过滤类似，然而它依据截留的分子的大小不同。在本发明的框架中，优选10kDa(10kDa UF)的截留分子量。超滤膜(UF膜)也可以用于渗滤以通过重复或者持续的稀释和再浓缩从溶液中去除盐和其他微生物。

在本发明一个优选的实施方案中，纯化方法包括一个或多个超滤/渗滤和/或纳米过滤步骤。这些过滤步骤可以使用商购的过滤设备，例如可从GE Healthcare或者Sartorius购买的过滤设备进行。

超滤优选的使用Sartorius销售的Sartocon盒和Sartocon Slice盒进行。

Sartorius销售的错流盒中用到的聚醚砜膜(PESU)是稳定的膜聚合物，其特征是宽的pH和温度范围。

也可以使用Sartorius销售的Hydrosart

超滤盒。Hydrosart是一种稳定的基于纤维素的膜，其已经为生物技术应用进行了优化。以下标称的截留分子量的Hydrosart超滤膜和试剂盒是可购买的：2kD，5kD，10kD和30kD。

在一个优选的实施方案中，纯化方法包含纳米过滤步骤。纳米过滤可以使用任何可用的纳米过滤设备进行。纳米过滤优选地使用Planova滤器进行，所述滤器可从Asahi Kasei Medical Co.，Ltd得到。

设计Planova滤器以在生物治疗药物产品如生物药剂的生产中去除病毒。它们是基于中空纤维微孔膜，此种膜由具有狭窄的孔分布的天然亲水的铜铵再生纤维素构成。可得到Planova滤器，其为单次使用的自主式模块，15nm，19nm，35nm和72nm的四种平均孔径(分别为Planova15N，20N，35N和75N)。在本发明的方法中，优选地使用Planova 15N滤器，即具有平均孔径15nm的滤器。滤器按照供应商的方案使用。

优选地，按照本发明纯化促卵泡激素的方法不包含金属离子亲和层析。

进一步地，优选的本发明的方法还避免免疫亲和层析。没有免疫亲和层析步骤的促卵泡激素的纯化消除了来源于抗体制备的杂质或传染物对促卵泡激素化合物可能导致的干扰。

在另一个实施方案中，本发明涉及纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的方法，其包括将含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行膜阳离子交换剂的步骤。

在一个优选的实施方案中，膜阳离子交换剂是一种固定在膜上的强酸性阳离子交换剂磺酸，或者具有类似特征的交换剂。

本发明的方法中使用的合适的膜吸附剂是本领域众所周知的并且可以从一些供应商购买。例如，本发明方法的阳离子交换层析可以使用膜进行，所述膜由再生纤维素制成，并且具有在纤维素骨架上形成的磺酸的层析基质。一种有用的膜吸附剂的实例是Sartorius出售的Sartobind S膜吸附剂。它的技术细节在上面给出。

在另一个实施方案中，本发明涉及纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的方法，其包括将含有促卵泡激素的液体进行膜阳离子交换剂的步骤，其进一步的包括疏水作用层析。

本发明方法中的疏水作用层析方法可以按照上面在纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的方法的方面所述的进行，包括将含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行阴离子交换层析，疏水作用层析，染料亲和层析，这些层析可以以任意顺序进行，其中所述方法既不包含弱的阴离子交换层析也不包含反相层析，和其优选的实施方案。

在一个优选的实施方案中，疏水作用层析使用用苯基或丁基衍生的交联琼脂糖珠组成的树脂或者具有类似特征的树脂进行。

除非另外指出，下列定义旨在说明和定义用于描述本发明的多种术语的含义和范围。

术语“FSH”指的是卵泡刺激激素多肽，作为全长的成熟蛋白，其包含但不限于人FSH或者“hFSH”，其通过重组方法或者从人源分离如绝经后的妇女尿液中产生。本领域的技术人员可以从科学和专利文献上(参考例如，WO2004/087213)知道人糖蛋白的蛋白质序列和人FSHβ亚基的蛋白质序列。

人促卵泡激素的α链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，并且人促卵泡激素的β链的氨基酸序列如说明书所附的SEQ ID No.2所示。这些氨基酸序列对应于EMBL数据库中以登录号J00152和NCBI数据库中以登录号NM_OOO510中分别保持的人促卵泡激素的α链和β链的野生型氨基酸序列。

编码人促卵泡激素的野生型核酸序列在SEQ ID No.3(＝α链)和SEQID No.4(＝β链)中显示。

重组的促卵泡激素可以由在人体内发现天然的野生型核酸序列编码，或者也可能由改变的核酸序列编码，其表达导致具有野生型氨基酸序列的促卵泡激素，即在人体内天然发现的野生型蛋白质序列。

编码人促卵泡激素的核酸序列可以例如如此改变使得编码人促卵泡激素的α链和/或β链的一条或者两条核酸序列已经适应在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的密码子选择，以便增加重组促卵泡激素在这些宿主细胞中的表达水平和产量。

在国际专利申请WO2009/00913中描述了核酸序列的实例，该核酸序列编码人促卵泡激素并且在CHO细胞中的密码子选择方面进行了修饰。编码人促卵泡激素β链的经修饰的核酸序列是SEQ ID No.5中描述的核酸序列的编码区(在SEQ ID No.5中编码区从56位核苷酸开始并且延伸到442位核苷酸)，并且编码人促卵泡激素α链的经修饰的核酸序列是SEQID No.6中给出的核酸序列的编码区(在SEQ ID No.6中编码区从19位核苷酸开始并且延伸到366位核苷酸)。一种CHO细胞系包含重组的核酸分子，其包含编码人促卵泡激素β链的第一个经修饰的核酸序列和编码人促卵泡激素的α链的第二个经修饰的核酸序列，此细胞系在2007年3月28日保藏在不伦瑞克的德意志微生物保藏中心，保藏号是DSMACC2833。

在一个优选的实验方案中，按照本发明的促卵泡激素的液体制剂包含重组的人野生型促卵泡激素，其通过促卵泡激素核酸序列的重组基因表达得到，所述核酸序列在CHO细胞中的密码子选择方面对人促卵泡激素的β链和人促卵泡激素的α链进行了修饰。在另一个优选的实验方案中，通过公开在WO2009/00913中的促卵泡激素核酸序列的表达得到重组的促卵泡激素。

表达“促卵泡激素变体”意在包括与人促卵泡激素在氨基酸序列，糖基化模式或者亚基间连接不同但是显示促卵泡激素活性的那些分子。实例包括CTP-FSH，其是长效的经修饰的重组促卵泡激素，其由野生型的α亚基和杂合的β亚基组成，其中在杂合的β亚基中，hCG的羧基端的肽融合到FSH的β亚基的C端，如LaPolt等人(1992)Endocrinology，131，2514-2520或者Klein等人(2003)Human Reprod.，18，50-56所述。也包含一个单链的CTP-FSH，其是如文献Klein等人(2002)Fertility &Sterility，77，1248-1255描述的单链分子。其他的促卵泡激素变体的实例包括在WO 01/58493中公开的促卵泡激素分子，其具有掺入α亚基和/或β亚基中的额外的糖基化位点，和在WO 98/58957中公开的具有亚基间S-S键的促卵泡激素分子。在WO2004/087213中公开了其他促卵泡激素变体的实例，其以β亚基羧基端的缺失为特征。其他促卵泡激素变体的实例包括促卵泡激素分子，其与野生型促卵泡激素相比具有改变的糖基化程度，这是由于蛋白质氨基酸序列的改变，由此引入了额外的糖基化位点或者缺失了天然存在的糖基化位点。

此外，按照本发明的促卵泡激素或者促卵泡激素变体可以是被化学部分修饰的促卵泡激素分子。这些促卵泡激素缀合例如可以包含聚(亚烷基)二醇(如PEG)，羟基烷基淀粉(如HES)或者其他的聚合部分。

促卵泡激素异源二聚体或者促卵泡激素变体异源二聚体可通过任何合适的方法生产，如重组，从天然来源中分离或者纯化，或者通过化学合成，或者其任何组合。

术语“重组”的使用指的是通过使用重组DNA技术产生的促卵泡激素或者促卵泡激素变体的制备物(例如见WO 85/01958)。一些物种的促卵泡激素α亚基和β亚基的基因组和cDNA克隆的序列是已知的。多种使用重组技术生产重组促卵泡激素或者促卵泡激素变体的方法在现有技术描述，例如参考欧洲专利申请EP0711894和欧洲专利申请EP0487512。

优选的，按照本发明纯化的促卵泡激素具有根据SEQ ID No.1的α亚基和根据SEQ ID No.2的β亚基。

在另一方面，本发明涉及到按照本发明的纯化方法得到的纯化的促卵泡激素或者促卵泡激素变体蛋白。

本发明进一步的涉及到一种药物组合物，其包含使用本发明的方法纯化的促卵泡激素或者促卵泡激素变体以及可药用的赋形剂。在一个优选的实施方案中，药物组合物含有防腐剂并且可以用于多剂量施用。优选的药物组合物在PCT/EP2009/051451中描述。

进一步的，本发明也涉及到使用本发明的方法纯化的促卵泡激素或者促卵泡激素变体的用途，或者涉及药物组合物在治疗生育病症中的用途，所述药物组合物包含所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体和可药用赋形剂的组合。

重组的人促卵泡激素是使用本发明的方法从宿主细胞培养物的上清液中纯化出来的。重组的人促卵泡激素或者其变体优选地如国际专利申请WO 2009/000913描述的生产。

更优选的，促卵泡激素是人促卵泡激素，其重组生产，特别优选地，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞来生产，所述细胞用包含编码人促卵泡激素的糖蛋白α亚基和β亚基的DNA序列的载体转染，所述α亚基和β亚基由SEQ ID No.3和4编码(＝野生型的核酸序列)，或者由SEQ ID No.5和6编码(＝密码子优化的核酸序列)。编码α亚基和β亚基的DNA序列可以存在于相同或者不同的载体上。

相对于它的尿液对应物，重组的促卵泡激素具有几个优点。使用重组细胞的培养和分离技术允许批次之间的一致性。相比，批次与批次之间的尿液促卵泡激素在这些特征如纯度、糖基化模式、亚基的唾液酸化作用和氧化方面改变很大。由于重组的促卵泡激素更好的批次之间的一致性和纯度，此激素可使用技术如等电聚焦(IEF)来容易地鉴定和定量。可以鉴定和定量重组促卵泡激素的容易性允许根据激素的质量装到小瓶中而非根据生物测定来装填。

术语“促卵泡激素活性”指的是促卵泡激素制剂引起与促卵泡激素相关的生物反应的能力，如在Steelman-Pohley测定(Steelman等人(1953)Endocrinology 53，604-616)中卵巢重量增加或者在女性患者体内卵泡的生长。在女性患者体内卵泡的生长可通过超声来评估，例如按照在刺激后第8天具有约16mm的平均直径的卵泡数目。生物活性按照促卵泡激素可接受的标准评估。

重组的促卵泡激素的特异体内生物活性通常是约8000IU FSH/mg蛋白质至约16000IU FSH/mg蛋白质。例如，商业上可购买的重组人促卵泡激素产品Puregon(从Organon购买)具有约10000IE/mg蛋白质的特异生物活性，并且对于来自Serono的Gonal-f，该重组人促卵泡激素的生物活性是约13600IE/mg蛋白质。

促卵泡激素的活性可以用已知的涉及到促卵泡激素和其他的促性腺激素的方法来测定。这些方法包括，例如酶免疫活性测定(EIA)或者报告基因测定。生物活性通常按照欧洲药典第5版中公开的关于尿液来源的促卵泡激素的生物测定来检测，通过比较促卵泡激素在增大用绒毛膜促性腺激素处理的未成熟大鼠卵巢中的效果与标准制剂的相同效果来评估生物活性。

促卵泡激素或者促卵泡激素变体的生物活性可以通过在给定的条件下，比较促卵泡激素在增大用绒毛膜促性腺激素处理的未成熟大鼠卵巢中的效果与使用国际标准制剂或者以国际单位校准的参考制剂(欧洲药典第5版)的相同效果来评估。

体外促卵泡激素活性的测定例如按照Albanese等人(1994)Mol.CellEndocrinol.101：211-219所述。

按照本发明的方法得到的促卵泡激素或者促卵泡激素变体的纯度至少是95％，优选地至少是97％，更优选地纯度至少是99％，最优选地超过99％。可以通过HPLC分析来测定纯度。进行这些分析的合适的材料和方案可以从供应商如Vydac或者TOSOH Bioscience得到。

提供的以下的实例仅仅进一步的说明本发明的纯化方法。本发明的范围不应当理解为仅由以下的实施例组成。

实施例

实施例1

通过重组技术制备重组人促卵泡激素

按照标准方法从转染的CHO宿主细胞中生产重组人促卵泡激素。这些方法包括产生CHO细胞克隆，其从编码人促卵泡激素α链和β链的一种或多种重组核酸中产生重组人促卵泡激素，并且在合适的条件下培养宿主细胞。然后按照本发明的方法从细胞培养物中纯化重组人促卵泡激素。

在一个优选的实施方案中，按照国际申请专利WO2009/000913所述生产重组人促卵泡激素。

实施例2

从细胞培养物中纯化促卵泡激素。

纯化方案如下：

发酵持续时间是28天，并且发酵体积是30L。收获物用0.22μm过滤并用反渗透水(RO water)稀释3.5倍。

阴离子交换层析(AEC)步骤：

将稀释的细胞培养上清液收获物应用于阴离子交换层析，其使用的是季铵强阴离子交换树脂，在本领域已知为UNOsphere Q。这种基质可从BioRad购买。

将三个柱体积(CV)的50m M，pH 7.6的Tris-HCl用于平衡。层析柱用收获物装载(用反渗透水按照1∶3.5稀释，收获物滴度约是1.8μgFSH/mL)，并且之后用5倍柱体积(5CV)的50m M，pH 7.6的Tris-HCl洗涤。然后用5倍柱体积(5CV)的50m M Tris-HCl，15m M NaCl，pH7.6洗涤柱体，并且用8倍柱体积(8CV)的50m M Tris-HCl，200m MNaCl，pH 7.6洗脱蛋白质。此步骤的产率是90％和更高。

疏水作用层析(HIC)步骤：

HIC使用用由苯基衍生的交联琼脂糖珠构成的树脂进行。PhenylSepharose 6FF(可从GE Healthcare购买)是一种基于琼脂糖的高度交联的衍生物。它是物理和化学稳定的，其允许高流速和增加的树脂寿命。这种树脂的技术细节在上文给出。

汇集八份阴离子交换层析的洗脱液并用50m M Tris-HCl，4.5MNaCl，pH 7.6稀释3倍。疏水作用层析柱用4倍柱体积(4CV)50m MTris-HCl，3M NaCl，pH 7.6平衡，并且装载1∶3稀释的阴离子交换层析洗脱液。然后用3倍柱体积(3CV)50m M Tris-HCl，3M NaCl，pH 7.6洗涤层析柱，并且用5倍柱体积(5CV)50m M Tris-HCl，1.8M NaCl，pH 7.6洗涤柱体。发现具有1.8M NaCl的洗涤缓冲液具有很好的清洗潜力且没有可检测到的促卵泡激素的损失。然后用6倍柱体积(6CV)的50mM Tris-HCl，0.8M NaCl，pH 7.6洗脱蛋白质。

疏水作用层析步骤的促卵泡激素的产率是＞95％，在上样过程中没有任何明显的损失，并且具有约10的好的总蛋白质清除潜力。这些数据表明开发的疏水作用层析步骤是非常高效的纯化步骤，其具有合理的产率和产品质量。

染料亲和层析步骤：

染料亲和层析步骤使用Blue Sepharose FF，其可从GE Healthcare公司购买。疏水作用层析洗脱液用50m M Tris-HCl，pH 7.6溶液稀释4倍。使用3倍柱体积(3CV)的50m M Tris-HCl，pH 7.6平衡柱体，并且将1∶4稀释的疏水作用层析洗脱液加到柱上。用3倍柱体积(3CV)50m MTris-HCl，pH 7.6洗涤柱体，并且用6倍柱体积(6CV)50m M Tris-HCl，4M NaCl，pH 7.6洗脱促卵泡激素蛋白。

在亲和层析之后，病毒灭活步骤通过将洗脱液在15％的2-丙醇中温育2小时进行。为此目的，染料亲和层析的洗脱液用50m M Tris-HCl，30％2-丙醇，pH 7.6稀释2倍，得到了50m M Tris-HCl，15％2-丙醇，2M NaCl，pH 7.6。在温育2小时后，病毒灭活的染料亲和层析洗脱液用20m M Tris-HCl，pH 7.0稀释2倍。

10kDa UF/DF：

超滤和渗滤通常按照标准方案进行。有用的UF/DF设备是来自Sartorius的Sartocon超滤/渗滤盒(聚醚砜(PESU)，10kD)(过滤器面积：14000cm²，UF因子：13-20，DF因子：8-10，上样：0.1-0.5mg FSH/cm²)。用UF/DF设备的渗滤通常用超滤(浓缩)系数13-20和渗滤系数8-10进行。

病毒灭活的染料亲和层析洗脱液在Tris-HCl缓冲液(20m MTris-HCl，pH 7.0)中渗滤并且直接上样到阳离子膜吸附剂上。

阳离子膜吸附剂步骤：

本发明方法的阳离子交换层析使用再生纤维素制成的膜进行，并且其具有在纤维素骨架上形成的磺酸的层析基质。这种膜吸附剂可从Sartorius购买，其商品名称是Sartobind S膜吸附剂。Sartobind S膜吸附剂是有几层膜的胶囊，在其上固定了配体。膜吸附剂具有短处理时间和低缓冲液体积的优点。由于是一次性使用的想法，验证成本和时间可忽略不计。

膜吸附剂用20m M Tris-HCl，pH 7.0(200mL)平衡并且用10kDaUF/DF滞留物(大约100mL)上样。再用20m M Tris-HCl，pH 7.0(200mL)洗涤吸附剂。

在膜吸附剂上的处理是减少处理时间的流通模式。进一步的，无负荷调节对于下一个处理步骤(阴离子交换层析)是必须的。在流通中产品产率非常好。在不同的缓冲液系统中在6.0，6.5，7.0的pH值下用SartobindS组件上处理时几乎没有产品的损失。

阳离子膜吸附剂步骤对于HCP(宿主细胞蛋白)的清除是非常有利的。90％-95％的产率是非常有利的，因为在20m M Tris-HCl，pH 7.0缓冲液系统中，待纯化的促卵泡激素不与吸附剂结合。

阴离子交换层析步骤：

第二次阴离子交换层析使用季铵强阴离子交换树脂进行，其在本领域已知为Q Sepharose HP。这种树脂可从GE Healthcare得到。

用三倍柱体积(CV)的20mM，pH 7.0的Tris-HCl平衡阴离子交换层析柱。将膜吸附剂流通收集物(3CV)加到柱体上，并且柱体首先用2倍柱体积(2CV)的20mM，pH 7.0的Tris-HCl洗涤，再用3倍柱体积(3CV)的20mM，pH 8.5的Tris-HCl洗涤，并且最后用5倍柱体积(5CV)的20mM Tris-HCl，60mM NaCl，pH 8.5洗涤。然后用6倍柱体积(6CV)20mM Tris-HCl，130mM NaCl，pH 8.5洗脱促卵泡激素。

Q Sepharose HP洗脱液具有与商品GONAL-f

相当的非常高的纯度。

10kDa UF：

10kDa UFd超滤按照标准方案使用来自Sratorius(过滤器面积：3000cm²，UF系数：10-30，上样：0.2-1.0mg FSH/cm²)的Sartocon超滤盒(PESU，10kDa)进行。超滤通常用超滤(浓缩)系数10-30进行。

大小排阻层析(SEC)步骤：

大小排阻层析使用Superdex 75pg进行，其可从GE healthcare买到。层析柱用2倍柱体积(2CV)的50m M Na-PO₄，pH 7.0平衡。将0.025柱体积(0.0025CV)的10kDa UF滞留物加到柱体上，并且柱体再用2倍柱体积(2CV)的50m M Na-PO₄，pH 7.0洗涤。

大小排阻层析洗脱液具有与商品GONAL-f

位于同样范围内的高纯度。

纳米过滤：

最终SEC洗脱液使用Planova 15N滤器进行纳米过滤，该滤器由AsahiKasei Medical Co.，Ltd销售，平均孔径是15nm。目标最大上样量是2.5mL/cm²。过滤按照供应商的方案进行。

通过SE-HPLC和SDS-PAGE测定纯化的促卵泡激素的纯度。得到的促卵泡激素的纯度和具体的杂质如下：

重组人促卵泡激素的生物活性测定为至少约10000IU/mg。优选地，重组人促卵泡激素或者促卵泡激素变体的生物活性是在约10000IU/mg至约17000IU/mg的范围内，更优选地，生物活性至少是约12000IU/mg，最优选的生物活性至少是约15000IU/mg。

序列表

SEQ ID No.1：人促卵泡激素α链的氨基酸序列

SEQ ID No.2：人促卵泡激素β链的氨基酸序列

SEQ ID No.3：编码人促卵泡激素α链的野生型核酸序列

SEQ ID No.4：编码人促卵泡激素β链的野生型核酸序列

SEQ ID No.5：编码人促卵泡激素β链的密码子优化的核酸序列

SEQ ID No.6：编码人促卵泡激素α链的密码子优化的核酸序列

Claims

1.纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的方法，其包括将含有所述重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的液体进行：

-阴离子交换层析，

-疏水作用层析，和

-染料亲和层析，

这些步骤以任意顺序进行，

其中所述方法既不包括弱的阴离子交换层析又不包括反相层析。

2.权利要求1的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行：

a)阴离子交换层析，

b)疏水作用层析，和

c)染料亲和层析。

3.权利要求1或2的方法，其中所述阴离子交换层析使用具有-N⁺(CH₃)₃官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。

4.前述权利要求任一项的方法，其中所述疏水作用层析使用以苯基或者丁基衍生的交联琼脂糖珠组成的树脂或者具有类似特征的树脂进行。

5.前述权利要求任一项的方法，其中所述染料亲和层析使用CibacronBlue 3G作为配体共价的偶联到任何基质进行。

6.前述权利要求任一项的方法，其中所述层析使用pH在7.0至9.0范围内的Tris-HCl/氯化钠缓冲液作为洗脱剂进行。

7.前述权利要求任一项的方法，所述方法进一步包括阳离子交换层析。

8.权利要求7的方法，其中所述膜阳离子交换层析用固定在膜上的强酸性阳离子交换剂磺酸或者有类似特征的交换剂进行。

9.权利要求7或者8的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行：

a)阴离子交换层析，

b)疏水作用层析，

c)染料亲和层析，和

d)阳离子交换层析。

10.权利要求1至6任一项的方法，进一步包括另一阴离子交换层析。

11.权利要求10的方法，其中所述阴离子交换层析使用具有-N⁺(CH₃)₃官能团的强阴离子交换树脂或者具有类似特征的树脂进行。

12.权利要求10或11的方法，其中所述阴离子交换层析使用pH在7.0至9.0范围内的Tris-HCl/氯化钠缓冲液作为洗脱剂进行。

13.权利要求10至12任一项的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行：

a)第一次阴离子交换层析，

b)疏水作用层析，

c)染料亲和层析，

d)任选的阳离子交换层析，和

e)第二次阴离子交换层析。

14.权利要求1至6任一项的方法，所述方法进一步包括大小排阻层析。

15.权利要求14的方法，其中所述大小排阻层析使用交联琼脂糖和葡聚糖的球形复合材料的基质进行。

16.权利要求14或者15的方法，其中所述步骤按照以下顺序进行：

a)第一次阴离子交换层析，

b)疏水作用层析，

c)染料亲和层析，

d)任选的阳离子交换层析，

e)任选的第二次阴离子交换层析，和

f)大小排阻层析。

17.前述权利要求任一项的方法，其包括以下顺序的以下步骤：

a)第一次阴离子交换层析，

b)疏水作用层析，

c)染料亲和层析，

d)膜阳离子交换，

e)第二次阴离子交换层析，和

f)大小排阻层析。

18.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括一个或多个超滤和/或纳米过滤步骤。

19.前述权利要求任一项的方法，其中不进行金属离子亲和层析。

20.前述权利要求任一项的方法，其中不进行免疫亲和层析。

21.纯化重组促卵泡激素或者重组促卵泡激素变体的方法，其包括将含有所述促卵泡激素或者促卵泡激素变体的液体进行膜阳离子交换剂的步骤。

22.权利要求21的方法，其进一步包括疏水作用层析。

23.权利要求21或者22的方法，其中所述膜阳离子交换剂是强酸性阳离子交换剂磺酸，或者具有类似特征的交换剂。

24.前述权利要求任一项的方法，其中所述促卵泡激素具有根据SEQID No.1的α亚基和根据SEQ ID No.2的β亚基。

25.前述权利要求任一项的方法得到的促卵泡激素或者促卵泡激素变体。

26.药物组合物，其包含根据权利要求25的促卵泡激素或者促卵泡激素变体以及可药用赋形剂。

27.根据权利要求25的促卵泡激素或者促卵泡激素变体或者根据权利要求26的药物组合物用于治疗生育病症的用途。