CN102433331B - 一种甘蓝型油菜低亚麻酸分子标记及其制备方法与应用 - Google Patents
一种甘蓝型油菜低亚麻酸分子标记及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种与甘蓝型油菜亚麻酸含量紧密连锁的共显性SNP分子标记的制备，及其作为标记在辅助选择低亚麻酸甘蓝型油菜中的应用。用引物扩增低亚麻酸甘蓝型油菜品系甲A254和高亚麻酸甘蓝型油菜品系甲A177基因组DNA，分别得到两个DNA扩增片段，然后对所述4个DNA扩增片段进行克隆、测序、核苷酸序列比对；根据序列的差异，将正向引物和反向引物的3’端的第2个碱基同时进行错配处理，设计了引物对YQ-fad32-1和YQ-fad32-2。将引物对YQ-fad32-1和YQ-fad32-2进行PCR扩增，PCR扩增和群体检测效果分析，进而得到与甘蓝型油菜低亚麻酸基因连锁的共显性SNP分子标记，本发明的为油菜分子育种提供了一种新标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：7和8所示。
Description
技术领域
本发明是申请号为200910273437.1申请案的分案申请。
本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜低亚麻酸分子标记的制备及应用。所述的分子标记可以作为低亚麻酸甘蓝型油菜育种标记辅助选择，为培育遗传稳定的低亚麻酸油菜新品种提供新的分子标记。
背景技术
油菜种子中脂肪酸组成直接决定着菜籽油的品质和对人的营养价值。亚麻酸是高度不饱和脂肪酸中氧化比率最高的脂肪酸，与空气、光、热等接触后极易发生氧化形成恶臭氧化物，使菜油变质而不耐贮藏。更为严重的是亚麻酸的氧化产物对人体有害，可以引起心血管粥样硬化(Chang等，Effects of the ratio ofpolyunsaturated and monounsaturated fatty acid on rat plasma and liver lipid concentration.Lipids，1998，33：481-487)。不饱和脂肪酸的双链断裂后，比较容易形成自由基，即出现脂质过氧化反应，从而会损伤细胞与细胞膜的结构与功能(孔祥瑞，必需微量元素的营养生理及临床意义.合肥：安徽科学出版社.1982：3-60)，直接影响细胞的分裂、生长发育、繁殖和遗传。菜籽油中α-亚麻酸氧化后还会使油脂带有较强的辛辣味。因此，降低菜籽油中亚麻酸含量是育种家在甘蓝型油菜品质育种方面的长期目标(Rachael Scarth等，Designer oil canola-a review of new food-grade Brassica oils with focus on high oleic，low linolenic types，10thInt.Rapeseed Congress，1999)。
目前国内外低亚麻酸遗传资源还很缺乏，在将低亚麻酸性状导入到高产的高亚麻酸品种时主要利用传统的表型选择方法。由于甘蓝型油菜中亚麻酸含量受多基因控制，存在育种周期长、效率低等缺点。现代生物技术中的分子标记辅助选择技术，与传统表型选择相比有诸多优点。分子标记辅助选择可在任何生长期进行，不受环境条件影响，可排除非等位基因相互作用而造成的干扰，具有快速、经济，效率高、准确性强的特点。在甘蓝型油菜低亚麻酸育种过程中将分子标记技术与回交育种相结合，可借助分子标记对性状的基因型进行直接而快速进行前景选择，以排除环境和外界因素的影响。同时可利用分子标记对背景进行选择，从而加快遗传背景恢复速度，缩短育种年限和减轻连锁累赘。而开展这些工作的前提之一是开发高效的分子标记。
在低亚麻酸目的性状的定位方面，国内外的研究者已经取得很多的研究成果。Somers等(Somers等，Identification of Molecular Markers Associated with Linoleic Acid Desaturation in Brassica napus，TheoreticalandApplied Genetics，1998，96.897-903)利用BSA法在由115基因型组成的DH群体中，找到16个与亚麻酸含量有关的RAPD标记，位于3个连锁群，分别解释32％，14％和5％的表型变异，甘蓝型油菜fad3基因定位于解释14％变异的这个连锁群上。三个QTLs间表现加性效应，共解释51％的变异。HU等(Hu J等，Mapping of a gene determining linolenic acid content in rapeseed with DNA based markers.Theor Appl Genet1995，90：258-262)也找到一个与亚麻酸含量相关的RAPD显性标记，该标记扩增片段大小为650bp。他们进一步将此片段克隆、测序，转化为显性的SCAR标记。(Hu J等，SCAR and RAPD marker associatedwith 18-carbon fatty acids in rapeseed，Brassica napus.Plant Breeding，1999，118：145-150)。Cheung等(Cheung等，Molecular mapping of seed quality traits in(Brassica juncea L.)czern.and coss.Acta Horticulturae，1998，459：139-147)发现两个控制亚麻酸含量的QTLs一个位于fae1位点一个位于fad3位点。Jourdren等(Jourdren等，Specific molecular marker of the genes controlling linolenic acid content in rapeseed.Theor Appl Genet，1996b，93：512-518)定位了两个与亚麻酸含量有关的QTLs和fad3基因紧密相关。Lionneton等(Lionneton等，Development of an AFLP-based linkage map and localization of QTLs for seed fatty acid content incondiment mustard(Brassica juncea)Genome 2002，45：1203-1215)发现对于亚麻酸含量位于LG2上的一个QTL位点可解释41.2％的表型变异。
F.Javidfar等(F.Javidfar等，Identification of molecular markers associated with oleic and linolenic acid inspring oilseed rape(Brassica napus).Plant Breeding，2006，125：65-71)用一个高油酸，低亚麻酸品种(C18:1＞79％，C18:3＜2％)T099-5318-20与一个高油酸，高亚麻酸(C18:1＝68％，C18:3＞7％)DH系DH12075杂交。得到8个与油酸和亚麻酸含量关联的RAPD标记，其中RAPD标记UBC2830对油酸和亚麻酸含量变异的贡献率分别为43％和13％。RAPD标记UBC153550对亚麻酸含量变异的贡献率为19％。标记UBC2830被变换成SCAR标记。Somers等(Daryl Somers，US 2003/0150020A1，Aug.7，2003；Daryl Somers，US 7081564，July 25，2006)获得于低亚麻酸含量的SNP标记，Hu等(Hu等，Mapping ofthe loci controllingoleic and linolenic acid contents and development of fad2 and fad3 allele-specific markers in canola(Brassicanapus L.).Theor Appl Genet，2006，113：497-507)从DH作图群体中定位到了与甘蓝型油菜亚麻酸含量有关的主效QTL，控制低亚麻酸含量的一个主效QTL(fad3c)位于第14号染色体，另一个主效QTL位于第4号染色体，来自于A基因组。根据这些QTL，设计得到了两个与fad2，fad3相关的SNP(Single NucleotidePolymorphisms)标记。Zhao(Zhao J等.Mapping QTL controlling fatty acid composition in a doubled haploidrapeseed population segregating for oil content.Mol Breed，2008，21：115-125)在甘蓝型油菜N14上也检测到一个关于亚麻酸的QTL，解释了28％的遗传变异率。但由于Somers等(Daryl Somers，US 2003/0150020A1，Aug.7，2003；Daryl Somers，US 7081564，July 25，2006)及Hu等(2006)获得的SNP标记在引物设计时仅仅存在一个3’端的差异，在甘蓝型油菜亚麻酸辅助选择育种中的效果受到DNA模板浓度、引物合成质量、引物浓度、PCR反映体系及参数等多种因素等影响，使得其在实际生产中的应用存在受到很大限制。
发明内容
本发明的目的在于发展一种适用于选育具有低亚麻酸性状的甘蓝型油菜的分子标记，为甘蓝型油菜低亚麻酸育种提供一种简单、快速和有效的辅助选育方法。
本发明是通过以下方案实现：
申请人通过试验获得一种适用于选育具备低亚麻酸性状的甘蓝型油菜共显性SNP分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。本发明请求保护的重点是对序列表SEQ ID NO：7和8所示的核苷酸序列作为分子标记的保护。
本发明制备的一种甘蓝型油菜低亚麻酸含量的共显性SNP分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO：7和SEQ ID NO：8所示，如序列表SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示序列二者单独使用或组合使用作为甘蓝型油菜低亚麻酸SNP分子标记。
制备适用于甘蓝型油菜低亚麻酸性状的显性SNP分子标记的方法，按照以下步骤：
利用本申请人设计的引物HY-fad31、HY-fad32扩增低亚麻酸甘蓝型油菜品系甲A254和高亚麻酸甘蓝型油菜品系甲A177基因组DNA，分别得到两个DNA扩增片段，然后对所述4个DNA扩增片段进行克隆、测序，其中从甲A254中扩增得到如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，从甲A177中扩增得到如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
与序列表SEQ ID NO：2相比，在序列表SEQ ID NO：1的存在5个单碱基突变以及2个插入突变(见附图3)，申请人利用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中存在的突变位点28T→28C的单核苷酸多态性(SNP，Single Nucleotide Polymorphisms)，采用引物3’端错配技术策略(Drenkard等，A simple procedure for theanalysis of single nucleotide polymorphisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis.Plant Physiol，2000124：1483-1492)设计了引物对YQ-fad31-1及YQ-fad31-2。与序列表SEQ ID NO：4相比，在序列表SEQ IDNO：3的存在1个1450G→1450A的单碱基突变(见附图4)，申请人利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中存在的突变位点1450G→1450A的单核苷酸多态性，采用引物3’端错配技术策略设计了引物对YQ-fad32-1及YQ-fad32-2。将引物对YQ-fad31-1、YQ-fad31-2、YQ-fad32-1和YQ-fad32-2进行PCR扩增，得到与甘蓝型油菜低亚麻酸基因连锁的共显性SNP分子标记(即本发明的目标分子标记)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。其中序列表SEQID NO：5、SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列已经在本申请案的母案中请求作为分子标记的保护，本发明请求保护的重点是对序列表SEQ ID NO：7和8所示的核苷酸序列作为分子标记的保护。
在上述方法中，所用引物对的核苷酸序列如下所示：
引物对(1)，编号为HY-fad31：
正向引物5’-TGGACATGGGAGTTTCTC-3’，
反向引物5’-TTAGTTGATTTTGGATTTGTC-3’。
引物对(2)编号为HY-fad32：
正向引物5’-ACTCCACCCTGAGAACTT-3’，
反向引物5’-TTAGTTGATTTTGGATTTGTC-3’。
引物对(3)编号为YQ-fad31-1：
正向引物5’-GGAGTTTCTCAGACATTCGT-3’，
反向引物5’-GTGTCGTCCAAGCCTCTC-3’。
引物对(4)编号为YQ-fad31-2：
正向引物5’-GGAGTTTCTCAGACATTCGC-3’，
反向引物5’-GTGTCGTCCAAGCCTCTC-3
引物对(5)编号为YQ-fad32-1：
正向引物5’-CCTTGGTACAGAGGCAACA-3’，
反向引物5’-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3’。
引物对(6)编号为YQ-fad32-2：
正向引物5’-CCTTGGTACAGAGGCAATG-3’，
反向引物5’-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3’。
其中，引物对HY-fad31用于扩增序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；引物对HY-fad32用于扩增序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；引物对YQ-fad31-1、YQ-fad31-2分别用于扩增序列表中SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；引物对YQ-fad32-1、YQ-fad32-2分别用于扩增序列表中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。
本发明的积极效果：
本发明第一次将引物3’端错配策略应用于甘蓝型油菜SNP多态性标记的开发和检测；并第一次利用正向引物和反向引物同时错配手段在异源多倍体作物甘蓝型油菜中开发出基于PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳SNP标记。本发明成功得到甘蓝型油菜低亚麻酸的共显性SNP分子标记，运用该标记在低亚麻酸甘蓝型油菜的辅助选择中可以克服传统育种中依靠表型进行选择的缺点，减少育种工作量，缩短育种年限，加快了甘蓝型油菜低亚麻酸育种的进程。
更详细的技术方案参见《具体实施方式》。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1-4是本发明扩增的甘蓝型油菜品系甲A254和高亚麻酸甘蓝型油菜品系甲A177基因组DNA的基因组DNA获得的4个DNA片段(核苷酸序列)；
序列表SEQ ID NO：5-8是本发明制备的甘蓝型油菜亚麻酸含量分子标记的核苷酸序列。
图1：利用引物对HY-fad31在甘蓝型油菜品系甲A254和甲A177以及F1的基因组DNA中的扩增结果。图中：P1代表甲A254；P2代表甲A177；F1代表甲A254×甲A177；M代表DNA marker(片段大小依次为3000，2600，2050，1650，1000，700，500和278bp)。
图2：利用引物对HY-fad32在甘蓝型油菜品系甲A254和甲A177以及F1的基因组DNA中的扩增结果。图中：P1代表甲A254；P2代表甲A177；F1代表甲A254×甲A177；M代表DNA marker(片段大小依次为3000，2600，2050，1650，1000，700，500和278bp)。
图3：利用引物对HY-fad31在甘蓝型油菜品系甲A254和甲A177基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中：NO_1、NO_2分别代表序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的序列，实心黑三角形“▲”表示序列的第28T→28C的单碱基突变，设计的引物位置(即引物对YQ-fad31-1、YQ-fad31-2的正向引物位置)参见下划线处，空心三角形“▽”表示引物设计错配碱基。
图4：利用引物对HY-fad32在甘蓝型油菜品系甲A254和甲A177基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中：NO_3、NO_4分别代表序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列，实心黑三角形“▲”表示序列的第1450G→1450A的单碱基突变，设计的引物位置(即引物对YQ-fad32-1、YQ-fad32-2的正向引物位置)参见下划线处，空心三角形“▽”表示引物设计错配碱基。
图5：利用引物对HY-fad31、HY-fad32在甘蓝型油菜品系甲A254和甲A177基因组中的扩增的DNA片段序列比对，图中：NO_1、NO_2、NO_3、NO_4分别代表序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列，实心黑三角形“▲”表示引物对HY-fad31、HY-fad32在同一亲本中扩增的甘蓝型油菜fad基因的不同拷贝之间的单碱基差异；Pri.1代表引物对YQ-fad31-1、YQ-fad31-2的反向引物，Pri.2代表引物对YQ-fad32-1、YQ-fad32-2的反向引物，设计的引物位置参见下划线处，箭头代表引物方向，空心三角形“▽”表示引物设计错配碱基。
图6：本发明获得的引物YQ-fad31-1、YQ-fad31-2、YQ-fad32-1和YQ-fad32-2在甘蓝型油菜品系甲A254、甲177、F1以及利用(甲A254×甲A177)F1生产的D H群体的部分单株检测结果。图中：P1代表甲A254；P2代表甲A177；F1代表甲A254×甲A177；1-18代表DH群体中不同亚麻酸含量单株(图中正下方数值为单株亚麻酸含量，单位：％)；片段长度为所述引物扩增产物长度。
图7：是本发明的技术流程图。
具体实施方式
实施例1
1、制备F1代杂交种和建立双单倍体(DH)群体：
在本实施例中，以本单位选育的低亚麻酸含量(亚麻酸含量为2.28％)的甘蓝型油菜品系甲A254(该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC-P200909，该保藏的生物材料已在其母案申请中公开，母案申请的申请号为200910273437.1其公开号为：CN101818196A，其公开日为2010年09月01日)为母本，以普通亚麻酸含量(亚麻酸含量为7.78％)油菜高世代育种选系甲A177(该材料的种子已于2009年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC-P200908，该保藏的生物材料已在其母案申请中公开，母案申请的申请号为200910273437.1其公开号为：CN101818196A，其公开日为2010年09月01日)为父本进行杂交，得到F1种子。
将上述步骤得到的F1种子在自然条件下播种，得到F1植株，利用F1植株的花粉经小孢子培养得到190个双单倍体(简称DH)群体。
2、提取甘蓝型油菜基因组DNA
从上述步骤获得的DH分离群体以及双亲(即上述步骤所述的甘蓝型油菜甲A177及甲A254)的鲜嫩叶片中提取基因组DNA，具体制备方法参照李佳等(李佳等，一种有效提取油菜叶片总DNA的方法，华中农业大学学报，1994，13(5)：521-523)报道的方法进行，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，并用紫外分光光度计(型号：Pharmacia Biotech，GeneQuant II)检测DNA浓度。
3、亚麻酸含量的测定：
种子按单株收获后用气相色谱仪(HP6890，Genmany)，分析脂肪酸含量，亲本及后代混合样随机选取30-50粒饱满种子磨碎后倒入10ml试管，在试管中加入1ml乙醚、石油醚(体积比1∶1)混合液，然后再加入等体积的甲醇(含5％KOH)进行酯化反应，静置40分钟以上使其充分反应。最后加蒸馏水定容至10ml萃取，取上部醚层溶液取进样测定。若进行半粒材料分析，乙醚、石油醚(体积比为1∶1)混合液的加入量为100ul。
脂肪酸成份用气相色谱法测定，色谱条件如下
色谱仪：Hewlett Packard(HP6890，Genmany)，氢火焰离子化检测器，手动进样，进样量0.4ul(半粒分析进样量为0.8ul)，分流比1∶45；色谱柱HP-inowax19091N-133，30m×0.25mm×0.25um毛细管柱；检侧器和进样室温度分别为250℃和280℃；载气：N2，30ml/min，尾吹40min/min；空气流速：300ml/min；H2流速：30min/min；炉温：持续升温，180℃保持2分钟，之后以10℃/min升至220℃保持并保持7min。
脂肪酸成份由峰所在位置的保留时间与标准品对比确定，含量则用面积百分比表示。对测定的数据进行分析和整理时只考虑7种主要脂肪酸，即棕桐酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、花生烯酸(C20:1)、芥酸(C22:1)。
4、利用引物对HY-fad31、HY-fad32扩增分析双亲和F1的基因组DNA
利用本申请人开发的引物对HY-fad31、HY-fad32(引物对序列见表2)来扩增分析甘蓝型油菜品种甲A254和甲A177和F1的基因组DNA。
PCR反应体系如下：1×PCR buffer，1.35mM MgCl2，0.08mM dNTPs，1.0U Taq DNA聚合酶(均购自MBI Fermentas，Lithuania公司)，100ng DNA，正、反向引物各0.45μM，ddH2O补充至终体积20μl。热循环参数为：94℃C 3min；94℃C 30sec，复性温度45℃C sec，72℃C 60sec，29个循环；72℃C 10min，1个循环；4℃C保存，反应是在PTC-ALD1244PCR仪上完成。两个材料均进行两次重复。扩增产物在水平电泳槽上1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，使用1×TAE缓冲液(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH 8.0)，电压8V/cm，电泳35min。电泳完毕，凝胶成像系统(UVP)拍照保存。
本发明中引物对HY-fad31在双亲和F1的基因组DNA中扩增产物均为2150bp左右的亮带，该亮带包括很亮的目的带及比目的带稍大一点的非目标片段，双亲及F1扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶电泳检测片段长度无差异；引物对HY-fad32在双亲和F1的基因组DNA中扩增产物均为1950bp左右的单一亮带，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测片段长度无差异(实验见图1和表2)。
表2 本发明设计的引物对的编号及其核苷酸序列
注：(1)*表中粗体及下划线碱基(如G)代表该碱基在引物设计时进行了错配处理。
(2)依照描述的顺序，作为说明书的附件，已经单独提供了提供了的核苷酸序列和/或氨基酸计算机可读形式的副本中(请参见序列表)，上述表2所述的引物序列分别被处理成序列表SEQ ID NO：9-20，其与表2所示的引物序列是一致的。
5、回收、克隆、测序引物对HY-fad31、HY-fad32在双亲中扩增的DNA片段
回收上述步骤中获得的引物对HY-fad31、HY-fad32在甘蓝型油菜品种甲A254和甲A177中扩增的DNA片段。操作程序按GenClean柱式DNA胶回收试剂盒(购自上海捷瑞生物工程公司)说明书提供的方法：用刀片从1.0％的琼脂糖胶上挖出扩增的目的DNA片段，放入1.5ml的离心管，按每100mg琼脂糖凝胶加入300μl Binding Solution B，置于55℃C水浴中加热10min，每隔2min混匀一次；将融化的胶溶液转移至套在收集管内的GenClean Column中，室温放置2min，3,000rpm离心30sec；倒掉收集管中的废液，加入500μl Wash Solution，8,000rpm室温离心30sec，此步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将GenClean Column放入同一个收集管中，10,000rpm离心1min；将GenClean Column放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央加30μl Elution Buffer，室温放置2min；10,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃C备用。
取上述回收的目标DNA片段2μl作模板，用引物对HY-fad31、HY-fad32按照上述步骤进行PCR扩增，在1.0％的琼脂糖胶检测扩增的DNA片段。如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果不相同，需要重新扩增回收；如果扩增的DNA片段长度与上述步骤中扩增的结果相同，说明回收得到的DNA片段即是目标DNA片段，可用于下一步的T-A克隆。
将回收的目标DNA片段连接在pMDT-18载体上(该载体购自TaKaRa公司，即，宝生物工程(大连)有限公司代理)。操作程序按该试剂盒的说明书介绍的方法：试剂在使用前先短暂离心将其收集在管底部；在0.5ml的离心管中进行连接反应，连接反应体系为DNA 2.0μl，pMDT-18载体0.5μl和Solution I 2.5μl。用移液管来回吸几次混匀，置4℃冰箱进行过夜连接反应；准备LB液体培养基和LB固体培养基(含100mg/ml氨苄青霉素，24mg/ml的异丙基-硫代β-D-半乳糖苷和20mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷)；从-70℃冰箱中取出感受态细胞放在冰上待它慢慢解冻(约5min)；离心收集连接反应液，取2μl反应液加入到一个已经灭菌的1.5ml离心管(放在冰上预冷)；用手指轻弹装有感受态细胞的管底以混匀，取50μl感受态细胞加入装有2μl连接反应液的1.5ml离心管，用手指轻弹混匀，放在冰上20min；在42℃水浴中热激90sec(勿摇动)，然后在冰上放置5min；加500μl的LB液体培养基后在37℃振荡培养1h(150rmp/min)；吸取振荡培养后的转化液200μl涂在无菌的LB固体培养基上，在37℃放置16-20h；进行蓝、白斑筛选，挑选24个阳性克隆进行编号，并在无菌的液体LB培养基(含50ug/ml的氨苄青霉素)振荡培养16-20h；取振荡培养后的菌液2μl作PCR模板，用M13作引物(正向引物：5′-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3′；反向引物：5′-CGGATAACAATTTCACACAGGA-3′)扩增，PCR反应如上述步骤所述。扩增结果在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。如果所得的DNA片段比目标DNA片段大200bp左右，说明转化成功，选5份转化成功的菌液各吸取100μl送华大基因科技股份有限公司进行序列测定。剩余400μl浑浊菌液加400μl 50％无菌的甘油在2ml无菌的离心管中于-70℃编号保存。
本发明中，引物HY-fad31、HY-fad32在甲A254和甲A177中扩增的DNA片段各5次重复测序，其序列结果一致。其中引物HY-fad31在甲A254、甲A177中的扩增DNA片段长分别为2148bp、2137bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；引物HY-fad32在甲A254、甲A177中的扩增DNA片段长均为1963bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
6、制备甘蓝型油菜中与低亚麻酸性状连锁的SNP标记
对上述步骤得到的引物HY-fad31、HY-fad32在甲A254和甲A177中扩增的片段用EBI Tools ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)软件进行序列比对。比对结果显示，与序列表所示的SEQ ID NO：2相比，SEQ ID NO：1的存在4个单碱基突变以及2个插入突变，5个单碱基突变分别为：28T→28C、390A→390T、1692T→1703A、1723G→1734T、1865C→1876T；插入突变分别为在713-714处插入一个核苷酸T，在第1665-1666bp处插入一个10bp的核苷酸片段，插入碱基是ATGATTAGTA(见附图3)。与序列表SEQ IDNO：4相比，在序列表SEQ ID NO：3的在全长1963bp中仅存在1个1450G→1450A的单碱基突变(见附图4)。同时，将序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行多序列比对结果显示，在同一亲本中扩增出的甘蓝型油菜fad3基因不同拷贝间高度同源，差异部分主要集中在低GC含量区域，在GC含量适合设计引物的区域(40～60％)中，仅存在部分单碱基突变(见附图5)。
根据引物HY-fad31在甲A254和甲A177中扩增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示)，利用报道的Primer Premier 5.0软件(http://www.PremierBiosoft.com)，在序列SEQID NO：1中的突变位点设计一条引物，在同一亲本来源的不同甘蓝型油菜fad3基因的不同拷贝间的多态性位点设计一条引物，从而排除甘蓝型油菜基因组中其他fad3拷贝的对PCR扩增的干扰，上述要求的两条引物配对组成一对引物，达到在特定亲本中扩增特定拷贝的效果。设计时要求引物长度为17～25bp，复性温度50～62℃C，GC含量为40～60％，同时为有效区分该位点在双亲间的差异和排除，利用引物3’端错配策略将引物3’端的第2-4位碱基进行一个碱基的错配处理。按上述要求获得一对目标引物，正向引物在序列SEQ ID NO：1中的第9-28bp之间，反向引物在序列SEQ ID NO：1中的第788-805bp之间(序列见表2中引物对YQ-fad31-1，正向引物位置见附图3中NO_1下划线所示，反向引物位置见附图5中NO_1下划线所示)，设计时将正向引物和反向引物的3’端第2位碱基分别由C错配为G、由A错配为T，将其命名为YQ-fad31-1，预期在甘蓝型油菜甲A254的基因组DNA中扩增出797bp的片段，而在甲A177的基因组DNA中无任何扩增产物；按上述要求利用同样的方法，在序列SEQ ID NO：2中筛选得到一对目标引物，正向引物在序列SEQ ID NO：2中的第9-28bp之间，反向引物在序列SEQ ID NO：2中的第787-804bp之间(序列见表2中引物对YQ-fad31-2的，正向引物位置见附图3中NO_2下划线所示，反向引物位置见附图5中NO_2下划线所示)，正向引物和反向引物的3’端第2位碱基分别由C错配为G、由A错配为T；预期在亲本甲A177的基因组DNA中扩增出796bp的片段，而在亲本甲A254的基因组DNA中无任何扩增产物。
根据引物HY-fad32在甲A254和甲A177中扩增DNA片段的核苷酸序列(如序列表SEQ ID NO：3和SEQID NO：4所示)及开发引物对YQ-fad31-1、YQ-fad31-2的要求和方法，在序列SEQ ID NO：3中获得一对目标引物，正向引物在序列SEQ ID NO：3中的第1432-1450bp之间，反向引物在序列SEQ ID NO：3中的第1840-1859bp之间(序列见表2中引物对YQ-fad32-1，正向引物位置见附图4中NO_3下划线所示，反向引物位置见附图5中NO_3下划线所示)，设计时将正向引物和反向引物的3’端第2位碱基分别由G错配为C、由C错配为G，将其命名为YQ-fad32-1，预期在甘蓝型油菜甲A254的基因组DNA中扩增出428bp的片段，而在甲A177的基因组DNA中无任何扩增产物；同时在序列SEQ ID NO：4中获得一对目标引物，正向引物在序列SEQ ID NO：4中的第1432-1450bp之间，反向引物在序列SEQ ID NO：4中的第1840-1859bp之间(序列见表2中引物对YQ-fad32-1，正向引物位置见附图4中NO_4下划线所示，反向引物位置见附图5中NO_4下划线所示)，设计时将正向引物和反向引物的3’端第2位碱基分别由G错配为T、由C错配为G，预期在亲本甲A177的基因组DNA中扩增出428bp的片段，而在亲本甲A254的基因组DNA中无任何扩增产物。
本发明利用上述步骤设计的引物进行PCR，PCR反应体系同上所述，复性温度见表2。扩增结果在1.2％的琼脂糖胶上检测。其中引物YQ-fad31-1在甘蓝型油菜甲A254和F1的基因组DNA中扩增出797bp的目标片段，而在甘蓝型油菜甲A177的基因组DNA中无任何扩增产物(见附图6)，因此该扩增片段可作为甘蓝型油菜低亚麻酸性状的显性SNP分子标记。引物YQ-fad31-2在甘蓝型油菜甲A177和F1的基因组DNA中扩增出796bp的目标片段，而在甘蓝型油菜甲A254的基因组DNA中无任何扩增产物(见附图6)，该扩增片段与YQ-fad31-1组合可作为甘蓝型油菜低亚麻酸性状的共显性SNP分子标记。
其中引物YQ-fad32-1在甘蓝型油菜甲A254和F1的基因组DNA中扩增出428bp的目标片段，而在甘蓝型油菜甲A177的基因组DNA中无任何扩增产物(见附图6)，因此该扩增片段可作为甘蓝型油菜低亚麻酸性状的显性SNP分子标记。引物YQ-fad32-2在甘蓝型油菜甲A177和F1的基因组DNA中扩增出428bp的目标片段，而在甘蓝型油菜甲A254的基因组DNA中无任何扩增产物(见附图6)，该扩增片段与YQ-fad32-1组合可作为甘蓝型油菜低亚麻酸性状的共显性SNP分子标记。
7、甘蓝型油菜低亚麻酸性状的共显性SNP标记组合的验证
利用上述步骤得到的甘蓝型油菜低亚麻酸性状的SNP标记分析本发明中的DH分离群体，其中33个单株与亲本甲A254中扩增片段一样(即表中的“A/A带型”)，39个单株与亲本甲A177中扩增片段一样(即表中的“B/B带型”)，76个单株检测结果为“A/B带型”，42个单株检测结果为“B/A带型”(见表3)。通过分析表中数据可知，凡是YQ-fad31、YQ-fad32进行检测检测为“A/A带型”的，其亚麻酸含量均在3.50％以下，其符合Rachael Scarth在第10届国际油菜大会中提出的低亚麻酸育种标准(Rachael Scarth等，Designer oil canola-a review of new food-grade Brassica oils with focuson high oleic，low linolenic types，10th Int.Rapeseed Congress，1999)。因此，利用YQ-fad31、YQ-fad32可有效鉴定出甘蓝型油菜两个位点上均携带低亚麻酸基因的个体，可以把一个数量性状转化成质量性状进行选择，提高选育低亚麻酸含量甘蓝型油菜的准确性和有效性，从而加快低亚麻酸含量甘蓝型油菜选育。
表3 本发明中甘蓝型油菜DH分离群体的亚麻酸含量及标记检测结果
Claims (3)
1.一种甘蓝型油菜低亚麻酸含量的共显性SNP分子标记，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示。
2.扩增甘蓝型油菜低亚麻酸含量的共显性SNP分子标记的引物对YQ-fad32-1和YQ-fad32-2，其核苷酸序列如下所示：
引物对YQ-fad32-1：
正向引物5′-CCTTGGTACAGAGGCAACA-3′，
反向引物5′-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3′；和
引物对YQ-fad32-2：
正向引物5′-CCTTGGTACAGAGGCAATG-3′，
反向引物5′-TTGCCACCAAACTTTCCAGT-3′。
3.权利要求2所述的引物对在低亚麻酸甘蓝型油菜的辅助选择中的应用。
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