CN102435665A - 胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物、检测方法和诊断模型 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学诊断领域，特别涉及一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成：6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da。本发明还提供了胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法和诊断模型。本发明利用SELDI-TOF-MS技术从低丰度的血清样本中检测出联合肿瘤标志物，建立了胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，对胰腺癌患者的早期诊断提供了新的途径和方法，弥补了影像学的不足，可望提高胰腺癌早期诊断水平，从而有助于改善胰腺癌患者的预后。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断领域，特别涉及对胰腺癌早期诊断灵敏度、特异性高的血清肿瘤标志物、检测方法和蛋白质指纹图诊断模型。
背景技术
胰腺癌是恶性程度最高、预后最差的肿瘤之一，胰腺癌患病率和病死率迅速上升，发病年龄逐渐提前已引起普遍关注。由于临床上缺乏好的肿瘤标志物检测方法，绝大多数的胰腺癌患者确诊时已是中晚期。早期诊断、早期治疗是提高胰腺癌生存率和降低死亡率的关键。但是目前，胰腺癌早期诊断缺乏有效手段，目前主要手段靠影像学检查，但结果不尽人意。在早期阶段，尤其是亚临床阶段CT、MR则无能为力。肿瘤标志物的诊断是近年来研究的热点。然而单一的肿瘤标志物往往难以反映肿瘤的全貌，从理论上讲，最有可能成为理想肿瘤标志物的应是联合数个或多个的肿瘤标志物。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，为了提高胰腺癌早期诊断水平，从而有助于改善胰腺癌患者的预后，本发明的目的旨在建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，进一步可筛选出胰腺癌早期诊断的新的体液蛋白质肿瘤标志物。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实施的：
本发明首先提供了胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成：6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da。
本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，包括：
（1）血清准备，
（2）质谱数据收集，筛选出差异蛋白峰，建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，
（3）进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选出血清肿瘤标志物。
作为优选方案，根据本发明所述的一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，其中，所述的步骤（2）中：质谱数据收集设置激光强度为180，检测灵敏度为6，检测上限为100000m/z，收集数据范围为2000-20000 m/z，信号收集位置从20-80。
本发明还提供了一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的蛋白质指纹图诊断模型，其中，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成：6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da，
所述的蛋白质指纹图诊断模型按下述方法建立：
（1）利用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱，
（2）结合生物信息学的方法筛选出相应的血清肿瘤标志物并建立诊断模型。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
（1）利用SELDI-TOF-MS技术从低丰度的血清样本中检测出血清肿瘤标志物。
（2）联合在血清中筛选的候选的肿瘤标志物，对胰腺癌患者的早期诊断提供新的途径和方法，弥补了影像学的不足。影像学技术的进步，在早期胰腺癌患者诊断方面取得了一定的突破。
（3）相关的支持向量机等生物信息学软件的开发和应用，提高诊断的准确率。
（4）本发明从一个崭新的技术平台和理念检测胰腺癌的联合蛋白质肿瘤标志物，可望提高胰腺癌早期诊断水平，从而有助于改善胰腺癌患者的预后。
说明书附图
图1是本发明实验方法的流程示意图。
图2是本发明所有样本的递加质谱蛋白质峰示分布意图。
图3是早期胰腺癌组与健康人对照组两组样本支持向量机散点分布图，图中，纵坐标principal component表示主成分，横坐标SVM predict labels表示支持向量机预测值，SVM Result Scatter Plot表示支持向量机散点分布结果。
图4是所有样本的质谱表达图。
图5是人胰腺癌血清样本与相应羊抗人抗体反应过夜后经SELDI检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
1、样本和资料
胰腺癌患者：共54例(早期22、晚期32)，术后病理确诊，平均年龄65岁。
健康对照组：共20例，来源于体检，平均年龄为63岁。
共分两组进行血清的蛋白质谱分析对比：
①早期胰腺癌组vs 健康人对照组，
②早期胰腺癌 vs 晚期胰腺癌组。
各组年龄和性别均配对，有相似的暴露史，无影响血清中蛋白质含量的其他相关疾病，于清晨空腹采集健康人及患者治疗前外周静脉全血5ml，4℃静置1-2h，3000 r/min条件下离心10min，分离血清，－80℃冰箱保存备用。
2、实验方法
主要仪器设备及试剂：
l Ciphergen PBS-Ⅱ-PLUS型SELDI-TOF-MS系统
l 蛋白质芯片： CM10芯片
实验试剂的配制：
1.U9血清变性溶液：9 mol/l尿素，2 % CHAPS，1 % DTT。配制完成后分装，-80℃低温冰箱保存。
2.50%饱和SPA溶液：SPA的溶剂为50% H2O＋50%乙腈＋0.5% TFA。将SPA溶解于其溶剂中直至过饱和，13,000rpm离心1分钟后取上清液，与溶剂1：1混合即可。室温避光保存。
3.CM10芯片Binding Buffer：50 mmol/l 乙酸钠（pH＝4.0）。乙酸钠2.051g溶于去离子水中，HCl调节pH值至4.0，定容为500ml。
实验方法（流程图见附图1）
芯片的预处理
l 每孔中加入200μl Binding Buffer
l 摇床上振荡（600rpm，室温）5分钟使充分平衡后去除液体，重复平衡一次。
血清的预处理
l 冰浴上缓慢融解血清（30～60分钟），10000rpm离心5分钟（4℃）。
l 10μl U9血清变性溶液中加入血清5μL，摇床上振荡使充分混合（600rpm，4℃，30分钟）。
l 用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200μl用于上样，摇床上振荡使充分混合（600rpm，4℃，2分钟）。至此血清被稀释约40倍。
蛋白质与芯片结合
l 取上述经U9处理并稀释过的血清100μl加到芯片上，仔细检查并去除每个孔中的气泡以免其影响蛋白质与芯片的结合。
l 芯片与血清充分反应1小时（600rpm摇床上振荡，4℃）后去除样品。
结合后冲洗
l 每孔加入200μl相应的Binding Buffer，摇床上振荡5分钟（600rpm，室温）后除去液体。重复该过程2次。
l 用水（纯度HPLC级）200μl快速清洗每个孔1次，用力甩干并将Bio-processor倒扣在清洁的吸水纸上轻拍以去除多余的水。
l 将芯片从Bio-processor中取出，自然干燥。
加能量吸收分子（EAM）
每孔点加50%饱和的SPA溶液1μl，待其自然干燥后重复点加1次。自然干燥即可上机检测。
数据采集及统计学处理
SELDI质谱仪参数设置及原始数据采集和输出
首先用已知分子量的标准蛋白质芯片All-in-One将SELDI质谱系统的分子量误差校正到<0.1%，再将结合好蛋白质的芯片放入质谱仪中进行检测。原始数据由Proteinchip Software 3.2软件采集，设置激光强度为180，检测灵敏度6，检测上限100,000m/z，优化收集数据范围2000～20000 m/z，信号收集位置从20～80，每个样本取168个点所收集信号的平均值。用Proteinchip Software 3.2软件将原始数据以xlm的格式输出。
数据处理
采用ZJU-PDAS（ProteinChip Data Analyze System）软件分析，整个流程如下：
1.原始质谱图上传到服务器，
2.先用小波变换(UDWT undecimated discrete wavelet transform)去除质谱仪器本身造成的噪音，
3.修正去除噪音后的质谱图的基线，
4.校正整个图谱的分子量值，
5.用局部极值法找出蛋白值峰，用信噪比和这个峰在各个样本中出现的比率过滤蛋白质峰，
6.均一化所有样本数据，
7.对预处理完筛选出来的蛋白质峰做进一步的检验分析，筛选出P<0.05差异蛋白峰，
8.对筛选的差异蛋白峰进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选最佳模型，用留一法评估模型的预测效果，选出建立支持向量机模型预测的约登指数最高的组合作为最终的候选标志物，建立的模型和留一法交叉验证的结果作为最终的结果。
9.输出各种统计结果和图片。
结果：
1、早期胰腺癌组（阳性组）vs健康人对照组
22例早期胰腺癌组和20例健康人对照组进行t检验，筛查p值小于0.05的差异蛋白质。共检测到153个经过信噪比和强调过滤的高质量质谱蛋白质峰，发现有14个蛋白质峰含量有统计学差异(P<0.05)，从中筛选出11个蛋白质峰用于建立SVM判别模型。所有样本的递加质谱蛋白质峰示分布意图见图2。两组样本支持向量机散点分布图，见图3，每一点表示一个样本，纵坐标为主成分，横坐标为SVM预测值，两组可清晰的区分。
说明：本发明中所有图表中Group0或者Class0为对照组，Group1或者Class1为阳性组。
从上述表1中筛选11个峰用于建立区分两组的SVM（支持向量机）模型的标志物：6684.598Da、6668.8192Da、8591.8289Da、6471.9468Da、4121.3689Da、8775.5261Da、4290.4956Da、6655.6858Da、2959.1113Da、5913.514Da 和5346.1731 Da。
建立的最佳模型的验证判别结果如下：
从表2可以看出，模型的特异性为95%，敏感性为100%。
图4是所有样本的质谱表达图，举例：peak 6685.emf 为 MZ6684.598，图中，横坐标为质荷比，纵坐标为表达强度，每根线标示一个样本，箭头→为MZ6684.598这个峰的位置。从图4中可以看出MZ6684.598标志物在健康人对照组中表达较高。
实施例2 对筛选出的敏感特异的血清肿瘤标志物进行分离和鉴定，制定单克隆抗体
1、5.9kDa(5913.3631)蛋白质在两个模型中均高表达，发明人对其进行鉴定。
（1）5.9kDa(5913.3631 )蛋白质峰鉴定
用SPE柱富集蛋白质，LC-MS分离并确定蛋白，将分离的组分用胰蛋白酶消化，再将其用MS-MS测序，本研究对一个在早期胰腺癌中表达显著升高的蛋白质(5.9 kDa)做了鉴定，鉴定的结果为一种纤维蛋白的一个片断。具体为：分离用的样本为1ml胰腺癌早期患者血清。血清先用SPE柱（反相，乙腈梯度）初步分离（用SELDI-TOF-MS监测目标蛋白所在的洗提组分），用冰冻干燥仪富集。重新溶解后用高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS）分离纯化（用MALDI-TOF-MS监测目标蛋白所在的洗提组分），将目标洗提组分进一步用胰酶消化，纯化的组分经胰酶消化选取分子量为2040.8、1189.5和1139.5的3个峰进入LC/MS/MS测序，测序的结果如下：
分子量2040.8 ：qftsstsyn rgdstfesk
分子量1189.5 ： qftsstsyn r
分子量1139.5 ： gse sgiftntk
这3个分子量片断的氨基酸序列到MASCOT (MatrixScience, www.matrixscience.com)上比对以，均与一个纤维蛋白的片断相匹配，其完整序列如下：
mfsmrivclv lsvvgtawta dsgegdflae gggvrgprvv erhqsackds dwpfcsdedw
nykcpsgcrm kglidevnqd ftnrinklkn slfeyqknnk dshslttnim eilrgdfssa
nnrdntynrv sedlrsriev lkrkviekvq hiqllqknvr aqlvdmkrle vdidikirsc
rgscsralar evdlkdyedq qkqleqviak dllpsrdrqh lplikmkpvp dlvpgnfksq
lqkvppewka ltdmpqmrme lerpggneit rggstsygtg setesprnps sagswnsgss
gpgstgnrnp gssgtggtat wkpgssgpgs tgswnsgssg tgstgnqnpg sprpgstgtw
npgssergsa ghwtsessvs gstgqwhses gsfrpdspgs gnarpnnpdw gtfeevsgnv
spgtrreyht eklvtskgdk elrtgkekvt sgsttttrrs csktvtktvi gpdghkevtk
evvtsedgsd cpeamdlgtl sgigtldgfr hrhpdeaaff dtastgktfp gffspmlgef
vsetesrgse sgiftntkes sshhpgiaef psrgksssys kqftsstsyn rgdstfesks
ykmadeagse adhegthstk rghaksrpvr dcddvlqthp sgtqsgifni klpgsskifs
vycdqetslg gwlliqqrmd gslnfnrtwq dykrgfgsln degegefwlg ndylhlltqr
gsvlrveled wagneayaey hfrvgseaeg yalqvssyeg tagdaliegs veegaeytsh
nnmqfstfdr dadqweenca evygggwwyn ncqaanlngi yypggsydpr nnspyeieng
vvwvsfrgad yslravrmki rplvtq
（2）用相应的羊抗人抗体与人胰腺血清样本反应过夜后经SELDI检测5.9kDa这个峰明显消失，如图5所示，图中①为未与相应抗体反应的血清，②为与相应抗体反应过后的血清。
2、对其他血清肿瘤标志物用TagIdent tool工具进一步搜索UniProtKB/Swiss-Prot数据库，分别鉴定其他蛋白质，结果如下：
（1）.分子量：6667.6807
蛋白质简称CKLF1_HUMAN (Q8IZ96-10)
蛋白质名称Isoform 10 of CKLF-like MARVEL transmembrane domain
检测到的蛋白质片段的氨基酸序列Chain: 1-65，
pI值: 8.19，
理论分子量Mw: 6669
（2）.分子量：8572.3799
蛋白质简称SAA_HUMAN (P02735)
蛋白质名称Amyloid protein A.
Chain: 19-94，pI: 5.56，Mw: 8575
（3）.分子量：2958.761
蛋白质简称CKLF1_HUMAN (Q8IZ96-15)
蛋白质名称CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing protein 1
Chain: 1-28，pI: 4.95，Mw: 2962
（4）.分子量：6441.593
LUZP6_HUMAN (Q538Z0)
Leucine zipper protein 6.
Chain: 1-58, pI: 9.69, Mw: 6437
（5）.分子量：6668.8192
蛋白质简称CKLF1_HUMAN (Q8IZ96-10)
蛋白质名称Isoform 10 of CKLF-like MARVEL transmembrane domain
检测到的蛋白质片段的氨基酸序列Chain: 1-65,
pI值: 8.19,
理论分子量 Mw: 6669
（6）. 分子量：8775.5261
PLGA_HUMAN (Q15195)
Plasminogen-related protein A.
Chain: 20-96, pI: 5.83, Mw: 8778
（7）. 分子量：6655.6858
A4_HUMAN (P05067)
Gamma-secretase C-terminal fragment 57.
Chain: 714-770, pI: 6.74, Mw: 6651
（8）. 分子量：2959.1113
Recommended name:
CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing protein 1
Alternative name(s):
Chemokine-like factor superfamily member 1
CKLF1_HUMAN (Q8IZ96-15)
Isoform 16 of CKLF-like MARVEL transmembrane domain-conta...
Chain: 1-28, pI: 4.95, Mw: 2962
（9）. 分子量：6119.674
F19A5_HUMAN (Q7Z5A7-3)
Isoform 3 of Protein FAM19A5 OS=Homo sapiens GN=FAM19A5
Chain: 1-53, pI: 8.48, Mw: 6119
（10）. 分子量：5346.1731
COX7C_HUMAN (P15954)
Cytochrome coxidase subunit 7C, mitochondrial.
Chain: 17-63, pI: 8.97, Mw: 5356
上述优选实施例只是用于说明和解释本发明的内容，并不构成对本发明内容的限制。尽管发明人已经对本发明做了较为详细地列举，但是，本领域的技术人员根据发明内容部分和实施例所揭示的内容，能对所描述的具体实施例做各种各样的修改或/和补充或采用类似的方式来替代是显然的，并能实现本发明的技术效果，因此，此处不再一一赘述。本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不构成对本发明的限制。
参考文献：
1. 谢艳茹，黄建瑾，余捷凯，李旭芬，丁凌 SELDI-TOF-MS技术在检测肺癌化疗敏感性相关蛋白质中的研究，肿瘤学杂志，2010，16（8）：610-613.
2. 胡跃，余捷凯，张苏展，刘建，郑树 蛋白质指纹图谱在乳腺癌诊断与随访中的应用研究，中国病理生理杂志，2010，26 ( 4 ) ：700-704.
3.韩小宏，毛巧霞，李晓春，沈建法，陆国峰，余捷凯 基于生物信息学方法的血清标志物模型在胃癌诊断中的应用，中国癌症杂志，2010，20 ( 5 ) ：364-368.
4. 徐文鸿，陈益定，胡跃，余捷凯，王连聪，郑树，张苏展 基于支持向量机的大肠黏液腺癌术前血清蛋白质标志物检测及分析，细胞生物学杂志，2008，30：819 – 822.
5. 陈新洲，王玉杰，张琼，王庆荣，余捷凯 血清蛋白质指纹图谱诊断模型在肾癌中的应用，新疆医科大学学报，2010，33 ( 2 ) ：141-148.
6. 刘颖斌，吴文广 胰体尾癌根治性切除的范围探讨，中国普外基础与临床杂志，20 11，1 8（1）：11-13。
Claims (4)
1.胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物，其特征在于，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成：6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da。
2.一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
（1）血清准备，
（2）质谱数据收集，筛选出差异蛋白峰，建立胰腺癌早期诊断的蛋白质指纹图诊断模型，
（3）进一步用遗传算法结合支持向量机模型的方法筛选出血清肿瘤标志物。
3.根据权利要求2所述的一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）中：质谱数据收集设置激光强度为180，检测灵敏度为6，检测上限为100000m/z，收集数据范围为2000-20000 m/z，信号收集位置从20-80。
4.一种胰腺癌早期诊断的血清肿瘤标志物的蛋白质指纹图诊断模型，其特征在于，所述的血清肿瘤标志物由11个蛋白质质荷比峰组成：6684Da、6668Da、8591Da、6471Da、4121Da、8775Da、4290Da、6655Da、2959Da、5913Da和5346Da，
所述的蛋白质指纹图诊断模型按下述方法建立：
（1）利用表面加强激光解吸电离-飞行时间质谱仪测定肿瘤患者与健康人血清标本的蛋白质组图谱，
（2）结合生物信息学的方法筛选出相应的血清肿瘤标志物并建立诊断模型。
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2011
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