CN102417883A - 产喜树碱的新菌种筛选及制备喜树碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了产喜树碱的新菌种及其制备喜树碱的方法，产喜树碱的新菌种Phomopsis sp.B29，已于2010年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3988。喜树碱是从中国珙桐科植物喜树(Camptotheca acuminate)中提取的一种具有抗肿瘤活性的吲哚类生物碱，对治疗结肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤有很好疗效。直接从喜树中提取喜树碱导致植被破坏、生态失衡等问题，而化学合成法路线长、得率低、成本高。针对这些问题，本发明从喜树(Camptotheca acuminate)树皮和果实分离、纯化内生真菌，从中筛选到一株产喜树碱的菌株，用于发酵后制备喜树碱。本发明提供的新菌种可作为生产喜树碱的新药源，而且利用其发酵制备喜树碱的方法操作简单、成本低。
Description
技术领域
本发明属于植物内生菌的分离、筛选及微生物发酵领域，特别涉及从喜树中分离、纯化内生真菌，发酵筛选产喜树碱的菌株以及利用筛选的菌株制备喜树碱的方法。
背景技术
喜树碱是1966年Wall等从中国珙桐科植物喜树(Camptotheca acuminate)中提取的一种具有抗肿瘤活性的吲哚类生物碱。目前，喜树碱主要的生产方法是从喜树中提取，而喜树中喜树碱的含量很低，一般为0.01％～0.1％，导致提取得率低、成本高，而且喜树是国家II级重点保护野生植物，大量砍伐喜树容易导致植被破坏、生态失衡等问题。化学全合成喜树碱已经取得成功，但由于合成路线长、产率低、成本高而无法投入工业化生产。因此，开发喜树碱的新药源成为国内外面临的重大问题。
植物内生菌是指生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部，但对植物没有引起明显病害症状的微生物。内生菌侵入宿主植物体内，长期生活在植物细胞内或细胞间隙的特殊环境中，与宿主植物协同进化，形成一种互利共生的稳定的生态关系。1993年Strobel小组首次从短叶红豆杉(Taxus brevifolian Nutt.)中分离到一株合成紫杉醇的内生真菌，证明内生菌具有合成与宿主植物相同或相似活性成分的功能。这一发现掀起了从药用植物中分离内生菌的研究热潮，之后研究者们先后从数十种药用植物中分离了多种内生菌，人工培养后培养物中发现与宿主植物相同或相似的活性成分。
产喜树碱及其类似物的喜树内生菌2005年开始报道，详见附表。利用内生菌发酵生产喜树碱，反应条件温和、无毒、无污染，操作简单，成本低，具有广泛的应用前景。
附表产喜树碱及其类似物的喜树内生真菌
发明内容
本发明的目的在于从喜树树皮和果实中分离、纯化内生真菌，筛选产喜树碱的新菌种，并利用该菌株发酵制备喜树碱。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供的产喜树碱的新菌种拟茎点霉Phomopsis sp.B29，已于2010年7月14日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3988。
本发明所述的产喜树碱的新菌种Phomopsis sp.B29为从喜树树皮和果实中分离、纯化的27株内生真菌经过发酵筛选得到的一株产喜树碱的菌株。该菌株在PDA平板上培养4d直径达60mm，白色绒毛状，发散向四周生长，边缘整齐；液体培养2d，菌丝球呈白色，直径达2～4mm，培养液澄清；显微镜检发现菌丝无色、有隔、多分枝，无孢子。
上述产喜树碱的新菌种Phomopsis sp.B29的筛选方法，1)将喜树树皮和果实先用无菌水冲洗表面尘土，再用体积比为75％的乙醇浸泡30s，用无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的升汞浸泡30s，用无菌水冲洗3～5次，然后用无菌刀将其剪成5mm×5mm的小块；
2)将上述材料接种到PDA培养基平板上，28～30℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到PDA培养基斜面，28～30℃纯化培养，储藏备用；
3)菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基斜面，28～30℃活化48h；
4)发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基，28～30℃，170r/min摇床培养4～6d。
5)喜树碱的提取及检测：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为50％～80％的乙醇超声提取20min～40min，离心收集上清液，高效液相色谱进样检测。
产喜树碱的新菌种Phomopsis sp.B29制备喜树碱的方法，1)菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基斜面，28～30℃活化48h；
2)发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基，28～30℃，170r/min摇床培养4～6d；
3)喜树碱的提取及制备：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为50％～80％的乙醇超声提取20min～40min，离心收集上清液，旋转蒸发除去乙醇，收集析出物，加入体积比为1∶1～4∶1的氯仿、甲醇混合液萃取剂静置萃取1～2h，收集下层溶液减压浓缩、烘干，得到喜树碱粗品。
本发明的优点在于：利用本发明提供的产喜树碱的新菌种Phomopsis sp.B29发酵制备喜树碱，反应条件温和、无毒、无污染，操作简单，成本低，可代替直接从喜树中提取以及化学合成等复杂、高价的方法，解决喜树碱药源问题。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
从喜树树皮中筛选产喜树碱的新菌种，具体实验步骤如下：
1.将喜树树皮先用无菌水冲洗表面尘土，再用体积比为75％的乙醇浸泡30s，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的升汞浸泡30s，无菌水冲洗3～5次，然后用无菌刀将其剪成5mm×5mm的小块；
2.将上述材料接种到PDA培养基平板上，28～30℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到PDA培养基斜面，28～30℃纯化培养，储藏备用；
3.菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，琼脂20g/L，pH6.8斜面，28～30℃活化48h；
4.发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH6.8，28～30℃，170r/min摇床培养4d；
5.喜树碱的提取及检测：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为50％的乙醇超声提取40min，离心收集上清液，高效液相色谱进样检测。
实施例2
从喜树果实中筛选产喜树碱的新菌种，具体实验步骤如下：
1.将喜树果实先用无菌水冲洗表面尘土，再用体积比为75％的乙醇浸泡30s，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的升汞浸泡30s，无菌水冲洗3～5次，然后用无菌刀将其剪成5mm×5mm的小块；
2.将上述材料接种到PDA培养基平板上，28～30℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到PDA培养基斜面，28～30℃纯化培养，储藏备用；
3.菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，琼脂20g/L，pH6.8斜面，28～30℃活化48h；
4.发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH6.8，28～30℃，170r/min摇床培养6d；
5.喜树碱的提取及检测：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为80％的乙醇超声提取20min，离心收集上清液，高效液相色谱进样检测。
实施例3
从喜树树皮中筛选产喜树碱的新菌种，具体实验步骤如下：
1.将喜树树皮先用无菌水冲洗表面尘土，再用体积比为75％的乙醇浸泡30s，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的升汞浸泡30s，无菌水冲洗3～5次，然后用无菌刀将其剪成5mm×5mm的小块；
2.将上述材料接种到PDA培养基平板上，28～30℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到PDA培养基斜面，28～30℃纯化培养，储藏备用；
3.菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，琼脂20g/L，pH6.8斜面，28～30℃活化48h；
4.发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH6.8，28～30℃，170r/min摇床培养4d；
5.喜树碱的提取及检测：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为70％的乙醇超声提取30min，离心收集上清液，高效液相色谱进样检测。
实施例4
产喜树碱的新菌种制备喜树碱的方法，
1.菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，琼脂20g/L，pH6.8斜面，28～30℃活化48h；
2.发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH6.8，28～30℃，170r/min摇床培养，发酵4d；
3.喜树碱的提取及制备：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为50％的乙醇超声提取20min，离心收集上清液，旋转蒸发除去乙醇，收集析出物加入体积比为1∶1的氯仿、甲醇混合液萃取剂静置萃取1h，收集下层溶液减压浓缩、烘干，得到喜树碱粗品。
实施例5
产喜树碱的新菌种制备喜树碱的方法，
1.菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，琼脂20g/L，pH7.0斜面，28～30℃活化48h；
2.发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，pH7.0，28～30℃，170r/min摇床培养，发酵4d；
3.喜树碱的提取及制备：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为80％的乙醇超声提取40min，离心收集上清液，旋转蒸发除去乙醇，收集析出物加入体积比为4∶1的氯仿、甲醇混合液萃取剂静置萃取2h，收集下层溶液减压浓缩、烘干，得到喜树碱粗品。
实施例6
产喜树碱的新菌种制备喜树碱的方法，
1.菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，琼脂20g/L，pH6.8斜面，28～30℃活化48h；
2.发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，pH6.8，28～30℃，170r/min摇床培养，发酵6d；
3.喜树碱的提取及制备：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为70％的乙醇超声提取30min，离心收集上清液，旋转蒸发除去乙醇，收集析出物加入体积比为2∶1的氯仿、甲醇混合液萃取剂静置萃取2h，收集下层溶液减压浓缩、烘干，得到喜树碱粗品。
实施例7
产喜树碱的新菌种制备喜树碱的方法，
1.菌种活化：将分离到的内生真菌接种于活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，琼脂20g/L，pH7.0斜面，28～30℃活化48h；
2.发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，pH7.0，28～30℃，170r/min摇床培养，发酵6d；
3.喜树碱的提取及制备：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为80％的乙醇超声提取20min，离心收集上清液，旋转蒸发除去乙醇，收集析出物加入体积比为4∶1的氯仿、甲醇混合液萃取剂静置萃取1h，收集下层溶液减压浓缩、烘干，得到喜树碱粗品。
附参考文献
产喜树碱的臭味假柴龙树内生真菌.天然产物杂志，第68卷第12期.2005.(An endophytic fungus fromNothapodytes foetida that produces camptothecin.Puri SC，Verma V，Amna T，Qazi GN，Spiteller M..Journal ofNatural Product，第68卷第12期.2005)
喜树内生真菌产喜树碱及生物活性的研究.陆荣.安徽农业大学硕士学位论文.2008
产喜树碱及类似物的牺牲内生真菌.天然产物杂志，第72卷第1期.2009.(An endophytic fungus fromCamptotheca acuminata that produces camptothecin and analogues.Kusari S，Zuhlke S，Spiteller M，Journal ofNatural Product，第72卷第1期.2009)
产喜树碱、10-羟基喜树碱和9-甲基喜树碱的茶茱萸科柴龙树腐皮镰刀属内生真菌.植物化学，第71卷第1期.2009.(Endophytic fungal strains of Fusarium solani，from Apodytes dimidiata E.Mey.ex Arn(Icacinaceae)produce camptothecin，10-hydroxycamptothecin and 9-methoxycamptothecin.Shweta S，Zuehlke S，Ramesha BT，Priti V，Mohana Kumar P，Ravikanth G，Spiteller M，Vasudeva R，Uma SR，Phytochemistry，第71卷第1期.2009)
Claims (3)
1.产喜树碱的新菌种，其特征是：所述的新菌种Phomopsis sp.B29是从喜树(Camptotheca acuminate)树皮和果实中分离筛选的内生菌，已于2010年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3988。
2.权利要求1所述的产喜树碱的新菌种Phomopsis sp.B29的筛选方法包括以下步骤：1)将喜树树皮和果实先用无菌水冲洗表面尘土，再用体积比为75％的乙醇浸泡30s，无菌水洗掉表面乙醇，再用质量分数为0.1％的升汞浸泡30s，无菌水冲洗3～5次，然后用无菌刀将其剪成5mm×5mm的小块；
2)将上述材料接种到PDA培养基平板上，28～30℃恒温培养；待样品周围明显长出菌落，挑取不同形态的菌落，转到PDA培养基斜面，28～30℃纯化培养，储藏备用；
3)菌种活化：将分离的内生真菌接种于活化培养基斜面，28～30℃活化48h；
4)发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基，28～30℃，170r/min摇床培养4～6d；
5)喜树碱的提取及检测：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为50％～80％的乙醇超声提取20min～40min，离心收集上清液，高效液相色谱进样检测，发酵后提取液液相检测到喜树碱的菌株即为本发明所述的产喜树碱的新菌种。
3.利用权利要求1所述的产喜树碱的新菌种Phomopsis sp.B29制备喜树碱的方法，其特征是包括以下步骤：1)菌种活化：将产喜树碱的新菌株接种于活化培养基斜面，28～30℃活化48h；
2)发酵培养：将活化后的菌种接种于发酵培养基，28～30℃，170r/min摇床培养，发酵4～6d；
3)喜树碱的提取及制备：发酵结束后分离菌丝，烘干后粉碎，加入体积比为50％～80％的乙醇超声提取20min～40min，离心收集上清液，旋转蒸发除去乙醇，收集析出物，加入体积比为1∶1～4∶1的氯仿、甲醇混合液萃取剂静置萃取1～2h，收集下层溶液减压浓缩、烘干，得到喜树碱粗品。
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-
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