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CN102414554B - 采用液晶的分析物检测 - Google Patents

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CN102414554B CN201080018339.4A CN201080018339A CN102414554B CN 102414554 B CN102414554 B CN 102414554B CN 201080018339 A CN201080018339 A CN 201080018339A CN 102414554 B CN102414554 B CN 102414554B
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Abstract

描述了使用微米级分散液晶结构域中的缺陷变化以检测或定量测试样品中分析物的装置和方法，所述分析物包括内毒素脂多糖(LPS)。使分散的液晶微结构域接触测试样品，通过检测微结构域的锚定构型变化来测定液晶微结构域中缺陷数量的任何变化。这种锚定构型变化指示测试样品中存在分析物。

Description

采用液晶的分析物检测
相关申请的交叉参考
本申请要求2009年4月22日提交的美国临时专利申请第61/171,699号和2010年4月15日提交的美国临时专利申请第61/324,650号的优先权，其通过引用全部纳入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在美国政府支持下进行，由下列机构资助：国家科学基金会，授予号0520527和0602570。美国政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明一般涉及采用液晶的分析物检测方法。本发明具体涉及采用微米级液晶结构域以检测水溶液中的分析物如内毒素脂多糖(LPS)的系统和方法。
发明背景
内毒素(脂多糖，LPS)的检测和定量在广泛范围的健康相关情况中具有临床重要性，包括人体保健、临床和基础医学研究、药物生产、职业和公众健康及食物和水纯度测试。目前，大部分内毒素检测或定量方法是基于鲎变形细胞裂解物相关胶凝反应或显色反应，根据1960年代首先报道的原始鲎变形细胞裂解物测试(LAL测试)修改而来。
鲎变形细胞是美洲鲎(Limulus polyphemus)、马蹄蟹血液中发现的唯一循环细胞。当马蹄蟹感染革兰氏阴性菌时，鲎变形细胞裂解物酶与生成的LPS的脂质A部分相互作用并激发胞外凝固。此反应是许多用于检测和定量水样本中内毒素的测试方法的基础(例如动态比浊法LAL测试、动态显色法LAL测试、凝胶法LAL和终点LAL)，使用这些测试的内毒素检测限度可以是低至pg/mL范围。
然而，目前基于LAL的测试有许多劣势。例如，分离自不同细菌种类的LPS不能同样激活LAL。此外，某些物质干扰LAL与内毒素反应的能力。另外，由于裂解物是天然和可变的混合物，而非单一的纯化酶，需要用复杂且昂贵的方法对每批提取的LAL进行酶活性标准化。LAL测试的试剂也源自动物，所述试剂需要在受控条件下保存，如受控温度。通常，测试的复杂性要求采用熟练的技术人员。目前LPS测试的限制证明持续性需要简单、花费较低且迅速、敏感和选择性的测试来报道和定量含水样品中的LPS。
先前已描述了使用液晶的测试装置作为检测和定量不同分析物的方式。例如，报道了使用混合的自组装单层膜(SAM)的液晶测试装置，该膜含在斜沉积于玻璃的各向异性金膜上支撑的辛硫醇和生物素。Gupta，V.K.；Skaife，J.J.；Dubrovsky，T.B.，Abbott N.L.Science，279，(1998)，第2077-2079页。另外，1999年12月9日出版的PCT公开WO 99/63329描述的测试装置使用附于基底的SAM和由SAM锚定的液晶层。Abbott等发布的美国专利第6,288,392号公开了使用原子力显微镜定量鉴定斜沉积的金基底并描述了基底形貌对液晶锚定的影响。Abbott等发布的美国专利第6,284,197号描述了使用液晶来光放大分子相互作用。
过去的研究也报道了当表面活性剂吸附在乳液中水相和向温性液晶界面时，表面活性剂对液晶取向的影响(Drzaic，“液晶分散体.液晶系列”(Liquid Crystal Dispersions.Series on Liquid Crystals)；世界科学：新加坡(World Scientific：Singapore)，1995；Poulin等.Science 1997，275，1770；Mondain-Monval等.Eur.Phys.J B 1999，12，167)。近期，向温性液晶和水溶液之间的平界面用于研究带有表面活性剂(Brake等.Langmuir 2002，16，6101；Brake等.Langmuir 2003，16，6436；Brake等.Langmuir 2003，21，8629)、脂类(Brake等.Science 2003，302，2094；Brake等.Langmuir 2005，21，2218)、蛋白质(Brake等.Science 2003，302，2094)的液晶取向。最近，讨论了使用由多个充满液晶的栅格制成的传感器以检测测试样品中的不同LPS浓度，尽管作为本研究对象的论文所示分子结构既不是LPS也不是其脂质A(McCamley等.Proc.SPIE 2007，6441，64411Y)。
本领域仍然持续需要能检测和定量低限度的LPS、对LPS有特异性且快于先前所述方法的新测试。
发明内容
本发明人意外发现在＜1pg/ml浓度的脂质A或LPS内毒素存在时，水溶液中分散的微米级液晶液滴的锚定构型转换。另外，本发明人通过观察到这种锚定构型转换，确定可在1分钟内定量0.1-1000pg/mL范围的内毒素，比现有LPS测试快许多。此灵敏度比McCamley等或Brake等报道的通过液晶平膜界面的脂类吸附获得的灵敏度高许多。
尽管本发明不受任何提出的理论或作用机制限制，细菌脂质显然引发锚定构型转换，这是通过改变液晶液滴产生的拓扑点缺陷能量，而不是通过在液晶液滴水性界面上均匀吸附实现的。此新发现的推动锚定构型转换的机制仅对内毒素的特定脂质构型敏感。
因此，在第一方面，本发明包括基于液晶检测测试样品中分析物的传感器。所述传感器包括一个或多个液晶微结构域(由在液晶微结构域中产生一个或多个缺陷的界面限制)以及能鉴定液晶微结构域的取向序的检测器。构成微结构域的优选液晶是4′-戊基-4-氰基联苯(5CB)。
在某些实施方式中，微结构域限制在液滴内、微孔内、毛细管内、表面上、或其他物质内。微结构域优选具有弯曲界面。
液晶微结构域优选是分散的且具有约0.5μm-200μm的短轴。微结构域更优选具有约1μm-10μm的短轴，微结构域最优选具有约2μm-4μm的短轴。
在某些实施方式中，传感器包括多个分散在固体载体所支撑物质内的液晶微结构域。在某些实施方式中，微结构域是在液晶乳液中分散的液晶液滴。在一些这类实施方式中，液晶乳液可包含无LPS的水相。无LPS的水相可任选包括无LPS的缓冲液，如磷酸缓冲盐水(PBS)。
在某些实施方式中，传感器也包括与液晶乳液接触的含水测试样品。含水测试样品与液晶乳液内所含液晶的体积比优选大于或等于约100比1；比例更优选大于或等于约1,000比1；比例最优选大于或等于约40,000比1。
优选地，传感器所含检测器通过确定液晶微结构域缺陷数量、检测微结构域锚定构型或两者一起来鉴定取向序。检测器任选使用基于光的检测，可以是基于光的成像设备，包括但不限于基于偏振光的成像设备、基于荧光的成像设备、检测散射光的检测器、或检测透射光的检测器。传感器还可包括亮场光源。在某些实施方式中，检测器位于流体装置，包括但不限于流式细胞仪。流式细胞仪任选使用基于荧光的检测模式。
在某些实施方式中，有两个点缺陷的装置中包括至少一个液晶微结构域。传感器可任选包括与微结构域接触的分析物，优选其中至少一个微结构域有一个点缺陷。在一些这类实施方式中，分析物分配至微结构域中的缺陷上。优选的分析物是内毒素脂多糖(LPS)或脂质A。
在某些实施方式中，液晶微结构域固定。在一些这类实施方式中，微结构域包含吸附于微结构域表面的聚合物，聚合物有利于微结构域在基材表面的固定。或者，微结构域固定在亲水性聚合物网络中、在胶体或聚合物形成的凝胶中、或在脱水物质中。任选地，将吸附性物质放置成与其中固定有液晶微结构域的物质接触。
本发明的传感器还包括基于液晶检测测试样品中内毒素脂多糖(LPS)的传感器。这种检测器包括含分散液晶微结构域的物质(所述微结构域具有约.5μm-200μm的短轴)和能检测液晶微结构域的锚定构型的检测器。
第二方面，本发明包括检测测试样品中分析物的方法。所述方法包括步骤：(a)提供具有一个或多个缺陷的一个或多个液晶微结构域；(b)使所述微结构域与测试样品接触；(c)使用检测器，通过例如检测微结构域中的缺陷数量，确定液晶微结构域的取向序。缺陷数量的变化指示样品中存在分析物。液晶微结构域的界面优选是弯曲的。
在一些实施方式中，液晶微结构域中缺陷数量的变化是微结构域中缺陷数量减少，例如从两个缺陷变成一个缺陷。液晶微结构域中的缺陷数量可直接检测，或可通过检测微结构域的锚定构型来确定。
液晶微结构域优选具有约0.5μm-200μm的短轴；液晶微结构域更优选具有约1μm-10μm的短轴；液晶微结构域最优选具有约2μm-4μm的短轴。在某些实施方式中，测试样品是含水测试样品。使用所述方法检测的优选分析物包括内毒素脂多糖(LPS)和脂质A。
使用检测器以检测液晶微结构域的任何构型变化的步骤优选是以下步骤中的一个或多个：光学成像、荧光成像、采用偏振光的光学成像、偏振光显微术、亮视野显微术、荧光显微术、光散射测量、流式细胞术、荧光流式细胞术、微量电泳、双向电泳、电容测量、磁性测量、浊度测量、检测光反射、检测光透射、目测、使用读板仪、使用微孔板、或使用检测器中的比色皿。微流体装置和/或固体支持物任选可用于将样品传递给检测器。所述方法使用的所有移液管、塑料制品、容器和其他装置优选无LPS。
在某些实施方式中，提供多个分散的液晶微结构域。在一些这类实施方式中，所获用于分散微结构域的液晶缺陷信息还可用于定量测定样品中存在的分析物。使用所述方法定量的优选分析物包括内毒素脂多糖(LPS)或脂质A。在其他实施方式中，所获用于分散微结构域的液晶缺陷信息还可用于区分LPS或脂质A与其他脂质。
在某些实施方式中，在水乳液中提供分散的液晶微结构域，所述液晶微结构域是乳液中的液晶液滴。乳液优选无LPS，可包含无LPS的缓冲液。
测试样品可以是含水测试样品。在这种实施方式中，含水测试样品与液晶乳液内所含液晶的体积比优选大于或等于约100比1；更优选大于或等于约1,000比1；最优选大于或等于约40,000比1。
所述检测分析物的方法还包括检测测试样品中内毒素脂多糖(LPS)的方法。这种方法包括步骤：(a)提供含分散液晶微结构域的物质，所述微结构域具有约.5μm-200μm的短轴；(b)使所述物质与含水测试样品接触；(c)使用检测器以检测液晶微结构域的锚定构型。
第三方面，本发明包括制备基于液晶的检测测试样品中分析物的传感器的方法。所述方法包括步骤：(a)提供含分散液晶微结构域的物质，所述微结构域具有约.5μm-200μm的短轴；(b)提供能检测液晶微结构域的锚定构型的检测器。含分散液晶微结构域的物质优选是液晶乳液，提供该乳液的步骤还包括超声处理和涡旋处理含有液晶和无LPS缓冲液的混合物的步骤。在一些这类实施方式中，超声处理和涡旋处理混合物的步骤对同一混合物进行多次。
提供含分散液晶微结构域的物质的步骤还可包括在分散液晶微结构域周围形成水凝胶，或使用其他方法将分散的液晶微结构域固定于基材表面上。
本发明的其他目的、特点和优势在阅览本说明书、权利要求书和附图后显而易见。
附图简要说明
图1A显示在革兰氏阴性菌外膜中发现的一种内毒素细菌脂多糖(LPS)的示意图。图1B显示LPS的双磷酸化脂质成分脂质A的分子结构。图1C是用于制备LC乳液的操作方案和用于显微镜下观察与感兴趣的分析物接触时发生的LC乳液锚定转换的实验设置的示意图。
图2A显示形成LC的分子5CB的分子结构。图2B是向列型LC的分子组成的示意图。图2C是水性缓冲液中分散的向列型LC液滴的光学显微图。图2D是与LPS接触时LC液滴结构变化的示意图。接触LPS前，液滴中的LC采用双极构型，接触LPS后，液滴中的LC采用辐射构型。
图3A是液晶液滴的双极锚定构型的示意图。图3D是液晶液滴的辐射锚定构型的示意图。图3D的剩余部分是聚合物包封的5CB液滴的亮视野(3B，3E)和极化(3C，3F)光学显微图，其直径为8.0±0.2μm，具有双极(3B，3C)和辐射(3E，3F)锚定构型。LC液滴的点缺陷由白色箭头指示。
图4显示样本金栅格限制的5CB的光学显微图(A-C)和侧视图(D-F)。图4A是显示接触PBS缓冲溶液时5CB锚定的光学图像且图4D是卡通表现。图4B是显示与2mL 1微克/毫升LPS的PBS缓冲溶液以25℃接触24小时后5CB锚定的光学图像且图4E是卡通表现。图4C是显示与2mL 1微克/毫升LPS的PBS缓冲溶液以25℃接触少于2分钟时5CB锚定的光学图像且图4F是卡通表现。图4C的插图是通过5CB锥光成像获得的干涉图形。比例尺是300um。
图5显示5CB-PBS乳液(10μL 5CB乳液与40μL PBS缓冲液)(A-E)和5CB-LPS(1mg/mL LPS的PBS缓冲溶液)乳液(10μL 5CB乳液与40μLPBS缓冲液)(F-H)的锚定构型分布(C，H)和光学显微图(A、D和F是亮视野显微图，B、E和G是偏振显微图)。PBS缓冲液包含少于2pg/mLLPS，由供应商证明。5CB-PBS乳滴界面的5CB平面锚定产生具有两个表面缺陷的双极构型(圆柱(boojums))。箭头加入图A、B、D和E以通过定位液滴界面的圆柱(boojums)来强调双极构型。在5CB-PBS乳液中，接触1mg/mL LPS时在液滴中心发生单一点缺陷(刺猬)转换，导致5CB在界面(F)辐射锚定。图5G所示偏振显微图的同消色线特征是液滴中辐射锚定构型的特性。比例尺对应于5μm。
图6显示来自分析系统的LC液滴的偏振显微图，所述系统在测试溶液中含有不同体积的LC乳液(Y轴)和不同浓度的LPS(X轴)。该系统所用LPS测试溶液的体积固定在40μL。通过减少系统所用每单位体积LPS溶液的LC乳滴数量来“饥饿”水/5CB乳液界面的LPS，使得具有辐射构型的LC乳滴部分增加，如偏振显微图所示。比例尺对应于5μm。
图7是暴露于溶液中LPS的LC液滴的第二剂量反应曲线。辐射锚定构型液滴百分比(Y轴)作为LPS浓度的函数作图。内毒素溶液的体积是40μL，内毒素溶液中LC液滴的数量是8,600(■)、43,000(●)、86,000(▲)或260,000(◆)。液滴数量用流式细胞仪确定。星号指示的LPS浓度都作为对LAL测试的基准。N指示独立进行的实验数量，n指示分析的LC乳滴总数。划线以引导观察。
图8是比较引起LC液滴采用辐射构型所需的不同脂质或表面活性剂浓度的柱图。通过添加8,600LC液滴到40μL感兴趣的溶液并随后以交叉极分析5CB液滴，进行测量。所示浓度是引起至少60％LC液滴采用辐射构型所需的浓度。没有脂质和表面活性剂时，LC液滴显示双极构型。
图9显示在PBS缓冲液(包含少于2pg/mL LPS，由供应商证明)中以不同的感兴趣浓度室温接触LPS(A)、脂质A(B)、SDS(C和D)、DOPC(E和F)和DLPC(G和H)时5CB乳液的偏振光显微图。通过动态比浊法LAL测试来测量0.3-1pg/mL LPS浓度。5CB乳液和感兴趣分析物溶液的量在测量中固定为0.4μL和40μL。比例尺对应于5μm。
图10是具有双极锚定构型(11A)和辐射锚定构型(11B)的LC液滴的流式细胞仪测量图。侧光散射(SSC-H)的强度作为前向光散射(FSC-H)的函数作图。
图11A是具有辐射构型的BODIPY FL-内毒素-修饰LC液滴(接触20μg/ml BODIPY FL-内毒素)的共聚焦荧光显微图。用于光漂白测量的感兴趣区域(ROI)在较小的白色圆圈内。
图11B是图13A所示ROI光漂白期间观察到的荧光强度(底部)和所用的激光功率(顶部)随着时间变化的图。在光漂白过程中，30％激光功率用于时间序列测量且100％激光功率用于预期的光漂白。比例尺是5μm。
图11C是热淬灭实验中双极-辐射型锚定构型转换的时间间隔与LC液滴半径作图。10pg/mL内毒素溶液的体积是100μL且内毒素溶液中的LC液滴数量是21,500。由于LC液滴在母液中自由移动，通过对LC转换时的LC双极-辐射型锚定转换成像来进行测量。
图12是水凝胶中聚集的LC液滴的示意图，含LPS的样品在其上流动。
图13是微流体通道内表面上固定的LC液滴的示意图。
图14是流动装置的示意图，LC液滴的水分散体在其上流动，使用光学方法(如散射光、成像、荧光检测)确定液滴内LC的构型。
图15是LC液滴置于孔中用于光分析的本发明实施方式的示意图。
图16是样品液滴置于固体表面上支持的含LC物质上的本发明实施方式的示意图。
图17是吸光度校准曲线，将～280nm波长处的吸光度(X轴)与已知5CB体积(Y轴，以nL形式表示的5CB体积)作图。
发明详述
I.总述
在描述本材料和方法前，应理解本发明不限于所述特定方法、操作方案、材料和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文所用术语仅用于描述特定实施方式目的，而不在于限制本发明范围。
如本文和所附权利要求书所用，单数形式“一”、“一个”、“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。同样，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”可互换使用，术语“包括”、“包含”和“具有”可互换使用。
除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。尽管与本文所述类似或相同的任何方法和材料可用于本发明的实践和测试，下面描述优选的方法和材料。本文特定提及的全部出版物和专利出于所有目的通过引用纳入本文，包括描述和公开与本发明相关使用的出版物所报道的化学物、仪器、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献代表本领域技术水平。本文并非承认本发明无权在先前发明公开物之前。
如本文所用，“液晶”指固体和液体之间的中间态或介晶态的有机组合物。本发明使用的适当液晶包括但不限于向温性、聚合、溶剂致、色、近晶、向列、铁电和胆固醇液晶。
液晶的“微结构域”指由界面确定的液晶相中的物质体积，其中所述体积的短轴在任何点都不大于200μm且所述短轴定义为跨液晶体积的最短长度。
术语微结构域的“锚定构型”在本文中用于描述微结构域内的液晶排序，不用于指引起排序的机制。特定地，它不用于指分析物在液晶微结构域界面均匀吸附而引起排序。本发明的独特方面是报道LPS没有在液晶微结构域表面均匀吸附，因而将本发明与现有技术相区别。
本文所用的术语“缺陷”指液晶的局部区域，其中液晶内分子的取向序与周围区域不同，如教科书例如P.G.de Gennes的“液晶物理学”(ThePhysics of Liquid Crystals)所述。缺陷的核心通常是纳米大小，且散射光。局部性地，在大部分缺陷的核心内，液晶的取向序比周围区域低。缺陷可以是液晶中的线(通常称为向错线)或点以及其他几何形状(参见上面参考的文本)。
“LPS”在本文中也互换称为“脂多糖”或“内毒素”，指由一个称为脂质A的疏水性糖磷脂区(详细结构见图1B)和两个多糖部分(称为核心多糖链和O-抗原性多糖侧链)(见图1A)组成的脂多糖。LPS是异源的且自缔合性强，分子量范围为10-20KDa。LPS是革兰氏阴性菌外膜的成分，在细菌繁殖或死亡时释放到环境中。本文使用的术语LPS包括LPS片段如LPS的脂质A成分。
脂质A为LPS对革兰氏阴性菌外膜的疏水性锚。细菌生长所需的最小LPS结构由脂质A和Kdo(3-脱氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸)结构域(见图1A)组成，但在野生型细菌菌株中可能存在核心多糖链和O-抗原性多糖侧链。脂质A构造显示在不同革兰氏阴性菌株间大部分保守，LPS的自缔合倾向和LPS结合宿主细胞膜的能力来自该分子的脂质A成分。细菌间脂质A的结构变化可包括7个疏水尾的存在，而不是图1B所示的6个。本发明的范围涵盖这些脂质A的结构变化，且不限于图1所示结构。
LPS的核心多糖区主要(见图1A)由“内核”多糖链(脂质A近侧)中的庚糖(通常由磷酸盐、焦磷酸盐或二磷酸乙醇胺取代)和“外核”(O-抗原近侧)中的糖成分(D-葡萄糖、D-半乳糖、D-葡糖胺、D-半乳糖胺或N-乙酰衍生物)组成。“O-抗原性多糖链”的重复单元由1到8个糖组成，完整的链含至多50个单元。
“无LPS”指所含LPS浓度大大低于感兴趣浓度范围的介质。例如，若样品中感兴趣的LPS浓度范围是100pg/ml到1000pg/ml LPS，则认为含低于0.1pg/ml LPS的缓冲液无LPS。许多缓冲液可作为“无LPS”出售。一些这种“无LPS”缓冲液被证实含低于2pg/ml LPS。这类缓冲液用于稀释所含LPS浓度可能远大于2pg/ml的样品。
下列缩写在本发明中使用：LC，液晶；LAL，鲎变形细胞裂解物；PBS，磷酸缓冲盐水；LPS，脂多糖；5CB，4′-戊基-4-氰基联苯；LOD，检测限度；OTS，十八烷基三氯硅烷；DLPC，二月桂酰磷脂酰胆碱；SDS，十二烷基硫酸钠；DOPC，二油酰磷脂酰胆碱；BODIPY FL，荧光团4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-二环戊二烯并苯(4，4-difluoro-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene)(BODIPYFL，生命科技公司(Life Technologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚)。
II.本发明
尽管本发明不受任何提出的理论或作用机制限制，本发明人证明了某些分析物(包括但不限于LPS和脂质A)在接触液晶微结构域时引发锚定构型转换，这是通过改变此类液晶微结构域内产生的拓扑点缺陷能量，而不是先前公认的在液晶微结构域水性界面上均匀吸附的机制实现的。此新发现的推动锚定构型转换的机制仅对分析物的特定构造敏感，提供了检测某些分析物的异常敏感的传感器和方法的基础。
本发明人最近具体确定了LPS与微米级LC结构域(微结构域)接触可引发结构域内LC锚定构型变化。在本发明的特定实施方式中，LC结构域包括分散在水相中的LC液滴。可在较低资源环境中通过用偏振光或亮视野显微术目测，或在高通量环境中通过用连续流动装置如流式细胞仪，确定LC结构域和液滴的锚定构型(包括由LPS诱导的变化)。电容测量也可用于确定微结构域内液晶的构型。
其他检测微米级结构域和液滴内LC构型的方法是本领域技术人员熟知的，包括使用荧光探针和二向色性染料以报告LC排序。本发明人也观察到LC液滴的辐射构型可作为光波导，产生能区分辐射与双极构型的LC液滴的荧光特征。该发现表明荧光强度测量和荧光显微术也可用于报告微米级结构域内LC的排序。例如，许多流动装置可报告微米级对象的荧光特征，包括装置如流式细胞仪。
因此，本发明提供了通过确定LC微结构域暴露于测试样品后的一个或多个LC微结构域构型来检测测试样品中的分析物的装置和方法。在本专利申请中，术语LC液滴定义为LC的微结构域，但本发明的LC微结构域不仅限于分散在水溶液中的LC液滴。相反，本发明包括包含LC微结构域的复合材料，如聚合和无机物质。LC的微结构域可以是移动或固定的，本发明范围涵盖固定和移动液滴。另外，结构域形状不限于球形。除了球形，包括由表面液滴形成的半球形等形状也涵盖在本发明范围内。
本领域技术人员应认识到本发明的装置和方法有许多用途，包括但不限于监控实验室或LPS生产厂的供水、测量血清中的LPS、测量气溶胶中的LPS、监控工作场所中的LPS水平、监控病人的LPS、确定待用于注射或吸入的水中的LPS水平、或制备治疗化合物。它也可用于确定乡村诊所或食物中的LPS。它还能用于测量存在干扰LAL测试的化合物的环境中的LPS。当需要高水平自动化、LAL测试费用过高，或需要快速分析(少于15分钟到1小时)时，也可使用它。
所述方法的可行性在下列实施例中确立，其显示本发明基于LC的方法可检测测试样品中的LPS，比用常规LAL测试更敏感(LOD 0.1-1pg/mL)且更快(在1分钟内)，而不需要生物试剂。在溶液中脂质浓度低于1μg/ml时，采用本方法的LC液滴检测反应对LPS特异，所述方法不检测这种浓度的磷脂如DLPC和DOPC或其他合成表面活性剂。另外，与LAL测试相反，不同LPS细菌菌株(来自大肠杆菌(E.coli)O127:B8和大肠杆菌O111:B4)使用本发明基于LC的液滴检测的灵敏度相当。此外，当使用本发明的液晶乳液时，可调整测试样品与液晶乳液的体积比以最大化LPS检测方法的灵敏度(LOD)。最后，定量本发明所用LC结构域中的LC构型提供了定量测试样品中LPS或其他分析物浓度的方法。
在下面实施例中，所用液晶是4-氰基-4′-戊基联苯-1(5CB)(见图2A)。图2B描述了这些分子组装成所谓的向列LC相，其中所述分子显示各向同性液体中未发现的远程取向序。由于本发明的LC是基本有序的油，所以可产生含分散于水相的向列相LC液滴的乳液，或LC结构域可接触水相但LC未溶于水相。大量方法可用于产生LC分散相，包括超声处理水相中的LC、经膜挤压、机械搅拌、流动聚焦，包括在微流通道中的流动聚焦。图2C显示水缓冲液中制备的LC乳滴的光学图像。
在这些LC液滴内，称为“锚定构型”的LC组成取决于LC和水相间的界面状态以及与给定锚定构型特有的一个或多个点缺陷相关的热动力学。根据液滴大小、任意界面吸附物的结构、浓度和组成、这些吸附物与液滴内存在的任意点缺陷的相关性，液滴内的LC锚定构型可显著改变，此改变可用光学和其他检测方法测得。参见Gupta等.Angew.Chem.Int.Ed.2008，48，1652-55。LC的构型由LC的界面相互作用以及LC液滴体积中保存的能量(作为LC弹性应变的结果)决定。
图2D描述了本发明中所见的两种LC液滴锚定构型。当液滴内的LC以切线方向锚定于液滴的内部界面时，LC的锚定构型对应于所谓的“双极构型”(图2D左侧)。相反，如果LC以垂直于界面的方向锚定时，LC液滴的构型变成“辐射构型”(图2D右侧)。
令人惊讶地，本发明人显示将LPS与μm大小LC液滴在LC液滴界面接触可引起LC液滴在显著较低LPS浓度下从“双极”很快变成“辐射”构型，其特异性高于对生物基质中普遍存在的其它化合物(即盐、其他脂质、核酸)的特异性。如果内毒素经与LC液滴局部区域，例如一个或多个点缺陷相互作用引发锚定构型转换，而不是如其他脂质所确立的经均匀表面吸附引发锚定构型转换，则可以解释引发LC液滴内锚定构型转换所需的LPS浓度比引发锚定构型转换所需的其他脂质浓度低。此新发现的机制在实施例中进一步证实。
在第一方面，本发明包括基于液晶的检测测试样品中的分析物的传感器。所述分析物优选但不限于LPS或脂质A。所述传感器包括一个或多个液晶微结构域和能检测液晶微结构域内锚定构型或缺陷数量的检测器。微结构域优选是分散的且具有约0.5μm-200μm的短轴。液晶微结构域更优选具有约1μm-10μm的短轴，液晶微结构域最优选具有约2μm-4μm的短轴。尽管多种液晶可用于本发明，优选的液晶是4′-戊基-4-氰基联苯(5CB)。
在一些优选的实施方式中，在将液晶微结构域暴露于分析物之前，液晶微结构域具有拓扑缺陷。在一个优选的实施方式中，与分析物相互作用之前，液晶微结构域具有两个或更多表面点缺陷，与分析物相互作用后点缺陷更少则报告存在分析物。在一个优选的实施方式中，通过将液晶限制在非平面几何形状中产生液晶起始状态的两个或更多点缺陷，这些几何形状包括液滴、表面支撑的液滴、不限制微孔形状的微孔及毛细管。也可通过使固体对象分散于液晶产生两个或更多缺陷，所述固体对象包括熟知引起液晶产生拓扑缺陷的胶体颗粒。本发明的关键方面是分析物如LPS与缺陷型液晶微结构域的相互作用导致液晶内的缺陷数量减少。
液晶微结构域中的缺陷数量优选可通过检测微结构域内液晶锚定构型来确定。在一个优选的实施方式中，通过使用具有两个缺陷(称为圆柱)的双极构型的液晶微滴，在液晶中产生两个或更多缺陷。通过微滴构型转换成辐射构型报告了分析物的存在，其中在微结构域中心的单个点缺陷被分析物稳定。
在一些优选的实施方式中，液晶微结构域是分散在液晶乳液中的液晶液滴。在一些这种实施方式中，液晶乳液是水乳液中的液晶，其中水相无LPS。在一些实施方式中，乳液的水相可包括缓冲液以控制pH。用于这种实施方式的适当无LPS缓冲液的一个非限制性例子磷酸缓冲盐水(PBS)。
在进一步的实施方式中，基于液晶的传感器额外包括与液晶乳液接触的含水测试样品。在这种实施方式中，含水测试样品与液晶乳液内所含液晶的体积比优选大于或等于约100比1；含水测试样品与液晶乳液内所含液晶的体积比更优选大于或等于约1,000比1；含水样品与液晶乳液内所含液晶的体积比最优选大于或等于约40,000比1。
在其它实施方式中，分散的液晶微结构域固定于含分散液晶微结构域的物质内。在一些这种实施方式中，微结构域可包含微结构域表面吸附的聚合物。在某些这种实施方式中，通过聚合物与单独固体表面的共价结合或聚合物与单独固体表面间的静电力固定微结构域。在分散液晶微结构域固定的其他实施方式中，含分散液晶微结构域的物质可脱水，且可包括但不限于亲水性聚合物网络、胶体或聚合物形成的凝胶。在一些这种实施方式中，本发明还包括放置成与含分散液晶微结构域的物质接触的吸附性物质。
在一些实施方式中，液晶微结构域在含凹陷(孔)的表面上分散于水中，处理孔表面以产生孔表面和微结构域间的排斥作用。该几何形状将液晶微结构域限制在孔中，但防止微结构域吸附至孔表面。此限制可用于促进读取微结构域中液晶的构型。在一个优选的实施方式中，通过在液晶微结构域和孔表面上带上类似的表面电荷来获得排斥作用。在第二个实施方式中，通过将聚合物吸附于液晶微结构域、孔或两者的表面产生排斥作用。
本发明可包括多种不同检测器以检测液晶微结构域的锚定构型。在一些实施方式中，检测器使用基于光的检测。在一些这种实施方式中，检测器可以是基于光的成像设备，包括但不限于基于偏振光的成像设备或基于荧光的成像设备。在其他这种实施方式中，检测器可检测散射光或透射光。在一些实施方式中，检测器包括亮场光源。
在一些实施方式中，检测器位于流动装置上。一个检测器可定位于其上的流动装置的非限制性例子是流式细胞仪。流式细胞仪使用许多可能的检测模式，包括但不限于基于光散射或荧光的检测模式。
不同液晶可用于本发明的分散液晶液滴。适当液晶的例子包括但不限于4-氰基-4′-戊基联苯1(5CB)、7CB和8CB及E7和TL205。适当液晶的长列表示于Peter J.Collings和Jay S.Patel的“液晶研究手册”(Handbook of Liquid Crystal Research)，牛津大学出版社(Oxford UniversityPress)，1997，ISBN 0-19-508442-X。聚合物液晶也适用于本发明的装置和方法。由于本发明的装置和方法可包括使液晶接触含水测试溶液，所以本发明所用的优选液晶应不溶于水或在水中的溶解度很有限。另外，本发明所用的优选液晶应不与水反应。
在本发明的某些实施方式中，含液滴的液晶是4-氰基-4′-戊基联苯-1(5CB)。尽管可使用不同液晶类型，但优选向列和向温性液晶。然而，形成自8CB的近晶型液晶也适用于本发明。适当液晶还包括近晶C、近晶C*、蓝相、胆固醇相、近晶A和聚合物液晶。
液晶液滴内液晶排序的变化受到液滴大小影响，反映了体积和界面理化因子间的微妙竞争(Gupta等.Angew.Chem.Int.Ed.2008，48，1652-55)。另外，液滴大小可以是液滴聚结和因而液滴分散体稳定性的因素(Heppenstall-Butler等.Liquid Crystals 2005，32，77-84)。本发明液晶微结构域的优选尺寸是短轴约.5μm-200μm，更优选尺寸是短轴约1μm-10μm。本发明液晶液滴的最优选尺寸是短轴约2μm-4μm。
在某些实施方式中，含分散液晶液滴的物质是另一种液体内，优选水缓冲溶液内的液晶液滴乳液。缓冲溶液应无LPS，以防止干扰本发明的LPS测试。水溶液也可无缓冲液。尽管多种标准缓冲液适合，但本发明所用的无LPS的缓冲溶液优选是磷酸缓冲盐水(PBS)。
这些实施方式的LC乳液中LC与水性缓冲溶液的体积比可以变化。然而，乳液内起始LC体积与水性缓冲液体积的比例优选显著小于1比1，优选小于约1/10，最优选小于约1/100。
在某些实施方式中，乳液内的分散液晶微结构域固定于基材表面。固定液晶微结构域的方法包括但不限于使用聚合物(如某些聚合物具有的结构有利于(a)吸附于液晶表面界面和(b)将液晶微结构域固定于基材表面)以促进液晶液滴固定在基材表面上。这类聚合物可从周围水溶液中自发吸附于液滴界面。本发明范围内的另一种方法是在构成微结构域的LC内溶解聚合物，使其从液体中吸附于界面。
可利用液滴界面存在的聚合物通过共价键形成或非共价相互作用将液晶液滴固定在基材表面上。可用于将液体微结构域固定于基材表面的非共价相互作用的例子包括但不限于静电引力、疏水作用、与格(dative)作用、配位键、金属介导的相互作用、或多官能聚合物与基材表面间的其他相互作用。
在一些实施方式中，能与液滴界面吸附的聚合物相互作用的基材表面上存在化学官能化表面进一步促进LC微结构域固定于基材。此外，官能性表面可设计成更有利于本方法所需的液晶液滴固定于表面的模式。
在其他实施方式中，含分散液晶微结构域的物质是固体或半固体。在一些这种实施方式中，LC液滴可固定在含水测试样品能流动的物质内，由于其接触了液滴因而影响固定液滴的锚定构型。这些实施方式的优选材料是不引发LC液滴锚定构型变化或产生光学反应的聚合物水凝胶。本领域技术人员应认识到有许多方法可合成这种含分散液晶液滴的聚合物水凝胶。一种制成这类物质的方法是用光或化学方法交联LC液滴分散体周围的水凝胶。另一种方法是用挥发性溶剂与LC形成化合物的各向同性混合物浸透水凝胶。蒸发挥发性溶剂时，介晶会发生相分离，以在凝胶内形成LC液滴。该过程在本领域熟知且用于制备LC显示器所用聚合物网络中的LC液滴分散体。
凝胶也可物理形成，如通过氢键和疏水作用。两亲聚合物如普罗流尼克聚合物形成的凝胶适合本发明的这些实施方式。在其他实施方式中，LC微结构域可在复合材料内形成，其中微结构域的一个界面暴露于含LPS的含水样品。在一个优选的实施方式中，复合材料是由微米级LC结构域组成的液晶包胶体的凝胶。在其他优选的实施方式中，LC微结构域支撑于固体材料表面，其中LC结构域在该材料中不自发扩散。这种材料的一个例子是支撑LC微结构域的硅烷化显微镜载玻片。在其他实施方式中，LC微结构域由表面的拓扑特征确定，如微孔的阶跃边缘和壁。在其他优选的实施方式中，用电场和光场限制或移动LC微结构域从而能检测分析物。
在某些使用聚合物水凝胶的实施方式中，水凝胶可用本领域已知的多种脱水方法中任何方法来脱水。在这些实施方式中，可利用水凝胶再水化使含LPS的含水测试样品与分散的LC液滴接触。在其他使用聚合物水凝胶的实施方式中，水凝胶可在引入样品前水化，吸附性物质可置于水凝胶下游以用毛细力推动样品跨越分散的LC液滴。在本发明的其他实施方式中，样品可置于含LC微结构域的物质顶面，或样品可经微流体通道流动以接触LC微结构域，或样品可置于孔中以接触LC微结构域。在发明的其他实施方式中，装置与水溶液接触以去除装置表面的LPS，然后通过与微米级LC结构域接触检测水溶液中的LPS。
本发明以液晶为基础的传感器也包括能检测和报告液晶微结构域锚定构型或液晶微结构域缺陷数量的检测器，如上所述。由于液晶液滴锚定构型可用偏振光显微术或亮视野显微术确定，所以光学显微镜在某些实施方式中可用作检测器。
本发明的范围更常包括使用偏振光或非偏振光以检测液滴内LC的构型。LC微结构域的有序阵列也可确定光学带隙材料，且本发明范围包括使用LC微结构域阵列显示的这种集合光学特性。由于LC液滴内形成的缺陷散射光，也能通过测量非偏振光散射来检测LC微结构域内的LC构型。光可以是单色、白光、或含混合波长的彩色光，它们都可用于本发明实践。
本发明的范围包括使用LC微结构域作为波导。例如，通过在LC微结构域内包含一个或多个荧光分子，能确定微结构域内的LC构型，因为LC构型会将光导向或导出荧光分子。例如，LC液滴的辐射构型会将光导向液滴的中心，在液滴中心产生亮荧光点。亮荧光点可用于检测液滴是否采用辐射构型。因此，检测荧光强度和图像荧光发射的方法在本发明范围内。
在双极锚定构型中，引导线(局部对齐LC)跟随液滴表面轮廓，连接LC液滴极点的两个直径相反的点缺陷(称为圆柱)(图3A)。在亮视野图像(图3B)中存在两个点缺陷和对应的显示相对均匀的亮圆盘的特征性偏振图像(图3C)确认了LC液滴内的双极锚定构型。
相反，在辐射锚定构型中，引导线从液滴中心发出且垂直于界面。LC液滴有一个位于液滴中心的点缺陷(图3D)，其可在亮视野图像中发现(图3E)。当在偏振光显微镜下观察时，辐射锚定构型液滴的光学外观在不同角度观察时保持不变，显示了同消色线特征(暗十字形)(图3F)，而双极构型不是如此(图3C)。
因此，本发明某些方面所用的检测器可以是装有特定部件从而能观察偏振光或亮视野图像的光学显微镜。这些部件包括但不限于适合亮视野显微镜的亮视野光源和用于偏振光显微镜的交叉偏振器。本领域技术人员容易识别其他可用于这种检测器的部件。
更通常，光探测LC微结构域、记录随LC微结构域内LC内部构型而变化的特征的装置可用于本发明实践。这些装置可包括流动通道，其中LC微结构域经入口引入该装置且经出口排出(流体阅读机，图14)，或该装置可包括具有单一入口的几何体，如用于分光光度计的比色皿。本发明包括使用分光光度计以通过经LC结构域传递的光强度变化来确定LC液滴构型。这些装置也可包括一个或多个孔或微孔以包含用于光探测的LC微结构域(图15)。
在某些其他实施方式中，流体阅读机如流式细胞仪可用作基于液晶的传感器中的检测器。在流式细胞仪中，光束被导向液压-动力集中的液流，其可包括本发明某些实施方式所含的液晶乳液。多个检测器针对液流经过光束的点，包括与光束在一条线内(测量前散射或FSC)和垂直于光束(测量侧散射或SSC)。经过光束的液晶液滴向前方或侧面散射光，此光散射可通过分析各检测器亮度波动来检测。
本发明人已确定，进行流式细胞仪分析的液晶液滴中光的侧散射与前散射比例取决于液滴的锚定构型。另外，相较具有双极锚定构型的液晶液滴，具有辐射锚定构型的LC液滴中存在的较高对称度，导致这类液滴的光散射数据分布更紧密。此结果与我们现有的锚定构型模型一致，因为来自辐射液滴的光散射应对液滴旋转保持不变，而来自双极液滴的散射取决于液滴和入射光的方向。在本发明中使用流式细胞仪作为传感器的检测器，可能提供了一种快速且高通量方法以检测和定量辐射与双极LC液滴的相对群体，并因而检测和定量含水测试样品中的LPS。本发明的范围更常包括测量来自LC结构域的光散射以确定LC微结构域内的LC构型。多种市售装置可测量对象的光散射，包括光散射仪器。
熟练的技术人员应认识到本发明有额外的检测器类型用于检测和报告液晶液滴的锚定构型。例如，如上所述，由于具有两种构型的液晶液滴之间的荧光特性差异，检测荧光的流式细胞仪或荧光显微镜可用作检测器。在另一个例子中，由于具有不同构型的液晶介电性质不同，检测器可包括电泳或双向电泳设备或其他施加电场的装置。随后可通过观察电场内随时间变化的液晶液滴移动差异来检测锚定构型。
在一些实施方式中，本发明的传感器包括放置成与液晶微结构域接触的含水测试样品。所述含水测试样品是待测试LPS存在和定量的溶液。如下面实施例所示，本发明人发现改变LPS测试样品与微结构域中液晶的体积比(进而是测试溶液与乳液所含LC的体积比)显著影响传感器的灵敏度。通过减少系统所用每单位体积LPS测试样品的LC乳滴数量来“饥饿”水-LC界面的LPS，使本方法的灵敏度增加。
在优选的实施方式中，含水测试样品与接触该测试样品的微结构域中液晶的体积比大于或等于约100比1。通过增加样品体积与微米级结构域中液晶体积的比例，能大幅提高本发明的灵敏度。含水测试样品与微结构域中液晶的体积比更优选大于或等于约1,000比1。当含水测试样品与微米级结构域中液晶的体积比大于或等于约40,000比1时，获得最高灵敏度。此比例的上限由实践本发明需要具有至少一个液晶微结构域所确定。
在发明的一些实施方式中，LC直接添加到样品中且在样品体积内产生LC乳滴的分散体。在一个优选的实施方式中，通过超声处理或使含LC的样品通过乳化器来产生LC液滴乳液。现有文献描述了许多形成乳液的机器，本发明内容也考虑使用这些机器。
第二方面，本发明是检测和/或定量测试样品中分析物，优选内毒素脂多糖(LPS)或脂质A的方法。所述方法包括提供一个或多个液晶微结构域，优选分散且具有约0.5μm-200μm的短轴，使该微结构域与测试样品，优选含水测试样品相接触，并使用检测器检测液晶微结构域的锚定构型或确定缺陷数量。液晶微结构域更优选具有约1μm-10μm的短轴，液晶微结构域最优选具有约2μm-4μm的短轴。
在一些实施方式中，液晶微结构域以水乳液中液晶形式提供，液晶微结构域是液晶液滴。含水测试样品与液晶乳液所含液晶的体积比优选大于或等于约100比1，含水测试样品与液晶乳液所含液晶的体积比更优选大于或等于约1,000比1，含水测试样品与液晶乳液所含液晶的体积比更加优选大于或等于约40,000比1。在一些这种实施方式中，乳液无LPS，在水中提供液晶的步骤可包括提供无LPS的缓冲液。
可利用各种方法检测液晶微结构域的锚定构型，包括但不限于光学成像、荧光成像、采用偏振光的光学成像、偏振光显微术、亮视野显微术、荧光显微术、光散射测量、流式细胞术、荧光流式细胞术、微量电泳、双向电泳、电容测量、磁性测量、浊度测量、检测光反射、检测光透射、目测、使用读板仪、使用微孔板、或使用检测器中的比色皿。更多细节在上文关于基于液晶的传感器描述中详述。
在进一步的实施方式中，所述方法包括使用微流体装置以传递样品给检测器的额外步骤。在其他实施方式中，所述方法使用的所有移液管、塑料制品、容器和其他装置均无LPS。
在一些实施方式中，所述方法包括定量测定含水测试样品中存在的分析物，优选LPS或脂质A的额外步骤。这可以许多方法完成。例如，本发明人证明接触含水测试样品后辐射或双极锚定构型液滴的百分比取决于测试溶液中的LPS含量。因此，通过使锚定构型百分比与已知浓度的标准样品所得百分比相关联，可完成定量。本领域技术人员应理解LPS定量不限于这种直接关联，有许多方法可从检测器数据中定量测试样品中的LPS。作为一个非限制性的例子，可开发基于测试已知浓度LPS溶液的计算机程序以分析来自流式细胞仪的光散射或荧光数据，从而直接计算测试样品中存在的LPS含量而不需计算具有给定锚定构型的液滴的百分比。
第三方面，本发明涉及制备基于液晶的传感器以检测和/或定量测试样品中分析物，优选内毒素脂多糖(LPS)或脂质A的方法。所述方法包括(a)提供含一个或多个分散液晶微结构域的物质，所述微结构域优选具有约0.5μm-200μm的短轴，和(b)提供能检测和报告微结构域中液晶的锚定构型或缺陷数量的检测器。在此方面，液晶微结构域、含分散微结构域的物质和优选的检测器在上文关于基于液晶的传感器描述中详述。
在本发明此方面的进一步实施方式中，含分散液晶液滴的物质是液晶乳液。本领域技术人员应认识到乳液可以多种方式制成。优选通过超声处理和涡旋含液晶及无LPS缓冲液的混合物来制备乳液，更优选超声处理和涡旋过程交替进行多次，最优选通过12个或更多个超声处理和涡旋处理的循环制备乳液。在其他实施方式中，乳液用流动集中的微流体通道制成，或通过使液晶或水溶液流经一个或几个孔口而制成。
在其他实施方式中，含分散液晶微结构域的物质是含微结构域的复合材料。复合材料可以是凝胶，如通过使胶体分散在液晶内制备的凝胶，即所谓的液晶包胶体凝胶。在其他实施方式中，微结构域可在聚合物或无机材料中形成。在其他优选的实施方式中，聚合物材料具有的亲水性区段可形成含微米级液晶微结构域的水凝胶。本发明涵盖材料制备，包括在分散液晶液滴周围形成水凝胶。该方法的更多细节在上文中讨论。
提供下列实施例仅用于阐述目的，而不在于限制本发明范围。实际上，除了本文所示和所述之外的不同发明改良通过上面描述和下列实施例对本领域技术人员显而易见，且在所附权利要求书范围内。
III.实施例
实施例1：材料和方法
作为应用且除非另有说明，下列实施例中使用以下材料和方法。
材料。内毒素(来自大肠杆菌(E.coli)O127:B8和大肠杆菌O111:B4的脂多糖(LPS))、脂质A(来自大肠杆菌F583的焦磷酰(diphosphoryl))和十二烷基硫酸钠(SDS)购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，)。DLPC和DOPC购自阿拉巴马州阿拉巴斯特的APL公司(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL)。十八烷基三氯硅烷(OTS)、甲醇、二氯甲烷、硫酸、过氧化氢(30％w/v)和庚烷获得自宾夕法尼亚州匹兹堡的费氏科学公司(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)。乙醇获得自康涅狄格州布鲁克菲尔德的PA公司(Pharmco-Aaper，Brookfield，CT)。LC 4′-戊基-4-氰基联苯(5CB)获得自纽约州纽约市的EM科学公司(EM Sciences，New York，NY)。LAL试剂水购自马萨诸塞州艾凡费尔茅斯的CC联合企业(Associates of Cape Cod，Inc.，E Falmouth，MA)。内陷红(Endo Trap red)平衡缓冲液(PBS缓冲液)购自德国雷根斯堡的普洛佛斯公司(Profos AG，Regensburg，Germany)。海王星(Neptune)吸头(无可检测的内毒素)购自大陆实验室产品公司(Continental Lab Product，Inc.)。聚苯乙烯管(认证级无热原管)购自新泽西州弗兰克林湖的BD实验室设备公司(Becton Dickinson Labware，Franklin lakes，NJ)。显微镜载玻片是来自费氏科学公司的费氏最高等级。金样本栅格(20μm厚度，50μm宽柱和283μm栅格间距)获得自宾夕法尼亚州华盛顿堡的电子显微镜科学公司(ElectronMicroscopy Sciences，Fort Washington，PA)。
制备实施例2的充满LC的栅格。显微镜载玻片根据公开的过程清洗并用OTS包被。通过检查两种OTS包被载玻片间限制的5CB排列来评估OTS层的量。剔除不引起5CB垂直配向锚定(5CB的垂直排列)的任何表面。金样本栅格在二氯甲烷、乙醇和甲醇中连续清洗，并置于OTS包被载玻片表面。将约1μL 5CB分散于各栅格上，随后通过使毛细管与5CB液滴接触而去除过量LC。各充满LC的栅格在室温平衡，然后25℃浸入感兴趣的水溶液。
制备标准LPS水分散体(测试水溶液)。LPS粉末在室温溶于LAL试剂水(用于LAL比较试验)或PBS缓冲液(用于本发明的试验)。对于新复原的LPS溶液(如1mg/mL或100μg/mL LPS浓度；1到5mL总体积)，第一种溶液以2500rpm振荡4分钟，各系列稀释后以相同速度45秒振荡混合从而达到最终所需浓度。对于LAL比较试验，威斯康星大学(Universityof Wisconsin)的魏斯曼临床生物生产设备实验室(Waisman ClinicalBiomanufacturing Facility Laboratory)进行了有效LPS检测灵敏度范围为100-0.001EU/mL(约10000-0.1pg/mL)的动态比浊法LAL测试(动态比浊法(KTA2)LAL测试，查尔斯河实验室国际公司(Charles RiverLaboratories International，Inc.))。
制备实施例5的DLPC、DOPC和SDS水分散体。根据公开的方法制备DLPC和DOPC的含泡分散体。简要地，DLPC或DOPC溶于氯仿并分散到玻璃小瓶中。含磷脂的氯仿溶液在N2流下蒸发，随后含脂质的小瓶置于真空至少2小时。干燥的脂质重悬于PBS缓冲溶液。然后用探测超声波处理器声波降解脂质悬浮液，产生透明溶液。随后，磷脂溶液在使用前经0.22μm孔过滤器(密理博公司(Millipore))挤出。对于所有DLPC、DOPC和SDS溶液，PBS缓冲液用作溶剂。
制备LC乳液。通过在25℃超声波降解和振荡2μL 5CB与1mL PBS缓冲液的混合物形成PBS中的LC乳液。12轮交替的10秒振荡混合(2500rpm)和10秒超声波降解产生奶白色的PBS中LC乳液。乳液的LC液滴是半径大小范围2-4μm的球形，目测到抗凝结稳定至少3小时。我们制备了在3小时内使用的LC乳液，以避免与乳液凝结和熟化相关的液滴大小分布的可能变化(图1C)。
通过偏振光显微镜确定液晶取向。用带有交叉偏振器的Olympus BX60显微镜(透射模式)观察实施例2中金栅格内充满的LC取向。进行正视检测，光源强度设置为50％全光照且光圈设置为10％以校准入射光。通过在镜台下插入聚光器和在镜台上插入伯特朗透镜可锥光偏振检测样本，确定LC的垂直配向(垂直)排列。由两种交叉同消色线组成的界面模式确认了垂直排列。用显微镜式数码相机(奥林巴斯C4000 Zoom型(Olympus C-4000Zoom))捕捉图像，设置光圈值为2.8且快门速度为1/320秒。在Olympus IX71倒置显微镜下观察LC乳液内的LC构型，物镜为100x(油镜头)。LC乳液的亮视野和偏振光图像用新泽西州布里奇沃特(Bridgewater，NJ)生产的浜松(Hamamatsu)1394 ORCA-ER CCD相机收集，该相机与计算机相连且经简单PCI(SimplePCI)成像软件(康比克斯公司(Compix，Inc.)，科瑞伯瑞图普，纽约州)控制。
LC乳液的大小分布。使用ImageJ软件从亮视野显微镜拍摄的光学显微图中测量和计算LC乳液接触不同的感兴趣分析物溶液时的大小分布。100x物镜下的120X96μm2视野区通常在感兴趣焦面下含5到10个LC乳滴。
实施例2：基于栅格的LC装置中水-LC界面上的自发LPS吸附
在此实施例中，本发明人使用基于栅格(非基于液滴)的LC装置以证明水-LC界面上的自发LPS吸附可引发LC中从平行方向(平面锚定)到垂直配向(垂直)锚定的排序转换。通过使LC集聚在金属栅格内来进行这些实验，该栅格置于OTS处理的显微镜载玻片上。这些实验的结果示于图4。
接触PBS缓冲液时，处于缓冲液界面的LC维持平行方向的平面锚定(图4D)。这可通过光学显微图(图4A)确认。接触2mL 1毫克/毫升LPS(在PBS缓冲液中)少于2分钟，处于缓冲液界面的LC转变成垂直方向的垂直锚定(图4F)。这可通过光学显微图(图4C)确认。应注意图4F右下角插图中通过锥光成像获得的同消色线特征。接触2mL 1毫克/毫升LPS(在PBS缓冲液中)24小时后，LC仍显示平行方向的初始平面锚定，如光学显微图(图4E和4B)所确认。
结果显示LPS浓度为1mg/mL时，LPS在1分钟时间间隔内自发吸附于水-LC界面且使LC锚定从平面变成垂直排列。然而，此实验设置对水溶液中低于1mg/mL的LPS浓度不敏感。具体说，甚至24小时后，采用此栅格几何形状不能检测样品中1微克/毫升的LPS。如下列实施例所示，通过使用基于液滴的传感器和本发明方法可获得显著较高的灵敏度。
实施例3：水-LC乳液界面上的自发LPS吸附
在此实施例中，本发明人进行了初步实验以证明本发明基于LC液滴的传感器和方法能用于检测含水样品中的LPS。10μL LC乳液与40μL 1mg/mL LPS或40μL无LPS的缓冲液(对照)混合。预期没有LPS(对照)时，LC液滴维持双极锚定构型(图5C)，如亮视野显微镜下观察到的两个表面缺陷所证实(图5A，5D)。也应注意偏振图像(5B，5E)中缺乏同消色线。
相反，当LC乳滴接触1mg/mL LPS(在PBS缓冲液中)时，它们迅速(接触后少于1分钟)转变成辐射锚定构型(图5H)，如显示各液滴中单一点缺陷的亮视野显微图(图5F)和偏振显微图中观察到的同消色线特征(图5G)所证明。这些结果证实LPS自发吸附于水-LC乳液界面以引起易用光学方法观察到的排序转换。
实施例4：通过LC乳滴提高LPS灵敏度并进行定量测定
此实施例显示降低LC乳液(因而乳滴内LC体积)与测试水溶液的体积比显著增加了方法的灵敏度。另外，所述实施例证明了使用锚定构型数据定量测试水溶液中存在的LPS的可行性。
四种LPS浓度为0.1pg/mL、1pg/mL、10pg/mL和100pg/mL的LPS测试溶液用于此实施例(图6，左轴)。首先，本发明人将10.8μL LC乳液与各40uL体积的四种不同LPS测试溶液接触，用偏振光显微镜观察到四种所得测试体系中的液滴(图6，右柱)。应注意在10pg/mL与100pg/mLLPS浓度间(图4，右柱)发生从辐射锚定到双极锚定的转换(如出现同消色线所示)。因此，4/1的测试样品与乳液比例的灵敏度(LOD)是10-100pg/mL LPS。这对应于至少1000比1的样品体积与微滴内LC比例。
为证明使用更大的LPS测试样品与LC乳液体积比时本方法的灵敏度提高，用相同体积(40uL)的四种标准LPS测试溶液与三种更小体积的LC乳液(.4uL、1.2uL和3.6uL)完成额外的试验(图6，左三柱)。应注意随着LC乳液体积下降，所述方法愈加敏感。此“饥饿”效应在采用1.2uL LC乳液的试验中特别明显，其中偏振显微图内的所有液滴在1pg/mL LPS浓度显示同消色线(指示辐射锚定构型)(图6，左边第二个柱，底部第二张显微图)。乳液体积的额外减少进一步增加了所述方法的灵敏度，用.4uL LC乳液的试验显示灵敏度(由显微图中出现同消色线证明的锚定构型变化)下降到最小的测试LPS浓度.1pg/mL(图6，左下方显微图)。当使用0.4uL乳液时，样品体积与微滴中LC的比例至少为40,000/1(参见实施例10的微滴中LC体积定量)。
图6的结果显示减少每单位体积LPS溶液的LC乳滴数量，使得具有辐射锚定构型的LC乳滴数量增加。另外，在给定LC乳液体积显示辐射构型的液滴相对数量似乎与测试溶液中的LPS浓度相关。这为采用本方法通过比较未知测试样品的锚定构型数据(即辐射构型百分比)与已知浓度的标准LPS样品的数据来定量测试溶液中存在的LPS提供了基础。
为进一步证明使用锚定构型数据检测和定量LPS的可行性，本发明人比较15种不同LC乳液-LPS样品的锚定构型数据(锚定构型随着内毒素浓度而变化)，其中内毒素溶液的体积是40μL且内毒素溶液中LC液滴的数量是8,600(正方形数据点)、43,000(圆形数据点)、86,000(三角形数据点)或260,000(菱形数据点)。结果示于图7。用流式细胞仪确定液滴数量，星号指示的内毒素浓度都是以LAL测试为基准。
如图7数据所示，辐射锚定构型的百分比随着LPS浓度而增加，数据也显示通过改变系统中LC与样品体积的比例，可改变该测定的动态范围。
总之，此实施例证明用本发明基于LC-乳液的LPS检测方法，灵敏度下降到0.1-1pg/mL LPS LOD，也证明用本方法获得的锚定构型数据可用于定量测试样品中的LPS。
实施例5：LPS诱导的LC乳液锚定转换对LPS的特异性
此实施例显示本方法检测LPS的高灵敏度对LPS特异。本发明人确定普通双尾脂质如DLPC和DOPC及单尾合成表面活性剂在小于10μg/ml浓度不诱导LC液滴重排序，该浓度比引起LPS内毒素反应的浓度至少大6个数量级。本发明人也用内毒素(脂质A，来自大肠杆菌F583的焦磷酰)进行实验，确定其引发LC液滴排序转换的方式与LPS内毒素无区别。
本发明人比较引起LC液滴采用辐射构型所需的脂质DLPC和DOPC及表面活性剂SDS的浓度与引起LC液滴采用辐射构型所需的LPS浓度。比较结果示于图8。进行测量，添加8,600LC液滴到40μL给定的感兴趣溶液，随后分析正交偏光片下的5CB液滴。所示浓度是引起至少60％LC液滴采用辐射构型所需的浓度。没有脂质或表面活性剂时，LC液滴表现出双极构型。
为进一步检验LC乳液锚定转换是否特异于LPS分析物，本发明人再次将LC乳滴与不同感兴趣浓度的脂质A(来自大肠杆菌F583的焦磷酰，一种LPS成分)、表面活性剂SDS、磷脂DLPC和DOPC接触(图9)。对于这些试验，各使用.4uL乳液和40uL测试溶液。
如图9的偏振显微图中出现同消色线所示，仅在接触完整LPS或脂质A时观察到LC乳滴在pg/mL分析物浓度处从双极锚定转换成辐射锚定。相反，仅在高许多的μg/mL-100μg/mL浓度范围，观察到LC乳滴在接触表面活性剂SDS或磷脂DLPC和DOPC时从双极锚定转换成辐射锚定，而在pg/mL浓度没有这种现象。
因此，本发明人证明所述方法的高灵敏度特异于LPS及其成分的检测，得出结论，LC液滴对内毒素的高敏感和特异性反应是由脂质A的独特结构引起的。
实施例6：在检测和定量中使用流式细胞仪
此实施例证明了使用流式细胞仪(光散射模式)作为检测器，以区分辐射与双极构型的LC液滴并定量测定的可行性。具有辐射与双极锚定构型的液滴通过流式细胞仪。结果示于图10，其中侧光散射强度(SSC-H)作为前光散射(FSC-H)强度的函数绘图，用于显示双极构型(图10A)和辐射构型(图11B)的LC液滴。
图10显示光的侧散射与前散射比例取决于LC液滴的内部构型。另外，图10B的数据分布更紧密，这与辐射构型的LC液滴中存在的对称度更高相一致(辐射液滴的光散射对液滴旋转保持不变；双极液滴的散射取决于液滴和入射光的方向)。此结果提示可能有迅速且高通量的方法来定量辐射与双极LC液滴的相对群体，从而用本发明方法检测和定量LPS。
实施例7：LPS与LC中的点缺陷相互作用：提出的特异性机制
本发明人计算出，如果40μL 1pg/ml溶液中的所有LPS内毒素在1,500个分散于水溶液的LC液滴(半径3μm)的水-LC界面上均匀吸附，内毒素分子的表面密度为～350,000纳米2/分子或～10-5饱和单层覆盖(～10-5朗缪尔)。相反，双尾脂质如DLPC和DOPC在对应于0.6纳米2/分子(饱和覆盖为～0.4纳米2/分子)的界面浓度引发排序转换。引发LC液滴内排序转换所需的此表面密度大差异(5到6个数量级)提示LPS内毒素通过与LC液滴局部区域如缺陷相互作用引发锚定构型转换，而不是如脂质例如DLPC所确立的通过均匀表面吸附引发锚定构型转换。
为检验此假设，本发明人改变了系统的几何形状(拓扑缺陷的存在很大程度取决于几何形状)。本发明人具体测量了内毒素在平界面诱导的排序转换。与LC液滴相反，脂质A和内毒素都不重排序微米厚的向列5CB膜(有平界面)，直到脂质A或内毒素的浓度超过mg/mL(也参见实施例2)。此外，本发明人转移脂质A的朗缪尔单层到5CB向列膜的平界面，确定了需要～1.15纳米2/分子的脂质A表面浓度才能引起产生垂直取向的LC排序。
考虑到脂质A在平界面有6个尾而常规磷脂如DLPC有2个尾，所以脂质A在与DLPC相当的界面脂质尾密度时引发LC中的排序转换。即，在平界面，脂质A通过LC界面的均匀吸附而推动LC中的排序转换。此结果有力支持了内毒素通过几何形状依赖性缺陷引发微米级LC液滴中报告的锚定构型转换的假设。
为了解内毒素与LC微滴缺陷的相互作用，本发明人用BODIPY标记的内毒素进行共聚焦显微镜检查。共聚焦显微镜测量用100μL 20μg/mLBODIPY FL-内毒素进行，在PBS溶液中有～21,500个LC液滴。这些测量确认了内毒素在具有辐射构型的LC液滴中心所形成的点缺陷处集中(见图11A)。
此外，在对液滴中心点缺陷内BODIPY标记的内毒素进行仔细光漂白后，本发明人测量了荧光回收(见图11B)，结果指示点缺陷与液滴表面间的LPS内毒素交换在以秒计的时间尺度上发生。对于LC液滴的时间序列和光漂白测量，由于不能追踪移动的LC液滴，本发明人选择性挑选了在底盖不平的基材上所吸附的带有BODIPY FL-内毒素的LC液滴；在亮视野显微镜测量下确认了对应的LC锚定。
本发明人假设由可产生中心点缺陷的～10-5朗缪尔表面内毒素浓度所推动的排序转换需要将吸附的内毒素跨液滴界面转运到圆柱缺陷。为检验此假设，加热5CB乳液至高于向列相的清除温度(Tiso＝33.5°；实验在50℃进行)，并加入同样加热至50℃的10pg/mL内毒素溶液。冷却后，测量向列相的最早出现与LC液滴内辐射排序确立间的时间间隔。如图11C所示，当内毒素浓度为10pg/ml时，液滴显示辐射排序(出现向列相后)所需的时间间隔随着液滴大小而增加。这些结果与扩散过程相一致，其中反应时间与特征性扩散长度的平方成比例。
本发明人计算在淬灭进入向列相(t1＝LA 2/4Ds，其中LA对应于πR/2，沿表面从中纬线到极区的距离)后，对于直径6μm的液滴，脂质侧向扩散到液滴表面局部区域的时间为～0.6s(使用Ds～10x10-12m2/s)。此结果提示内毒素跨液滴表面的侧向扩散确定了排序转换的动力学，因而为LC液滴排序转换是通过内毒素局部相互作用而发生的想法提供了额外支持。
结果提示内毒素通过与液滴缺陷的相互作用引发微米级LC液滴的排序转换，而不是通过LC的表面锚定变化。由于本发明人用脂质A朗缪尔-Shaefer膜的测量表明10-5L脂质A对表面锚定没有可测得的效果，本发明人得出结论，脂质A诱导的LC液滴从双极到辐射构型的排序转换导致液滴表面能量E表面～WR2增加。如果液滴内LC的弹性应变由单一弹性常数描述，从双极构型到辐射构型的转换不引起液滴紧张状态所贮存弹性能的量级变化((E弹性～KR，其中K是弹性常数)。
从双极构型到辐射构型的转换导致系统的点缺陷数量从两个(两个圆柱)减少为一个(辐射)。如果一个具用圆柱核心能量且中心点缺陷量级相似，双极到辐射排序的转换伴随着能量减少E核心～4π/3rc 3εc，其中rc是缺陷核心的半径且εc是熔化能密度。通过弹性能密度与熔化密度的竞争效应，估计核心大小为rc～(K/εc)0，从而得出E核心～4π/3εc -0.5K1.5。
此模型提示当E核心＞E表面或R＜(E核心/W)0.5时，可发生缺陷推动的排序转换。通过将εc近似为向列到各向同性转换的焓(～106J/m3)，W为10-4J/m2且K为10-11N，本发明人计算出液滴排序受到R＜11μm的缺陷能的影响很大。实际上，本发明人观察到内毒素在pg/ml范围中不引发尺寸显著大于10μm的液滴的排序转换，这与上面提出的缺陷推动排序转换模型相一致。
尽管本发明不受任何具体理论或提出的作用机制限制，本发明人发现的这个关于所述方法对LPS令人惊讶的灵敏度和特异性的新机制进一步阐述了权利要求的装置和方法的新颖性。
实施例8：使用固定于凝胶中的LC微结构域的LPS传感器
在此预示性实施例中，本发明人解释了水凝胶如何可用于LPS传感器以保持LC液滴分散。图12显示含聚集于水凝胶的LC液滴的装置，其中流动着含LPS的测试样品。目测液滴阵列能用于报告LPS的存在。这种设计可用于侧向流装置(类似于妊娠试验)，该装置整合了基于LC液滴的LPS检测。LC液滴可固定于水凝胶。应注意，能用于产生水凝胶的聚合材料不引发LC中的光学反应。该水凝胶可经光或化学交联在LC液滴分散体周围形成。其他可能的方法包括用挥发性溶剂与LC形成化合物的各向同性混合物浸透水凝胶。蒸发挥发性溶剂时，介晶会发生相分离，以在凝胶内形成LC液滴。该过程在本领域已知且用于制备LC显示器所用聚合物网络中的LC液滴分散体。
在此方法的一个实施方式中，将水凝胶脱水，利用水凝胶的水化使含内毒素的含水样品接触LC液滴。在第二个实施方式中，在引入样品之前将水凝胶水化，吸附性物质置于水凝胶下游以用毛细力推动样品跨越LC液滴。这些实施方式代表侧向流装置的基本原理，所述装置是适用于低资源环境的诊断法的成功基础。
实施例9：支撑于表面且暴露于样品且采用微流体通道的基于LC微结构域的LPS的LC传感器
在本发明的此预示性实施例中，用压电分配器将直径50微米的5CB LC液滴分散到十八烷基三氯硅烷处理的载玻片上。PDMS微通道压在支撑液滴上，含LPS的含水样品经过该通道。用偏振光显微镜监控支撑LC液滴的光学外观。当LPS吸附于液滴界面时，观察到液滴光学外观的变化，因而指示样品中的LPS存在。此实施例的更广义描述示于图13，其中样品通过流体通道，在该过程中接触固定的LC微结构域。
实施例10：基于LC包胶体凝胶内形成的LC微结构域的LC传感器
在本发明的此预示性实施例中，将1个微米大小的聚苯乙烯球分散于5CB的各向同性相中，然后置于十八烷基三氯硅烷处理的温热的显微镜载玻片上。在载玻片上形成5微米厚的各向同性5CB膜和微球，随后冷却成5CB的向列相以形成由微米级LC结构域构成的薄凝胶。含LPS的水溶液液滴放置成与微米级结构域游离表面接触，用偏振光显微镜以透射模式确定结构域的光学外观。以结构域的光学外观变化来报告样品的LPS存在。此实施例的更广义描述示于图16，其中样品施加于含LC的物质顶部，该物质自身放置于单独支撑材料的顶部。
实施例11：LC乳液中LC的校准曲线和体积测量
在此实施例中，本发明人定量了0.4μL 5CB乳滴所含的5CB体积，乳液如实施例1所述制备。
将多种已知体积的5CB溶于1mL乙醇溶液。对标准化样品进行UV-Vis吸收光谱测量，吸收峰波长为～280nm。生成已知5CB体积随着吸光度变化的校准曲线图(图17)。为确保在UV-Vis扫描波长下观察不到额外的PBS缓冲液吸收峰，对10μL PBS缓冲溶液(在1mL乙醇中)进行另外的吸光度测量。
如前面实施例1所述制备5CB乳液(2μL 5CB，在1mL PBS缓冲液中)。将0.4μL所得的5CB乳液混合到1mL乙醇中，进行UV-Vis测量。随后，本发明人使用校准曲线(图18)以定量0.4μL和0.8μL 5CB乳滴中的5CB体积。如校准曲线所示，5CB体积与吸光度呈线性相关。0.4μL和0.8μL(加入2个单独的0.4μL液滴)5CB乳液分别包含0.16nL和0.32nL 5CB，表明液晶体积与乳液体积的比例为.0004/1。这些结果在一些测试样品中重复出现。
本领域技术人员应认识或能确定，可使用不超出常规的实验实施本文所述特定材料和方法的多种等同形式。认为这些等同形式落入本发明范围内且为所附权利要求书所涵盖。

Claims (60)

1.一种检测测试样品中分析物的基于液晶的传感器，所述样品中分析物的浓度低于1μg/ml，所述传感器包括：
(a)一个或多个由界面限制的液晶微结构域，所述液晶微结构域是液晶乳液内分散的液晶液滴，所述界面在液晶液滴中产生一个或多个缺陷；
(b)能鉴定所述液晶微结构域的取向序的检测器；和
(c)与所述液晶乳液接触的含水测试样品，所述样品中分析物的浓度低于1μg/ml；
所述含水测试样品与所述液晶乳液内所含液晶的体积比大于或等于约1,000比1，所述液晶液滴中至少其一有一个点缺陷。
2.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴是分散的且具有0.5μm-200μm的短轴。
3.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴具有1μm-10μm的短轴。
4.如权利要求3所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴具有2μm-4μm的短轴。
5.如权利要求1-4中任一项所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述能鉴定液晶液滴的取向序的检测器通过确定所述液晶液滴中的缺陷数量、检测所述液晶液滴的锚定构型或两者来鉴定所述取向序。
6.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述检测器使用基于光的检测。
7.如权利要求6所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述检测器是基于光的成像设备。
8.如权利要求7所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述检测器是基于偏振光的成像设备。
9.如权利要求6所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述检测器是基于荧光的成像设备。
10.如权利要求6所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述检测器检测散射光。
11.如权利要求6所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述检测器检测透射光。
12.如权利要求7所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述传感器还包括亮场光源。
13.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述检测器位于流动装置上。
14.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，多个液晶液滴分散在固体载体所支撑的物质内。
15.如权利要求13所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述流动装置是流式细胞仪。
16.如权利要求15所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述流式细胞仪使用基于荧光的检测模式。
17.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶乳液还包含无LPS的水相。
18.如权利要求17所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述无LPS的水相还包括缓冲液。
19.如权利要求18所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述无LPS的缓冲液是磷酸缓冲盐水(PBS)。
20.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述含水测试样品与所述液晶乳液内所含液晶的体积比大于或等于约40,000比1。
21.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴中至少一个包括两个点缺陷。
22.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述分析物分配至所述液晶液滴中的缺陷上。
23.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述分析物是内毒素脂多糖(LPS)或脂质A。
24.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴是固定的。
25.如权利要求24所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴包含吸附于所述液晶液滴表面的聚合物，其中所述液晶液滴固定于基材表面。
26.如权利要求24所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴固定在亲水性聚合物网络中。
27.如权利要求24所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述分散的液晶液滴固定在胶体或聚合物形成的凝胶中。
28.如权利要求24所述的基于液晶的传感器，其特征在于，还包括将吸附性物质放置成与其中固定有所述液晶液滴的物质相接触。
29.如权利要求1所述的基于液晶的传感器，其特征在于，所述液晶液滴内的液晶是4'-戊基-4-氰基联苯(5CB)。
30.一种检测测试样品中分析物的方法，所述样品中分析物浓度低于1μg/ml，所述方法包括步骤：
(a)提供具有一个或多个缺陷的一个或多个液晶微结构域；
(b)使所述微结构域与测试样品接触，所述样品中分析物浓度低于1μg/ml；和
(c)使用检测器确定所述液晶微结构域中的缺陷数量，其中所述缺陷数量改变指示所述测试样品中存在所述分析物。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述液晶微结构域的界面是弯曲的。
32.如权利要求30或31所述的方法，其特征在于，所述液晶微结构域中缺陷数量的改变是所述微结构域中缺陷数量减少。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述液晶微结构域中缺陷数量减少是从两个缺陷变成一个缺陷。
34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述液晶微结构域中的缺陷数量通过检测所述微结构域的锚定构型来确定。
35.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述测试样品是含水测试样品。
36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述分析物是内毒素脂多糖(LPS)或脂质A。
37.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述液晶微结构域具有0.5μm-200μm的短轴。
38.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述液晶微结构域具有1μm-10μm的短轴。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述液晶微结构域具有2μm-4μm的短轴。
40.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述使用检测器检测所述液晶微结构域的任何构型变化的步骤是以下步骤中的一个或多个：光学成像、荧光成像、采用偏振光的光学成像、偏振光显微术、亮视野显微术、荧光显微术、光散射测量、流式细胞术、荧光流式细胞术、微量电泳、双向电泳、电容测量、磁性测量、浊度测量、检测光反射、检测光透射、目测、使用读板仪、使用微孔板、或使用检测器中的比色皿。
41.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用微流体装置将样品传递给检测器的步骤。
42.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用固体支持物将样品传递给检测器的步骤。
43.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法使用的所有移液管、塑料制品、容器和其他装置无LPS。
44.如权利要求30所述的方法，其特征在于，提供多个分散的液晶微结构域。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用所述分散微结构域的液晶缺陷信息以定量测定所述样品中存在的分析物的步骤。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述分析物是内毒素脂多糖(LPS)或脂质A。
47.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用所述分散微结构域的液晶缺陷信息以区分LPS或脂质A与其他脂质的步骤。
48.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述提供多个分散液晶微结构域的步骤包括在水乳液中提供液晶，其中所述液晶微结构域是液晶液滴。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述乳液无LPS。
50.如权利要求48或49所述的方法，其特征在于，所述在水乳液中提供液晶的步骤包括提供无LPS的缓冲液。
51.如权利要求48所述的方法，其特征在于，所述测试样品是含水测试样品，所述含水测试样品与所述液晶乳液内所含液晶的体积比大于或等于约100比1。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述含水测试样品与所述液晶乳液内所含液晶的体积比大于或等于约1,000比1。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述含水样品与所述液晶乳液内所含液晶的体积比大于或等于约40,000比1。
54.一种制备检测测试样品中分析物的基于液晶的传感器的方法，所述样品中分析物浓度低于1μg/ml，所述方法包括步骤：
(a)提供含分散液晶微结构域的液晶乳液，所述微结构域具有0.5μm-200μm的短轴；
(b)提供能检测所述液晶微结构域的锚定构型的检测器；和
(c)将含水测试样品与所述液晶乳液接触，所述测试样品中分析物浓度低于所述样品中分析物浓度低于1μg/ml，所述含水测试样品与所述液晶乳液内所含液晶的体积比大于或等于约1,000比1。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述提供乳液的步骤还包括超声处理和涡旋处理含液晶和无LPS缓冲液的混合物的步骤。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述超声处理和涡旋处理混合物的步骤对同一混合物进行多次。
57.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述提供液晶乳液的步骤还包括在所述分散液晶微结构域周围形成水凝胶。
58.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述提供液晶乳液的步骤还包括将所述分散的液晶微结构域固定于基材表面上。
59.一种检测测试样品中内毒素脂多糖(LPS)的基于液晶的传感器，所述测试样品中LPS浓度低于1μg/ml，所述传感器包括：
(a)含分散液晶微结构域的液晶乳液，所述微结构域具有0.5μm-200μm的短轴；
(b)能检测所述液晶微结构域的锚定构型的检测器；和
(c)将含水测试样品与所述液晶乳液接触，所述测试样品中LPS浓度低于1μg/ml，所述含水测试样品与所述液晶乳液内所含液晶的体积比大于或等于约1,000比1。
60.一种检测测试样品中内毒素脂多糖(LPS)的方法，所述测试样品中LPS浓度低于1μg/ml，所述方法包括步骤：
(a)提供含分散液晶微结构域的物质，所述微结构域具有0.5μm-200μm的短轴；
(b)使所述物质与含水测试样品相接触，所述测试样品中LPS浓度低于1μg/ml；
(c)使用检测器以检测所述液晶微结构域的锚定构型。
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