CN102367451A

CN102367451A - 一种提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒及应用

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Publication number: CN102367451A
Application number: CN2011103440137A
Authority: CN
Inventors: 刘永胜; 唐维; 牛向丽; 张黎
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2031-11-04
Also published as: CN102367451B

Abstract

本发明涉及一种提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示。通过同源序列比对筛选并克隆了提高水稻香气的基因OsBadh1。将OsBadh1基因片段正向和反向插入真核载体，获得本发明所述真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。实验表明：本发明所述的OsBadh1基因在水稻幼根，幼苗，幼穗，成熟植株根、茎、叶、花组织中均表达；OsBadh1基因的下调可以提高水稻主要香气成分2-乙酰吡咯啉的含量。因此，本发明所述基因可在水稻食味品质改良中应用。

Description

一种提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。特别涉及一种提高水稻香味的基因重组质粒及其在水稻香味品质改良中的应用。

背景技术

优质香米以其清香可口、营养价值丰富等特点深得消费者喜爱。育种家早已将稻米香味作为一项重要的选育指标；对其香味成份的代谢与生化途径的研究也是从事基础研究的学者们探索的重要课题（Buttery等，1983，Cooked rice aroma and 2-acetyl-1-pyrroline. J Agric Food Chem；Bhattacharjee等，2002，Basmatirice: A review. Int J Food Sci Technol)。在蒸煮的香米中可以检测到114种挥发性成分，其主要的香味物质是2-乙酰基-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP)（Yajima等，1978，Volatile ﬂavor components of cooked rice kaorimai: scented rice. J Agric Bio Chem）。遗传分析表明水稻中主要米香物质2AP的积累受位于水稻第八染色体上一对隐性基因控制（Berner等，1986，Inheritance of scent in American long grain rice. Crop Sci；Jin等，2003，A single nucleotide polymorphism (SNP) marker linked to the fragrance gene in rice. Plant Sci）。精细定位揭示该基因位点编码水稻甜菜碱醛脱氢酶的一个同源基因（betaine aldehyde dehydrogenase，OsBADH2)（Bradbury等，2005，The gene for fragrance in rice. Plant Biotechnol J）。在香稻品种中检测到的2AP含量明显高于非香稻品种，其主要原因是香稻品种中OsBADH2位点的自然突变引起基因功能缺失，从而加强了2AP的积累（Bradbury等，2005，The gene for fragrance in rice. Plant Biotechnol J）。利用RNA干扰技术下调OsBADH2的表达也使非香稻品种产生明显的香味物质2AP的积累（Niu等，2008， RNAi-directed downregulation of OsBADH2 results in aroma (2-acetyl-1-pyrroline) production in rice. BMC Plant Biol）。应用转基因技术在香稻品种中表达正常功能的OsBADH2显著降低2AP含量，表明OsBADH2通过消耗2AP的合成前体而抑制2AP的合成（Chen 等，2008，Badh2, Encoding Betaine Aldehyde Dehydrogenase, Inhibits the Biosynthesis of 2-Acetyl-1-Pyrroline, a Major Component in Rice Fragrance. Plant Cell）。可见，OsBADH2基因是水稻2AP合成代谢的关键基因，但2AP代谢的生化途径还不清楚。

有一些研究者曾报道了香味遗传的9：7、15：1和13：1的二基因分离和27：37的三基因分离模式，还有研究者观察到香味是多基因控制的复杂性状（Tsuzuki 等，1990，Tsuzuki E, Shimokawa E: Inheritance of aroma in rice. Euphytica；Ren等，1999，Genetic analysis of aroma in rice. Southwest China J Agric Sci）。最近的遗传研究表明，除第八染色体的OsDBADH2位点外，至少还有两个基因位点与香味物质2AP的合成有关，它们分别定位在水稻的第三、第四染色体上（Amarawath等，2008，Mapping of quantitative trait loci for basmati quality traits in rice. Mol Breed），而定位在第四染色体上的基因就是OsBadh1。这些结果为进一步解析香味物质2AP生物合成的生化途径和代谢网络提供了极具参考意义的研究资料。

Louis等纯化了OsBadh1和OsBADH2原核表达蛋白并用四种底物（N-乙酰基-γ-氨基丁醛，γ-胍基丁醛，甜菜碱醛，γ-氨基丁醛）检测了它们的酶活性，发现OsBadh1和OsBADH2可以催化γ-氨基丁醛（γ-aminobutyraldehyde）变为γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)（Louis等，2008，Inactivation of an aminoaldehyde dehydrogenase is responsible for fragrance in rice. Plant Mol Biol）。可见，OsBadh1、OsBADH2可以竞争性地使γ-氨基丁醛脱氢形成γ-氨基丁酸，从而消耗2AP可能的合成前体γ-氨基丁醛。故此，当香稻中OsBADH2基因发生突变和功能缺失时便有利于γ-氨基丁醛和香味物质2AP的合成积累，因为γ-氨基丁醛可能是合成Δ1-吡咯啉（Δ1-pyrroline）的前体，而Δ1-吡咯啉又被推测为香味物质2AP的合成前体，但相应的生化机制尚不清楚。有证据表明腐胺（putrescine）是合成γ-氨基丁醛的直接前体，腐胺可通过精氨酸/鸟氨酸脱羧而合成（Kakkar等，2000，Polyamines and plant morphogenesis. Biol Plant；Babu等，2003，Ornithine decarboxylase activity in vivo and in vitro models of Cerebral ischemia. Neurochemical Research）。根据这些结果可以推测香味物质2AP的生物合成途径可能是：脯氨酸/精氨酸→鸟氨酸→腐胺→γ-氨基丁醛→Δ1-吡咯啉，再加上糖代谢提供的乙酰基团生成2AP。显然，生化和遗传学的证据都揭示OsBadh1和OsBADH2有一定程度的功能冗余。

虽然目前对2AP的合成途径还不很清楚，但是利用RNA干扰技术下调OsBADH2的表达可使非香稻品种产生明显的香味物质2AP的积累（Niu等，2008，RNAi-directed downregulation of OsBADH2 results in aroma (2-acetyl-1-pyrroline) production in rice. BMC Plant Biol）。因此，在香味物质2-乙酰基吡咯啉的代谢途径中，通过RNA干扰技术下调消耗γ-氨基丁醛的基因可以使γ-氨基丁醛的含量增加，从而增加2-乙酰基吡咯啉的含量。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个新的提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒及其制备方法，本发明的目的之二是将所述基因真核重组质粒应用于增加水稻稻米中的香味物质2-乙酰基吡咯啉的积累。

本发明的技术方案如下：

利用稻米中2-乙酰基吡咯啉有关的基因OsBADH2（Gene Bank: AK071221）序列，通过生物信息学方法分析确定一个与OsBADH2高度同源的基因OsBadh1。序列分析显示OsBadh1包含1518个碱基的开放阅读框，该基因编码甜菜碱醛脱氢酶，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明所述提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游867bp至1283bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列。

本发明所述提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒的制备方法，具体步骤如下：

(1) 在序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是位于起始密码子下游1815bp至2152bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；

(2) 利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获真核重组质粒。

本发明所述提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒及其制备方法中，所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303、pMON1772、pBE12、pBC7中的一种。

将本发明所述基因重组质粒转化水稻，获得水稻转基因植株。实验表明：所述转基因水稻植株可以促进稻米香味物质2-乙酰基吡咯啉的积累；GC-MS分析结果显示转基因水稻中OsBadh1表达量下调时稻米中2-乙酰基吡咯啉含量明显高于野生型。因此，本发明所述的该基因真核重组质粒可在水稻香味品质改良中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明从OsBadh1基因核苷酸序列中选择了一段基因片段与真核表达载体构建真核重组质粒，为促进水稻香味物质积累提供了一种新的基因资源和重组质粒制备方法，有利于水稻的品质改良；

2、本发明所用的基因为水稻本身自有的基因，所以转基因水稻的安全性能高；

3、本发明所述基因的克隆和水稻转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

附图说明

图1 是OsBadh1基因全长序列的扩增电泳图，图中，M泳道：分子量标记（Trans2k plus DNA Marker, 购自TRANS公司）；1泳道：为OsBadh1基因的全序列。

图2是半定量RT-PCR分析OsBadh1基因在各种组织中表达情况的电泳结果图。 Actin为内参。1：节间，2：茎，3：根，4：成熟花序，5：成熟叶片，6：幼根，7：幼叶。结果表明OsBadh1基因在各个组织中表达，无明显差异。

图3 是荧光定量PCR分析OsBadh1基因的水稻组织表达差异。J：节间，S：茎，R:根，F：成熟花序，L:成熟叶片，YR：幼根，YF：幼花，YL：幼叶。结果表明：OsBadh1基因在各个组织都表达，但在成熟植株中根和叶的表达量较高。

图 4是水稻OsBadh1基因RNA干扰的真核重组质粒（pHB-OsBadh1RNAi）示意图。intron是内含子，HPT是潮霉素基因。

图 5 是pHB-OsBadh1RNAi载体构建中的质粒酶切验证图。图中，M泳道表示：分子量标记（Trans2k plus DNA Marker, 购自TRANS公司）；第1泳道：PCR扩增OsBadh1干扰片段，第2泳道：T载体+OsBadh1干扰酶切；第3泳道：PSK空载体酶切；第4泳道：PSK+ OsBadh1正反片段质粒酶切正向；第5泳道：PSK+ OsBadh1正反片段质粒酶切反向；第6泳道：PHB载体空载酶切；第7泳道：PHB+OsBadh1RNAi质粒酶切。

图 6 是转基因水稻植株中筛选标记潮霉素抗性基因(Hpt)PCR扩增结果电泳图。图中，1-8泳道：PCR模板为候选的转基因水稻植株DNA；9泳道：PCR模板为野生型水稻DNA；10泳道：PCR模板为真核重组质粒；Marker分子量标记（DL5000）。

图 7是pHB-OsBadh1RNAi转基因水稻阳性植株中OsBadh1基因RT-PCR结果图。图中WT1，WT2为野生型的水稻植株；B1-R1，B1-R2，B1-R3表示三个独立的转基因植株。Actin为内参，可以明显看到转基因植株中OsBadh1基因的含量明显低于两个野生型，而OsBadh1同源基因 OsBadh2无明显变化。

图8是pHB-OsBadh1RNAi转基因水稻阳性植株中OsBadh1基因荧光定量PCR结果图。图中WT1，WT2为野生型的水稻植株；B1-R1，B1-R2，B1-R3表示三个独立的转基因植株。可以明显看到转基因植株中OsBadh1基因的含量明显低于两个野生型。

图9是GC-MS分析pHB-OsBadh1RNAi转基因阳性植株和野生型中稻米的香味。2-AP为二乙酰基吡咯啉。结果表明，OsBadh1 基因表达量下调的转基因植株中2-乙酰基吡咯啉含量明显增加。

具体实施方式

下面结合实施事例，对本发明作进一步说明。下述实施事例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook, Russell的分子克隆实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

水稻OsBadh1基因的克隆。

1、试剂

RNA提取试剂盒购于北京天根生化有限公司；反转录试剂盒购于Toyobo公司；pEASY Blunt 载体购于北京全式金生物技术有限公司、高保真DNA聚合酶PrimeStar、Taq DNA聚合酶购于TaKaRa公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌克隆菌株为 DH5α，购于北京全式金生物技术有限公司；水稻粳稻品种日本晴（Oryza sative L. Nipponbare）种子由重庆大学农学及生命科学研究院试验基地提供。

3、培养基和溶液

LB培养基: 胰蛋白胨 10 g /L，酵母粉 5 g /L，NaCl 10 g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌；

SOB培养基: 胰蛋白胨 20 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 0.58 g/L，KCl 0.19 g/L，100×Mg²⁺ 10 mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌；

SOC培养基: SOB + 20 mM葡萄糖；

TB buffer（临用前配置）: 1 M KCl 4 mL，0.45 M MnCl₂2.4 mL，0.50 M CaCl₂0.6 mL，0.50 M K-MES 0.5 mL，ddH₂O 12.5 mL（总体积20 mL）；

100×Mg²⁺溶液: 20.33 g MgCl₂.6H₂0和24.65 g MgSO₄.7H₂0定容于100 mL H₂O，高压灭菌；

20%葡萄糖溶液: 20g葡萄糖定容于100 mL H₂O，过滤除菌；

1 M KCl溶液: 7.45 g KCl定容于100 mL H₂O，高压灭菌；

0.45 M MnCl₂溶液: 8.9 g MnCl₂.4H₂0定容于100 mL H₂O，高压灭菌；

0.50 M CaCl₂溶液: 7.35 g CaCl₂.2H₂0定容于100 mL H₂O，高压灭菌；

0.50 M K-MES溶液: 9.76 g MES定容于100 mL H₂O，用KOH 调pH至6.3，过滤除菌，分装成0.5 mL每管，-20℃储存；

DMSO: 分装200μl新鲜DMSO，-20℃储存。

4、实验方法。

4.1水稻RNA提取

1）将50-100 mg水稻叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450 μL RL溶液（使用前加入β-巯基乙醇4.5 μL），涡旋剧烈震荡混匀；在56℃孵育1-3 min使水稻组织裂解；

2）将所有溶液转移至过滤柱CS上，12,000 rpm离心5min，收集管中的上清液，并将此上清液转移至RNase-free离心管中；

3）缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，12,000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

4）向吸附柱CR3中加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CS3放回收集管中；

5）向吸附柱CR3中央加入80 μL的DNase I工作液，室温放置15 min；

6）向吸附柱CR3加入350 μL去蛋白液RW1，12,000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CR3放回收集管中；

7）向吸附柱CR3中加入500 μL漂洗液RW（向RW原液中加入4倍体积的无水乙醇，即得漂洗液RW）。室温静置2 min，12,000 rpm离心60 s，弃去收集液，将吸附柱CR3放回收集管中；

8）重复步骤7一次。之后，将吸附柱CR3置于室温数分钟，彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

9）将吸附柱CR3放入一个新的RNase-free 离心管，在柱的中央加入30-100 μL的RNase free水，室温放置2分钟。12,000 rpm离心2 min，洗脱RNA。RNA样品在-70°C中保存备用。

4.2RT_PCR

4.2.1RT

1）取1 μg总RNA 与1 μL 25 pmol oligo dT 引物，混合，用RNase-free ddH₂O补足到12.75 μL，轻轻混匀；

2）65°C 保温5 min，立即转移至冰浴中，放置2 min；

3）加入5×RT反应缓冲液4 μL，10mM dNTP 2 μL，RNA 抑制剂0.25 μL (40 U/μL)，ReverTra Ace反转录酶1 μL (100U/μL)，42°C 保温30 min，合成第一链cDNA；

4）95°C加热5 min，失活反转录酶，终止合成反应；

4.2.2PCR

水稻OsBadh1基因的克隆

将200 μl EP管放置于冰上，加入以下各种试剂：

5×PrimeStar Buffer 10 μL

dNTP Mixture(各2.5 mM ) 4 μL

RT产物 1 μL

B1F1 1 μL

B1R1 1 μL

ddH₂O 32.5 μL

PrimeStar 0.5 μL

按以下程序进行扩增：98℃ 3 min（预变性）；98℃ 10 s（变性），58℃ 15 s（复性），72℃ 2 min（延伸），所述变性-复性-延伸30个循环；72℃ 5 min（终延伸）；

以上述PCR产物为模板，以引物B1F2和B1R1进行第二轮高保真PCR，其它条件同上；

引物序列如下：

B1F1: 5’-CAGCGGAGCAGCAGCAGCAG-3’

B1F2: 5’-GCCGCCCCCCAACCGGAAGC-3’

B1R1: 5’-ATGGCTTGCTTGATGACGCA-3’

通过上述操作，获得了OsBadh1全长序列扩增产物（1723bp，图1）。

4.3高保真PCR产物和克隆载体pBLUNT-EASY连接

第二轮高保真PCR产物与克隆载体pBLUNT-EASY按摩尔分子数比2/1连接(25℃，10min)，连接体系如下：

pBLUNT-EASY (50 μg/μL) 1 μL

PCR产物 (～150 μg/μL) 2 μL。

4.4 大肠杆菌转化

4.4.1 感受态细胞的制备

1）接种大肠杆菌单菌落于2 mL SOB培养液中，37℃过夜培养；

2）转接0.5 mL过夜培养物至50 mL SOB培养液中，18℃剧烈震荡18～24 h至A₆₀₀≈0.55；

3）将培养液转入50 mL离心管中，冰浴10 min, 4℃ 4000 rpm离心10 min；

4）去上清，加16 mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意：轻轻旋转,不要用振荡器或吹吸混匀)，冰浴10 min，4℃ 4000 rpm离心10 min；

5）去上清，加4 mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280 μL的DMSO，轻柔混匀，冰浴10 min；

6）分装于预冷的1.5 mL EP管中，液氮冻存；

4.4.2转化

1）从液氮中取出一管感受态细胞冰浴解冻；

2）将10 μL连接产物与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30 min；

3）42℃热冲击90 s，立即冰浴1-2 min；

4）加0.8 mL的SOC，混匀，37℃温和振荡培养1 h；

5）室温13,000 rpm离心1 min，倒掉一部分上清液，留约200 μL的上清液，用枪头将上清液与细胞混匀，涂布LB+Amp(100 μg/mL)平板，37℃培养过夜。

4.5细胞快速裂解法鉴定重组子

1）挑取单个转化子接种于500 μL含有抗生素Amp(100 μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀为0.6～0.8；

2）取200 μL菌液至0.5mL EP管中，13,000 rpm离心1 min，去上清，留约20 μL上清；

3）加20 μL 2×快速裂解液(0.2 mol/L NaOH 50mL + SDS 0.5g, 蔗糖27.2 g,加双蒸水至200 mL)，剧烈振荡；

4）13,000 rpm离心15min；

5）取5 μL上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组载体。

4.6菌落PCR鉴定重组质粒

经过快速裂解法鉴定的重组载体再做菌落PCR以确定插入片段是目标片段，反应体系如下：

10×PCR Buffer 2 μL

Mg²⁺(1.5 mM) 1.2 μL

dNTP Mixture (各2.5 mM) 0.6 μL

菌液 1 μL

B1F2 0.4 μL

B1R1 0.4 μL

ddH₂O 12.4 μL

Taq DNA聚合酶 1 μL

反应条件：94℃ 5 min（预变性）；94℃ 40 s（变性），56℃ 30 s（复性），72℃ 2 min（延伸），所述变性-复性-延伸30个循环；72℃ 5 min（终延伸）；

对菌落PCR确定的重组载体进行测序。测序结果为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

实施例2：

RT-PCR和荧光定量PCR检测OsBadh1基因的表达模式。

1、植物材料和试剂

常规试剂和水稻材料与实施例1相同；荧光定量PCR试剂购于百乐生物技术公司；PCR引物由上海英俊生物公司合成。

2、方法。

2.1水稻不同组织RNA提取

分别用液氮迅速研磨水稻幼根、幼苗、幼穗、成熟根、茎、叶、花等组织样品，提取总RNA，具体操作步骤与实施例1中4.1相同。

2.2RT-PCR

分别取各组织总RNA1 μg进行反转录，具体操作步骤与实施例1中4.2.1相同。各组织cDNA样品以水稻ACTIN基因为内参进行半定量PCR。反应体系为：

10×PCR Buffer 2 μL

Mg²⁺(1.5 mM) 1.2 μL

dNTP Mixture (各2.5 mM) 1.6 μL

cDNA 1 μL

引物-F 0.4 μL

引物-R 0.4 μL

ddH₂O 12.4 μL

Taq DNA聚合酶 1 μL

RT-PCR的程序如下：94℃变性4 min，变性94℃ 30s，复性温度56℃ 20s，延伸72℃ 20s，所述变性-复性-延伸26个循环，72℃延伸10 min；

ACTIN基因RT-PCR扩增引物为：

ACT-F：5’-AAGATCCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'

ACT-R：5'-CTTCCTAATATCCACGTCGCACTTC-3

OsBadh1基因RT-PCR扩增引物为：

B1-F3：5’-TGCGAACGCTGGTCAAGTCT-3’

B1-R3：5’-ATCACAGCGCCAGCTAGACC-3’。

2.3荧光定量PCR

分别取水稻各组织样品总RNA各1μg，进行反转录，操作步骤如实施例1所述。以水稻内参基因（ACTIN）为对照进行实时定量PCR分析；

OsBadh1基因定量PCR扩增引物为：B1rt-F和B1rt-R；ACTIN基因定量PCR扩增引物为：ACTrt-F和ACTrt-R。引物序列如下：

B1rt-F：5’-CCCGACCACAACACCTCAA-3’

B1rt-R：5’-CCAAAGACTTCCTCTCGCCA-3’

ACTrt-F：5’-ACCTTCAACACCCCTGCTAT-3’

ACTrt-R：5’-CACCATCACCAGAGTCCAAC-3’

荧光定量PCR反应条件：95°C 30 s；95°C 5 s，60°C 20 s，40个循环。扩增后，样品在95°C保持15 s，60°C保持1 min，然后每15 s上升0.5°C进行溶解曲线分析。每个样品重复三次。PCR反应在Applied Biosystems Step-One RT-PCR system上运行。

3、结果

半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析结果基本一致，OsBadh1在水稻幼根，幼苗，幼穗，成熟植株根、茎、叶、花等组织中均表达，表明OsBadh1基因属于组成型表达(图2、3所示)。

实施例3：

OsBadh1基因RNA干涉重组质粒的构建。

1、试剂

质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶、T4连接酶、pMD18-T载体购于TaKaRa公司。其它常规试剂与实施例1相同。

2、农杆菌菌株和植物表达载体

用于转基因的农杆菌菌株为EHA105，购自Clontech公司；真核表达载体pHB由重庆大学农学及生命科学研究院提供。

3、培养基

YEB培养基：酵母提取物 1 g/L，牛肉膏 5 g/L，蛋白陈 5 g/L，蔗糖 5 g/L，MgS0₄.7H₂O 0.5 g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

4、方法。

4.1OsBadh1基因片段的获得

4.1.1 PCR

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列起始密码子下游867bp至1283bp的基因片段设计构建真核重组质粒，引物如下：

B1IF1: 5’-GTCGACGGATCCTGCGAACGCTGGTCAAGTCT-3’

B1IR1: 5’-AAGCTTATCACAGCGCCAGCTAGACC-3’

B1IF2: 5’-GAGCTCTGCGAACGCTGGTCAAGTCT-3’

B1IR2: 5’-GAATTCATCACAGCGCCAGCTAGACC-3’

以已经获得的全长质粒为模板，以B1IF1和B1IR1为正向片段扩增引物，通过PCR扩增获得到正向片段，以B1IF2和B1IR2为反向片段扩增引物通过PCR扩增获得反向片段。 PCR反应体系及程序进行扩增如下：

PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer 2 μL

Mg²⁺(1.5 mM) 1.2 μL

dNTP Mixture (各2.5 mM) 0.6 μL

cDNA 1 μL

B1IF 0.4 μL

B1IR 0.4 μL

ddH₂O 13.4 μL

Taq DNA聚合酶 1 μL

PCR扩增程序：预变性94°C 4 min，变性94°C 30 s，退火温度58°C 20 s 延伸72°C 20 s，所述变性-复性-延伸30个循环；72°C 10 min（终延伸）；

目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接

PCR产物与pMD18-T载体连接反应体系如下：

10×ligase Buffer 1 μL

pMD18-T (50 μg/μL) 1 μL

PCR产物 (～150 μg/μL) 3 μL

T4 Ligase (350 U/μL) 1 μL

ddH₂O 4 μL

16°C连接过夜；

4.1.3连接产物的转化(操作步骤见实施例1中4.4)

4.1.4菌落PCR鉴定重组质粒(操作步骤见实施例1中4.6)

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，将测序结果与基因序列进行比对，确定所扩增片段为目的基因片段。获得了pMD18T-B1正向，pMD18T-B1反向重组质粒。

4.2中间载体的构建

4.2.1质粒微量提取

pMD18T-B1正向菌和pSK载体，分别提取质粒，质粒提取过程按照生产商建议程序进行；

1）将带有克隆载体质粒的E. coli DH5α接种于裝有5 mL LB培养液(含有抗生素Amp, 100 μg/mL)的试管中，37°C培养12-16 h；

2）取1.5-5 mL菌液，室温下10000 g离心1 min。尽量吸尽上清。加入250 μL无色溶液RB（含RNase A），漩涡振荡使细胞完全重新悬浮；

3）加入250 μL 蓝色溶液LB，温和翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮溶液；

4）加入350 μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2 min；

5）15000 g离心5 min，小心吸取上清加入吸附柱中；

6）15000 g离心1 min，弃去收集液；

7）加入650 μL溶液WB，15000 g离心1 min，弃去收集液；

8）15000 g离心2 min，彻底去除残留的WB；

9）将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50 μL EB溶液，室温静置1 min；

10）10000 g离心1 min，洗脱DNA。DNA溶液于-20°C保存；

4.2.2DNA片段酶切回收

将测序正确的pMD18T-B1正向重组质粒和pSK载体，分别以Xho I、Hind III进行双酶切、DNA片段回收，DNA回收过程按照生产商建议程序进行（全式金 EasyPure Quick Gel Extraction Kit 目录号：EG101）；

1）切取琼脂糖凝胶中的DNA片段，放入干净的离心管中；

2）加入3倍体积溶液GSB，于55°C水浴6-10 min确保胶块完全融化。当胶块完全融化后，观察溶液颜色，如颜色为紫色，加入适量3 M醋酸钠(pH 5.2)，调整颜色和GSB颜色相同(黄色)；

3）待融化的凝胶溶液降至室温，将其加入吸附柱中，静置1 min后，于10000 g下离心1 min，弃去收集液；

4）向吸附柱中加入650 μL溶液WB(washing buffer)，于10000 g下离心1 min，弃去收集液；

5）再将吸附柱于10000 g下离心2 min，去除残留的WB；

6）将吸附柱开盖静置1 min，使残留乙醇挥发干净，在柱的中央加入60-70°C预热30-50 μL EB溶液，室温静置1 min；之后，于10000 g下离心1 min，洗脱DNA。将洗脱出的DNA于-20°C保存；

4.2.3正向基因片段与pSK载体的连接

将正向基因片段、pSK载体酶切回收产物进行连接，连接反应体系如下：

pSK载体酶切回收产物 7 μL

正向酶切回收片段 10 μL

T4连接酶 1 μL

10×T4连接缓冲液 2 μL

16°C反应12小时后进行转化。转化操作步骤见实施例1中4.4；

4.2.4反向基因片段与已连有正向基因片段的pSK载体的连接

将测序正确的pMD18T-B1反向重组质粒和已连有正向基因片段的pSK载体，以EcoR I、Sac I进行双酶切，将酶切回收产物进行连接、转化。具体参数如下：

Psk+正向载体酶切回收产物 7 μL

反向酶切回收片段 10 μL

T4连接酶 1 μL

10×T4连接缓冲液 2 μL

16°C反应12小时后进行转化。转化操作步骤见实施例1中4.4。

4.3真核重组质粒的获得

将含有正向基因片段和反向基因片段的pSK中间载体用BamH I、Sac I双酶切，同时将pHB真核表达载体用BamH I、Sac I双酶切后，分别回收、连接，并进行转化。具体参数如下：

PHB载体酶切回收产物 7 μL

正反向酶切回收片段 10 μL

T4连接酶 1 μL

10×T4连接缓冲液 2 μL

16°C反应12小时后进行转化。转化操作步骤见实施例1中4.4；

通过以上操作，获得OsBadh1基因RNA干涉真核重组质粒，命名为pHB-OsBadh1RNAi (如图4、图5所示)。

4.4农杆菌感受态细胞的制备

1) 挑取农杆菌单菌落于2 mL的YEB液体培养基(含有Rif 50 μg/mL)中，28℃振荡培养过夜；

2) 取过夜培养液500 μL转接于50 mL YEB(含Rif 50μg/mL)液体培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀= 0.5；

3)将步骤2）培养液于 4℃下5,000 rpm离心5 min，收集菌体，加l0 mL 0.15 M的NaCl溶液悬浮菌体，冰浴10 min；

4) 将步骤3）菌悬液于4℃下5,000 rpm离心5 min，收集菌体，用l mL预冷的20 mM CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10 min；

5) 制备好的细胞立即使用，或分装成200 μL/管，液氮中速冻l min, 置-80℃保存备用。

4.5农杆菌的转化

1）取200 μL感受态细胞，冰上解冻；

2）加l μg pHB-OsBadh1 RNAi重组载体，轻弹混匀，冰浴30 min；

3）液氮中速冻l min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培养基，28℃振荡培养4 h；

4）将培养物涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）和50 μg/mL利福平（Rif）的YEB平板上，28℃培养约48 h。

4.6农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于含50 μg/mL Kan和50 μg/mL Rif 的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定；

鉴定结果表明，获得了可用于转基因的阳性农杆菌克隆。

实施例4：

OsBadh1基因RNA干涉转基因水稻植株的获得。

1、试剂

DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

2、培养基

常规用组织培养基：

组分 MS基本培养基(g/L) B5基本培养基(g/L) N6基本培养基(g/L)

大量元素

KNO₃1.900000 2.500000 2.830000

NH₄NO₃1.650000 n/a n/a

(NH₄)₂SO₄n/a 0.13400 0.463000

MgSO₄-7H₂O 0.370000 0.250000 0.185000

CaCl₂0.332020 0.113240 0.125330

KH₂PO₄0.170000 n/a 0.400000

NaH₂PO₄-H₂O n/a 0.150000 n/a

微量元素

MnSO₄-H₂O 0.016900 0.010000 0.003330

H₃BO₃0.006200 0.003000 0.001600

ZnSO₄-7H₂O 0.008600 0.002000 0.001500

NaMoO₄-2H₂O 0.000250 0.000250 n/a

CuSO₄0.000025 0.000025 n/a

KI 0.000830 0.000750 0.000800

CoCl-6H₂O 0.000025 0.000025 n/a

铁盐

FeSO₄-7H₂O 0.027800 0.027800 0.027800

Na₂-EDTA 0.037300 0.037300 0.0373000

有机成分

肌醇 0.100000 0.100000 n/a

甘氨酸 0.002000 n/a 0.002000

烟酸 0.000500 0.001000 0.000500

盐酸吡哆醇 0.000500 0.001000 0.000500

盐酸硫胺素 0.000100 0.010000 0.001000

其它

蔗糖 30 20 50

琼脂 8 8 8

pH 5.8 5.5 5.8

(1) 诱导培养基：N6 + 2 mg/L 2，4-D，pH 5.8~5.9；(2) 共培养培养基：N6 + 2 mg/L 2，4-D + 100 μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.2；(3) 筛选培养基：N6+ 2 mg/L 2，4-D + 250 mg/L羧苄青霉素 + 30 ~ 50 mg/L潮霉素，pH 5.8 ~ 5.9；(4) 分化培养基：N6 + 10 mg/L KT + 0.4 mg/L NAA + 250 mg/L 羧苄青霉素，pH 5.8~5.9；(5) 生根培养基：1/2 MS，pH 5.8~5.9。

3、方法。

3.1 农杆菌介导法转化水稻

3.1.1 胚性愈伤组织的诱导及继代

水稻日本晴成熟种子手工去壳，依次经75%乙醇和25%次氯酸钠溶液分别消毒1 min和25 min，再用灭菌蒸馏水冲洗灭菌的去壳种子3次，然后接种到诱导培养基上，于27℃暗培养诱导愈伤组织形成，并继代培养2次；

3.1.2农杆菌的培养及处理

从－80℃低温冻存管中刮取少量农杆菌阳性克隆菌液，在含有Kan 50mg/L和Rif 50mg/L 的YEB固体培养基划线，然后在28℃暗培养36-72 h活化。取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃培养两天后，悬浮于20 mL含有100 µM/L乙酰丁香酮培养基中，剧烈摇动1 min后，静置1 h；

3.1.3共培养

选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3 mm的颗粒状愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述处理的农杆菌菌液，略微摇动后静置15 min，于无菌滤纸上晾干愈伤后接种于共培养基，25℃暗培养2 d；

3.1.4洗除农杆菌

挑取共培养后的愈伤组织于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250 mg/L羧卞青霉素的无菌水浸泡愈伤组织1 h，然后置于无菌滤纸上晾干，再移至筛选培养基上培养；

3.1.5愈伤组织的筛选

转化的愈伤组织在筛选培养板上生长，每两周转板1次；

3.1.6抗性愈伤组织的继代与植株的再生

转化的愈伤组织在筛选培养板上生长约三周后即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤组织从褐化干瘪的愈伤组织中长出。待其长大后挑选抗性愈伤组织的一部分转移至分化培养基上，培养约2周或更长时间后愈伤开始转绿，培养3周或更长时间后分化出幼苗。将幼苗移至生根培养基上，待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。

3.2转基因植株的鉴定

3.2.1 水稻基因组DNA的提取

分别取野生型、转基因植株叶片提取基因组DNA，提取过程按照生产商建议程序进行；

1）取新鲜水稻组织100 mg，加入液氮充分研磨；

2）加入250 µL溶液RB1，振荡混匀，使样品完全悬浮；

3）加入30 µL 10%SDS，15 µL RNase A至裂解液中，充分混匀；

4）55°C水浴孵育15 min；

5）12,000 rpm离心15 min，轻轻吸取上清于干净的离心管中；

6）加入100 µL溶液PB1中，充分混匀，冰浴5 min，12,000 rpm离心5 min；

7）轻轻吸取上清于干净的离心管中，加入375 µL溶液BB1(使用前加入无水乙醇)，充分混匀；

8）取全部混合液加入吸附柱中，12,000 rpm离心30 s，弃去收集液；

9）加入500 µL溶液CB，12000 rpm离心30 s，弃去收集液；

10）加入500 µL溶液WB(使用前加入无水乙醇)，12,000 rpm离心30 s，弃去收集液；

11）重复步骤10一次；

12）12,000 rpm离心2 min，彻底去除残留的WB；

13）将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入100 µL预热(60°C)的EB溶液，室温静置1 min，12,000 rpm离心1 min，洗脱DNA。DNA溶液于-20°C保存；

3.2.2阳性转基因植株鉴定

分别以野生型、转基因植株基因组DNA为模板，对水稻潮霉素抗性标记基因(Hpt)进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer 2 μL

Mg2+ (1.5 mM) 1.2 μL

dNTP Mixture (各2.5 mM) 0.6 μL

cDNA 1 μL

HPTF 0.4 μL

HPTR 0.4 μL

ddH2O 13.4 μL

Taq DNA聚合酶 1 μL

潮霉素抗性基因特异引物为：

HPTF：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3'

HPTR：5'-GCGTCTGCTGCTCCATACAAG-3'

按以下程序进行扩增：94℃ 3 min（预变性）；94℃ 30 s（变性），58℃ 30 s（复性），72℃ 20 s（延伸），所述变性-复性-延伸30个循环；72℃ 5 min（终延伸）；

3.2.3转基因阳性植株中OsBadh1基因表达分析

分别提取野生型、转基因水稻植株叶片的RNA、反转录(操作步骤如实施例1所述)，以水稻ACTIN基因做为内参进行RT-PCR、定量PCR分析，操作步骤如实施例2；

3.2.4转基因植株香味测定

1）水稻香味的初步评价

以香粳9407作为正对照，野生型日本晴作为负对照，OsBadh1 RNA干涉转基因植株为实验材料，用KOH法初步分析转基因植株的香味。即：选取抽穗期新鲜叶片约2g，剪成约5 mm的小段，浸泡于装有10 mL KOH溶液（1.7%，W/V）的试管中密封约10分钟，初步评定叶片是否含有香味物质；

2）GC-MS分析

以野生型稻米为负对照，市场购买的泰国香米Thai Hom Mali 105为正对照，2,4,6三甲基吡啶（TMP，购自sigma）作为内标。2,4,6三甲基吡啶稀释到0.1 M的HCL中终浓度为2.00 ppm。将磨细的稻米30 g置于250 mL烧瓶中，加入120 mL含有内标的提取液中，振荡2小时后过滤。加入9 mL 1.0 M NaOH，使过滤液的pH值达到弱碱性，然后分装到两个50 mL离心管中，8,000 rpm离心10分钟。将约80 mL的上清液转移至250 mL分液漏斗中，加入120 mL二氯甲烷萃取。重复萃取1次。将共240 mL二氯甲烷溶液，加入无水硫酸钠脱水后，在旋转蒸发仪中于26℃下减压蒸馏至1 mL，再室温挥发，得0.1 mL浓。取1 µL浓缩液进行GC-MS（GC-MSQ P2010W, Shimadzu, Japan）分析；

氦气（纯度99.999%）压力80 Kpa作为GC的载气。GC、MS进样口的温度分别为170℃和250℃。Rtx-wax毛细管柱（30m× 0.25mmid，膜厚度为0.25μm）的起始温度为40℃。进样后40℃保持2分钟，然后以6℃/min上升到80℃，保持1 min后以4℃/min上升至120℃，然后以8℃/min上升到200℃，保持20 min。毛细管中的气体直接进入MS进行检测。MS采用电子对撞模式，离子源温度200℃，电压温度为70 eV。

4、结果。

4.1转基因植株的鉴定

以空质粒pHB为阳性对照，非转基因植株为阴性对照。提取转基因水稻植株的总DNA，根据已知的质粒pHB中选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（Hpt）序列设计引物，阳性转基因植株扩增出Hpt目标条带(560bp)，而野生型植株未能扩增出目标条带(图6)。

4.2转基因水稻阳性植株OsBadh1基因表达分析

RT-PCR、定量PCR分析结果显示，在3个独立转基因植株(B1-R1、B1-R2和B1-R3)中，OsBadh1基因表达量较野生型显著降低(图7、8)；而OsBadh1同源基因OsBADH2的表达量并未受到明显影响(图7)，表明转基因植株特异下调了OsBadh1基因的表达。

4.3转基因植株香味物质的GC-MS测定

通过GC-MS分析转基因、野生型水稻的稻米香味，结果表明，转基因植株稻米的总离子图在11.5分钟检出香味物质2-乙酰基吡咯啉，而野生型水稻则未检测到该物质（图9）。

Claims

1.一种提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游867bp至1283bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列。

2.一种提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1) 在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是起始密码子下游867bp至1283bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子序列；

(2) 利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到真核表达载体上，即获提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒。

3.根据权利要求2所述的一种提高水稻香味物质含量的基因真核重组质粒的制备方法，其特征在于所述真核表达载体为pHB、pCAMBIA1301、pTCK303、pMON1772、pBE12、pBC7中的一种。

4.一种影响水稻香味品质的方法，其特征在于将权利要求2所述的基因真核重组质粒转化水稻，获得转基因植株。

5.权利要求1所述真核重组质粒在水稻香味品质改良中的应用。