CN102365360A - 具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸

涉及序列表

本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过提述并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

相关技术描述

植物细胞壁多糖构成植物细胞壁的90％并且能够分成以下三组：纤维素、半纤维素和果胶。纤维素是细胞壁多糖的主要成分。半纤维素是植物细胞壁中第二丰富的成分。主要的半纤维素聚合物是木聚糖。植物细胞壁中发现的木聚糖的结构取决于它们的来源可能差异显著，但是它们总是含有β-1，4-连接的D-木糖主链。β-1，4-连接的D-木糖主链能够用多个侧基取代，所述侧基如L-阿拉伯糖(L-aribinose)、D-半乳糖、乙酰基、阿魏酰基(feruloyl)、对-香豆酰基(p-coumaroyl)和葡糖醛酸残基。

木聚糖主链的生物降解依赖于两类酶：内切木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)将木聚糖主链切割成较小的寡糖，这些寡糖能够进一步通过β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)降解成木糖。木聚糖的降解中涉及的其它酶包括，例如，乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯糖酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和对-香豆酸酯酶。

乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.6)从乙酰木聚糖的β-D-吡喃木糖基残基(β-D-xylopyranosyl residue)上的2位和/或3位去除O-乙酰基。乙酰木聚糖在木聚糖的水解中发挥重要作用，因为所述乙酰侧基能够在空间上干扰切割主链的酶的接近。乙酰侧基的去除促进内切木聚糖酶的作用。基于序列相似性的糖酯酶分类体系产生了对13个家族的定义，其中的七个含有乙酰木聚糖酯酶(Henrissat B.，1991，Biochem.J.280：309-316，及Henrissat和Bairoch，1996，Biochem.J.316：695-696)。

本发明涉及来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的乙酰木聚糖酯酶和编码该多肽的多核苷酸。

根据WO 1995/002689已知来自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶(GENESEQP：AAR63006)；然而，该酶和本发明的乙酰木聚糖酯酶并无显著的同源性。

根据EP507369已知来自黑曲霉(Aspergillus niger)的乙酰木聚糖酯酶(GENESEQP：AAR25291)。该酶与本发明的乙酰木聚糖酯酶80％相同。

发明内容

本发明涉及乙酰木聚糖酯酶，所述乙酰木聚糖酯酶具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，5.0的pI和32.7Da的MW，且具体涉及具有与SEQ IDNO：2中公开的棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶同源或相同的氨基酸序列的乙酰木聚糖酯酶。

在第一方面，本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，选自下组：

(a)一种多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少85％同一性的氨基酸序列；

(b)一种由下述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；和

(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

在第二方面，本发明涉及包含编码第一个方面的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。

在第三方面，本发明涉及包含可操作地连接于一个或多个在表达宿主中指导所述多肽产生的调控序列的多核苷酸的核酸构建体。

在第四方面，本发明涉及包含第三方面的核酸构建体的重组表达载体。

在第五方面，本发明涉及包含第三方面的核酸构建体的重组宿主细胞。

在第六方面，本发明涉及产生第一方面的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含下述核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

在第七方面，本发明涉及产生第一方面的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

在第八方面，本发明涉及经编码第一方面的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

在第九方面，本发明涉及用于降解乙酰木聚糖的方法，包括用第一方面的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽处理包含乙酰化的木聚糖的材料。

在第10方面，本发明涉及包含第一方面的多肽和一种或多种其他选自如下的酶的组合物：木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、葡聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonas)和木聚糖酶。

在第11方面，本发明涉及第一方面的多肽或第10方面的组合物用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的工艺中的用途，所述工艺包括下述步骤：

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)在纤维素分解酶和本发明的酶的存在下水解所述材料；

(c)使用发酵微生物进行发酵。

定义

乙酰木聚糖酯酶活性：术语“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定义为羧酸酯酶活性(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合的木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenylacetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是按照标题为“乙酰木聚糖酯酶活性的确定”的段落中所述的方法而确定的。

本发明的多肽具有SEQ ID NO：2的成熟多肽的乙酰木聚糖酯酶活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少100％。

分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下实现：通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为以其在翻译和任何翻译后修饰(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式存在的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述成熟多肽是SEQID NO：2的氨基酸34-308。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ ID NO：1的核苷酸136-963。

同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”来描述。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等，2000，Trends in Genetics 16：276-277)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)来测定。使用的可选参数是：缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的残基x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等，2000，见上)(优选版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，见上)来测定。使用的可选参数是：缺口打开罚分为10，缺口延伸罚分为0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：

(相同的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)

同源序列：术语“同源序列”在本文中定义为用SEQ ID NO：2的棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶、其成熟肽或其片段，在tfasty检索(Pearson，W.R，1999，于Bioinformatics Methods and Protocols，S.Misener和S.A.Krawetz编，185-219页)中给出小于0.001的E值(或预期分数)的预测蛋白质。

或者，术语“同源序列”定义为与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有优选至少85％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性程度的具有乙酰木聚糖酯酶活性的氨基酸序列。

当用于表征多核苷酸序列时，术语“同源序列”表明所述多核苷酸序列编码其为“同源序列”的氨基酸序列。

多肽片段：术语“多肽片段”在本文定义为从SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(数个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有乙酰木聚糖酯酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQID NO：2的成熟多肽或其同源序列的至少200个氨基酸残基，更优选至少215个氨基酸残基，并且最优选至少230个氨基酸残基。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的5′和/或3′端缺失了一个或多个(数个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少600核苷酸，更优选至少650个核苷酸，并且最优选至少700个核苷酸。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。

编码序列：当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框确定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列。

cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA没有任何内含子序列。

核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需或有利的所有组分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。

修饰：术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码这样的多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(数个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(数个)氨基酸侧链的置换。

人工变体：当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或其同源序列的修饰的多核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰公开于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列或其同源序列来获得。

发明详述

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽

在一个优选的方面，本发明涉及包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％，并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度的氨基酸序列的分离的多肽，所述多肽具有乙酰木聚糖酯酶活性(下文称为“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽。在另一优选的方面，多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1至308，或其等位变体；或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其等位变体，或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成。在另一优选的方面，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸1至308或其等位变体，或它们的具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段组成。

在一个优选的方面，本发明涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选极低严格条件、更优选低严格条件、更优选中严格条件、更优选中-高严格条件、甚至更优选高严格条件、和最优选非常高严格条件下与下列杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亚序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可以编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其亚序列；以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的DNA。具体而言，可将这些探针用于根据标准的Southern印迹方法与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14个，优选至少25个，更优选至少35个，并且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度上是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度上可以是至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少550个核苷酸，优选至少600个核苷酸，甚至更优选至少650个核苷酸，或最优选至少700个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记用于检测相应的基因(例如，用³²p、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针包含于本发明中。

因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列；包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；它们的全长互补链；或其亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸136-963。在另一优选的方面，核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO：1。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3％SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25％的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35％的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50％的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2％SDS优选在45℃(非常低严格性)，更优选在50℃(低严格性)，更优选在55℃(中严格性)，更优选在60℃(中-高严格性)，甚至更优选在65℃(高严格性)，并且最优选在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy计算法(1962，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 48：1390)计算得出的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至24小时。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在6X SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6X SSC在比计算得出的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

在一个优选的方面，本发明涉及由如下多核苷酸编码的具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少85％，优选至少90％、更优选至少95％、并且甚至最优选至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成，其编码活性多肽。参见本文多核苷酸部分。

在一个优选的方面，本发明涉及SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(或数个)氨基酸的人工变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly-histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于The Proteins，Academic Press，New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

除了20个基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上可得到的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烷羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。

可供选择的是，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即，乙酰木聚糖酯酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失、和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；美国专利5,223,409号；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17：893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。

SEQ ID NO：2的成熟多肽如SEQ ID NO：2的氨基酸34-308的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的来源

本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有乙酰木聚糖酯酶活性的革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有乙酰木聚糖酯酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选具有乙酰木聚糖酯酶活性的酵母多肽如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或更优选具有乙酰木聚糖酯酶活性的丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、Trichophaea、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Hum icola insolens)、疏棉状腐质霉(Hum icola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在一个更优选的方面，所述多肽是具有乙酰木聚糖酯酶活性的棘孢曲霉多肽，例如，包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或其同源序列的多肽。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员会容易地识别适合的等同物的身份(identity)。

这些种的菌株在许多培养物保藏机构对于公众能够容易地取得，所述保藏机构如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center)(NRRL)。

此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。

融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的Kex2位点(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3：568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76：245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63：3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13：498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9：378-381)；Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg位点，其在精氨酸残基后通过因子Xa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25：505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位点，其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13：982-987)；His-Tyr-Glu位点或His-Tyr-Asp位点，其通过Genenase I切割(Carter等，1989，Proteins：Structure，Function，and Genetics 6：240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位点，其在Arg后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4：35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位点，其在Gln后通过TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过遗传工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上)。

多核苷酸

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由该核苷酸序列组成。

在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。在在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。在另一优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO：1的核苷酸37-963或由SEQ ID NO：1的核苷酸37-963组成。本发明还涵盖编码如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ IDNO：2或其成熟多肽的氨基酸序列，或由SEQ ID NO：2或其成熟多肽的氨基酸序列组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO：1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID NO：1的亚序列，所述亚序列编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的SEQ ID NO：2的片段。

本发明还涉及突变的多核苷酸，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变或由具有至少一个突变的SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成，其中突变的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的成熟多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以从梭胞壳属菌株，或另外的或相关的生物体克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其组成，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，并且最优选至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性程度，所述多核苷酸编码活性多肽。

修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ IDNO：1的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列：所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等，1991，Protein Expression and Purification 2：95-107。

对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的乙酰木聚糖酯酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos等，1992，见上；Smith等，1992，见上；Wlodaver等，1992，见上)。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严格条件下，优选低严格条件，更优选中严格条件，更优选中-高严格条件，甚至更优选高严格条件，并且最优选非常高的严格条件下，与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链，或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

本发明还涉及通过如下获得的分离的多核苷酸：(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严格条件下，将DNA的群体与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的全长互补链。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(数个)调控序列可操作地连接，所述调控序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下的表达。

可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸用于多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。

调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins from recombinant bacteria″于Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook等，1989，见上中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992，Yeast 8：423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为向转录的mRNA添加聚腺苷残基的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

调控序列还可为信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列与编码分泌多肽的编码序列区段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列为外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS，nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前(多)肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转变为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(数个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达用调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

本发明的载体优选地含有一个或多个(数个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphate decarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10,000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO 00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，从而也含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生。将包含本发明的多核苷酸的载体引入宿主细胞从而将所述载体作为染色体整合体或作为自复制的染色体外载体保持，如前文所述。术语“宿主细胞”包含亲本细胞的任何子代，其因为在复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择在很大程度上会依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属和海洋芽孢杆菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166：557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.16：6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等，2004，Folia Microbiol.(praha)49：399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171：3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64：391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets，2005，Appl.Environ.Microbiol.71：51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.32：1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios.68：189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65：3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45：409-436)。然而，可使用将DNA引入宿主细胞的领域中已知的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi，第八版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等，1995，见上)。

在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述。

在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。

在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngu)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene78：147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente，于Abelson，J.N.和Simon，M.I.编，Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，182-187页，AcademicPress，Inc.，NewYork；Ito等，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是青霉属的。在一个更优选的方面，所述细胞是Penicillium aurantiogriseum。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养如本文所述的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的成熟多肽或由SEQ ID NO：2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌到培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶试验(enzyme assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。

所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(bluegrass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如为了促进本发明的应用而分离的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。

表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码本发明多肽的一个或多个(数个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达载体方便地是包含编码本发明多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等，1988，Plant Physiology 86：506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294，Christensen等，1992，Plant Mo.Biol.18：675-689；Zhang等，1991，Plant Cell 3：1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性启动子如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等，1998，Plant and CellPhysiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology152：708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等，1998，Plantand Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其它种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，Plant Physiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular and General Genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现本发明多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993，见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其它的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current OpinionBiotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择并入了表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，其包括：(a)在有益于产生多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。

组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。优选地，所述组合物富含这样的多肽。术语“富含”表示所述组合物的乙酰木聚糖酯酶活性，例如，以至少1.1的富集因数(enrichment factor)增加。

所述组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如，单组分组合物。或者，所述组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，优选棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，优选特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，优选哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包括于所述组合物中的多肽稳定化。

下面给出的是本发明多肽组合物的优选的用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其它条件可以基于本领域内已知的方法确定。

用途

本发明还涉及使用具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽或其组合物的方法。

本发明具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可用于多种应用以通过用有效量的多肽(参见，例如WO2002/18561)处理含乙酰木聚糖材料来降解或转化所述含乙酰木聚糖材料。本发明的多肽优选与其他木聚糖降解酶如木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶一同用于必须降解木聚糖的工艺中。作为脱酰基反应的后果，木聚糖变得更加易受木聚糖酶和其他木聚糖降解酶的作用。

具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽可用于多种应用：体内修饰含木聚糖的动物饲料以改善可消化性；由生物质降解或转化为可发酵的糖所得的用于产生例如燃料和/或饮用乙醇的一般应用；用于纸浆和纸脱木质化中的处理助剂(processing aid)；用于纺织品的酶煮炼系统(enzymatic scouring system)的组分；食品应用，例如烘烤，与其他酶功能组合以改善烘烤商品的物理性质；和与其他酶功能组合用于洗衣用洗涤剂(laundry detergent)。

所述多肽可用于根据美国专利5,658,765号的供处理牛皮纸浆的方法。一般而言，用木聚糖酶处理牛皮纸浆以在纸产品的制备中去除木质素。由于木聚糖的高乙酰化程度，当用乙酰木聚糖酯酶在木聚糖酶处理之前或同时处理纸浆时，木聚糖酶的有效性得到极大提高。

所述多肽亦可用于根据美国专利5,658,765号的供产生木糖或木寡糖的工艺。

所述多肽亦可用作根据美国专利6,245,546号的改善饲料可消化性以增加其利用效率的饲料增强酶。乙酰木聚糖酯酶在饲料中的使用可减少饲料组分的溶解度，从而减少其粘度并减少戊聚糖(pentosanes)的抗营养作用(anti-nutritional effect)。

所述多肽亦可用于根据美国专利5,693,518号的烘烤。

所述多肽还可用于根据WO2002/24926的酿造，其中该酶与其他酶的组合可用于降解生物细胞壁材料以在涉及制备果汁或啤酒的应用中增加可消化性或流体性质(flow characteristics)。

因此，本发明亦涉及用于降解乙酰化木聚糖的方法，包括用此种具有乙酰基木聚糖酯酶活性的多肽处理包含所述乙酰化木聚糖的组合物。在一个优选的方面，用木聚糖降解酶进一步处理所述包含乙酰化木聚糖的材料。所述木聚糖降解酶可选自下组：木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其组合。

纤维素材料的加工

本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括，用酶组合物在纤维素分解酶和本发明的酶的存在下处理纤维素材料。在一个优选的方面，所述方法进一步包括回收经降解或转化的纤维素材料。

本发明还涉及产生发酵产物的方法，包括：(a)用纤维素分解酶组合物在本发明的酶的存在下糖化纤维素材料；(b)用一种或多种发酵微生物发酵经糖化的纤维素材料以产生发酵产物；和(c)从发酵回收所述发酵产物。

本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，包括：用一种或多种发酵微生物发酵所述纤维素材料，其中所述纤维素材料用纤维素分解酶组合物在本发明的酶的存在下糖化。在一个优选的方面，所述纤维素材料的发酵产生发酵产物。在另一个优选的方面，所述方法进一步包括从发酵回收发酵产物。

本发明的酶可为去除或未去除细胞的粗发酵液的形式，或为半纯化或纯化的酶制剂的形式，或在使用生物质的发酵工艺中所述组合物可包含本发明的宿主细胞作为本发明的酶的来源。

本发明的方法可用于将纤维素材料糖化为可发酵的糖，并将可发酵的糖转化为许多有用物质，例如化学品和燃料。从纤维素材料产生所需发酵产物通常涉及预处理、酶水解(糖化)和发酵。

根据本发明纤维素材料的加工可使用本领域常规工艺达成。而且，本发明的方法可使用配置为依照本发明操作的任何常规生物质加工装置实施。

水解(糖化)和发酵，分别或同时，包括但不限于，分离的水解和发酵(SHF)、同步糖化和发酵(SSF)、同步糖化和共发酵(SSCF)、混合的水解和发酵(HHF)、分离的水解和共发酵(SHCF)、混合的水解和共发酵(HHCF)，和直接微生物转化(DMC)。SHF使用分离的处理步骤以首先将木素纤维素酶水解为可发酵糖，例如，葡萄糖，纤维二糖、纤维三糖和戊糖，然后将可发酵糖发酵成为乙醇。在SSF中，木素纤维素的酶水解和糖变为乙醇的发酵在一个步骤中组合(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversion technology，于Handbook onBioethanol：：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。S SCF包括多种糖的共发酵(Sheehan，J.，和Himmel，M.，1999，Enzymes，energy and the environment：A strategic perspective on theU.S.Department of Energy’s research and development activities for bioethanol，Biotechnol.Prog.15：817-827)。HHF在同步糖化和水解步骤之外，还涉及单独水解步骤，所述步骤可以在同一个反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度，即，高温酶糖化，然后在发酵菌株能够耐受的较低温度进行SSF。DMC在一个或多个步骤中组合了所有三个过程(酶产生、木素纤维素水解和发酵)，其中使用相同的生物体产生用于将木素纤维素转化成可发酵糖并将可发酵糖转化成终产物的酶(Lynd，L.R.，Weimer，P.J.，van Zyl，W.H.，和Pretorius，I.S.，2002，Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology，Microbiol.Mol.Biol.Reviews 66：506-577)。在本文可以理解的是，本领域中任何已知的方法，包括预处理、酶水解(糖化)、发酵，或它们的组合，可用于实施本发明的方法。

常规设备包括补料批式搅拌反应器、批式搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流柱式反应器(Fernanda de Castilhos Corazza，Flávio Faria de Moraes，Gisella Maria Zanin和Ivo Neitzel，2003，Optimalcontrol in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis，Acta Scientiarum.Technology 25：33-38；Gusakov，A.V.，和Sinitsyn，A.P.，1985，Kinetics of theenzymatic hydrolysis of cellulose：1.A mathematical model for a batch reactorprocess，Enz.Microb.Technol.7：346-352)、研磨反应器(Ryu，S.K.，和Lee，J.M.，1983，Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor，Biotechnol.Bioeng.25：53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov，A.V.，Sinitsyn，A.P.，Davydkin，I.y.，Davydkin，V.Y.，Protas，O.V.，1996，Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type ofbioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field，Appl.Biochem.Biotechnol.56：141-153)。其它反应器类型包括：流化床、升流层、固定化和用于水解和/或发酵的挤出机型的反应器。

预处理。在本发明的方法的实施中，可以使用本领域已知的任何预处理过程破坏植物细胞壁成分(Chandra等，2007，Substrate pretreatment：The key toeffective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics？Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：67-93；Galbe和Zacchi，2007，Pretreatment of lignocellulosic materials forefficient bioethanol production，Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.108：41-65；Hendriks和Zeeman，2009，Pretreatments to enhance the digestibility oflignocellulosic biomass，Bioresource Technol.100：10-18；Mosier等，2005，Featuresof promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass，BioresourceTechnol.96：673-686；Taherzadeh和Karimi，2008，Pretreatment of lignocellulosicwastes to improve ethanol and biogas production ：A review，Int.J.of Mol.Sci.9：1621-1651；Yang和Wyman，2008，Pretreatment：the key to unlocking low-costcellulosic ethanol，Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.2：26-40)。

纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤或调节。常规的预处理包括但不限于，蒸汽预处理(伴随或不伴随爆炸)、稀酸预处理、热水预处理、碱性预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆炸、氨纤维爆炸、有机溶剂预处理和生物预处理。其它预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界CO₂、超临界H₂O、臭氧和γ辐射预处理。

可以在水解和/或发酵之前预处理纤维素材料。预处理优选在水解前进行。或者，预处理可以与水解同时进行，如与用本发明的酶组合物同时处理纤维素材料以释放可发酵糖，如葡萄糖、木糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身使一些生物质转化成可发酵糖(甚至在不存在酶的情况下)。

蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁成分，包括木质素、半纤维素和纤维素，使酶可以到达纤维素和其它部分，例如，半纤维素酶。将木素纤维素材料通过或穿过反应容器，其中注入蒸汽以增加温度至需要的温度和压力，并且在其中保持期望的反应时间。蒸汽预处理优选在140-230℃，更优选160-200℃，并且最优选170-190℃进行，其中最优的温度范围依赖于任何化学催化剂的加入。蒸汽预处理的停留时间优选1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最优的停留时间依赖于温度范围和任何化学催化剂的加入。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，使得纤维素材料在预处理过程中通常仅仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后对物质的爆炸放料(explosive discharge)组合，这称为蒸汽爆炸，即，快速闪变至大气压和物质的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积(Duff和Murray，1996，Bioresource Technology 855：1-33；Galbe和Zacchi，2002，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：618-628；美国专利申请No.20020164730)。在蒸汽预处理过程中，切割半纤维素乙酰基团，并且得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。去除木质素至有限的程度。

经常在蒸汽预处理之前加入催化剂如H₂SO₄或SO₂(通常0.3至3％w/w)，其可减少时间，降低温度，增加回收率，并促进酶水解(Ballesteros等，2006，Appl.Biochem.Biotechnol.129-132：496-508；Varga等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.113-116：509-523；Sassner等，2006，Enzyme Microb.Technol.39：756-762)。

化学预处理：术语“化学处理“指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)、氨渗滤(APR)和有机溶剂预处理。

在稀酸预处理中，将纤维素材料与稀酸(通常是H₂SO₄)和水混合以形成浆料，由蒸汽加热至期望的温度，并在一段停留时间后闪变至大气压。可以用很多反应器设计进行稀酸预处理，例如，活塞流式反应器、逆流反应器或连续逆流收缩床反应器(Duff和Murray，1996，supra；Schell等，2004，BioresourceTechnol.91：179-188；Lee等，1999，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.65：93-115)。

还可以使用碱性条件下的几种预处理方法。这些碱预处理包括，但不限于，石灰预处理、湿氧化、氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX)。

用碳酸钙、氢氧化钠或氨，在85-150℃的低温进行石灰预处理，停留时间从1小时到几天(Wyman等，2005，Bioresource Technol.96：1959-1966；Mosier等，2005，Bioresource Technol.96：673-686)。WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO 2006/110900和WO 2006/110901公开了使用氨的预处理方法。

湿法氧化是热预处理，通常在180-220℃进行5-15分钟，加入氧化剂如过氧化氢或过压氧(Schmidt和Thomsen，1998，Bioresource Technol.64：139-151；Palonen等，2004，Appl.Biochem.Biotechnol.117：1-17；Varga等，2004，Biotechnol.Bioeng.88：567-574；Martin等，2006，J.Chem.Technol.Biotechnol.81：1669-1677)。预处理以优选1-40％干物质，更优选2-30％干物质，并且最优性5-20％干物质进行，并且由于加入碱如碳酸钠，初始pH经常会增加。

湿氧化预处理方法的修改方法，称为湿爆炸(湿氧化和蒸汽爆炸的组合)，能够处理高达30％的干物质。在湿爆炸中，在预处理过程中，在一定的停留时间后引入氧化剂。然后通过闪变至大气压而结束预处理(WO 2006/032282)。

氨纤维爆炸(AFEX)涉及在温和温度如90-100℃和高压如17-20bar，用液体或气体氨处理纤维素材料5-10分钟，其中干物质含量可以高达60％(Gollapalli等，2002，Appl.Biochem.Biotechnol.98：23-35；Chundawat等，2007，Biotechnol.Bioeng.96：219-231；Alizadeh等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：1133-1141；Teymouri等，2005，Bioresource Technol.96：2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素解聚，和半纤维素的部分水解。木质素-糖复合物得到切割。

有机溶剂预处理通过用含水乙醇(40-60％乙醇)在160-200℃提取30-60分钟而将纤维素材料去木质素化(Pan等，2005，Biotechnol.Bioeng.90：473-481；Pan等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：851-861；Kurabi等，2005，Appl.Biochem.Biotechnol.121：219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，去除大部分半纤维素。

合适的预处理方法的其他实例如Schell等，2003，Appl.Biochem andBiotechn.Vol.105-108：p.69-85，和Mosier等，2005，Bioresource Technology 96：673-686，和美国专利公开申请2002/0164730所述。

在一个方面，化学预处理优选作为酸处理，并且更优选作为连续稀酸和/或弱酸(mild acid)处理进行。酸通常是硫酸，但也可以使用其它酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。弱酸处理在优选1-5，更优选1-4，并且最优选1-3的pH范围内进行。在一个方面，酸浓度在优选0.01至20wt％酸，更优选0.05至10wt％酸，甚至更优选0.1至5wt％酸，并且最优选0.2至2.0wt％酸的范围内。酸与纤维素材料接触，并在优选160-220℃，和更优选165-195℃范围内的温度保持数秒到数分钟，例如1秒-60分钟的时间。

在另一个方面，预处理作为氨纤维爆炸步骤(AFEX预处理步骤)进行。

在另一个方面，预处理发生在含水浆料中。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材料以优选10-80wt％，更优选20-70wt％，并且最优性30-60wt％，如约50wt％的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或者使用本领域任何已知的方法洗涤，例如，用水洗涤。

机械预处理：术语“机械预处理”指各种类型的研磨或碾磨(例如，干磨、湿磨或振动球磨)。

物理预处理：术语“物理预处理”指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何处理。例如，物理预处理可涉及辐射(例如，微波辐射)、汽蒸/蒸汽爆炸、水热解(hydrothermolysis)和它们的组合。

物理预处理可以涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在一个方面，高压指优选约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500psi，如约450psi的压力。在另一个方面，高温指约100至300℃，优选约140至235℃的温度。在一个优选的方面，机械预处理在使用如上所定义的高温和高压的分批过程、蒸汽枪水解器系统，例如来自Sunds DefibratorAB，Sweden的Sunds Hydrolyzer中进行。

组合的物理和化学预处理：可以对纤维素材料进行物理和化学预处理。例如，预处理步骤可以涉及稀酸或弱酸处理和高的温度和/或压力处理。根据需要，可以顺序或同时进行物理和化学预处理。还可以包括机械预处理。

因此，在一个优选的方面，对纤维素材料进行机械、化学或物理预处理，或者它们的任何组合，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

生物预处理：术语“生物预处理”指可以促进纤维素、半纤维素和/或木质素从纤维素材料分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木质素的微生物(参见，例如，Hsu，1996，Pretreatment of biomass，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E编，Taylor &Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh和Singh，1993，Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，1994，Pretreating lignocellulosicbiomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production，Himmel，Baker和Overend编，ACS Symposium Series 566，American ChemicalSociety，Washington，DC，chapter 15；Gong，Cao，Du和Tsao，1999，Ethanolproduction from renewable resources，于Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology，Scheper编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson和Hahn-Hagerdal，1996，Fermentation oflignocellulosic hydrolysates for ethanol production，Enz.Microb.Tech.18：312-331；和Vallander和Eriksson，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95)。

糖化。在水解(也称作糖化)步骤中，将预处理的纤维素材料水解以将纤维素和任选地也将半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或可溶的寡糖。水解用酶组合物在本发明的酶存在下以酶法进行。所述组合物可进一步包含一种或多种半纤维素分解酶。组合物的酶还可以顺序加入。

酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下，在合适的含水环境中进行。在一个优选的方面，水解在适于酶的活性，即对于酶最优的条件下进行。水解可以以补料批式或连续的工艺进行，其中将预处理的纤维素材料(底物)逐渐补入，例如，含酶的水解溶液中。

糖化通常在搅拌釜反应器或发酵罐中，在受控的pH、温度和混合条件下进行。合适的处理时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续长达200小时，但是通常优选进行约12至约168小时，更优选约24至约120小时，并且最优选约48至约72小时。温度优选约40℃至约70℃，更优选约45℃至约65℃，并且最优选约50℃至约60℃，特别是约55℃。pH优选约3至约9，更优选约3.5至约8，更优选约4至约7，并且最优选约4.5至约6，特别是约pH5。干燥固体含量优选约1至约50wt％，更优选约5至约40wt％，更优选约10至约30wt％，并且最优选约15至约25wt％。

除本发明的酶之外，所述组合物的纤维素分解酶成分优选是具有内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶与β-葡糖苷酶活性的酶。在一个优选的方面，所述酶组合物包含一种或多种(几种)选自下组的纤维素分解酶：纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一个优选的方面，所述纤维素分解酶制备物另外或甚至还包含一种或多种其他选自下组的酶活性：半纤维素酶，酯酶(例如，脂肪酶，磷脂酶和/或角质酶)，蛋白酶，漆酶，过氧化物酶或其混合物。在本发明的方法中，所述其他酶可在发酵之前或之中添加，包括在发酵微生物繁殖过程中或之后添加。

所述酶可源自或获得自任何合适的来源，包括细菌，真菌，酵母，植物或哺乳动物来源。在本文中术语“获得”意指该酶可分离自天然产生该酶作为天然酶的生物。在本文中术语“获得”亦意指所述酶可为在宿主生物中使用本文所描述的方法重组产生的，其中所述重组产生的酶对于所述宿主生物可为天然的或外源的，或具有经修饰的氨基酸序列，例如，缺失，插入和/或取代了一个或多个氨基酸，亦即，该重组产生的酶其为天然氨基酸序列的突变体和/或片段，或者其为通过本领域已知的核酸改组过程(nucleic acid shufflingprocess)产生的酶。天然酶含意所涵盖的范围包含天然变体，而外源酶含意所涵盖的范围包含重组获得的变体，例如，通过定位诱变或改组得到的变体。

用于本发明中的酶可为任何适用于本文所描述的方法中的形式，例如，有或无细胞的粗发酵培养液，或基本上纯的多肽。所述酶可为干粉或颗粒，液体，稳定化的液体或受保护的酶。液体酶制备物可例如通过添加稳定剂例如糖、糖醇或其它多元醇和/或乳酸或另一有机酸根据已经建立的过程加以稳定化。

酶和具有纤维素分解增强活性的多肽的最适量取决于几个因素，其包括但不限于，组分纤维素分解酶的混合物、含纤维素底物、含纤维素底物的浓度、含纤维素底物的预处理、温度、时间、pH和包括发酵生物体(例如，同步糖化和发酵的酵母)。

在一个优选的方面，纤维素分解酶对于纤维素材料的有效量是约0.5至约50mg，优选约0.5至约40mg，更优选约0.5至约25mg，更优选约0.75至约20mg，更优选约0.75至约15mg，甚至更优选约0.5至约10mg，并且最优选约2.5至约10mg每g纤维素材料。

在另一个优选的方面，具有纤维素分解增强活性的多肽对于纤维素材料的有效量是约0.01至约50.0mg，优选约0.01至约40mg，更优选约0.01至约30mg，更优选约0.01至约20mg，更优选约0.01至约10mg，更优选约0.01至约5mg，更优选约0.025至约1.5mg，更优选约0.05至约1.25mg，更优选约0.075至约1.25mg，更优选约0.1至约1.25mg，甚至更优选约0.15至约1.25mg，并且最优选约0.25至约1.0mg每g纤维素材料。

在本发明的方法中，所述解酶组合物可包含任何参与将含纤维素材料加工为葡萄糖，或将半纤维素加工为木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖、其聚合物、或如下所述由其衍生的产物的蛋白质。在一个方面，所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一方面，所述纤维素分解酶组合物另外还或甚至还包含一种或多种其他的酶活性以改进含纤维素材料的降解。优选的其他酶为木聚糖酶、半纤维素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物。

所述解酶组合物可为单组分制备物，例如，内切葡聚糖酶，可为多组分制备物，例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶，或多组分和单组分蛋白质制备物的组合。所述纤维素分解蛋白可具有活性，亦即，可于酸性、中性或碱性pH范围水解所述含纤维素材料。

所述酶组合物的一个或多个组分可为重组组分，亦即，通过克隆编码单一组分的DNA序列，并随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达来产生(参见，例如，WO91/17243和WO91/17244)。所述宿主优选为异种宿主(酶对宿主是外源的)，但在一些情况下所述宿主亦可为同种宿主(酶对宿主是内源的)。单组分纤维素分解蛋白亦可通过从发酵液中纯化上述蛋白质来制备。

用于本发明中的酶可为任何适用于本文所述工艺的形式，如例如，有或无细胞的粗发酵液、干粉或颗粒、液体、稳定化的液体或受保护的酶。液体酶制备物可，例如，通过添加稳定剂如糖、糖醇或其它多元醇，和/或乳酸或另一种有机酸根据已经确立的方法加以稳定化。

具有纤维素分解酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有纤维素分解酶活性的革兰氏阳性细菌多肽如芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌属或海洋芽孢杆菌属多肽；或具有纤维素分解酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属或脲原体属多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性的似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌或马链球菌兽瘟亚种多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性的不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌多肽。

本发明具有纤维素分解酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选具有纤维素分解酶活性的酵母多肽如念珠菌属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属多肽；或更优选具有纤维素分解酶活性的丝状真菌多肽如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、Botryospaeria、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、Coptotermes、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属、Leptospaeria、梨孢菌属、Melanocarpus、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、Pseudotrichonympha、根毛霉属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、Trichophaea、轮枝孢属、小包脚菇属或炭角菌属多肽。

在一个优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性的卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母多肽。

在另一优选的方面，所述多肽是具有纤维素分解酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金孢子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium mops、毡金孢子菌、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporium zonatum、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产紫青霉、黄孢平革菌、无色梭孢壳、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳、Thielaviafimeti、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、Thielavia peruviana、瘤孢梭孢壳、毛梭孢壳、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉或Trichophaea saccata多肽。

亦可使用经化学修饰的或蛋白质工程改造的纤维素分解蛋白的突变体。

适用于本发明的商业性的纤维素分解蛋白制备物的实例包括，举例而言，CELLIC^TM Ctec2(Novozymes A/S)、CELLUCLAST^TM(Novozymes A/S)和NOVOZYM^TM 188(Novozymes A/S)。其它包含纤维素酶的可以使用的商业上可得到的制备物包括CELLUZYME^TM、CEREFLO^TM和ULTRAFLO^TM(Novozymes A/S)，LAMINEX^TM和SPEZYME^TM CP(Genencor Int.)，ROHAMENT^TM 7069W (

GmbH)以及

LDI、

LBR或

150L(Dyadic International，Inc.，Jupiter，FL，USA)。所述纤维素酶以固体的约0.001％到约5.0％wt.，更优选固体的约0.025％到约4.0％wt.，且最优选固体的约0.005％到约2.0％wt.的有效量添加。

可以用于本发明的方法的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO 91/05039；WO93/15186；美国专利5,275,944；WO 96/02551；美国专利5,536,655，WO00/70031，WO 05/093050)；Thermobifi fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050)；和Thermobifi fusca内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。

可以用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不仅限于，里氏木霉内切葡聚糖酶I(Penttila等，1986，Gene 45：253-263；GENBANK^TM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等，1988，Gene 63：11-22；GENBANK^TM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等，1988，Appl.Environ.Microbiol.64：555-563；GENBANK^TM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶IV(Saloheimo等，1997，Eur.J.Biochem.249：584-591；GENBANK^TM登录号Y11113)；以及里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等，1994，Molecular Microbiology 13：219-228；GENBANK^TM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(Ooi等，1990，Nucleic Acids Research 18：5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等，1995，Current Genetics 27：435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等，1990，Gene 90：9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号L29381)；灰腐质霉thermoidea变种内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS 495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株VTT-D-80133号内切葡聚糖酶(GENBANK^TM登录号M15665)。

可用于本发明的方法的纤维二糖水解酶的示例包括但不仅限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I；里氏木霉纤维二糖水解酶II；特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II、土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)、嗜热毛壳(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I以及嗜热毛壳纤维二糖水解酶II。

可用于本发明的方法的β-葡糖苷酶的实例包括但不仅限于米曲霉β-葡糖苷酶；烟曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT 20888 β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；以及棘孢曲霉β-葡糖苷酶。

具有β-葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据WO 2002/095014获取。具有β-葡糖苷酶活性的烟曲霉多肽可根据WO 2005/047499获取。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青霉多肽可根据WO 2007/019442获取。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据Dan等，2000，J.Biol.Chem.275：4973-4980获取。具有β-葡糖苷酶活性的棘孢曲霉多肽可根据Kawaguchi等，1996，Gene 173：287-288获取。

所述β-葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，所述β-葡糖苷酶是根据WO 2008/057637获取的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白。

其它内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶公开于许多使用根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities，Biochem.J.280：309-316和Henrissat B.，and Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based  classification of glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696的分类法的糖基水解酶家族中。

其它可用于本发明的纤维素分解酶描述于EP 495,257、EP 531,315、EP531,372、WO 89/09259、WO 94/07998、WO 95/24471、WO 96/11262、WO96/29397、WO 96/034108、WO 97/14804、WO 98/08940、WO 98/012307、WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 98/028411、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025846、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2000/009707、WO 2002/050245、WO 2002/0076792、WO 2002/101078、WO2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、美国专利4,435,307、美国专利5,457,046、美国专利5,648,263、美国专利5,686,593、美国专利5,691,178、美国专利5,763,254以及美国专利5,776,757。

适用于本发明的商业性木聚糖降解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)、CELLIC^TM Htec(Novozymes A/S)、

(Novozymes A/S)、(Novozymes A/S)、

HC(Novozymes A/S)、Xylanase(Genencor)、

TX-200A(AB Enzymes)、HSP 6000 Xylanase(DSM)、DEPOL^TM333P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)、DEPOL^TM 740L.(Biocatalysts Limit，Wales，UK)和DEPOL^TM 762P(Biocatalysts Limit，Wales，UK)。

可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP：AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉NRRL 8126木聚糖酶(WO 2009/079210)。

可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)，埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)。

可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉DSM 1800乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/073709)。

可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。

可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。

可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。

用于本发明方法的纤维素分解酶和蛋白可通过在含有合适碳源和氮源和无机盐，使用本领域已知方法(参见，例如Bennett，J.W.和LaSure，L.(编)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)的营养培养基上发酵上述指出的微生物菌株来产生。合适的培养基可从供应商获得，或可根据已公开组合物制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录)。适于生长和纤维素分解酶产生的温度范围和其他条件在本领域是已知的(参见，例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.，Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-HillBook Company，NY，1986)。

所述发酵可以是任何其结果为纤维素分解酶表达或分离的培养细胞的方法。因此，发酵可以理解为包括在合适的培养基中并在允许所述纤维素分解酶得以表达或分离的条件下进行的摇瓶培养，或在实验室或工业发酵罐中的小-或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)。通过上述方法产生的所得的纤维素分解酶可从发酵培养基回收并通过常规方法纯化。

发酵得自所述经预处理与水解的纤维素材料的可发酵的糖可由一种或多种能够将所述糖直接或间接发酵为所期望的发酵产物的发酵微生物进行发酵。“发酵”或“发酵工艺”指任何发酵工艺或任何包含发酵步骤的工艺。发酵工艺亦包括用于醇类消费品工业(例如，啤酒与葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳产品)、皮革工业与烟草工业的发酵工艺。发酵条件取决于所期望的发酵产物以及发酵生物，且可由本领域技术人员容易地确定。

在所述发酵步骤中，作为预处理与酶水解步骤的结果自所述纤维素材料释放的糖由发酵生物(如酵母)发酵为产物，例如乙醇。可分别或同时进行水解(糖化)与发酵。上述方法包括但不限于，分别水解与发酵(SHF)；同时糖化与发酵(SSF)；同时糖化与共发酵(SSCF)；混合水解与发酵(HHF)；SHCF(分别水解与共发酵)；HHCF(混合水解与发酵)，以及直接微生物转化(DMC)。

在本发明的发酵步骤中可以使用任何合适的经水解的纤维素材料。通常根据所需发酵产品(即，要从发酵获得的物质)和使用的方法来选择底物，如本领域中所公知。适用于本发明的方法的底物的实例包括纤维素材料，如木材或植物残余物或从经加工的纤维素材料获得的低分子糖DP1-3，其可由发酵微生物代谢，并可通过直接添加至发酵介质来提供。

术语“发酵培养基”在本文中可理解为指加入发酵微生物之前的培养基，如，由糖化过程产生的培养基，以及同步的糖化和发酵方法(SSF)中使用的培养基。

“发酵微生物”指适用于理想的发酵方法产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物体可以是C₆和/或C₅发酵生物体，或它们的组合。C₆和C₅发酵生物体均在本领域公知。合适的发酵微生物能将糖(如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖)直接或间接地发酵(即，转化)成理想的发酵产品。

可产生乙醇的细菌和真菌发酵生物体的实例如Lin等，2006，Appl.Microbiol.Biotechnol.69：627-642所述。

能发酵C₆糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种，优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

能发酵C₅糖的发酵生物体的实例包括细菌和真菌生物体，如酵母。优选的C₅发酵酵母包括毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属，优选博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

其它发酵生物体包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)；汉逊酵母属(Hansenula)，如异常汉逊酵母(Hansenulaanomala)；克鲁维酵母属，如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)；和大肠杆菌的菌株，特别是已经经过遗传修饰而改进乙醇产量的大肠杆菌菌株。

在一个优选的方面，酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一个更优选的方面，酵母是糖化酵母。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选的方面，酵母是克鲁维酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)。在另一个更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一个优选的方面，酵母是假丝酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是迪丹斯假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一个优选的方面，酵母是棒孢酵母属(Clavispora)。在另一个更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)。在另一个更优选的方面，酵母是Clavispora opuntiae。在另一个优选的方面，酵母是管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个更优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一个优选的方面，酵母是酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis，G.P.，1996，Cellulose bioconversiontechnology，于Handbook on Bioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.编，Taylor & Francis，Washington，DC，179-212)。

能有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌和热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis，1996，见上文)。

在一个优选的方面，细菌是发酵单胞菌属。在更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选的方面，细菌是热纤维梭菌。

商业上可得到的适合乙醇产生的酵母包括，例如ETHANOLRED^TM酵母(可从Red Star/Lesaffre，USA获得)、FALI^TM(可从Fleischmann’s Yeast，Bums PhilpFood Inc.，USA的部门获得)、SUPERSTART^TM和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)、BIOFERM^TM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation，GA，USA获得)、GERT STRAND^TM(可从Gert Strand AB，Sweden获得)和FERMIOL^TM(可从DSM Specialties获得)。

在一个优选的方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，提供发酵戊糖的能力，如利用木糖、利用阿拉伯糖和共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。

通过将异源基因克隆入多种发酵微生物已经构建了能将己糖和戊糖转化成乙醇(共发酵)的生物体(Chen和Ho，1993，Cloning and improving the expression ofPiichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae，Appl.Biochem.Biotechnol.39-40：135-147；Ho等，1998，Genetically engineered Saccharomycesyeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose，Appl.Environ.Microbiol.64：1852-1859；Kotter和Ciriacy，1993，Xylose fermentation bySaccharomyces cerevisiae，Appl.Microbiol.Biotechnol.38：776-783；Walfridsson等，1995，Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing theTKL1 and TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymestransketolase and transaldolase，Appl.Environ.Microbiol.61：4184-4190；Kuyper等，2004，Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficientanaerobic xylose fermentation：a proof ofprinciple，FEMS Yeast Research 4：655-664；Beall等，1991，Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugarsby recombinant Escherichia coli Biotech.Bioeng.38：296-303；Ingram等，1998，Metabolic engineering of bacteria for ethanol production，Biotechnol.Bioeng.58：204-214；Zhang等，1995，Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway inethanologenic Zymomonas mobilis，Science 267：240-243；Deanda等，1996，Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis train by metabolicpathway engineering，Appl.Environ.Microbiol.62：4465-4470)。

在一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是大肠杆菌。在另一个优选的方面，经过遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。

本领域中公知的是，上述生物体还能用于产生其它物质，如本文所述。

通常向降解的木素纤维素或水解物加入发酵微生物，并进行约8至约96小时，如约24至约60小时发酵。温度通常为约26℃至约60℃，特别是约32℃或50℃，并且在约pH3至约pH8，如约pH4-5、6或7。

在一个优选的方面，对降解的木素纤维素或水解物施用酵母和/或另一种微生物，并进行约12至约96小时，如通常为24-60小时发酵。在一个优选的方面，温度优选为约20℃至约60℃，更优选约25℃至约50℃，并且最优选约32℃至约50℃，特别是约32℃或50℃，并且pH通常为约pH3至约pH7，优选约pH4-7。然而，一些例如细菌发酵生物体，具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以约10⁵-10¹²，优选约10⁷-10¹⁰，特别是约2x10⁸活细胞计数每ml发酵液的量施用。关于使用酵母进行发酵的进一步指导可以在例如“The Alcohol Textbook”(K.Jacques，T.P.Lyons和D.R.Kelsall编，NottinghamUniversity Press，United Kingdom 1999)中找到，其通过提述并入本文。

本领域最广泛应用的工艺是同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中对于糖化无保持阶段(holding stage)，意指酵母和所述酶一同添加。

对于乙醇生产，在发酵后蒸馏浆料以提取乙醇。根据本发明的方法获得的乙醇可以用作，例如燃料乙醇；饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。

发酵刺激剂可以与本文所述的任何酶法工艺组合使用，以进一步改进发酵工艺，而且特定地，改进发酵微生物的性能，如，速率增加和乙醇得率。“发酵刺激剂”指用于发酵微生物(特别是酵母)生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等，Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by avitamin feeding strategy during fed-batch process，Springer-Verlag(2002)，其通过提述并入本文。矿物质的实例包括能够提供营养物的矿物质和矿物质盐，所述营养物包括P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。

发酵产物：发酵产物可以是源自发酵的任何物质。发酵产物可以是，不限于，醇(例如，阿拉伯醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1，3-丙二醇、山梨醇和木糖醇)；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；和气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是作为高价值产品的蛋白质。

在一个优选的方面，发酵产物是醇。可理解的是，术语“醇”涵盖包含一个或多个羟基基团的物质。在更优选的方面，所述醇是阿拉伯醇。在另一个更优选的方面，所述醇是丁醇。在另一个更优选的方面，所述醇是乙醇。在另一个更优选的方面，所述醇是甘油。在另一个更优选的方面，所述醇是甲醇。在另一个更优选的方面，所述醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选的方面，所述醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，所述醇是木糖醇。参见，例如，Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.，和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Silveira，M.M.，和Jonas，R.，2002，The biotechnological production of sorbitol，Appl.Microbiol.Biotechnol.59：400-408；Nigam，P.，和Singh，D.，1995，Processes for fermentative production ofxylitol-a sugar substitute，Process Biochemistry 30(2)：117-124；Ezeji，T.C.，Qureshi，N.和Blaschek，H.P.，2003，Production of acetone，butanol and ethanol byClostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping，World JournalofMicrobiology and Biotechnology 19(6)：595-603。

在另一个优选的方面，所述物质是有机酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是醋酮酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是己二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是2，5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是甲酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是戊二酸。在另一个优选的方面，所述有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是衣康酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是乳酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是苹果酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙二酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是草酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是丙酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen，R.，和Lee，Y.Y.，1997，Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from cellulosic biomass，Appl.Biochem.Biotechnol.63-65：435-448。

在另一个优选的方面，所述物质是酮。可理解的是术语“酮”包括含有一个或多个酮基的物质。在另一个更优选的方面，所述酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek，2003，见上文。

在另一个优选的方面，所述物质是氨基酸。在另一个更优选的方面，所述有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的方面，所述氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard，A.，和Margaritis，A.，2004，Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)productionand other microbial biopolymers，Biotechnology and Bioengineering 87(4)：501-515。

在另一个优选的方面，所述物质是气体。在另一个更优选的方面，所述气体是甲烷。在另一个更优选的方面，所述气体是H2。在另一个更优选的方面，所述气体是CO₂。在另一个更优选的方面，所述气体是CO。参见，例如，Kataoka，N.，A.Miya，和K.Kiriyama，1997，Studies on hydrogen productionby continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria，WaterScience and Technology 36(6-7)：41-47；和Gunaseelan V.N.于Biomass andBioenergy，Vol.13(1-2)，pp.83-114，1997，Anaerobic digestion of biomass formethane production：A review。

回收可以使用本领域已知的任何方法，任选地从发酵培养基回收发酵产物，所述方法包括，但不限于，层析、电泳方法、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、蒸馏或提取。例如，通过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料分离并纯化醇。可以获得纯度高达约96vol％的乙醇，其能用作，例如，燃料乙醇、饮料乙醇，即，中性饮料酒，或工业乙醇。

乙酰木聚糖酯酶活性的确定

乙酰木聚糖酯酶活性是使用乙酸对硝基苯酯(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，USA)作为底物确定的。稀释样品酶制备物以提供少于15％的乙酸对硝基苯酯的转化，即在1.5ml微离心管中用50mM乙酸钠pH5.0制备550倍的起始稀释，然后用50mM乙酸钠pH 5.0进行2倍系列稀释。然后将100μl稀释酶的等分试样转移至96孔板的孔中。

乙酸对硝基苯酯的储液是通过将对乙酸对硝基苯酯溶解于二甲亚砜(DMSO)以构成0.1M溶液来制备的。在测定之前，将储液样品在50mM乙酸钠pH5.0中稀释100倍以制备1mM溶液。将100μl体积的1mM乙酸对硝基苯酯与该酶的每个稀释相混合，然后在25℃温育10分钟。运行底物自身、酶自身和缓冲液自身作为对照。0.25、0.2、0.1、0.05和0.02mM的对硝基苯酚标准溶液是通过将10mM储液在50mM乙酸钠pH5.0中稀释来制备的。在10分钟，将50μl 1.0M Tris-HCl pH8.0缓冲液添加至每个孔(包括样品、底物对照、酶对照、试剂对照和标准)，混合，并立即在例如SPECTRAMAX^TM 340PC平板读数器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)上测量在405nm处的吸光度。一个单位的乙酰木聚糖酯酶活性定义为能够在pH5，25℃每分钟释放1μmol对硝基苯酚阴离子的酶量。

实施例

测定法

乙酰木聚糖酯酶测定法

为了测定AXE活性，将20μl的培养液添加至测定缓冲液中的1mM乙酸对硝基苯酯(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，并在37℃温育15分钟。通过添加2M TRIS缓冲液pH8.0中止反应，并通过测量405nm处的吸光度来即时监测对硝基苯基的释放。

培养基和缓冲液

FG4P培养基

测定缓冲液

50mM磷酸

50mM乙酸

50mM硼酸

50mM KCl

1mM CaCl₂

0.01％Triton X-100

pH调整至6.0

乙酸对硝基苯酯储液

100mM溶解于DMSO的乙酸对硝基苯酯

在4℃储藏并在即将使用之前稀释

实施例1.表达来自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶

为了获得用于测试来自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶的材料，克隆了来自SEQ ID NO：1的DNA序列，并将其在米曲霉中表达。

可从GENEART AG(Regensburg，Germany)或类似的DNA合成供应商定购合成的DNA构建体，其包含SEQ ID NO：1的编码部分，其中Kozak序列“TCACC”添加至紧接着起始密码子的5’，以及适当的限制性位点例如BamHI和XhoI分别添加至5’和3’端以协助亚克隆至曲霉表达载体。将合成的基因片段亚克隆至适当的曲霉表达载体，例如pMStr57(WO 04/032648)，并可对所得的曲霉属表达构建体进行测序以确证该序列完全与SEQ ID NO：1的编码序列一致。

用所述表达构建体根据Christensen等，1988，Biotechnology 6，1419-1422和WO 04/032648所述的实验方案转化适当的米曲霉表达宿主，例如BECh2(WO 00/39322)。为了鉴定产生重组AXE的转化体，将所述转化体和BECh2在合适的培养基中，例如在500ml摇瓶中的100ml FG4P培养基中在30℃和200RPM培养4日，并就重组的乙酰木聚糖酯酶产生进行测定。

为了测定AXE活性，将20μl的培养液添加至1mM测定缓冲液中的乙酸对硝基苯酯(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，并在37℃温育15分钟。通过添加2M TRIS缓冲液pH8.0中止反应，并通过测量405nm处的吸光度立即监测对硝基苯基的释放。

基于该结果，选择了这些转化体之一，并将其在合适的培养基中发酵以提供用于纯化的材料。

实施例2.表达来自黑曲霉的乙酰木聚糖酯酶

克隆了在US 6,010,892中作为SEQ ID NO：7描述的来自黑曲霉的最接近的现有技术乙酰木聚糖酯酶，并将其在黑曲霉中表达。

为了获得该基因，从GENEART AG(Regensburg，Germany)定购了合成的DNA构建体，其包含来自US 6,010,892的SEQ ID NO：7的编码序列，其中Kozak序列“TCACC”添加至紧接着起始密码子的5’，以及适当的限制性位点例如BamHI和XhoI分别添加至5’和3’端以协助亚克隆至曲霉表达载体。将所述BamHI-XhoI合成基因片段亚克隆至曲霉表达载体pMStr57(WO04/032648)，并可对所得的曲霉表达构建体pMStr201进行测序。该序列完全与来自US 6,010,892的SEQ ID NO：7的编码序列一致。

用pMStr201根据Christensen等，1988，Biotechnology 6，1419-1422和WO04/032648所述的实验方案转化黑曲霉菌株MBin118(WO 04/090155)。为了鉴定产生重组AXE的转化体，将所述转化体和MBin118在500ml摇瓶中的100ml的FG4P培养基中在30℃和200RPM培养4日，并就重组的乙酰木聚糖酯酶产生进行测定。为了测定AXE活性，将20μl的培养液添加至1mM测定缓冲液中的乙酸对硝基苯酯(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，并在37℃温育15分钟。通过添加2M TRIS缓冲液pH8.0中止反应，并通过测量405nm处的吸光度立即监测对硝基苯基的释放。

基于该结果，选择了这些转化体之一，命名为MStr362，并将其如上所述在FG4P培养基中发酵以提供用于纯化的材料。

实施例3.纯化来自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶

将在米曲霉中如实施例1中所述表达的来自棘孢曲霉的乙酰木聚糖酯酶从发酵上清纯化。将发酵上清灭菌过滤，并调整至1摩尔硫酸铵的终浓度，并将pH调整至7。

将50ml柱用苯基Sepharose(Pharmacia/Now GE-health care)填充，并用含有1M硫酸铵的50mM磷酸盐平衡，且pH为7。将发酵上清加载于苯基Sepharose柱上，并用含有1M硫酸铵的磷酸盐缓冲液洗去未结合的物质。洗涤柱直至280nm处的UV吸光度低于0.05。

用50％乙醇洗脱结合的蛋白。透析洗脱的蛋白，并将电导率调整为低于2MSi且pH为7。

将在50ml Q Sepharose柱上的阴离子交换(Pharmacia/now GE Health care)用50mM Tris乙酸pH7缓冲液平衡。将来自苯基Sepharose的经透析的洗脱物加载于Q Sepharose柱上。用50mM Tris乙酸缓冲液pH7洗去未结合的物质。

将结合的蛋白使用含有0.5M NaCl的50mM Tris乙酸缓冲液pH7使用线性盐梯度以10个柱体积洗脱。

使用SDS-PAGE检查纯度，并通过质谱法确定分子量。N端通过Edman降解确定。

实施例4.纯化来自黑曲霉的乙酰木聚糖酯酶

为了减少颜色，将如实施例2中所述获得的发酵上清在纯化之前使用Sartorius UF 10kDa膜过滤/缓冲液交换。最终体积为800mL并使用HOAc将pH调整至4.4。

步骤1

使用具有固定相为XpressLine ProA(Upfront，Copenhagen，Denmark)的70mL柱纯化样品。使用50mM HOAc pH4.4洗涤样品直至吸光度低于0.05，之后使用50mMHEPES，pH7.5洗脱蛋白。

使用活性测定(如实施例2中所述)以鉴定含有AXE活性的级分，然后将其汇集以供进一步纯化。

步骤2

使用具有固定相为Source 15Q(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)的20mL柱纯化来自步骤1的样品。使用20mM HEPES pH7.5洗涤样品直至吸光度低于0.05，然后使用50mM HEPES+1M NaCl，pH7在400mL中以线性盐梯度洗脱蛋白。

同样，使用上述活性测定以鉴定含有AXE活性的级分，然后将其汇集以供进一步纯化。

步骤3

使用具有固定相为Butyl Toyopearl(Tosoh Bioscience，Stuttgart，Germany)的60mL柱纯化样品。将1.8MNH₄OAc，pH7.5添加至样品。使用1.8MNH₄OAc，pH7.5洗涤样品直至吸光度低于0.05，然后使用20mM HEPES，pH7.5以不连续梯度然后是20mM HEPES，pH7.5+50％EtOH以不连续梯度洗脱蛋白。

实施例5.棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶对经预处理的玉米纤维水解的作用

比较并衡量了棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶和黑曲霉乙酰木聚糖酯酶对经处理的玉米纤维水解的作用。玉米纤维是来自玉米仁(corn kernel)湿磨的级分。玉米纤维是种皮和在去除淀粉并进一步加工之后留下的残余胚乳。通过在140℃高压处理(autoclave)150分钟来预处理玉米纤维。使用下述方法，将底物中理论上阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的量确定为114、302和204g每kg干物质。

阿拉伯糖和木糖通过使用稀盐酸进行糖水解来加以确定。将经预处理的玉米纤维转移至125ml锥形瓶中，并稀释至含有约10％的干物质。将所得玉米纤维样本在油浴中在100℃预加热。通过添加5ml的2M盐酸在100℃处理2小时来开始水解。在温育后，将所述烧瓶在冰上冷却，并以4M氢氧化钠中和。用

0.2微米注射器式滤器(Sartorius AG.Goettingen，Germany)过滤样本，并在DIONEX

系统(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA，USA)上分析阿拉伯糖和木糖。通过对所述经预处理的玉米纤维样本进行两步硫酸水解来进行确定葡萄糖。将三ml的72％硫酸添加至压力管(Ace Glass，Inc.，Vineland，NJ，USA)中大约300mg的干玉米纤维中。将样本混合并置于30℃水浴中60分钟。每5到10分钟搅拌样本。在60分钟后，移除所述样本，并添加84ml的去离子水。将样本置于高压灭菌器中，并在121℃加热1小时。在冷却后，将所述样本过滤以去除残余的固体，并通过添加碳酸钙进行中和。用系统根据下述方法确定葡萄糖浓度。将样本(10μl)加载到装有与CARBOPAC^TM PA1保护柱(4x50mm)(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA，USA)组合的

CARBOPAC^TM PA1分析柱(4x250mm)(Dionex Corporation，Sunnyvale，CA，USA)的DIONEX系统。单糖用10mM氢氧化钾以每分钟1ml的流速进行等度分离，并通过处于脉冲安培测量模式(pulsed amperiometric mode)的脉冲电化学检测器(pulsedelectrochemical detector)进行检测。电极的电势经程序设计为+0.1伏特(t＝0-0.4秒)到-2.0伏特(t＝0.41-0.42秒)到0.6伏特(t＝0.43秒)以及最终-0.1伏特(t＝0.44-0.50秒)，而将所得信号自t＝0.2-0.4秒进行积分。阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的混合物(每种组分的浓度：每升0.0050-0.075g)用作标准物。

用里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物(包含具有纤维素分解增强活性的桔橙嗜热霉(Thermoascus aurantiacus)GH61A多肽和米曲霉β-葡萄糖苷酶融合物的里氏木霉培养液；WO2008/151079(PCT/US2008/065417))和里氏木霉β-木糖苷酶来进行经预处理的玉米纤维的水解。通过如Rasmussen等，2006，Biotechnology and Bioengineering 94：869-876所述的使用米曲霉标准培养方法在米曲霉中表达来重组获得里氏木霉β-木糖苷酶。所述棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶可如实施例1所述获得。所述黑曲霉乙酰木聚糖酯酶如实施例2所述获得。

所述经预处理的玉米纤维的水解在2ml管(Eppendorf AG，Germany)中在50℃的温度和5.0的pH在50mM琥珀酸中进行。将样本在Comfort(Eppendorf AG， Germany)中温育，其对每个样本进行不断加热和混合。使用的底物量为在2ml的总样本体积中的2.5w/w％。除添加所述里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物和里氏木霉β-木糖苷酶外，将所述棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶和黑曲霉乙酰木聚糖酯酶以每g干物质1mg酶的酶加载量添加。所述里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物以每g干物质5mg酶的加载量添加，而里氏木霉β-木糖苷酶以每g干物质1mg酶的加载量添加。在24小时后通过在加热块(Techne Inc.，Burlington NJ，USA)中将所述样本在100℃加热10分钟来终止水解。

使用下述公式通过确定自所述底物释放的糖量占起始时添加的糖量的百分比来计算转化率。用样本数据的等方差(equal variance)和双尾(two-tailed)分布来进行T-检验。

转化率(％)＝(水解物中的糖量/添加的底物中的糖量)x100

将经预处理的玉米纤维当以每克干物质1mg的酶的酶加载量添加棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶连同每克干物质1mg酶的里氏木霉β-木糖苷酶和每克干物质5mg酶的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物时的转化率，与仅添加每克干物质1mg酶的来自里氏木霉的β-木糖苷酶和每克干物质5mg酶的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物时的转化率进行比较，显示相对转化率由100.0显著(p≤0.000007)增加为140.5(表1)。

表1

将经预处理的玉米纤维当以每克干物质1mg酶的酶加载添加量黑曲霉乙酰木聚糖酯酶连同每g干物质1mg酶的里氏木霉β-木糖苷酶和每g干物质5mg酶的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物时的转化率，与仅添加每g干物质1mg酶的来自里氏木霉的β-木糖苷酶和每g干物质5mg酶的里氏木霉纤维素分解蛋白质组合物的转化率相比较，显示相对转化率由100.0显著(p≤0.012)增加为104.5(表2)。

表2

实施例6：棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶对四乙酰D-木糖的水解的作用

评价了棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶对四乙酰D-木糖(D-xylose tetraacetate)的水解的作用。棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶可如实施例1所述获得。

四乙酰D-木糖(Benn Chemicals，Dielsdorf，Switzerland)的水解在1.5ml

管中以50℃的温度和5.0的pH在50mM琥珀酸中进行48小时。将样本在

Comfort中温育，其对每个样本进行不断加热和混合。使用的底物量为1ml的浓度为1w/w％的四乙酰D-木糖。将对照样本(1ml的底物)与棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶样本(1ml底物+6μl的酶)进行比较。棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶以0.5mg棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶/g干固体的酶加载量添加。在48小时后通过在加热块中在100℃加热样本10分钟来终止水解。

乙酸的定量是通过使用两个与具有

515Pump，

MPSA Millipore，

717Plus Autosampler，

Column HeaterModule和

2410RI检测器(Waters Corporation，Milford，MA，USA)的预柱(Micro-Guard Cation H Refill Cartridges，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)串接偶联的HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)的高压液相色谱来进行的。色谱是在60℃以0.4ml/分钟的流速的0.005M硫酸来进行。

向1ml底物(1w/w％的四乙酰D-木糖)添加0.5mg的棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶，得到76.1μmol/ml的计算的释放(表3)。棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶导致的乙酸释放由对照样本(1.9μmol/ml)和棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶样本的浓度(78.0μmol/ml)计算。

表3

样本	乙酸浓度(μmol/ml)	由酶释放的乙酸(μmol/ml)
			对照	1.9
棘孢曲霉乙酰木聚糖酯酶	78.0	76.1

Claims (24)

1.一种具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)一种多肽，其包含与SEQ ID NO：2的成熟多肽具有至少85％同一性的氨基酸序列；

(b)一种由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)一种由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；和

(d)SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(数个)氨基酸的变体。

2.权利要求1的多肽，其由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQID NO：1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链。

3.权利要求1或2任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列或由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列组成。

4.权利要求1至3中任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸136至963或由SEQ ID NO：1的核苷酸136至963组成。

5.权利要求1至4中任一项的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列组成。

6.权利要求1至5中任一项的多肽，其中所述多肽为SEQ ID NO：2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。

7.权利要求1至6中任一项的多肽，其中所述成熟多肽是SEQ ID NO：2的氨基酸34至308。

8.权利要求1至7中任一项的多肽，其中所述成熟多肽编码序列是SEQID NO：1的核苷酸136至963。

9.一种分离的多核苷酸，包含编码权利要求1至8中任一项的多肽的核苷酸序列。

10.一种核酸构建体，包含可操作地连接于一个或多个在表达宿主中指导所述多肽产生的调控序列的权利要求9的多核苷酸。

11.一种重组表达载体，包含权利要求10的核酸构建体。

12.一种重组宿主细胞，包含权利要求10的核酸构建体。

13.一种产生权利要求1至8中任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。

14.权利要求9的分离的多核苷酸，其中所述成熟多肽编码序列是SEQID NO：1的核苷酸136至963，或同源序列。

15.一种产生权利要求1至8中任一项的多肽的方法，包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

16.一种转基因植物、植物部分或植物细胞，其经编码权利要求1至8中任一项的多肽的多核苷酸转化。

17.一种用于降解乙酰木聚糖的方法，包括用权利要求1至8中任一项具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽处理包含乙酰基化木聚糖的材料。

18.权利要求17的方法，进一步包括用木聚糖降解酶处理所述包含乙酰基化木聚糖的材料。

19.权利要求17或18的方法，其中所述木聚糖降解酶选自下组：木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其组合。

20.权利要求17至19中任一项的方法，其中所述包含乙酰基化木聚糖的材料是动物饲料。

21.权利要求17至20中任一项的方法，其中所述包含乙酰基化木聚糖的材料是牛皮纸浆(Kraft pulp)。

22.权利要求17至21中任一项的方法，其中所述包含乙酰基化木聚糖的材料是纤维素或木素纤维素生物质。

23.一种组合物，其包含权利要求1至8中任一项的多肽和一种或多种其他选自如下的酶：木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、葡聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶和木聚糖酶。

24.权利要求1至8中任一项的多肽或权利要求23的组合物在从含木素纤维素材料产生发酵产物的工艺中的用途，所述工艺包括下述步骤：

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)在纤维素分解酶和本发明的酶存在下水解所述材料；

(c)使用发酵生物进行发酵。