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CN102358752B - 与GLP-1和肠促胰岛素类似物(exendin)有关的发明 - Google Patents

与GLP-1和肠促胰岛素类似物(exendin)有关的发明 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与GLP-1和肠促胰岛素类似物(exendin)有关的发明。具体而言，本发明涉及衍生自GLP-1(类胰高血糖素肽1)和exendin-3和/或exendin-4的肽，其结合GLP-1受体并可以在标记或未标记的情况下用于生产恶性和致命疾病的诊断和治疗装置，在上述疾病中GLP-1受体的表达起着作用。

Description

与GLP-1和肠促胰岛素类似物(exendin)有关的发明
本申请是2005年8月26日提交的申请号为200580029760.4，发明名称为“与GLP-1和肠促胰岛素类似物(exendin)有关的发明”申请的分案申请。 
发明领域描述及简介 
在定位胃肠胰腺神经内分泌肿瘤时，生长激素释放抑制因子受体闪烁照相法(SRS)是除了超声之外最重要的诊断方法。其原理是在被肿瘤细胞吸收的放射性标记的肽的帮助下，对肿瘤进行特异性描绘。然后在伽马射线照相机的帮助下，肿瘤组织中放射性的积累可以被目视证实。当一种类型的肿瘤具有一种用于SRS、例如用于生长激素释放抑制因子类似物 的必需受体时，这些肿瘤的证实是没有问题的。但是，如果相应的受体不表达，它们就避开了闪烁照相法的证实。除了定位诊断之外，放射性标记的肽也可以用于治疗肿瘤的方法，其中人们可以通过用适当的放射性核素(α-orβ-粒子发射体)标记生长激素释放抑制因子类似物例如 来执行特异性的受体指导的放射性肽疗法。由于相应的放射性核素被肽结合的方式(例如通过与以前结合到该肽上的金属螯合剂形成复合物)使得它们事实上被肿瘤细胞吸收而且不再能够被释放，因此在肿瘤组织中导致了高特异性的积累。 
但是，一系列的神经内分泌肿瘤(NET)、其中包括胰岛瘤和小细胞支气管癌，不能表达使用生长激素释放抑制因子类似物 进行SRS或放射性肽疗法所必需的生长激素释放抑制因子受体亚型。具体来说，有显著比例的胰岛瘤不能通过闪烁照相法诊断来检测。在小细胞支气管癌中SRS也不算适合的方法，因为尽管原发的肿瘤通常可以被看到，但肿瘤的转移由于失去了受体的表达而不能被显示。因 此，对于放射性肽疗法这种代表了一种有趣的附加或替代疗法的方法来说，治疗这些肿瘤是难以达成的。因此就需要适合的肽，它们能够被上述的肿瘤吸收。 
肠促胰岛素激素类胰高血糖素肽-1(GLP-1)以及其类似物exendin-3和exendin-4(来自美洲大毒蜥蜴Heloderma horridum和Heloderma suspectum的唾液)，是胰岛瘤和小细胞支气管癌以及许多其它种类的肿瘤为其表达受体的肽。胰岛瘤起源于胰腺的Langerhans岛中产生胰岛素的β-细胞，其中GLP-1以及exendin-3和exendin-4引发饭后的胰岛素分泌。 
现有技术状态 
为了在闪烁照相法中使用类胰高血糖素肽-1(GLP-1)，需要对肽进行标记。其方法以及用放射性核素标记蛋白的方法对于本技术领域的专业人员来说是熟知的，在大量的专利申请(例如DE 69018226T2)和科学出版物中有记录。那里描述的用于诊断成像和在病理组织中交换治疗有效分子的肽通常通过肽中的氨基插入到N末端。同时，考虑到稳定性必须对肽进行进一步修饰。 
例如，用在US 2003/0232761A1中的GLP-1及其衍生物GLP-1(7-37)在N末端用一个氨基修饰。因此，GLP-1的N末端不再能够与GLP-1受体键合，所以这些肽中的受体结合和内化都不够充分。因此后者不适合用于胰岛瘤和小细胞支气管癌的放射性肽疗法。正如经验所示，突变、例如GLP-1以及exendin-3或exendin-4的肽序列中氨基酸的取代、以及它们通过治疗分子或信号分子进行的可能修饰，经常引起肽结构的损坏，阻碍了与受体的任何进一步键合。 
目前尚不知道其它修饰GLP-1而不影响N末端的方法。此外，尚不知道适合用于胰岛瘤和小细胞支气管癌的放射性疗法的GLP-1衍生物，无论是标记的还是未标记的。 
任务 
因此，目前本发明的任务是消除现有技术状态中的缺陷，制造可以被标记并在带有该标记时仍能够与GLP-1受体键合的肽，该肽可以用于生产诊断和治疗疾病的药剂，在所述疾病中GLP-1受体的表达发挥作用的。 
任务的解决方案 
该任务基于本发明的权利要求、通过GLP-1、exendin-3和exendin-4的肽衍生物得到了解决，这些衍生物在C末端被氨基修饰，并通过GLP-1受体的N末端成键，以及GLP-1与exendin-3和exendin-4的嵌合肽。这些肽衍生物以及嵌合肽将是未标记的或标记的，以便用于生产良性或恶性疾病的诊断和治疗的药剂，用于其中GLP-1受体的表达发挥作用。 
通过这些GLP-1、exendin-3和exendin-4的衍生物以及GLP-1、exendin-3或exendin-4的嵌合肽，产生了用于闪烁照相法应用的手段，它将被用于表达GLP-1受体的肿瘤的诊断和治疗，包括NET(特别是胰岛瘤)和小细胞支气管癌。 
由于基于本发明的肽衍生物是在C末端被氨基修饰，因此这可能是第一次使得其N末端可以与GLP-1受体键合。 
通过将基于本发明的肽衍生物、例如放射性标记的GLP-1、exendin-3和exendin-4的嵌合肽与GLP-1受体键合，使得表达GLP-1受体的肿瘤的描绘成为可能，因此为病人的医疗护理提供了相当大的改善。NET、尤其是胃肠胰腺NET，例如胰岛瘤，目前对于它尚没有足够灵敏的非侵入性方法可用，另外如位于肺部区域的小细胞支气管癌，也不可能通过非侵入性的方法对发炎过程和肿瘤或转移之间进行特异性区分。 
此外，利用基于本发明的肽衍生物和嵌合肽，胰腺中产生的产胰岛素细胞的密度以及体内和体外GLP-1受体的表达被可视化。例如在糖尿病的情况下，表达GLP-1受体的细胞的描绘是体内描绘，因为这些细胞也分泌胰岛素。在患有糖尿病的病人用药物治疗期间或之后的情况下，胰腺中GLP-1受体密度的描绘是特别重要的。 
此外，GLP-1受体在恶性和良性组织中的分布被描绘。因此这个明确表示的问题既具有临床意义也具有科学意义，因为迄今为止关于GLP-1受体在人类中的分布情况尚没有完整的数据可用。 
因此，本发明的优点是GLP-1(类胰高血糖素肽-1)、exendin-3和exendin-4的肽衍生物以及GLP-1、exendin-3和exendin-4的嵌合肽可用于生产药剂，特别是用于受体定向的特异性描绘和治疗，特别是NET、尤其特别的是胰岛瘤和小细胞支气管癌的描绘和治疗。 
GLP-1受体闪烁照相法特别适用于小细胞支气管癌的诊断，这第一次允许了对淋巴结中的转移进行特异性检测(区分淋巴结由于炎症发生变化与淋巴结受到肿瘤转移的袭击发生的变化)。 
使用本发明的来自GLP-1(类胰高血糖素肽-1)、exendin-3和exendin-4的肽衍生物以及来自GLP-1、exendin-3和exendin-4的嵌合肽，最终为所有GLP-1受体的表达在其中发挥作用的恶性和良性疾病留下了诊断和治疗药剂，具体如下：在磁共振成像(MRI)中作为造影剂；在闪烁照相术(SPECT，单光子发射计算机断层照相)以及放射性肽疗法、PET(正电子发射断层照相)、受体介导的化学疗法以及光学诊断中用作放射活性试剂。这里的光学诊断是指通过特定的波长激发荧光分子，诱导出不同波长的连续的光发射。被检测的是发射出的波长。 
专业人员可以根据所需的应用容易地选择来自GLP-1(类胰高血糖素肽-1)、exendin-3和exendin-4的肽衍生物以及来自GLP-1、exendin-3和exendin-4的嵌合肽的C末端的标记种类：例如对于闪烁照相术或放疗选择放射性核素；对于磁共振成像(MRI)中的造影剂选择钆；对于内窥镜检查或科学检查选择荧光色素。 
根据本发明，恶性疾病是指那些与健康组织相比，被影响的组织显示出分化水平上的变化、侵入性的生长或将其组织扩散到血流或淋巴系统中的疾病。所有的神经内分泌肿瘤都归于这个范畴，特别是那些胃肠道的肿瘤，特别是胰岛瘤、支气管癌、胰腺癌以及所有其它与GLP-1受体的过量表达相关的恶性疾病。 
根据本发明，良性疾病是指那些其特征为被影响的组织没有明显地失去其分化水平、不显示出侵入性生长、没有任何组织转移到血流或淋巴系统中的疾病。这包括例如糖尿病以及饮食紊乱或精神紊乱。 
肽衍生物和嵌合肽的特征 
来自GLP-1、exendin-3和exendin-4的肽衍生物以及来自GLP-1、exendin-3或exendin-4的嵌合肽的发现是令人吃惊的，它们在C末端通过氨基被修饰，在N末端与GLP-1受体键合。它们甚至显示出与GLP-1受体的高度亲和性，如同天然的肽一样。使用荷瘤的无毛小鼠进行的实验显示出在阳性肿瘤组织的GLP-1受体中有特异性吸收。 
本发明的肽衍生物以及嵌合肽可以是未标记的，也可以在C末端的氨基通过螯合剂被标记为用于良性和恶性疾病的诊断和治疗的药剂，GLP-1受体的表达在其上述疾病中发挥作用。这里标记的类型主要包括放射性金属、MRI造影剂、荧光发色团或化疗剂。 
标记的过程和方法对于专业人员来说是熟知的(例如DE 69018226T2)，它可以通过例如结合放射性核素、无磁性的金属和其它MRI 造影剂或荧光染料来进行；这意味着本发明的肽衍生物以及嵌合肽与受体的键合或内化没有受到损坏，与GLP-1受体键合的N末端保持游离(未连接)。 
原始的肽的氨基酸序列： 
GLP-1： 
H-His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser- 
  1   2   3    4  5   6    7  8   9   10   11  12  13  14  15  16  17  18Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH19  20   21  22 23  24  25  26   27   28   29 30  31   32  33   34  35  36 37 
Exendin-3： 
H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala- 
  1   2   3   4   5   6   7    8  9    10  11 12  13   14  15  16   17  18Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-19  20   21  22 23   24   25 26  27  28  29   30 31  32   33   34 35  36   37Pro-Ser-NH238   39 
Exendin-4： 
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala- 
  1   2   3   4   5    6   7   8  9    10  11 12   13  14  15   16  17   18Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-19  20   21  22 23   24 25  26   27  28  29 30   31  32   33 34  35 36   37Pro-Ser-NH238   39 
根据本发明，产生了下列的GLP-1(1-37)、exendin-3和exendin-4肽衍生物： 
GLP-1(x-y)A1-37
Exendin-3(z-k)A1-40
Exendin-4(z-k)A1-40
其中： 
x表示GLP-1氨基酸序列的1-36位氨基酸 
y表示GLP-1氨基酸序列的2-37位氨基酸 
z表示exendin-3或exendin-4氨基酸序列的1-38位氨基酸 
k表示exendin-3或exendin-4氨基酸序列的2-39位氨基酸 
A表示由一个或多个氨基酸或其衍生物组成的连接基团，作为信号分子或与信号分子键合或稳定它们。对于A来说，优选位于C末端，氨基酸优选为赖氨酸或另一个具有游离氨基的氨基酸例如鸟氨酸、或者是具有游离氨基的有机基团，其上结合有螯合剂，用于用放射性核素或MRI造影剂、荧光色素或化疗剂进行标记。 
可以使用的螯合剂包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、或N，N-双(2-[双(羧甲基)氨基]-乙基)甘氨酸)、或DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)、HYNIC(6-吡啶肼-3-碳酸)、MAG3(巯基乙酰基-甘氨酰甘氨酰甘氨酸)、N4(1，4，8，11-四氮杂十一烷)以及上述螯合剂的所有已知的衍生物。 
指数表示在氨基酸序列中连接基团可以被发现的可选位置。 
GLP-1(x-y)A1-37
这里包含了不同长度的GLP-1衍生物，其中x可以取1到36的数目，y可以取2到37的数目，x总是小于y。A是可以放在任何位置的连接基团，但是优选位于C末端并比y前1位。优选情况下，连接基 团是氨基赖氨酸。 
Exendin-3(z-k)A1-40
这里包含了不同长度的exendin-3衍生物，其中z可以取1到38的数目，k可以取2到39的数目，z总是小于k。A是可以放在任何位置的连接基团，但是优选位于C末端并比k前1位。优选情况下，连接基团是氨基赖氨酸。 
Exendin-4(z-k)A1-40
这里包含了不同长度的exendin-4衍生物，其中z可以取1到38的数目，k可以取2到39的数目，z总是小于k。A是可以放在任何位置的连接基团，但是优选位于C末端并比k前1位。优选情况下，连接基团是氨基赖氨酸。 
下列的肽衍生物是特别优选的： 
1.MC 10：(DTPA-Lys37)GLP1(7-36)酰胺 
2.MC 13：(DTPA-Lys40)exendin-3酰胺 
3.MC 11：(DTPA-Lys40)exendin-4酰胺 
合成是在例如Peptide Specialty Laboratories GmbH公司按照Merrifield的方法进行的，并通过HPLC纯化。 
MC 10(DTPA-Lys37)GLP1(7-36)酰胺由GLP-1的7-36位氨基酸，在C末端带有具有游离氨基的氨基酸、优选为37位的赖氨酸以及螯合剂DTPA组成。 
MC 13(DTPA-Lys40)exendin-3酰胺由exendin-3完整的氨基酸， 在C末端带有具有游离氨基的氨基酸、优选为40位的赖氨酸以及螯合剂DTPA组成。 
MC 11(DTPA-Lys40)exendin-4酰胺由exendin-4完整的氨基酸，在C末端带有具有游离氨基的氨基酸、优选为40位的赖氨酸以及螯合剂DTPA组成。 
按照本发明产生了下列来自GLP-1(1-37)和exendin-3或exendin-4的嵌合肽： 
GLP-1(x-y)exendin-3(z-k)A1-75
GLP-1(x-y)exendin-4(z-k)A1-75
Exendin-3(z-k)GLP-1(x-y)A1-75
Exendin-4(z-k)GLP-1(x-y)A1-75
说明如下： 
x表示GLP-1氨基酸序列的1-36位氨基酸 
y表示GLP-1氨基酸序列的2-37位氨基酸 
z表示exendin-3或exendin-4氨基酸序列的1-38位氨基酸 
k表示exendin-3或exendin-4氨基酸序列的2-39位氨基酸 
A表示由一个或多个氨基酸或其衍生物组成的连接基团，作为信号分子或与信号分子键合或稳定它们。对于A来说，优选位于C末端，氨基酸优选为赖氨酸或另一个具有游离氨基的氨基酸例如鸟氨酸、或者是具有游离氨基的有机基团，其上结合有螯合剂，用于用放射性核素或MRI造影剂、荧光染料或化疗剂进行标记。 
可以使用的螯合剂包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、或N，N- 双(2-[双(羧甲基)氨基]-乙基)甘氨酸)、或DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)、HYNIC(6-吡啶肼-3-碳酸)、MAG3(巯基乙酰基-甘氨酰甘氨酰甘氨酸)、N4(1，4，8，11-四氮杂十一烷)以及上述螯合剂的所有已知的衍生物。 
指数表示在氨基酸序列中连接基团可以被发现的可选位置。 
GLP-1(x-y)exendin-3(z-k)A1-75
这里包含了来自GLP-1和exendin-3的嵌合肽，其中1-36位氨基酸来自GLP-1，其后的氨基酸来自exendin-3的1-39位氨基酸。A是可以放在任何位置的连接基团，但是优选位于C末端并比来自GLP-1和exendin-3的氨基酸数目靠前1位，优选情况下，连接基团是氨基赖氨酸。 
GLP-1(x-y)exendin-4(z-k)A1-75
这里包含了来自GLP-1和exendin-4的嵌合肽，其中1-36位氨基酸来自GLP-1，其后的氨基酸来自exendin-4的1-39位氨基酸。A是可以放在任何位置的连接基团，但是优选位于C末端并比来自GLP-1和exendin-4的氨基酸数目前1位，优选情况下，连接基团是氨基赖氨酸。 
Exendin-3(z-k)GLP-1(x-y)A1-75
这里包含了来自exendin-3和GLP-1的嵌合肽，其中z可以取1-38的数目，k可以取2-39的数目，而z总是小于k。A是可以放在任何位置的连接基团，但是优选位于C末端并比y前1位。优选情况下，连接基团是氨基赖氨酸。 
Exendin-4(z-k)GLP-1(x-y)A1-75
这里包含了来自exendin-4和GLP-1的嵌合肽，其中z可以取1-38的数目，k可以取2-39的数目，而z总是小于k。A是可以放在任何位置的连接基团，但是优选位于C末端并比y前1位。优选情况下，连接基团是氨基赖氨酸。 
嵌合的GLP-1(x-y)exendin-3(z-k)A1-75或GLP-1(x-y)exendin-4(z-k)A1-75肽的例子是MC12，由GLP-1(7-36)exendin(33-39)Lys酰胺(由Peptide Specialty Laboratories GmbH公司按照Merrifield的方法进行合成，并通过HPLC纯化。)组成。 
MC 12：(Ser37，Gly38，Ala39，Pro40，Pro41，Pro42，Ser43，DTPA-Lys44酰胺)GLP1(7-36) 
MC12由GLP-1(7-36)完整的氨基酸序列，在C末端带有一个氨基，优选在44位带有赖氨酸以及螯合剂DTPA，以及来自exendin(33-39)Lys酰胺的7个氨基酸的链组成。因此产生了嵌合肽GLP-1(7-36)exendin(33-39)Lys酰胺。 
对于专业技术人员来说，显然存在不同长度的来自GLP-1、exendin-3和exendin-4的肽衍生物，以及不同长度的来自GLP-1、exendin-3和exendin-4的嵌合肽，它们含有它们所基于的GLP-1、exendin-3和exendin-4的氨基酸序列的各种不同组合。 
基于本发明的、在C末端被氨基所修饰并通过N末端键合在GLP-1受体上的、来自GLP-1、exendin-3和exendin-4的肽衍生物以及来自GLP-1、exendin-3和exendin-4的嵌合肽，也包括在一个或多个位置上可以与上述的肽GLP-1、exendin-3和exendin-4区分开的、并与这些序列具有高度同源性的分子。此处的同源性是指至少40％的序列一致性、特别是60％的序列一致性、优选超过80％、特别优选超过90％的序列一致性。与上述氨基酸序列的偏差可能通过删除、取代和/或插入产生。 
此外，本发明的来自GLP-1、exendin-3或exendin-4的嵌合肽也可以被生产成在C末端没有任何修饰。它们被特别用于生产治疗糖尿病的药剂。 
GLP-1(x-y)exendin-3(z-k) 
GLP-1(x-y)exendin-4(z-k) 
Exendin-3(z-k)GLP-1(x-y) 
Exendin-4(z-k)GLP-1(x-y) 
MC 20：(Ser33，Gly34，Ala35，Pro36，Pro37，Pro38，Ser39)exendin GLP1(7-36) 
MC20由GLP-1(7-36)完整的氨基酸序列，在C末端带有来自exendin(33-39)的7个氨基酸的链组成。因此产生了未修饰的嵌合肽GLP-1(7-36)exendin(33-39)。 
肽衍生物和嵌合肽的标记 
将本发明的肽衍生物以及嵌合肽溶解在适当的稳定缓冲液中以稳定金属，例如优选以大约10-3M的浓度溶解在pH 5.4的0.5M乙酸钠中。此外，为了稳定荧光色素优选使用乙酸铵缓冲液；为了稳定化疗剂和造影剂优选使用生理缓冲液。 
标记发生在连接基团A上，通过结合放射性核素、MRI造影剂、荧光色素或化疗剂来进行。根据应用是体内的还是体外的来使用不同的方法。 
下面是用于共价或复合结合的放射性核素： 
PET(正电子发射断层照相)，SPECT(单光子发射计算机断层照相) 
使用的荧光色素/发色团如下： 
荧光素、罗丹明、香豆素、BODIPY、嵌二萘(级联蓝)、荧光黄、藻胆蛋白、花青苷、AlexaFluoro、俄勒冈绿、德克萨斯红及其衍生物。 
可以使用的螯合剂包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、或N，N-双(2-[双(羧甲基)氨基]-乙基)甘氨酸)、或DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)、HYNIC(6-吡啶肼-3-碳酸)、MAG3(巯基乙酰基-甘氨酰甘氨酰甘氨酸)、N4(1，4，8，11-四氮杂十一烷)以及上述螯合剂的所有已知的衍生物。 
可以使用的MRI造影剂包括：钆、锰、铁、铕、铜、镍、铬、镨、镝或钬或其化合物，以及阴性MRI造影剂例如全氟化碳，以及用于MRI光谱研究的同位素例如F-19、H-1、P-31、Na-19。本发明的阴性MRI造影剂是湮没MRI信号或极大地减弱它、即不放大它的那些试剂。 
可以使用的化疗剂包括：烷基化试剂、嵌入剂、抗代谢物、酶抑制剂和阻断剂以及纺锤体毒剂(例如烷基磺酸盐、乙基亚胺、亚硝化 单胞菌素(N.ureae)、氮芥子气衍生物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、鬼臼素衍生物、紫杉烷(taxane)、vincaalcaloide、蒽环霉素(anthracycline)、其它抑制细胞的抗生素、铂化合物、喜树碱(campthotecin)衍生物、不同的激素、生长因子、干扰素或白介素)，其它在Zuckschwerdtverlag出版的作者为Preiss、Dornhoff、Hagmann和Schmieder的“Onkologie 2004/05”的230页到287页中描述的化疗剂，以及所有其它抑制细胞的或细胞毒性物质。 
根据本发明所使用的蛋白衍生物和嵌合蛋白的应用类型，以及产生的与上述蛋白一起用于良性或恶性疾病的诊断和治疗的试剂的类型，所述疾病中GLP-1受体的表达发挥作用，标记反应将按照两种不同方式进行。 
在放疗中为体外应用进行标记 
将以大约10-3M的浓度溶解在适当的稳定缓冲液、优选为pH 5.4的0.5M乙酸钠中的本发明的肽衍生物或嵌合肽3μL，加入到500μLpH 5.4的0.5M乙酸钠中以进行标记。pH值在3到6之间。然后加入500μL溶于0.1M HCl的185MBq 111InCl3(Tyco，Petten，The Netherlands)，于37℃保温30分钟。最后加入3μL 10-3M的天然InCl3溶液，然后继续保温30分钟，以便使所有的键合位点饱和。 
质量控制通过HPLC柱来进行： 
柱子：CC 250/4.6Nucleosil 120-5 C18(Machery-Nagel，Oenisingen，Switzerland) 
梯度：0到5分钟使用100％0.05M的乙酸铵，pH 5.4(缓冲液A)；5到25分钟使用100％缓冲液A到50％缓冲液A/50％乙腈的梯度。 
当标记产率超过98％时，体外应用的质量控制实现。 
因此，放射性标记的试剂可用于其中GLP-1受体的表达发挥作用 的良性或恶性疾病的诊断和治疗，它可以被用于例如胰腺细胞的细胞和组织培养中。 
在放疗中为体内应用进行标记 
将以大约10-3M的浓度溶解在适当的稳定缓冲液、优选为pH 5.4的0.5M乙酸钠中的本发明的肽衍生物或嵌合肽3μL，加入到500μLpH 5.4的0.5M乙酸钠中以进行标记。最后加入500μL溶于0.1M HCl的185MBq 111InCl3(Tyco，Petten，The Netherlands)，于37℃保温30分钟。质量控制通过HPLC柱来进行： 
柱子：CC 250/4.6Nucleosil 120-5 C18(Machery-Nagel，Oenisingen，Switzerland) 
梯度：0到5分钟使用100％0.05M的乙酸铵，pH 5.4(缓冲液A)；5到25分钟使用100％缓冲液A到50％缓冲液A/50％乙腈的梯度。 
当标记产率超过98％时，体内应用的质量控制实现。 
因此，放射性标记的试剂可用于其中GLP-1受体的表达发挥作用的良性或恶性疾病的诊断和治疗，它可以被用于例如检测病人中的肿瘤。 
术语“病人”是指人类和脊椎动物等。因此，试剂可以用于人类和兽医医药。基于本发明的有治疗和诊断效果的试剂以下列形式中的一种作为可药用的制剂组合物被给予病人：口服、直肠、肠胃外、静脉内/动脉内、肌肉内、皮下、鞘内、脑池内、颅内、阴道内、腹膜内、血管内、局部(粉末、软膏或滴剂)或喷雾形式(喷雾剂)。 
所需的剂量将由医生根据每个单独的良性或恶性疾病的诊断和治疗病例来确定，所述疾病中GLP-1受体的表达发挥作用。 
内化研究 
内化研究以示例性的方式显示了本发明的体外放射性标记的肽衍生物和嵌合蛋白向细胞内的运输。 
在6孔板中接种100,000个GLP-1受体转染的CHO细胞。细胞生长直到满底。然后分成四组： 
第一组：完全键合，用PBS洗涤 
将100,000cpm111In(10-15Mol)标记的肽加入到2mL培养基中，在37℃保温1小时。然后用PBS清洗3次，将细胞用20mM MOPS(3-对氧氮杂己环基丙磺酸)和0.1％Triton-X-100(pH7.4)分离。细胞内的吸收用γ-计数器测量。细胞的数量用蛋白含量来测量，使用Bio-Rad(Munich，Germany)的蛋白分析试剂盒根据Bradford的方法进行。结果用cpm/μg蛋白来表示。 
第二组：非特异性结合，用PBS洗涤 
将20μL 10-3M的GLP-1溶液和100,000cpm111In标记的肽加入到2mL培养基中，在37℃保温1小时。然后用PBS清洗3次，将细胞用20mM MOPS(3-对氧氮杂己环基丙磺酸)和0.1％Triton-X-100(pH7.4)分离。细胞内的吸收用γ-计数器测量。细胞的数量用蛋白含量来测量，使用Bio-Rad(Munich，Germany)的蛋白分析试剂盒根据Bradford的方法进行。结果用cpm/μg蛋白来表示。 
第三组：完全键合，用酸洗涤 
将20μL 10-3M的GLP-1溶液和100,000cpm111In标记的肽加入到2mL培养基中，在37℃保温1小时。然后用0.1M pH 4的乙酸钠缓冲液洗1次，用PBS洗2次，将细胞用20mM MOPS(3-对氧氮杂己环基丙磺酸)和0.1％Triton-X-100(pH7.4)分离。细胞内的吸收用γ-计数器测量。细胞的数量用蛋白含量来测量，使用Bio-Rad(Munich，Germany)的蛋白分析试剂盒根据Bradford的方法进行。结果用cpm/μg蛋白来表示。 
第四组：非特异性结合，用酸洗涤 
将20μL 10-3M的GLP-1溶液和100,000cpm111In标记的肽加入到2mL培养基中，在37℃保温1小时。然后用0.1M pH 4的乙酸钠缓冲液洗1次，用PBS洗2次，将细胞用20mM MOPS(3-对氧氮杂己环基丙磺酸)和0.1％Triton-X-100(pH7.4)分离。细胞内的吸收用γ-计数器测量。细胞的数量用蛋白含量来测量，使用Bio-Rad(Munich，Germany)的蛋白分析试剂盒根据Bradford的方法进行。结果用cpm/μg蛋白来表示。 
计算： % IDsB = Res 3 . - Res 4 . Res 1 . - Res 2 . * 100
％IdsB代表特异性键合内在化的百分数 
    ％IdsB
  MC10   75±5
  MC11   70±7
  MC12   73±9
结果显示在细胞中发生了良好的运输。 
键合研究 
键合研究显示出通过在体内标记的放射性标记的本发明的肽衍生物和嵌合蛋白在GLP-1受体上发生的特异性键合。 
在6孔板中接种100000个GLP-1受体转染的CHO细胞。细胞生长直到满底。然后加入2mL100,000cpm111In标记的肽。然后用20μL10-3M的GLP-1进行阻断以测试键合。 
    阻断百分率
  MC10   80±3
  MC11   85±3
  MC12   77±6
体内生物分布可以显示在啮齿动物例如无毛小鼠中。为此将GLP-1转染的CHO细胞注射到无毛小鼠中。在大约3到5周后，生长出大小大约为300mg的肿瘤。然后用37MBq111In标记的本发明肽通过尾部静脉注射到小鼠体内，在4小时后用γ-相机进行测量。 
在该方法过程中存在通过肾的快速清除和向肾中的吸收。在GLP-1受体阳性的肿瘤中也有高的吸收，但是GLP-1受体阴性的肿瘤几乎不显示任何吸收。在胰腺中也有轻微的吸收；其它器官没有显示出可见的吸收。 
离体生物分布研究以每组四只小鼠来进行，将555kBq In-111标记的MC10注射到尾部静脉中。1、4和24小时后将所有的小鼠杀死，取出它们的器官。 
测量放射活性的吸收，并对器官进行称重。计算每克器官重量的注射剂量百分数。 
结果如下： 
  器官   1h   标准偏差   4h   标准偏差   24h   标准偏差
  血液   0.01   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00
  肝脏   0.03   0.01   0.01   0.01   0.01   0.00
  胃   0.14   0.10   0.13   0.07   0.07   0.06
  脾   0.02   0.02   0.01   0.00   0.01   0.00
  胰腺   0.58   0.50   0.62   0.28   0.37   0.27
  肾脏   7.90   3.62   7.41   3.56   4.85   3.05
  肠   0.12   0.06   0.07   0.06   0.04   0.03
  肺   0.80   0.56   0.36   0.17   0.22   0.07
  心脏   0.02   0.01   0.01   0.01   0.00   0.00
  骨骼   0.02   0.04   0.01   0.00   0.01   0.01
  肌肉   0.01   0.00   0.00   0.00   0.00   0.00
  阴性肿瘤   0.03   0.03   0.02   0.01   0.01   0.00
  阳性肿瘤   0.42   0.19   0.31   0.30   0.20   0.16
从每组四只小鼠的生物分布获得的平均值用每克器官重量的注射剂量百分数表示。 
序列表 
<110>菲利普斯大学马尔堡 
<120>与GLP-1和肠促胰岛素类似物(exendin)有关的发明 
<130>SPI111851-21 
<140>PCT/DE2005/001503 
<141>2005-08-26 
<160>3 
<170>PatentIn version 3.1 
<210>1 
<211>37 
<212>PRT 
<213>Human 
<220> 
<221>GLP-1 
<222>(1)..(37) 
<223> 
<300> 
<302>Erfindung betreffend GLP-1 und Exendin 
<309> 
<310>DE 10 2004 043 153.1 
<311>2004-09-03 
<312>2006-09-03 
<313>(1)..(37) 
<400>1 
His Asp Glu Phe Glu Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val 
1               5                   10                  15 
Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu 
            20                  25                  30 
Val Lys Gly Arg Gly 
        35 
<210>2 
<211>39 
<212>PRT 
<213>human 
<220> 
<221>Exendin-3 
<222>(1)..(39) 
<223> 
<300> 
<302>Erfindung betreffend GLP-1 und Exendin 
<309> 
<310>DE 10 2004 043153.1 
<311>2004-09-03 
<312>2006-09-03 
<313>(1)..(39) 
<400>2 
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 
1               5                   10                  15 
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 
            20                  25                  30 
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 
        35 
<210>3 
<211>39 
<212>PRT 
<213>human 
<220> 
<221>Exendin-4 
<222>(1)..(39) 
<223> 
<300> 
<302>Erfindung betreffend GLP-1 und Exendin 
<309> 
<310>DE 102004043153.1 
<311>2004-09-03 
<312>2006-09-03 
<313>(1)..(39) 
<400>3 
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 
1               5                   10                  15 
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 
            20                  25                  30 
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 
        35 

Claims (21)

1.exendin-3的肽衍生物，其中exendin-3的氨基酸序列为： 
H-His-Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
36 37 38 39； 
其中其C末端有氨基修饰，其N端与GLP-1受体键合，并且其中所述肽衍生物含有连接基团A，所述连接基团A位于C末端并且包括具有游离氨基的氨基酸或具有游离胺的有机基团。 
2.权利要求1中的exendin-3的肽衍生物，其中连接基团A为赖氨酸。 
3.权利要求1中的exendin-3的肽衍生物，其中连接基团A是氨基酸鸟氨酸。 
4.权利要求1中的exendin-3的肽衍生物，其中螯合剂与连接基团A结合，以便用放射性核素或MRI造影剂、荧光色素或化疗剂标记。 
5.权利要求4中的exendin-3的肽衍生物，其中螯合剂选自DTPA（二亚乙基三胺五乙酸）、N,N-双(2-[双(羧甲基)氨基]-乙基)甘氨酸、DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）、HYNIC（6-吡啶肼-3-碳酸）、MAG3（巯基乙酰基-甘氨酰甘氨酰甘氨酸）、N4（1,4,8,11-四氮杂十一烷）及其衍生物。 
6.权利要求4中的exendin-3的肽衍生物，其中标记是结合核素、MRI造影剂、荧光色素和/或化疗剂。 
7.权利要求4中的exendin-3的肽衍生物，其中所选的荧光色素具体来说来自荧光素、罗丹明、香豆素、BODIPY、嵌二萘、荧光黄、藻胆蛋白、花青苷、AlexaFluoro、俄勒冈绿、德克萨斯红及其衍生物。 
8.权利要求6中的exendin-3的肽衍生物，其中所选的核素具体来说来自F-18、Cu-64、Cu-67、Ga-67、Ga-68、Y-86、Y-90、Tc-99m、In-111、I-123、I-124、I-131、Lu-177、Re-186、Re-188、Pt-193m、Pt-195m、Ac-225、At-211、Bi-213、Sm-153或Er-169。 
9.权利要求6中的来自exendin-3的肽衍生物，其中所选的MRI造影剂具体来说来自钆、锰、铁、铕、铜、镍、铬、镨、镝或钬或其化合物或全氟化碳、或F-19、H-1、P-31、Na-19。 
10.权利要求6中的来自exendin-3的肽衍生物，其中所选的化疗剂具体来说来自烷基化试剂、抑制细胞的抗生素、铂化合物、喜树碱（campthotecin）衍生物、激素、生长因子、干扰素或白介素或细胞抑制物质或细胞毒性物质。 
11.权利要求10中的来自exendin-3的肽衍生物，其中所选的化疗剂选自乙基亚胺、亚硝基脲、氮芥子气衍生物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、鬼臼素衍生物、紫杉烷（taxane）、长春花生物碱和蒽环霉素（anthracycline）。 
12.权利要求4中的exendin-3的肽衍生物，其中经由结合核素为体外应用而标记是通过用natInCL3饱和键合位点来进行的。 
13.权利要求1中的exendin-3的肽衍生物在生产诊断和治疗良性和恶性疾病的药剂中的应用，所述疾病中GLP-1受体的表达发挥作用。 
14.权利要求1到12中的exendin-3的肽衍生物在制备试剂中的应用，所述试剂用于确定组织中产胰岛素细胞的密度。 
15.权利要求1到12中的exendin-3的肽衍生物在制备试剂中的应用，所述试剂用于确定GLP-1受体的表达或它们的密度。 
16.用于良性和恶性疾病的诊断和治疗的药剂，所述疾病中GLP-1受体的表达发挥作用，其特征是其中含有标记的权利要求1的exendin-3的肽衍生物。 
17.用于良性和恶性疾病的诊断和治疗的药剂，所述疾病中GLP-1受体的表达发挥作用，其中其含有未标记的权利要求1的exendin-3的肽衍生物。 
18.权利要求16的药剂，其中标记包括结合核素、MRI造影剂、荧光色素和/或化疗剂。 
19.权利要求1-12中的exendin-3的肽衍生物在制备药剂中的应用，所述药剂用于体外诊断和治疗神经内分泌肿瘤（NET）。 
20.权利要求19中的应用，其中神经内分泌肿瘤选自胰岛瘤和小细胞支气管癌。 
21.权利要求19或20中的应用，其用在体外闪烁照相术、PET、SPECT、MRI、光学诊断、受体介导的化学疗法、受体介导的细胞抑制或细胞毒性疗法和放射性肽疗法中。 
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