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CN102335135A - 功能性纳米粒子及其制造方法与应用 - Google Patents

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CN102335135A CN2011101427284A CN201110142728A CN102335135A CN 102335135 A CN102335135 A CN 102335135A CN 2011101427284 A CN2011101427284 A CN 2011101427284A CN 201110142728 A CN201110142728 A CN 201110142728A CN 102335135 A CN102335135 A CN 102335135A
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Abstract

本发明是关于一种用于药物递送的新型功能性纳米粒子，该功能性纳米粒子包含一种聚合物纳米粒子，一聚合物稳定剂包覆层，以及一药物；其中所述聚合物稳定剂包覆层是包覆在所述聚合物纳米粒子的表面，且所述药物是与所述聚合物稳定剂包覆层静电吸附力结合或共轭结合。本发明还关于一种制备这种纳米粒子的方法；并提供一种治疗缺血性或退化性疾病的方法，包含对患者投予有效量的这种功能性纳米粒子。

Description

功能性纳米粒子及其制造方法与应用
技术领域
本发明是关于一种用于药物递送的新型功能性纳米粒子、制备该纳米粒子的方法，及其用途。
背景技术
虽然目前已提出了治疗心脏病的新方法如控制药物递送(Engel et al.Proc Natl AcadSci U S A 103，15546-15551(2006))及干细胞治疗(Orlic et al.Nature 410，701-705(2001)及Quevedo et al.Proc Natl Acad Sci U S A 106，14022-14027(2009))，但要在没有副作用的情况下得出疗效仍是一项挑战。已有报告指出可将微球体(microsphere)(Sy et al.NatMater 7，863-868(2008))和类凝胶材料(gel-like materials)(Hsieh et al.J Clin Invest 116，237-248(2006)及Davis et al.Proc Natl Acad Sci U S A 103，8155-8160(2006))用于递送药物、延长药物在梗塞区域滞留的时间，并改善心脏功能。这些材料虽然可将药物送入心脏，但并不适用于控制药物释出，因为它们一般留存在梗塞区域的时间太久，以至于药物的释出动力学特性不佳。此外，目前也不清楚这些植入材料要如何在梗塞区域长时间留置(一般是指数周到数月)而不会以一适当速度分解(Anderl et al.Journal of BiomedicalMaterials Research Part A 88A，704-710(2009))，这通常最后都会引起发炎反应及/或异物反应。
发明内容
有鉴于前述现有技术的限制，本发明的主要目的之一是提供一种用于药物递送的新型功能性纳米粒子，特别是一种与类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor(IGF)-1)共轭结合的聚乳酸-甘醇酸(poly(D，L-lactide-co-glycolide))纳米粒子(下文作PLGA-IGF-1纳米粒子，或作PLGA-IGF-1NPs)，可在急性心肌梗塞后提供心脏保护效果。
本发明的另一目的是提供一种制造本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子的简便方法，且不会危及IGF-1的功能。
本发明的第三个目的是提供一种治疗缺血性疾病或退化性疾病的方法，其中缺血性疾病如缺血性中风(ischemic stroke)及周边动脉阻塞性疾病(peripheral arterial occlusivedisease)；而退化性疾病如肌肉骨骼伤病(musculoskeletal disorders)或神经疾病；该方法包含对患者投予有效量的本发明的功能性纳米粒子。
此外，本发明还提供将本发明的功能性纳米粒子用于再生医学的用途。
为达上述目的，本发明提供一种用于药物递送的新型功能性纳米粒子，其包含：一种聚合物纳米粒子，一聚合物稳定剂包覆层，以及一药物；其中所述聚合物稳定剂包覆层是包覆在所述聚合物纳米粒子的表面，且所述药物是与所述聚合物稳定剂包覆层静电吸附力结合或共轭结合。
在本发明的较佳实施态样中，所述聚合物纳米粒子的聚合物是选自生物可降解的聚合物或天然材料；又更佳者，是选自PLGA、胶原蛋白、明胶、甲壳素、几丁质、玻尿酸、海藻酸化物(alginate)、白蛋白、纤维蛋白(fibrin)、琼脂糖(agarose)或纤维素；最佳者，为PLGA。
在本发明的较佳实施态样中，所述功能性纳米粒子的平均粒径为从5至500nm；又更佳者，是从5至300nm；最佳者，是从50至100nm。
在本发明的较佳实施态样中，所述聚合物稳定剂为聚(乙烯)亚胺(poly(ethylene)imime)、聚离胺酸(polylysine)、或选自由亚精胺(spermidine)、腐胺(putrescine)及聚乙二醇所组成的组群的聚胺材料；最佳者，为聚(乙烯)亚胺。
在本发明的较佳实施态样中，所述药物为用于治疗的细胞激素、生长因子、合成蛋白、化合物、DNA或RNA；又更佳者，为IGF-1、PDGF、VEGF、HGF、G-CSF、FGF、BMP、SHH、骨膜蛋白(periostin)、神经调节蛋白(neuregulin)、p38抑制剂、或其组合；最佳者，为IGF-1。
在本发明的较佳实施态样中，所述功能性纳米粒子是通过注射投予；又更佳者，是通过开胸手术(transthoracic surgery)、心导管(cardiac catheterization)或超音波导引法(echo-guided approach)而藉由直接心肌注射来投予。
本发明还提供一种制备前文所述的功能性纳米粒子的方法，包含下列步骤：
(a)提供一聚合物溶液；
(b)一边搅拌一边将一醇溶液或水加入所述聚合物溶液，以得出一纳米粒子悬浮液；
(c)将所述悬浮液移入一聚合物稳定剂溶液，并进行均质化；
(d)过滤得自步骤(c)的经均质化的悬浮液，以得出一种经聚合物稳定剂包覆的聚合物纳米粒子；
(e)将所述经聚合物稳定剂包覆的聚合物纳米粒子加入一药物溶液，以得出前述功能性纳米粒子。
在本发明的较佳实施态样中，所述聚合物纳米粒子的聚合物是选自生物可降解的聚合物或天然材料；又更佳者，是选自PLGA、胶原蛋白、明胶、甲壳素、几丁质、玻尿酸、海藻酸化物、白蛋白、纤维蛋白、琼脂糖或纤维素；又更佳者，为PLGA。
在本发明的较佳实施态样中，所述功能性纳米粒子的平均粒径为从5至500nm；又更佳者，是从5至300nm；最佳者，是从50至100nm。
在本发明的较佳实施态样中，所述聚合物稳定剂为聚(乙烯)亚胺、聚离胺酸、或选自由亚精胺、腐胺及聚乙二醇所组成的组群的聚胺材料；最佳者，为聚(乙烯)亚胺。
在本发明的较佳实施态样中，所述药物为用于治疗的细胞激素、生长因子、或合成蛋白化合物、DNA或RNA；又更佳者，为IGF-1、PDGF、VEGF、HGF、G-CSF、FGF、BMP、SHH、骨膜蛋白、神经调节蛋白、p38抑制剂、或其组合；最佳者，为IGF-1。
在本发明的较佳实施态样中，所述醇溶液为乙醇溶液或其对等物。
本发明并提供一种治疗缺血性疾病或退化性疾病的方法，所述缺血性疾病如缺血性中风及周边动脉阻塞性疾病，所述退化性疾病如神经疾病或肌肉骨骼伤病；其包含对患者投予有效量的如前文所述的功能性纳米粒子。
本发明并提供所述的功能性纳米粒子在制备治疗缺血性疾病或退化性疾病的药物中的应用。所述缺血性疾病如缺血性中风及周边动脉阻塞性疾病。所述退化性疾病如神经疾病或肌肉骨骼伤病。
本发明进一步提供一种将如前文所述的功能性纳米粒子用于再生医学的用途。
本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子能通过在活体外(in vitro)活化Akt磷酸化作用来抑制多柔比星(doxorubicin)所引发的心肌细胞凋亡。而在活体内(in vivo)研究中，使用本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子进行心肌内注射(intramyocardial injection)会使IGF-1的滞留时间(retention)较单独注射IGF-1时更长，且IGF-1滞留时间会至少持续到注射后24小时。除此之外，超音波及组织学研究显示，在梗塞后将PLGA-IGF-1纳米粒子注射到心肌的周边梗塞区域能预防心肌细胞死亡，缩小梗塞区块，并改善小鼠的心脏功能。因此，本发明具有应用于缺血性心脏病的临床治疗的潜力。
附图说明
图1显示了(a)PLGA纳米粒子(PLGA NPs)及(b)PLGA-IGF-1纳米粒子(PLGA-IGF-1 NPs)的穿透式电子显微镜影像(比例尺：100nm)。
图2显示了共轭结合到本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子上的IGF-1量，其是通过ELISA测得。
图3显示了(a)本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子(PLGA-IGF-1 NPs)对磷酸化Akt(p-Akt)、全部Akt及GAPDH(内部对照组)的剂量效应，以及(b)IGF-1(1μg/mL)与(c)本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子(1μg/mL)对Akt磷酸化作用的时间效应。
图4显示了(a)经多柔比星处理的心肌细胞(Dox)、以及经多柔比星处理的心肌细胞再经PLGA纳米粒子处理(PLGA NPs+Dox)、或再经IGF-1处理(IGF-1+Dox)、或再经PLGA-IGF-1纳米粒子处理(PLGA-IGF-1 NPs+Dox)后的流式细胞仪结果，以及(b)上述结果的正规化图形。**：P＜0.01。***：P＜0.001。
图5是在引发心肌梗塞后将PLGA-IGF-1纳米粒子经由三个不同方向注射到边缘区域的示意图。
图6显示了(a)小鼠在注射PLGA纳米粒子(PLGA NPs)、IGF-1或PLGA-IGF-1纳米粒子(PLGA-IGF-1 NPs)后24小时内的IGF-1滞留情形；(b)从在心肌梗塞后1天注射PBS(MI+PBS)、PLGA纳米粒子(MI+PLGANPs)、IGF-1(MI+IGF-1)或PLGA-IGF-1纳米粒子(MI+PLGA-IGF-1 NPs)的小鼠身上取得的心脏组织的Akt磷酸化情形。Sham是指假手术组。*：P＜0.05。***：P＜0.001。n.s.：不明显。
图7显示在心肌梗塞后1天注射PBS(MI+PBS)、PLGA纳米粒子(MI+PLGA NPs)、IGF-1(MI+IGF-1)或PLGA-IGF-1纳米粒子(MI+PLGA-IGF-1 NPs)的小鼠的免疫组织化学染色结果。箭头指出磷酸化Akt(棕色)(200X)。Sham是指假手术组。
图8显示了假手术小鼠及注射PBS(MI+PBS)、PLGA纳米粒子(MI+PLGANPs)、IGF-1(MI+IGF-1)或PLGA-IGF-1纳米粒子(MI+PLGA-IGF-1 NPs)的小鼠的左心室射出率(EF％)，其是于心肌梗塞后(a)1天或(b)21天藉由超音波所得结果。*：P＜0.05。**：P＜0.01。
图9显示了(a)接受测定的梗塞区块的横截面区域示意图，以及(b)假手术小鼠及在心肌梗塞后21天注射PBS(MI+PBS)、PLGA纳米粒子(MI+PLGANPs)、IGF-1(MI+IGF-1)或PLGA-IGF-1纳米粒子(MI+PLGA-IGF-1 NPs)的小鼠的心脏切片经曼森氏三色染色的结果。
图10显示了假手术小鼠及在心肌梗塞后21天注射PBS(MI+PBS)、PLGA纳米粒子(MI+PLGA NPs)、IGF-1(MI+IGF-1)或PLGA-IGF-1纳米粒子(MI+PLGA-IGF-1NPs)的小鼠的梗塞区块大小。*：P＜0.05。
具体实施方式
发明人设计了一种纳米等级颗粒，其尺寸较作为药物载体的传统材料更小、且可与其所负载的药物以同样速率分解。本发明的纳米等级颗粒具有以下优点：首先，由于该纳米等级颗粒的表面积/重量比较微米等级颗粒高，故单一颗粒可带有一种或多种药物；再者，该纳米等级颗粒会有效地扩散到组织中，特别是心脏组织；最后，它们可以穿透更小的毛细血管，而被细胞所吸收(参见Desai et al.Pharm Res 13，1838-1845(1996)及Desai et al.Pharm Res 14，1568-1573(1997))。
以下实施例是用以进一步理解本发明的优点，而非用于限缩本发明的申请专利范围。
实施例
实施例1：本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子的制备
将乳酸(lactide)对甘醇酸(glycolide)的比例为50/50的PLGA粉末(50DGOH-040，M.W.35,000-65,000 Da，购自Bio Invigor Co.)溶解在5mL丙酮中，其终浓度为10mg/mL。之后使用蠕动泵将由乙醇/H2O(50/50，％v/v)构成的乙醇溶液逐滴加入PLGA溶液(1mL/min)，并用磁搅拌子于400rpm搅拌，直到出现混浊状态。在搅拌5分多钟后，将悬浮液移入玻璃烧杯内的20mL的聚(乙烯)亚胺(分枝型PEI，购自Sigma)中，并低速均质化20分钟。聚合物稳定剂是用以增加本发明的纳米粒子的稳定度，而PEI的NH3 +基团会与IGF-1的COOH-基团静电吸附力结合(conjugate)。分枝型或线型的PEI都可用于本发明。
同上，1-乙基-3-[3-(二甲胺基)丙基]碳化二亚胺(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide，EDC)是一种水溶性的交联剂，它主要用于活化羧基(carboxyl)与胺基(amines)产生交联形成酰胺键结，并以共轭键结方式合成功能性纳米微粒，将IGF-1结合于PLGA纳米微粒的表面；将EDC溶液加入混有IGF-1与有PEI稳定剂包覆的PLGA纳米微粒溶液中，EDC将活化IGF-1上COOH与PEI稳定剂包覆的PLGA表面的NH并以共轭键结的方式将IGF-1携带于纳米微粒表面。
之后将经均质化的悬浮液以0.22μm滤膜过滤，得出PLGA纳米粒子(PLGANPs)，再以去离子水清洗PLGA纳米粒子三次。之后于4℃在PLGA溶液中加入特定浓度的IGF-1(Pepro Tech)水溶液1小时，其中每十分钟将该溶液震荡一次，以得出PLGA-IGF-1纳米粒子的溶液。将PLGA-IGF-1纳米粒子溶液于14,000rpm离心20分钟，并除去上清液。之后以水清洗PLGA-IGF-1纳米粒子(PLGA-IGF-1 NPs)并藉由三次离心来移除剩余的IGF-1。
传统上用于预防PLGA纳米粒子聚集(aggregation)的聚合物稳定剂是聚(乙烯基醇)(poly(vinyl alcohol)，PVA)、Tween 80及Fluonic 127(poloxamer 407)(参见Jain etal.Biomaterials 21，2475-2490(2000)及Kim et al.Langmuir 21，8852-8857(2005))。然而，这些稳定剂可能会改变PLGA纳米粒子的zeta电位、颗粒大小，以及颗粒表面的特性。大多数的聚合物稳定剂并不具有可应用于进一步改质的官能基，故其于生物医学方面的应用有其限制。而本发明是以聚(乙烯)亚胺(PEI)作为聚合物稳定剂，可预防IGF-1变性(denature)。IGF-1带有负电，且可藉由静电力与功能性PLGA纳米粒子上带有正电的胺基基团结合，故不需要其它的化学物质。在穿透式电子显微镜(Hitachi 7500)下观察到的PLGA纳米粒子(PLGA NPs)及PLGA-IGF-1纳米粒子(PLGA-IGF-1 NPs)表面形态如图1的(a)、(b)所示，而PLGA纳米粒子及PLGA-IGF-1纳米粒子的平均直径分别为66.2±15.3nm及74.4±11.3nm。PLGA纳米粒子及PLGA-IGF-1纳米粒子的表面型态并无显著差异。
此外，PLGA纳米粒子及本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子的表面电位亦通过zeta电位进行测定(Zetasizer 3000HS Advanced)，两者之间并无显著差异(数据未显示)。
实施例2：本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子的IGF-1浓度
使用人类专一性IGF-1ELISA试剂盒(Diagnostic Systems Laboratories，Webster，TX)来检验结合到本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子表面的IGF-1最大量。首先，将5mg/mL的PLGA纳米粒子与不同浓度的IGF-1共同培养，其中IGF-1浓度范围是从3μg/mL到300μg/mL。培养后，将未结合的IGF-1离心移除，并依制造商的说明进行ELISA。图2所示的结果指出，与本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子静电吸附力结合或共轭结合的IGF-1最大量为1μg/mL。
实施例3：本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子在活体外延长心肌细胞的Akt磷酸化作用
在本说明书中所使用的心肌细胞是取自1至3天大的Sprague-Dawley大鼠。所有动物实验程序都经国立成功大学动物实验管理小组(IACUC)核可。
首先，从Sprague-Dawley大鼠身上分离出新生心肌细胞(neonatal cardiomyocyte)，以1mg/mL溶于HBSS(GIBIO/BRL)的胰蛋白酶(trypsin，Sigma)于4℃消化作用3小时，再以0.8mg/mL溶于HBSS缓冲液的胶原蛋白酶(Type II，Worthington BiochemicalCorporation，Lakewood，N.J.，USA)于37℃进行消化作用。所分离的细胞是包含纤维母细胞(fibroblast)及心肌细胞(cardiomyocyte)，其于1000rpm离心收集，并在培养皿中进行预先平板培养(pre-plate)两次，每次30分钟，以使纤维母细胞贴附。在移除纤维母细胞后，将未贴附的细胞(即心肌细胞)植入覆有1％明胶(J.T.Baker)的培养皿备用。
为了研究在PLGA-IGF-1纳米粒子当中的IGF-1的剂量效应，分别将浓度范围从3μg/mL到300μg/mL的IGF-1溶液与固定浓度的PLGA纳米粒子(5mg/ml)共同培养，以得出具有不同IGF-1浓度的PLGA-IGF-1纳米粒子，并将之用于处理前述经分离的新生心肌细胞。
在处理过后，收集经处理的细胞的蛋白萃取物，并将之与磷酸化Akt抗体(anti-phospho-Akt antiboby，1∶1000稀释)或全部Akt抗体(anti-total Akt antibody，1∶1000稀释)(两者均购自Cell Signaling)于4℃培养隔夜，再分别与1∶25000及1∶50000稀释的对应二级抗体共同培养。之后使用加强型化学冷光侦测试剂盒(enhancedchemoilluminescence detection kit，Millipore)来侦测信号。
图3中(a)说明了单独使用IGF-1或使用IGF-1浓度不同的PLGA-IGF-1纳米粒子处理心肌细胞30分钟后的结果，其中单独使用IGF-1及使用IGF-1浓度不同的PLGA-IGF-1纳米粒子会增加Akt磷酸化作用。图3中(b)及(c)则进一步说明单独使用IGF-1(1μg/μL)可维持Akt磷酸化高达8小时，而共轭结合了相同浓度的IGF-1(1μg/μL)的PLGA-IGF-1纳米粒子则可有效地将Akt磷酸化作用延长至高达24小时。也就是说，PLGA-IGF-1纳米粒子处理组可将Akt磷酸化作用的时间延长到比单独使用IGF-1处理组更久。
实施例4：IGF-1及本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子在活体外预防心肌细胞凋亡
如实施例3分离并培养心肌细胞。将心肌细胞以5×105个细胞/cm2的密度植入培养皿隔夜，并在无血清的DMEM培养基中培养24小时，再以IGF-1、PLGA纳米粒子或PLGA-IGF-1纳米粒子处理1小时。阴性对照组则不以IGF-1或纳米粒子进行处理。经前述处理后，加入1μM多柔比星(Doxirubicin，Sigma)再处理24小时，以引发心肌细胞凋亡。离心收集经多柔比星处理的细胞，并于37℃在包含20μM RNase(Sigma)的0.1％Triton X-100溶液中培养30分钟，然后用0.1mg/mL碘化丙啶(propidium iodide，Sigma)染色10分钟。之后，用FACSCalibur对细胞进行流式细胞分析。
图4中(a)显示以流式细胞仪测定凋亡的结果，而图4中(b)显示流式细胞仪数据的正规化图形。相对于对照组(CM+Dox)及PLGA NPs+Dox组，IGF-1+Dox及PLGA-IGF-1NPs+Dox组的心肌细胞凋亡明显减少。易言之，IGF-1处理或PLGA-IGF-1纳米粒子处理会保护心肌细胞免于凋亡。
实施例5：本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子在活体内延长IGF-1的心肌滞留时间
使用体重大约25g的雄性FVB小鼠进行下列心肌梗塞实验。首先，用Zoletil-50及2％Rompun将小鼠麻醉，施行气管内管插管(tracheal intubation)及左侧开胸术(leftthoracotomy)，使小鼠的心脏暴露出来。之后施行心包切开术(pericardiotomy)，找出左冠状动脉，并以6-0缝线(6-0 prolene)进行缝合，使之与在左心房心耳下方大约2-3mm处的位置接合(ligate)，以引发心肌梗塞(myocardial infarction，MI)。在假手术组，则只进行缝合但不接合左冠状动脉。在接合冠状动脉后，立即将总量为20μL的PLGA纳米粒子、PLGA-IGF-1纳米粒子(包含1μg之IGF-1)、或IGF-1(1μg)经由三个方向(每个方向为等量)注射到心肌的梗塞边缘区域，如图5所示。注射了PLGA纳米粒子的小鼠作为阴性对照组。注射后，将小鼠的胸腔关闭，并使动物在加热垫上复原。所有步骤都是以盲性随机方式进行。每组至少有5只动物进行分析。
使用RIPA缓冲液(含有0.1％SDS、10mM Tris-Cl(pH6.8)、120mM NaCl、1％NP-40、1％脱氧胆酸盐(deoxycholate)及1∶100稀释的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma))而由注射区域的心脏组织制备得出蛋白样本。依照制造商的说明，对每个蛋白样本进行抗-人类IGF-1 ELISA(Diagnostic Systems Laboratories，Webster)的三重复试验，以测定IGF-1滞留在心脏中的时间。如图6中(a)所示，IGF-1组及PLGA-IGF-1纳米粒子组的IGF-1浓度在五分钟内几乎是相同的；然而，在注射后2、8及24小时，PLGA-IGF-1纳米粒子组的心脏IGF-1浓度要比其它组来得高。易言之，PLGA-IGF-1纳米粒子可在注射后将IGF-1在心脏中的滞留时间延长至高达24小时。
实施例6：本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子在活体内引发心肌Akt磷酸化作用
如实施例3所述施行西方墨点法(Western blot)，以检验注射后一天从注射区域得出的蛋白萃取物。图6中(b)指出，PLGA-IGF-1纳米粒子能够延长IGF-1在注射区域中的滞留时间，使心肌中的Akt磷酸化，而在MI+PLGA-IGF-1 NPs组中，磷酸化Akt的量远高于其它组别。
此外并使用免疫组织化学染色来测量梗塞区域。首先，取出小鼠心脏，并于4℃以4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定隔夜，再储存于70％乙醇备用。在收集样本之后，以石蜡包埋固定后的心脏样本并将之制成组织学切片。之后，将心脏切片脱蜡(de-paraffinized)、再水合、并以沸腾的10mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)预处理10分钟。将经预处理之切片于室温在3％H2O2中培养10分钟，并以PBS-T清洗三次。之后以溶于PBS-T的1％BSA(含有5％FBS及5％山羊血清)于室温对心脏切片进行封阻(block)1小时。封阻后，以下列初级抗体于4℃对切片进行探测(probe)隔夜：抗-人类rhIGF-1、活性胱冬肽酶-3(cleaved caspase-3)、与抗-磷酸化Akt(Cell Signaling)。以PBS-T清洗三次，每次5分钟，以移除初级抗体。使用对应的二级抗体于室温培养30分钟，之后以PBS-T清洗三次。如图7所示，箭头指出的是染色结果为阳性的磷酸化Akt(棕色)(200X)。
实施例7：本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子的心脏保护效果
所有测试都是以盲性随机方式进行。总共使用57只体重大约25g的雄性FVB小鼠来研究本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子的心脏保护效果，其中每组有至少10只动物(假手术组的n＝10，MI+PBS组的n＝13，MI+NPs组的n＝12，MI+IGF-1组的n＝10，MI+PLGA-IGF-1 NPs组的n＝12)。
在心肌梗塞后1天或21天，利用活体内微影像系统(Vevo 770，Visualsonics，Toronto，Canada)做超音波并进行分析。测量左心室乳突肌的舒张末期内径(End-diastolicdimension，EDD，单位为mm)、收缩末期内径(end-systolic dimension，ESD，单位为mm)及射出率(ejection fraction，EF)，之后以下列公式计算得出左心室的短缩分率(leftventricular fractional shortening)，其以EF％表示：
EF % = ( EDD - ESD ) EDD × 100 %
由表1所示结果可知，本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子的EDD及ESD上升的程度要比IGF-1组及PLGA纳米粒子组来得低，近于假手术对照组。也就是说，以本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子进行治疗可预防心肌梗塞后的心室扩大(myocardial dilation)情形。
表1心肌梗塞后1天或21天的舒张末期内径及收缩末期内径
Figure BDA0000064877680000101
EDD：舒张末期内径；ESD：收缩末期内径
A与MI+IGF-1组相较之下p＜0.05
B与MI、MI+PLGA NPs、MI+IGF-1组相较之下p＜0.05
图8中(a)及(b)显示在心肌梗塞后1天及21天注射PBS、PLGA纳米粒子、IGF-1(单用)或注射PLGA-IGF-1纳米粒子的小鼠的左心室射出率(left ventricular ejectionfraction％，EF％)。如图8中(a)所示，MI+PLGA-IGF-1 NPs组的射出率明显高于MI+PLGANPs组，而其它所有的组别并没有明显差异(假手术组为59.9％±9.1％，MI+PBS组为48.7％±5.9，MI+PLGA NPs组为46.9％±5.9％，MI+IGF-1组为48.9％±6.0％，MI+PLGA-IGF-1 NPs组为52.6％±6.9％)，这显示手术后的心脏损伤会有相似的基准值(baseline)。然而在21天后，可在注射PLGA-IGF-1纳米粒子的动物身上观察到射出率明显改善(假手术组为55.8％±3.4％，MI+PBS组为42.0％±6.8，MI+PLGA NPs组为45.8％±9.9％，MI+IGF-1组为43.1％±6.8％，MI+PLGA-IGF-1 NPs组为52.5％±7.4％)，如图8中(b)所示。
除此之外，并在心肌梗塞后2 1天使用曼森氏三色染色(Masson’s trichrome staining)来侦测梗塞疤痕(infarcted scar)的大小。梗塞区域就是缺血后形成的纤维化心脏组织，无法像正常心肌一般收缩，且会造成心室扩大，最后导致心衰竭。
首先，取出所有小鼠的左心室，并于4℃以4％多聚甲醛固定隔夜，之后储存于70％乙醇。在收集样本之后，以石蜡包埋心室样本，将之制成组织学切片，并进行曼森氏三色染色。梗塞及未梗塞区域的大小是以自动化计算机影像分析进行测量，而小鼠心脏的左心室当中梗塞及未梗塞区域的比值是以下列公式计算得出：
梗塞区域(％)＝梗塞区域/(左心室的体积-左心室内腔的体积)
本研究的每个实验组至少有8只动物。依图9统计所得的结果显示，相较于其它接受PLGA纳米粒子或IGF-1(单用)注射的组别，接受本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子注射后的心脏梗塞区块明显缩小。图10显示了所有组别的小鼠身上梗塞区块缩小的情形。图9及图10说明注射本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子可缩小梗塞区块，这意味着收缩心肌重量(contracting myocardial mass)有所改善。
简言之，若在急性梗塞后将本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子注射至周边梗塞区域，可延长心脏保护，并改善心脏功能。因此，本发明的PLGA-IGF-1纳米粒子具备用于治疗心血管疾病的潜力。

Claims (20)

1.一种用于药物递送的功能性纳米粒子，该功能性纳米粒子包含：一种聚合物纳米粒子，一聚合物稳定剂包覆层，以及一药物；其中所述聚合物稳定剂包覆层是包覆在所述聚合物纳米粒子的表面，且所述药物是与该聚合物稳定剂包覆层静电吸附力结合或共轭结合。
2.如权利要求1所述的功能性纳米粒子，其中，所述聚合物纳米粒子的聚合物是选自生物可降解的聚合物或天然材料。
3.如权利要求2所述的功能性纳米粒子，其中，所述聚合物纳米粒子的聚合物是选自PLGA、胶原蛋白、明胶、甲壳素、几丁质、玻尿酸、海藻酸化物、白蛋白、纤维蛋白、琼脂糖或纤维素。
4.如权利要求1所述的功能性纳米粒子，其平均粒径为从5至500nm。
5.如权利要求1所述的功能性纳米粒子，其中，所述聚合物稳定剂为聚(乙烯)亚胺、聚离胺酸、或选自由亚精胺、腐胺及聚乙二醇所组成的组群的聚胺材料。
6.如权利要求1所述的功能性纳米粒子，其中，所述药物为细胞激素、生长因子、合成蛋白、化合物、DNA或RNA。
7.如权利要求6所述的功能性纳米粒子，其中，所述药物为IGF-1、PDGF、VEGF、HGF、G-CSF、FGF、BMP、SHH、骨膜蛋白、神经调节蛋白、p38抑制剂、或其组合。
8.如权利要求1所述的功能性纳米粒子，其是通过注射投予。
9.一种制备如权利要求1所述的功能性纳米粒子的方法，其包含下列步骤：
(a)提供一聚合物溶液；
(b)一边搅拌一边将一醇溶液或水加入所述聚合物溶液，以得出一纳米粒子悬浮液；
(c)将该悬浮液移入一聚合物稳定剂溶液，并进行均质化；
(d)过滤得自步骤(c)的经均质化的悬浮液，以得出一种经聚合物稳定剂包覆的聚合物纳米粒子；
(e)将所述经聚合物稳定剂包覆的聚合物纳米粒子加入一药物溶液，以得出所述功能性纳米粒子。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述聚合物纳米粒子的聚合物是选自生物可降解的聚合物或天然材料。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述聚合物纳米粒子的聚合物是选自PLGA、胶原蛋白、明胶、甲壳素、几丁质、玻尿酸、海藻酸化物、白蛋白、纤维蛋白、琼脂糖或纤维素。
12.如权利要求9所述的方法，其中，所述功能性纳米粒子的平均粒径为500nm以下。
13.如权利要求9所述的方法，其中，所述聚合物稳定剂为聚(乙烯)亚胺、聚离胺酸、或选自由亚精胺、腐胺及聚乙二醇所组成的组群的聚胺材料。
14.如权利要求9所述的方法，其中，所述药物为细胞激素、生长因子、合成蛋白、化合物、DNA或RNA。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述药物为IGF-1、PDGF、VEGF、HGF、G-CSF、FGF、BMP、SHH、骨膜蛋白、神经调节蛋白、p38抑制剂、或其组合。
16.如权利要求9所述的方法，其中，所述醇溶液为乙醇溶液。
17.权利要求1所述的功能性纳米粒子在制备治疗缺血性疾病或退化性疾病的药物中的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其中，所述缺血性疾病包含缺血性中风及周边动脉阻塞性疾病。
19.如权利要求17所述的应用，其中，所述退化性疾病包含神经疾病及肌肉骨骼伤病。
20.一种如权利要求1所述的功能性纳米粒子用于再生医学的用途。
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