CN102321762B - 一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒，步骤以下包括：(1)将生物细胞裂解释放出DNA；(2)将含有生物DNA的溶液和能够与DNA结合的磁性纳米颗粒混合，该磁性纳米颗粒是羧基修饰的二氧化硅包裹γ-Fe2O3纳米颗粒，在异丙醇的作用下，DNA结合到磁性纳米颗粒表面，在外加磁场作用下收集磁性纳米颗粒，即为结合了DNA的磁性纳米颗粒；(3)加水，磁性分离收集水溶液，即得到分离的生物的DNA溶液；(4)以DNA溶液为模板，利用目标生物的特异性引物进行PCR扩增。本发明整个检测过程所需的时间仅为2小时，对单增李斯特菌的检出限约为1CFU/25g(mL)，所需时间短，灵敏度高，结果可靠。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体公开了一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒。
背景技术
近年来，食源性致病菌快速检测技术正迅速发展，2009年2月在《中华人民共和国食品安全法》由十一届全国人民代表大会常务委员会第七次会议通过。食源性致病菌检测是对食品的原料及其生产加工、储藏等环境中的致病菌进行分离或者原位检测。食源性致病菌快速检测所用方法包括是免疫学、生物化学、生物物理等。
单增李斯特菌是唯一公认能引起人类疾病的李斯特菌。它是一种常见的土壤细菌，当污染食物后也能引起严重食物中毒。作为一种人畜共患病的病原菌，能引起人、畜的感染，主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多等。食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，尤其在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。
对于单增李斯特菌的检测，我国有国家标准《GB 4789.30-2010单核细胞增生李斯特氏菌检验》及出入境检验检疫行业标准《SN/T0184.1-2005进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法》。
现在广泛使用的致病菌检测方法主要有四种，都适用于单增李斯特菌的检测：平皿培养分离计数法，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，荧光PCR检验方法与ELISA酶联免疫吸附试验。平皿培养分离鉴定法是应用微生物检验的增菌培养、分离、生化鉴定等方法对奶粉中可能存在的食源性致病菌进行定性和定量的检验。其特点是稳定可靠，是目前最成熟，使用最广泛，作为基准的检验方法，但是存在检测时间长，过程繁琐，对操作人员技术要求高以及对特定血清型难以分离鉴定的问题。PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。样品(经前处理增菌后)，提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对样品中是否污染食源性致病菌进行快速检验。用PCR技术检测有害微生物具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时等优点。荧光PCR在普通PCR基础上加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板，可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。但是PCR反应受样品情况的影响比较大，特别在食源性有害微生物检查中，食品中的成分(糖类、酸类，油脂等物质)会干扰反应的正常进行。而检测的环境，中间处理环节也会带来一些PCR反应抑制剂。从而使PCR反应呈现较高的假阳性和假阴性率。ELISA，即酶联免疫吸附试验，具有很高的灵敏性及可重复性，但每次只能检测一种标志物，不能满足多种被检物同时检测的需要，且ELISA方法成本操作繁琐，试剂盒价格昂贵，大量使用将产生很高的成本负担。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的生物检测方法检测过程繁琐，灵敏度不高的不足，提供一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒。
本发明旨在提供一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：
一种高灵敏度快速检测生物种类的方法，步骤以下包括：
(1)将生物细胞裂解释放出DNA，得到含有该生物DNA的溶液；
(2)将步骤(1)所得的含有生物DNA的溶液和能够与DNA结合的磁性纳米颗粒混合，该磁性纳米颗粒是羧基修饰的二氧化硅包裹γ-Fe2O3纳米颗粒，在异丙醇的作用下，DNA结合到磁性纳米颗粒表面，在外加磁场作用下，收集磁性纳米颗粒，即为结合了DNA的磁性纳米颗粒；
(3)将步骤(2)收集所得的结合了DNA的磁性纳米颗粒中加水，磁性分离，收集水溶液，即得到分离的生物的DNA溶液；
(4)以步骤(3)得到的DNA溶液为模板，利用目标生物的特异性引物，进行PCR扩增。
步骤(1)中裂解生物细胞的方法是普通的常规细胞裂解法。较佳的，可以是热裂解法，将生物样品在水中煮沸，即细胞裂解，释放出DNA。
步骤(2)中可以采用现有的各种能够与DNA结合的磁性纳米颗粒，较佳的是羧基修饰的氨基二氧化硅包裹γ-Fe2O3纳米颗粒，更佳的是由本发明所述方法制备的。在DNA水溶液中加入该磁性纳米颗粒和异丙醇，即可使DNA结合到磁性纳米颗粒表面，从而通过磁性分离出该结合DNA的磁性纳米颗粒。异丙醇加入量较佳的为水相溶液体积的19倍，在这种情况下DNA吸附于磁性纳米颗粒表面。
步骤(3)中加入水即使DNA从磁性纳米颗粒表面脱落，溶解于水中，从而经过磁性分离得到DNA溶液。
步骤(4)中采用现有的任何生物的特异性引物为引物，来特异性扩增目标DNA片段。较佳的，例如采用李斯特菌的特异性引物来进行扩增，从而检测DNA溶液中是否含有李斯特菌的DNA。在得到扩增产物的情况下，则待测的生物中含有李斯特菌，是阳性结果。在没有得到扩增产物的情况下，则待测的生物中不含有李斯特菌，是阴性结果。本方法可以同时设立阳性对照、阴性对照或者空白对照。所述特异性引物优选Hly和Iap。PCR扩增条件优选：95℃1min；95℃30s，58.7℃20s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保存。
Hly：CCGCCTGCAAGTCCTAA/ACAGGAAGAACATCGGGT，
Iap：GATAAAGCCCAAATAGT/GGACTACTGTTGACGCAA。
本发明的一优选方案为：一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：
(1)将待测样品置于离心管，10000r/min离心1min，弃去上清液；用灭菌的去离子水离心洗涤，去除杂质；用灭菌的去离子水悬浮沉淀物，将悬浮液于沸水浴中煮沸10min，10000r/min离心1min，使样品中生物细胞裂解，释放出DNA，取其上清液；
(2)取步骤(1)所得的上清液于离心管中，向其中加入本发明所述的特异性结合DNA的磁性纳米颗粒和异丙醇，异丙醇加入量为水相溶液体积的19倍，在这种情况下DNA吸附于磁性纳米颗粒表面；
(3)在外加磁场作用下，收集磁性纳米颗粒，用98％乙醇洗涤去杂质，加入去离子水，在外加磁场作用下，收集洗脱液，用特定条件PCR检验单增李斯特菌。
所述的特异性结合DNA的磁性纳米颗粒较佳的是以四氧化三铁纳米粒子为内核，以二氧化硅为外壳，表面修饰羧基。
所述PCR扩增所用引物优选：
Hly：CCGCCTGCAAGTCCTAA/ACAGGAAGAACATCGGGT；
Iap：GATAAAGCCCAAATAGT/GGACTACTGTTGACGCAA。
所述PCR扩增程序为：95℃1min；95℃30s，58.7℃20s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保存。
所述PCR扩增的体系为：10×PCR Buffer(2.5μl)，Blend Taq-Plus(0.5μl)，模板(2.0μl)，引物(共8.0μl)，dNTPs(2.0μl)，ddH2O(10.0μl)。
步骤(2)和(3)所述的外加磁场为1000～5000Gs。
本发明所述的特异性结合DNA的磁性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(i)Fe2+和Fe3+与NaOH溶液混合共沉淀制得γ-Fe2O3纳米颗粒，二氧化硅包裹此颗粒同时修饰氨基，得氨基修饰的磁性纳米颗粒：
配制FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O和NaOH溶液，混合，在氢氧化钠溶液条件下反应后洗涤，干燥，研磨成粉。加入至添加了表面活性剂正己醇和环己烷体系，超声至稳定，滴加浓氨水，加入正硅酸乙酯反应完成。在外加磁场下洗涤纳米颗粒，高温煅烧后，与氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷(AEAPS)在醇溶液中反应，在外加磁场下洗涤，干燥。静置12h使粒子陈化。使用磁性分离柱分离后，用乙醇来洗涤粒子，并90℃烘干5h，去除粒子表面的有机物，得到二氧化硅包裹的磁性纳米粒子。将二氧化硅包裹的磁性纳米粒子与0.1mL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷共同分散于甲醇/丙三醇的混合溶液中，超声分散均匀，反应24h后使用磁性分离柱分离，分别用乙醇和蒸馏水洗涤，置于真空干燥箱中干燥，干燥后取出室温保存，得到氨基修饰的磁性纳米颗粒。
所述的氨基修饰的磁性纳米颗粒粒径为320nm～460nm。
所述的外加磁场为1000～5000Gs。
所述的二氧化硅包裹的磁性纳米颗粒的质量浓度与氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷(AEAPS)体积的比例为1mg/ml∶0.025ml至1mg/ml∶0.05ml。
(ii)羧基化的PEG与氨基修饰的磁性纳米颗粒结合，得羧基修饰的磁性纳米颗粒：
将1mg氨基修饰的磁性纳米颗粒与羧基化的PEG分散于水溶液中，加入N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，搅拌过夜，在外加磁场下分离洗涤，得到羧基修饰的磁性纳米颗粒，即为特异性结合DNA的磁性纳米颗粒。
所述的外加磁场为1000～5000Gs。
所述羧基化的PEG分子量为400Da至700Da.。
所述的氨基修饰的磁性纳米颗粒与羧基化的PEG质量比为10∶1至20∶1。
本发明还提供一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的试剂盒，包括：
(1)特异性结合DNA的磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒是羧基修饰的二氧化硅包裹γ-Fe2O3纳米颗粒；
(2)引物Hly和Iap，
Hly：CCGCCTGCAAGTCCTAA/ACAGGAAGAACATCGGGT，
Iap：GATAAAGCCCAAATAGT/GGACTACTGTTGACGCAA。
本试剂盒还包括(3)10×PCR Buffer；dNTP；和Taq DNA聚合酶。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
本发明整个检测过程所需的时间仅为2小时，对单增李斯特菌的检出限约为1CFU/25g(mL)，所需时间短，灵敏度高于单纯PCR方法，结果更加可靠。作为现有方法的补充，在检测领域可以广泛使用。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1是单增李斯特菌1CFU/25g(mL)基因组DNA经本方法检测结果电泳图。1为1000bp DNA Mark；2为沙门菌NCTC 6017株对照；3为被检单增李斯特菌ATCC13932株；其中hly基因扩增长度308bp，iap基因扩增长度505bp；4为金黄色葡萄球菌ATCC 29213株对照。该结果样品3为阳性。
具体实施方式
本发明提供了使用DNA特异性纳米磁性提取颗粒提取单增李斯特菌的DNA再经PCR检测的联合应用策略，从而丰富检测单增李斯特菌的手段。
本发明首先制备氨基修饰的纳米提取颗粒，然后与羧基化的PEG结合，得到羧基修饰的DNA特异性纳米磁性提取颗粒，该物质具有磁性且具有生物相容性，能特异性吸附DNA。
采用热裂解法使样品内单增李斯特菌裂解，释出样品内单增李斯特菌的DNA，在醇的作用下，使其与DNA特异性纳米磁性提取颗粒结合，在外加磁场作用下，收集上述磁性粒子，弃去混合液；用水溶解DNA，得到母液后作为模板按特定条件进行PCR检验，电泳观察判断结果。
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例1羧基修饰DNA特异性纳米磁性提取颗粒的制备
25ml 50mg/ml FeSO4·7H2O溶液和25ml 50mg/ml FeCl3·6H2O溶液溶于500ml蒸馏水，40℃恒温水浴边超声边机械搅拌，滴加50ml 0.1mol/L氢氧化钠稀释溶液，之后静置，倒入烧杯，分别用水和乙醇洗涤后，75℃下干燥3h，研磨粉碎。按体积比4∶1∶10的比例配环己烷、TritonX-100及正己醇混合溶液，超声，100mL上述溶液与50mg的研磨后粉末混合，超声，取400μL 28％浓氨水滴加，加正硅酸乙酯(TEOS)2ml，反应24h，静置48h。使用磁性分离柱吸附产物，用乙醇清洗，90℃烘干5h。将20mg/ml产物与0.5mL N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲基硅烷溶于甲醇与丙三醇混合液(甲醇与丙三醇的体积比4∶1)，超声6h，使用磁性分离柱吸附产物，用乙醇清洗，40℃干燥，即得氨基修饰的纳米提取颗粒。将20mg氨基修饰的纳米提取颗粒与2mg 400Da羧基化的PEG分散于50ml去离子水中，加入2.5mgN，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)，搅拌过夜，使用磁性分离柱吸附产物，用去离子水洗涤，得到羧基修饰DNA特异性纳米磁性提取颗粒。
实施例2DNA磁性分离提取
材料：单增李斯特菌ATCC13932株，沙门氏菌NCTC 6017株，金黄色葡萄球菌ATCC 29213株以上菌株均为购买并在上海德诺产品检测有限公司微生物室保存。乳粉由上海德诺产品检测有限公司提供。LB1培养基、LB2培养基和普通肉汤培养基由上海德诺产品检测有限公司提供。
添加检测：取单增李斯特菌ATCC13932株来污染乳粉，取25g样品按LB二次增菌法进行培养，稀释不同梯度，作为待测样品组1，同时平板计数并按GB/T 4789.30.2010验证。取沙门氏菌NCTC 6017株，接种5ml营养肉汤，37℃150r/min培养过夜，用无菌双蒸水稀释不同梯度，作为待测样品组2，同时平板计数并按GB 4789.4-2010验证。取金黄色葡萄球菌ATCC 29213株，接种5ml 7.5％NaCl肉汤培养基，37℃150r/min培养过夜，用无菌双蒸水稀释不同梯度，作为待测样品组3，同时平板计数并按GB 4789.10-2010验证。
将1ml上述3组中待测样品分别如下操作：置于离心管10000r/min离心1min，弃去上清液；用200μl灭菌的去离子水洗涤2次；用100μl灭菌的去离子水悬浮沉淀物，将悬浮液于沸水浴中煮沸10min，10000r/min离心1min，取其上清，备用。取上清液于1.5ml离心管中，向其中加入实施例1得到的羧基修饰DNA特异性纳米磁性提取颗粒0.1ml，震荡，涡旋，充分混匀，再加入1ml 94％异丙醇溶液，涡旋，震荡，充分混匀，放置2min；置于磁力架上，待粒子完全被捕获后，弃去清液；加入1ml 98％乙醇洗涤一遍，弃去清液；加入200μl的去离子水放置10分钟，用磁力架捕获磁珠，待粒子完全被捕获后，吸出清液，即为待测DNA洗脱液。
实施例3单增李斯特菌DNA提取液PCR检测
直接取实施例2制备的待测DNA洗脱液作为模板，采用引物Hly和Iap，进行多重PCR扩增，PCR扩增采用的生工生物工程(上海)有限公司SK2491-PCR扩增试剂盒。
Hly：CCGCCTGCAAGTCCTAA/ACAGGAAGAACATCGGGT；
Iap：GATAAAGCCCAAATAGT/GGACTACTGTTGACGCAA。
PCR体系：
PCR程序：
95℃1min；95℃30s，58.7℃20s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保存。
实施例4扩增产物电泳检测
将实施例3所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。Hly引物及Iap引物均检出特异性条带，则为阳性及可疑阳性结果。无条带检出或仅Hly引物检出条带或仅Iap引物检出条带，则为阴性结果。检测结果参见图1。图1是单增李斯特菌1CFU/25g(mL)基因组DNA经本方法检测结果的电泳图。1为1000bp DNA Marker；2为沙门菌对照；3为单增李斯特菌样品；4为金黄色葡萄球菌对照。结果，样品3为阳性。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.一种羧基修饰DNA特异性纳米磁性提取颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：25ml50mg/ml FeSO4·7H2O溶液和25ml50mg/mlFeCl3·6H2O溶液溶于500ml蒸馏水，40℃恒温水浴边超声边机械搅拌，滴加50ml0.1mol/L氢氧化钠稀释溶液，之后静置，倒入烧杯，分别用水和乙醇洗涤后，75℃下干燥3h，研磨粉碎；按体积比4:1:10的比例配环已烷、TritonX-100及正己醇混合溶液，超声，100mL上述溶液与50mg的研磨后粉末混合，超声，取400μL28%浓氨水滴加，加正硅酸乙酯2ml，反应24h，静置48h；使用磁性分离柱吸附产物，用乙醇清洗，90℃烘干5h；将20mg/ml产物与0.5mL N-（2-氨基乙基）-3-氨基丙基三甲基硅烷溶于甲醇与丙三醇混合液，所述甲醇与丙三醇的体积比为4︰1，超声6h，使用磁性分离柱吸附产物，用乙醇清洗，40℃干燥，即得氨基修饰的纳米提取颗粒；将20mg氨基修饰的纳米提取颗粒与2mg400Da羧基化的PEG分散于50ml去离子水中，加入2.5mg N,N-二异丙基碳二亚胺，搅拌过夜，使用磁性分离柱吸附产物，用去离子水洗涤，得到羧基修饰DNA特异性纳米磁性提取颗粒。
2.一种非诊断目的的高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将生物细胞裂解释放出DNA，得到含有该生物DNA的溶液；
（2）将步骤（1）所得的含有生物DNA的溶液和能够与DNA结合的磁性纳米颗粒混合，该磁性纳米颗粒是权利要求1所述的制备方法制备而得的羧基修饰DNA特异性纳米磁性提取颗粒，在异丙醇的作用下，DNA结合到磁性纳米颗粒表面，在外加磁场作用下，收集磁性纳米颗粒，即为结合了DNA的磁性纳米颗粒；
（3）将步骤（2）收集所得的结合了DNA的磁性纳米颗粒中加水，磁性分离，收集水溶液，即得到分离的生物的DNA溶液；
（4）以步骤（3）得到的DNA溶液为模板，利用目标生物的特异性引物，进行PCR扩增；
步骤（1）中裂解生物细胞的方法是热裂解法，将生物样品在水中煮沸即细胞裂解，释放出DNA；
步骤（2）中所述的异丙醇的加入量是水相溶液体积的19倍，在这种情况下DNA吸附于磁性纳米颗粒表面；
步骤（4）中采用单增李斯特菌的特异性引物来进行扩增，从而检测DNA溶液中是否含有单增李斯特菌的DNA；所述特异性引物为Hly和Iap，PCR扩增条件为：95℃1min；95℃30s，58.7℃20s，72℃20s，30个循环；72℃5min；4℃保存；
Hly上游引物:CCGCCTGCAAGTCCTAA，
Hly下游引物:ACAGGAAGAACATCGGGT，
Iap上游引物:GATAAAGCCCAAATAGT，
Iap下游引物:GGACTACTGTTGACGCAA。
3.一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，包括：
（1）特异性结合DNA的磁性纳米颗粒，该磁性纳米颗粒是权利要求1所述的制备方法制备而得的羧基修饰DNA特异性纳米磁性提取颗粒；
（2）引物Hly和Iap，
Hly上游引物:CCGCCTGCAAGTCCTAA，
Hly下游引物:ACAGGAAGAACATCGGGT，
Iap上游引物:GATAAAGCCCAAATAGT，
Iap下游引物:GGACTACTGTTGACGCAA。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括（3）10×PCR Buffer；dNTP；和Taq DNA聚合酶。
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