CN102292636B

CN102292636B - 鉴定分子的方法

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Publication number: CN102292636B
Application number: CN200980155483.XA
Authority: CN
Inventors: 方晔; A·M·菲里; J·拉稀瑞; E·特兰
Original assignee: Corning Inc
Current assignee: Corning Inc
Priority date: 2008-11-24
Filing date: 2009-11-23
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2029-11-23
Also published as: DK2361388T3; EP2361388B1; CN102292636A; WO2010060019A3; JP2012509667A; WO2010060019A2; US20100130725A1; EP2361388A2

Abstract

药物发现是面临着许多挑战的复杂任务，尤其是高消耗率，由于对疾病、进而对其生物系统、它们的靶标知之甚少，很多有希望的候选物在临床上被证明是无效或毒性的。因此，已形成广泛共识：提高药物发现的产率需要大大加深对于疾病的分子机理的理解，要超越单个基因和蛋白而考虑到药物靶标的全部生物环境。本方法依靠无标记细胞试验，特别是DMR指数的使用，系统化显示任何分子的作用模式、毒性、和靶标与途径。

Description

鉴定分子的方法

要求享有在先美国申请的优先权

本申请要求2008年11月24日提交的美国临时申请系列号61/117,450的权益。该文献以及本文提到的所有出版物、专利和专利文献的全部内容都通过引用纳入本文。

I.背景技术

本公开涉及生物传感器，例如共振波导光栅(RWG)生物传感器或表面等离振子共振(SPR)生物传感器或电子生物传感器，更具体涉及此类生物传感器在鉴定分子中的应用。本公开还涉及分子指数的生成方法和药物发现方法。

II.概述

本公开提供了采用无标记生物传感器细胞试验鉴定分子、和对包括配体在内的分子进行系统生物学和系统药理学分析、以及药物发现的方法、组合物、产品和机制。本公开还提供了为给定分子生成指数的方法、组合物、产品和机制，和采用不同分子指数的比较分析确定任何分子的作用模式的方法。

III.附图简要说明

图1显示了本公开的实施方式中用于药物发现的细胞概况药理学方法的示意图。

图2是本公开的实施方式中用于药物发现的细胞概况药理学方法的示例。

图3A和3B显示了本公开的实施方式中，各为10μM的16种不同配体作用于A549细胞的初级概况。

图4显示了本公开的实施方式中32nM表皮生长因子(EGF)作用于A431静息细胞的初级概况和“载剂”溶液作用于A431细胞的初级概况(阴性对照)的比较。

图5显示了本公开的实施方式中32nM EGF作用于A431静息细胞的初级概况(对照)和各为10μM的4种不同配体的二级概况。在各配体(BML-265、AG1478、U0126、粗糠柴苦素(Rottlerin))预处理细胞约1小时后，通过测量A431细胞对32nM EGF的光学应答获得各二级概况。

图6A、6B和6C显示了通过一组配体对A431静息细胞的32nM EGF诱导光信号的调节概况示例。分析了配体存在和缺乏时A431细胞的EGF DMR信号的三种光学应答参数并对配体作图。所述三种参数为：A431细胞EGFDMR信号的(A)P-DMR(正DMR)幅度、(B)N-DMR(负DMR)幅度、和(C)RP-DMR(恢复正DMR)幅度。用未经任何分子预处理的细胞的DMR信号作为阳性对照(阳性)，而仅用载剂(即试验缓冲溶液)处理的细胞的DMR信号作为阴性对照(缓冲液)。

图7显示了(A)32nM EGF、(B)5μM组胺、(C)1μM烟酸、和(D)2nM肾上腺素，作用于A431静息细胞的初级概况。

图8显示了(A)40μM吡那地尔(pinacidil)、(B)8μM SLIGKV-酰胺、(C)250μg/ml聚(I:C)、(D)8μM佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、(E)10μM组胺、和(F)16μM毛喉素，作用于A549细胞的初级概况。

图9显示了本公开的实施方式中，(A)HA-1077分子作用于A431静息细胞的初级概况，(B)HA-1077分子作用于A549的初级概况，和(C)HA1077的调节指数。通过比较HA1077存在和缺乏时的细胞内标志物诱导的光学应答的特定参数来生成调节指数。正值表明HA-1077增强了细胞内标志物光学信号的特定参数，而负值表明HA-1077抑制或减弱了细胞内标志物诱导信号的特定参数。

图10显示了本公开的实施方式中，(A)H-8分子作用于A431静息细胞的初级概况、(B)H-8分子作用于A549细胞的初级概况、和(C)H-8的调节指数。

图11显示了本公开的实施方式中，(A)LY294002分子作用于A431静息细胞的初级概况、(B)LY294002作用于A549细胞的初级概况、和(C)LY294002的调节指数。

图12显示了本公开的实施方式中，(A)槲皮素分子作用于A431静息细胞的初级概况、(B)槲皮素作用于A549细胞的初级概况、和(C)槲皮素的调节指数。

IV.发明详述

参考附图(如果有的话)详细描述本发明的各种实施方式。对各种实施方式的参考不限制本发明的范围，本发明范围仅受所附权利要求书的范围的限制。此外，在本说明书中列出的任何实施例都不意图构成限制，而仅是列出要求权利的本发明的许多可能实施方式中的一些。

A.定义

1.材料

材料是用于构成物理实体的某种东西(化学的、生物化学的、生物的、或混合的)的有形部分。

2.物质

物质或类似术语是指任何物理实体。材料是物质。分子、配体、标志物、细胞、蛋白质和DNA可视为物质。机器或物品应视为由物质组成，而本身不视为物质。

3.分子

本文所用的术语“分子”或类似术语是指以化学分子或有确定分子量的分子的形式存在的生物或生物化学或化学实体。不论其大小，分子或类似术语是化学、生物化学或生物分子。

很多分子属于称为有机分子(含有碳原子和其它原子，通过共价键连接的分子)的类型，但一些分子不含碳(包括简单的分子气体例如分子氧和更复杂的分子例如一些硫基聚合物)。一般术语“分子”包括大量描述性分子类或组，例如蛋白质、核酸、碳水化合物、类固醇、有机药物、小分子、受体、抗体和脂质。适当的时候，由于所述方法应用于分子亚组，本文中采用这些更具描述性的术语(其中很多，例如“蛋白质”，其本身描述了重叠的分子组)中的一个或多个，但不减损这些分子用作代表一般类别“分子”和所提亚类(例如蛋白质)的意图。除非明确说明，“分子”一词应包括特定的分子及其盐，例如药学上可接受的盐。

4.配体

配体或类似术语是指能与生物分子结合并形成复合物用于生物学目的的物质或组合物或分子。在生物系统中，配体及其靶分子之间实际的不可逆共价连接是罕见的。配体与受体的结合改变了化学构象，即受体蛋白质的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。结合的趋势或强度称为亲和力。配体包括底物、阻断剂、抑制剂、激活剂和神经递质。放射性配体是带放射性标记的配体，而荧光配体是带荧光标记的配体；两者都可视为配体，常用作受体生物学或生物化学研究中的示踪剂。配体和调节剂可互换使用。

5.标志物

标志物(marker)或类似术语是指在生物传感器细胞试验中产生信号的配体。所述信号还必须是至少一种特定的细胞信号途径和/或至少一种特定靶标介导的至少一种特定细胞过程的特征。所述信号可以是阳性、或阴性、或任何组合(例如振荡)。

6.分子混合物

分子混合物或类似术语是指含有至少两种分子的混合物。所述两种分子可以是，但不限于，结构不同(即对映异构体)、或组成不同(例如，蛋白质同种型、糖形、或带有不同聚乙二醇(PEG)修饰的抗体)、或结构和组成不同(例如未纯化的天然提取物、或未纯化的合成化合物)。

7.未知分子

未知分子或类似术语是指具有未知生物/药理/生理/病理生理活性的分子。

8.已知分子

已知分子或类似术语是指具有已知生物/药理/生理/病理生理活性的分子，其精确作用模式可以是已知或未知的。

9.测试分子

测试分子或类似术语是指在获得该测试分子信息的方法中使用的分子。测试分子可以是未知分子或已知分子。

10.药物候选分子

药物候选分子或类似术语是指对其用作药物或药效团的能力进行测试的测试分子。该分子可视为先导分子。

11.调节

调节，或其形式，是指提高、或降低、或维持通过细胞靶标介导的细胞活性。应当理解，在使用这些词语中的一个时，也公开了其可以是比对照提高了，例如，1％、5％、10％、20％、50％、100％、500％、或1000％，或可以是比对照降低了，例如，1％、5％、10％、20％、50％、或100％。

12.调节剂

调节剂或类似术语是指控制细胞靶标活性的配体。它是结合细胞靶标，例如靶蛋白的信号调节分子。

13.已知调节剂

已知调节剂或类似术语是指对至少一种已知靶标具有已知亲和力的调节剂。例如，已知调节剂可以是PI3K抑制剂、PKA抑制剂、GPCR拮抗剂、GPCR激动剂、RTK抑制剂、表皮生长因子受体中和抗体、或磷酸二酯酶抑制、PKC抑制剂或激活剂等。

14.细胞

细胞或类似术语是指外部被半透膜限定的、小的、通常为微观量的原生质，可包括一个或多个核和各种其它细胞器，能独自或与其它类似物质相互作用运行生命的所有基本功能，并形成能独立作用的活性物质的最小结构单元，包括合成细胞构建体、细胞模型系统和类似人工细胞系统。

细胞可包括不同的细胞类型，例如与特定疾病相关的细胞、来自特定来源的细胞类型、与特定靶标相关的细胞类型、或与特定生理功能相关的细胞类型。细胞还可以是天然细胞、工程细胞、转化细胞、永生细胞、原代细胞、胚胎干细胞、成人干细胞、肿瘤干细胞、或干细胞衍生的细胞。

人体由约210种已知的不同细胞类型构成。考虑到细胞的制备(例如工程改造、转化、永生化、或新鲜分离自人体)和获取细胞的来源(例如不同年龄或不同疾病阶段的人体等)，细胞类型几乎是无限的。

15.基体

基体或类似术语是可以使其它东西按某些规则产生、成形、或发展的某些东西。所述基体可以对进行分析的方式和所得结果的质量有显著影响。例如，在本公开的实施方式中，用于为鉴定分子选择一组细胞的基体包括，但不限于，例如特定的疾病(例如引起过敏反应、或炎性疾病、或致病感染、或乳腺癌、或皮肤癌、或结肠癌、或肝病、或胰腺癌、或心脏病等的各种细胞)、或特定的来源(例如，各种神经元细胞、或肺细胞、或皮肤细胞、或肌肉细胞、或肝细胞等)、或特定的细胞靶标(例如，受体、或酶、或激酶、或癌基因、或结构蛋白、或DNA、或RNA)、或人生理或病理生理代表性的广泛的细胞类型(例如，由角化上皮细胞、Wet复层屏障上皮细胞、外分泌上皮细胞、激素分泌细胞、代谢和储存细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、上皮细胞内层封闭的内部体腔、有推进功能的纤毛细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、感觉传导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、生殖细胞、抚育细胞和间隙细胞)。在另一种实施方式中，可以用至少两种细胞的混合群体作为细胞系统。

16.细胞培养

“细胞培养”是指原核或者真核细胞在受控条件下生长的过程。“细胞培养”不单指衍生自多细胞真核生物的细胞，特别是动物细胞的培养，也指复合组织和器官的培养。

17.生物传感器

生物传感器或类似术语是指用于检测分析物的结合了生物组件和理化检测器组件的装置。生物传感器通常由三部分组成：生物组件或元件(例如组织、微生物、病原体、细胞、或其组合)、检测器元件(以理化方式例如光学、压电、电化学、热学或磁力运作)、和与两种组件关联的换能器。生物组件或元件可以是，例如，活细胞、病原体或其组合。在实施方式中，光学生物传感器可以包括将活细胞、病原体、或其组合中的分子识别或分子刺激事件转化成可量化信号的光换能器。

18.试验

试验或类似术语是指用以确定物质如分子或细胞特征的分析，例如细胞受一种或多种外源刺激如配体或标志物刺激时光学或生物阻抗应答的存在、缺乏、量、程度、动力学、动态学或类型。细胞对刺激的应答产生生物传感器信号可以是试验。

19.长期试验

“长期试验”或类似术语用于研究给定分子对活细胞的长期影响。一种具体的长期试验是“长期生物传感器细胞试验”。”在一种实施方式中，每个类型的细胞仅暴露于分子中一段校长时间(例如，8小时、16小时、24小时、32小时、48小时、72小时)。这一长期试验用于确定分子对细胞健康状态(例如，活力、凋亡、细胞周期调节、细胞粘附调节、增殖)的影响。这一长期试验还包含可直接用于分子诱导细胞信号事件或途径研究的早期细胞信号应答(例如，分子刺激后30分钟、60分钟、120分钟、180分钟)。

在另一种实施方式中，标志物存在下的长期生物传感器细胞试验被用于交叉调节分子和标志物对细胞生物学和生理学的长期影响。所述标志物的添加可以在所述分子之前、同时、和之后。例如，当标志物(例如，H₂O₂)引发细胞组中至少一种细胞的凋亡时，可以采用这种长期试验确定分子是否是保护性的。反之，这种长期试验也可用于确定标志物对分子诱导的细胞事件(例如，凋亡、或坏死)的保护或协同作用。

20.短期试验

“短期试验”或类似术语用于研究给定分子对活细胞的短期影响。一种具体的短期试验是“短期生物传感器细胞试验”。在一种实施方式中，每个类型的细胞仅暴露于所述分子中一段较短时间(例如，5分钟、10分钟、30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、180分钟、240分钟)。这一短期试验常用于检测早期细胞信号应答，其可直接用于研究分子诱导细胞信号事件或途径或研究分子对标志物诱导的细胞应答的调节能力。

21.两步试验

“两步试验”或类似术语是指，细胞组中的每种细胞先暴露于分子以研究分子诱导的生物传感器信号，然后通过特定的标志物或一组标志物研究分子调节标志物诱导的生物传感器信号的能力。这一试验可称为双模式试验：如初始的激动模式和后续的拮抗模式，分子的作用模式(例如，靶标、激动和拮抗、和效能或功效)。

22.激动和拮抗模式

激动模式或类似术语是指细胞暴露于分子以确定所述分子引起生物传感器信号如DMR信号的能力的试验，而拮抗模式是指在分子存在时细胞暴露于标志物以确定所述分子对细胞应答所述标志物的生物传感器信号的调节能力的试验。

23.脉冲刺激试验

“脉冲刺激试验”或类似术语可用于细胞仅暴露于分子中极短时间(例如，数秒、或数分钟)的情况。这种脉冲刺激试验可用于研究分子作用于细胞/靶标的动力学，及其对标志物诱导的生物传感器信号的影响。可以通过在添加分子后的给定时间用液体操作装置简单地将分子溶液替换成细胞试验缓冲液来进行脉冲刺激试验。

24.处理

处理或类似术语可至少以两种方式使用。首先，处理或类似术语可以指施用或作用于对象。其次，处理或类似术语可以指将任何两种物品，例如任何两种或多种物质如分子和细胞，混合到一起。这种混合把至少两种物质汇集到一起使它们之间发生接触。

当处理或类似术语用于有疾病的对象时，并不意味治愈或甚至例如症状的减轻。当治疗或类似术语与处理或类似术语一起使用时，是指潜在疾病的症状被减轻，和/或一种或多种潜在的细胞、生理、或生化原因或引起症状的机理被减轻。应当理解，本文使用的减轻是指相对疾病的状态而言，包括疾病的分子状态，而不仅指疾病的生理状态。

25.接触

接触或类似术语是指，若至少两种物品，例如分子、细胞、标志物、至少一种化合物或组合物、或至少两种组合物、或这些中的任意一种和产品或机器间的分子可能相互作用，使相互靠近从而能发生分子相互作用。例如，接触是指将至少两种组合物、分子、物品、或东西接触，使其接近以混合或碰触。例如，有组合物溶液A和培养的细胞B并将组合物溶液A倾倒到培养的细胞B上，使组合物溶液A与细胞培养B接触。用配体接触细胞将把配体带到细胞确保细胞能得到配体。

应当理解本文公开的任何物品可与任何其它物品接触。例如，可以使细胞接触标志物或分子、生物传感器等。

26.引发

引发或类似术语是指引起或启动事件如应答的行为。

27.检测

检测或类似术语是指本公开中的设备和方法发现或感应分子或标志物诱导的细胞应答和区分对不同分子感应到的应答的能力。

28.应答

应答或类似术语是指对任何刺激的任何反应。

29.细胞应答

“细胞应答”或类似术语是指细胞对刺激的任何反应。

30.生物传感器应答

“生物传感器应答”、“生物传感器输出信号”、“生物传感器信号”或类似术语是指具有细胞的传感器系统对细胞应答的任何反应。生物传感器将细胞应答转化成可量化的传感器应答。生物传感器应答是由光生物传感器例如RWG或SPR测得的对刺激的光学应答或者是由电生物传感器测得的细胞对刺激的生物阻抗应答。因为生物传感器应答与细胞对刺激的应答直接相关，在公开的实施方式中，生物传感器应答和细胞应答可以互换使用。

31.DMR应答

“DMR应答”或类似术语是指采用光生物传感器的生物传感器应答。DMR是指动态物质再分布或动态细胞物质再分布。P-DMR是表明感应区内物质增加的正DMR应答，N-DMR是表明感应区内物质减少的负DMR应答，RP-DMR是表明刺激事件后物质再分布回复基础水平的回复P-DMR。

32.应答试验

“应答试验”或类似术语是指采用方法来鉴定应答。例如，若使分子与细胞接触，可以采用生物传感器测试细胞对暴露于所述分子的应答。

33.概况

概况或类似术语是指对组合物，例如细胞采集到的数据。如本文所述，概况可以从无标记的生物传感器采集。

34.初级概况

“初级概况”或类似术语是指当分子接触细胞时产生的生物传感器应答或生物传感器输出信号或概况。通常，在将初始细胞应答对净零生物传感器信号(即基线)标准化以后获得初级概况。

35.二级概况

“二级概况”或类似术语是指细胞在分子存在时对标志物应答的生物传感器应答或生物传感器输出信号。二级概况可以用作分子对标志物诱导的细胞应答或生物传感器应答的调节能力的指示剂。

36.调节概况

“调节概况”或类似术语是指标志物在分子存在时的二级概况和标志物在不存在任何分子时的初级概况之间的比较。例如，所述比较可以通过从二级概况中减去初级概况或从初级概况中减去二级概况或将二级概况对初级概况进行标准化。

37.库

库或类似术语是指集合。库可以是本文公开的任何物品的集合。例如，它可以是指数的集合，指数库；它可以是概况的集合，概况库；或者它可以是DMR指数的集合，DMR指数库；同样，它可以是分子的集合，分子库；它可以是细胞的集合，细胞库；它可以是标志物的集合，标志物库；例如，库可以是随机或非随机的，确定或不确定的。例如，公开了已知调节剂的DMR指数库或生物传感器指数库。

38.组

组或类似术语是指预先确定的整套样本(例如，标志物、或细胞、或途径)。可以从库中选取样本产生组。

39.标志物组

“标志物组”或类似术语是指包括至少两种标志物的组。所述标志物可以针对不同的途径、相同的途径、不同的靶标、或甚至相同的靶标。

40.细胞组

“细胞组”或类似术语是指包括至少两种细胞的组。所述细胞可以是本文公开的任何种类的细胞或组合。

41.在分子存在下

“在分子存在下”或类似术语是指将培养的细胞接触或暴露于分子。所述接触或暴露可以在细胞接触刺激之前、或同时发生。

42.生物传感器信号

“生物传感器信号”或类似术语是指生物传感器测得的由细胞受刺激下的应答产生的细胞信号。

43.DMR信号

“DMR信号”或类似术语是指光生物传感器测得的由细胞受刺激下的应答产生的细胞信号。

44.标准化

标准化或类似术语是指，调整数据、或概况、或应答以消除至少一个共变量。例如，若产生了两种应答，一种针对作用于细胞的标志物且一种针对作用于细胞的标志物与分子，标准化是指比较没有分子时标志物诱导的应答和存在分子时的应答，并消除后仅由标志物引起的应答，使得标准化的应答代表由于分子对标志物的调节造成的应答。通过在分子存在下标准化标志物的初级概况和标志物的二级概况(调节概况)得到调节比较。

45.对照

术语对照或“对照水平”或对照细胞“或类似术语定义为测量变化的标准，例如对照不进行实验，而是进行整套确定的参数，或对照是基于处理前或处理后的水平。它们或者与测试平行进行，或者在之前或之后进行，或者它们可以是预先确定的标准。例如，对照可以指对象或客体在除了略去受测过程或试剂以外按平行实验处理的实验所得结果，该结果用作比较实验效果的标准。因此，对照可以用来确定与过程或试剂或变量等相关的效果。例如，若所研究的是测试分子对细胞的影响，可以a)简单地记录细胞在分子存在下的特征，b)添加具有已知活性或无活性的对照分子、或对照组合物(例如，试验缓冲溶液(载剂))并记录影响，然后将测试分子的影响与对照进行比较。在某些情况中，一旦进行了对照，所述对照就可用作标准，不再进行对照实验，而在另一些情况中每当要作出比较时都应平行进行对照实验。

46.阳性对照

“阳性对照”或类似术语是一种对照，其显示能产生数据采集的数据采集条件。

47.调节比较

“调节比较”或类似术语是初级概况和二级概况标准化的结果。

48.指数

指数或类似术语是指数据的集合。例如，指数可以是含有一种或多种调节概况的列表、表格、文件、或编目。应当理解，可以由任何数据组合生成指数。例如，DMR概况可以有P-DMR、N-DMR和RP-DMR。可以采用完整的概况数据、P-DMR数据、N-DMR数据、RP-DMR数据、或其中的任意点、或这些数据的组合或其它数据生成指数。指数是任何此类信息的集合。通常，在比较指数时，所述指数是类似数据，即P-DMR对P-DMR数据。

49.生物传感器指数

“生物传感器指数”或类似术语是由生物传感器数据的集合构成的指数。生物传感器指数可以是生物传感器概况，例如初级概况、或二级概况的集合。所述指数可以包含任何种类的数据。例如，概况的指数可以只包括N-DMR数据点，它可以是P-DMR数据点、或者两种都有或者它可以是阻抗数据点。它可以是与概况曲线相关的所有数据点。

50.DMR指数

“DMR指数”或类似术语是由DMR数据的集合构成的指数。

51.分子生物传感器指数

“分子生物传感器指数”或类似术语是由对分子采集的数据生成的生物传感器指数。例如，分子生物传感器指数可以由分子作用于细胞组的概况、和分子针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

52.分子DMR指数

“分子DMR指数”或类似术语是通过对分子采集的数据生成的DMR指数。例如，分子生物传感器指数可以由分子作用于细胞组的概况、和分子针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

53.分子指数

“分子指数”或类似术语是涉及分子的指数。

54.调节剂生物传感器指数

“调节剂生物传感器指数”或类似术语是由对调节剂采集的数据生成的生物传感器指数。例如，调节剂生物传感器指数可以由调节剂作用于细胞组的概况、和调节剂针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

55.调节剂DMR指数

“调节剂DMR指数”或类似术语是通过对调节剂采集的数据生成的DMR指数。例如，调节剂DMR指数可以由调节剂作用于细胞组的概况、和调节剂针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

56.分子调节指数

“分子调节指数”或类似术语是指显示分子对标志物组作用于细胞组的生物传感器输出信号的调节能力的指数。通过把分子存在下受标志物刺激的细胞应答的特定生物传感器输出信号参数对没有任何分子时的情况进行标准化而生成调节指数。

57.已知调节剂生物传感器指数

“已知调节剂生物传感器指数”或类似术语是由对已知调节剂采集的数据生成的调节剂生物传感器指数。例如，已知调节剂生物传感器指数可以由已知调节剂作用于细胞组的概况、和已知调节剂针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

58.已知调节剂DMR指数

“已知调节剂DMR指数”或类似术语是由对已知调节剂采集的数据生成的调节剂DMR指数。例如，已知调节剂DMR指数可以由已知调节剂作用于细胞组的概况、和已知调节剂针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

59.标志物生物传感器指数

“标志物生物传感器指数”或类似术语是由对标志物采集的数据生成的生物传感器指数。例如，标志物生物传感器指数可以由标志物作用于细胞组的概况、和标志物针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

60.标志物DMR指数

“标志物DMR指数”或类似术语是由对标志物采集的数据生成的生物传感器DMR指数。例如，标志物DMR指数可以由标志物作用于细胞组的概况、和标志物针对标志物组的调节概况构成，每组标志物针对细胞组中的一种细胞。

61.指数相似性

“指数相似性”或类似术语是表达针对分子的两种指数之间、或至少三种指数之间基于指数的模式、和/或分数矩阵的相似性的术语。分数矩阵与其对应物密切相关，例如在相应细胞中不同分子的初级概况的特征，和不同分子对各标志物的调节概况的本质和百分比。例如，给予更相似的特征更高的分数，给予不相似的特征较低或负的分数。因为分子调节指数只有三种调节类型，正、负和中性，相似性矩阵相对简单。例如，简单的矩阵可以给相同的调节(例如正调节)评分为+1，给不同的调节评分为-1。

或者，可以给具有不同水平的一种调节类型不同的分数。例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、100％、200％等的正调节可以相应评分为+1、+2、+3、+4、+5、+6、+10、+20。相反，对于负调节，可以给出相似但相反的评分。根据这一方法，图9C显示了HA-1077针对标志物组的调节指数，表明PKA/PKG抑制剂HA1077差异性地调节不同标志物诱导的生物传感器应答：在A549细胞中：吡那地尔(pinacidil)(-86％)、聚(I:C)(+18％)、PMA(+36％)、SLIGKV-酰胺(+22％)、毛喉素(+18％)、组胺(早期P-DMR，+26％)、组胺(后期P-DMR，+55％)；和在A431静息细胞中，肾上腺素(-38％)、烟酸(+8％)、EGF(P-DMR，+19％)、EGF(N-DMR，-20％)、和组胺(-50％)。因此，HA1077调节指数的协同评分可以定为(-8.6，1.8，3.6，2.2，1.8，2.6，5.5，-3.8，0.8，1.9，-2，-5)。另一方面，对于H8，其协同评分为(-7.2，1.8，2.2，3.2，2，3.8，6.5，-1.6，1，0.3，-2，1.6)。

HA1077和H8指数的比较可以基于(1)简单评分矩阵，其中它们在A549和A431中的初级指数是相似的(评分为+1，+1)，和调节指数相似(评分为+1，+1，+1，+1，+1，+1，+1，+1，+1，+1，+1，-1)；(2)基于比例的分数矩阵，其中两者的协同评分相似但不相同，可能是由于它们作用于细胞靶标的效力不同。值得注意的是，两项指数都采用相同剂量(10μM)产生；(3)采用显著的调节概况(例如吡那地尔应答)分选，其中两种分子产生相似的调节。综合考虑，可以总结出在检测的两种细胞系中HA1077和H8都显示相似的初级作用模式。类似的，在检测的两种细胞系中LY294002和槲皮素也都显示相似的初级作用模式。但是，HA1077/H8和LY294002/槲皮素显示不同的作用模式。

62.鉴定

鉴定或类似术语是指收集关于物质，例如配体、分子、标志物或细胞的任何性质的信息，例如获得配体、分子、标志物或细胞的概况。

63.增强

增强、被增强或类似术语是指由分子导致的细胞内标志物的生物传感器应答的特定参数的提高。通过比较标志物的初级概况和分子存在下相同标志物在相同细胞内的二级概况，可以计算出分子对细胞的标志物诱导生物传感器应答的调节。正调节是指分子导致标志物诱导的生物传感器信号的提高。

64.更高和抑制和类似词语

术语更高、提高、提升或升高或类似术语或这些术语的变形是指提高到基础水平以上，例如与对照相比。术语低、更低、减少、降低或缩减或类似术语或这些术语的变形是指降低到基础水平以下，例如与对照相比。例如，在向细胞内添加分子例如激动剂或拮抗剂之前或不存在添加时基础水平是正常体内水平。抑制或抑制形式或类似术语是指降低或遏制。

65.分子药理学

分子药理学或类似术语是指分子作用于细胞的系统细胞生物学或系统细胞药理学或作用模式。通常通过，但不限于，毒性、影响特定细胞过程(例如，增殖、分化、活性氧物质信号传导)的能力、或调节特定细胞靶标(例如，PI3K，PKA，PKC，PKG，JAK2，MAPK，MEK2，或肌动蛋白)的能力鉴定分子药理学。

66.受体

受体或类似术语是指包埋在细胞的质膜或胞质内的，可以结合移动的信号传导(或“信号”)分子的蛋白分子。与受体结合的分子称为“配体”，并可以是肽(例如神经递质)、激素、药物、或毒素，当发生这种结合时，受体发生的构象变化通常启动细胞应答。但是，一些配体只是阻断受体而不引起任何应答(例如拮抗剂)。配体诱导的受体变化导致生理变化，这构成配体的生物活性。

67.细胞靶标

“细胞靶标”或类似术语是指能通过外部刺激改变活性的生物聚合物例如蛋白质或核酸。细胞靶标最常见的是蛋白质例如酶、激酶、离子通道和受体。

68.信号传导途径

“确定的途径”或类似术语是指从接收信号(例如外源配体)到细胞应答(例如细胞靶标表达的提高)的细胞途径。在一些情况中，配体与受体结合导致的受体激活与细胞对配体的应答直接偶联。例如，神经递质GABA能激活作为离子通道的一部分的细胞表面受体。GABA与神经元上GABA A受体的结合打开了是受体的一部分的氯选择性离子通道。GABA A受体激活使带负电的氯离子能移动进入神经元从而抑制神经元产生动作电位的能力。但是，对于很多细胞表面受体，配体受体相互作用不直接与细胞应答关联。在配体产生对细胞行为的最终生理效应之前，激活的受体必须首先与细胞内的其它蛋白质相互作用。通常，一系列相互作用的细胞蛋白质的行为在受体激活后被改变。由受体激活诱导的整套细胞变化称为信号传导机理或途径。信号传导途径可以是比较简单或相当复杂的。

69.经分子处理的细胞

经分子处理的细胞或类似术语是已暴露于分子的细胞。

70.细胞过程

细胞过程或类似术语是指在细胞内或通过细胞发生的过程。细胞过程的例子包括，但不限于，增殖、凋亡、坏死、分化、细胞信号传导、极性变化、迁移或转化。

71.“时间段”

“时间段”是指代表时间推移的任何期间。例如，1秒、1分钟、1小时、1天和1年都是时间段。

72.“短的时间段”

“短的时间段”或类似术语是指在1分钟到300分钟之间的时间段。

73.“另一时间段”

“另一时间段”或类似术语是指在一个时间段后相继发生的时间段。

74.“整个细胞组和针对标志物组”

短语“整个细胞组和针对标志物组”是指检测分子作用于细胞组内各细胞的初级概况以及分子调节标志物组的调节概况的系统过程。对于标志物/细胞对，所述过程首先从检测分子独立作用于每个类型细胞的初级概况开始，然后检测相同细胞内标志物在分子存在下的二级概况。术语“针对”具体用于表示分子调节标志物诱导的生物传感器应答的能力。

75.分子作用模式的指示剂

“指示剂”或类似术语是进行指示的东西。具体地，“分子作用模式的指示剂”是指能被理解为分子和熟知调节剂具有相似作用模式的事物，例如分子的生物传感器指数与公知调节剂指数相比较的相似性。

76.“特定人生理或病理生理的代表”

“代表”或类似术语是某种类型或种类东西的示例或典型。例如，认为人肺癌细胞系A549的细胞特征代表人肺癌的生理；因此，A549用作研究人肺癌的细胞生物学和生理学的模型细胞系。

77.“长期生物传感器信号”

“长期生物传感器信号”是长期试验产生的生物传感器信号。

78.“长期DMR信号”

长期DMR信号或类似术语是指长期光生物传感器细胞试验产生的光生物传感器信号。

79.淘选

淘选或类似术语是指筛选存在一种或多种受体或细胞靶标的细胞。

80.“强生物传感器信号”

“强生物传感器信号”是指生物传感器信号幅度显著超过噪音水平或阴性对照应答(例如3x，10x，20x，100x，或1000x)。阴性对照应答通常是添加试验缓冲溶液(即载剂)后细胞的生物传感器应答。噪音水平是不另外添加任何溶液时细胞的生物传感器信号。值得注意的是，在添加任何溶液前，细胞总是被溶液覆盖。

80.“强DMR信号”

“强DMR信号”或类似术语是指“强生物传感器信号”的DMR形式。

82.效能

效能或类似术语是用产生给定强度效应所需的量表述的分子活性的度量。例如，高效能药物在低浓度引起较高的应答。效能和亲和力与功效成比例。亲和力是药物分子与受体结合的能力。

83.功效

功效或类似术语是指在理想或最优条件下产生所需规模的效应的能力。这些条件区分了功效和相关的有效性概念，后者涉及在现实条件下的改变。功效是受体占用和启动分子、细胞、组织或系统水平应答的能力之间的关系。

84.确定的途径

“确定的途径”或类似术语是指特定的途径，例如Gq途径、Gs途径、Gi途径、EGFR途径或PKC途径。

85.网状相互作用

“网状相互作用”或类似术语是指至少两种特定信号传导级联反应或途径间的相互作用。例如，A431细胞内缓激肽B2受体的激活影响至少两种信号传导途径：Gq和Gs途径，其中这两种途径能相互交叉调节。这种交叉调节就是一种网状相互作用。另一个例子是A431细胞内的EGFR信号传导，它涉及复杂的多组成信号传导途径。这些途径提供了反馈、信号扩增、和细胞内多种信号和信号传导途径之间相互作用的机会，主要通过网状相互作用。

86.化学生物学方法

“化学生物学方法”或类似术语是指涉及应用化学技术和工具，通常是合成化学生成的化合物，进行生物系统的研究和操控的科学方法。一些形式的化学生物学尝试通过在化学水平直接探测活的系统来回答生物学问题。与采用生物化学、遗传学或分子生物学这些能突变产生新的感兴趣生物体或细胞的研究相反，化学生物学研究有时采用为特定目的设计或在基于生化或细胞筛选的基础上鉴定的小分子在体内或体外探测系统。

87.细胞生物学方法

“细胞生物学方法”或类似术语是指涉及研究细胞-其生理学特性、结构、所含细胞器、与环境的相互作用、生命周期、分裂和死亡的科学方法。这在显微和分子水平上完成。知晓细胞的组成和细胞如何工作是所有生物科学的基础。

88.生物传感器细胞试验为核心的细胞概况药理学

“生物传感器细胞试验为核心的细胞概况药理学”或类似术语是采用无标记生物传感器细胞试验确定分子的药理学的方法。

89.系统生物学

“系统生物学”或类似术语是指在生物学过程发挥作用的复杂生理环境中对这些过程的‘系统化’调查。

90.系统药理学

“系统药理学”或类似术语是指用系统生物学探索药理学目标。

91.调节标志物的生物传感器信号

“调节生物传感器信号”或类似术语是指使细胞应答标志物刺激的生物传感器信号或概况发生改变。

92.调节DMR信号

“调节DMR信号”或类似术语是指使细胞应答标志物刺激的DMR信号或概况发生改变。

93.(药物候选分子的)直接作用

“直接作用”或类似术语是指(药物候选分子)独立作用于细胞的结果。

94.细胞概况药理学

“细胞概况药理学”或类似术语采用无标记生物传感器，特别是光生物传感器，产生细胞对单独刺激或与刺激与分子一起的应答的初级概况，和细胞在没有分子时对单独刺激或与标志物分子组一起的应答的二级概况。初级概况和二级概况的集合、及其所得调节概况被独立或集中用于确定分子的药理学。

95.细胞/标志物在没有和存在分子时的动力学应答

“细胞/标志物在没有和存在分子时的动力学应答”或类似短语是指在没有和存在分子时标志物诱导的细胞应答的整个试验或部分试验的时间系列，采用例如模式识别分析，其可直接用于检测分子的药理学或作用模式。

96.结合

“结合”、“附着”、“粘附”、“粘着”、“贴壁”、“固定化”、或类似术语一般指例如，表面修饰物质、相容剂、细胞、配体候选分子、和本公开的类似实体通过物理吸附、化学结合、和类似过程或其组合固定化或固着在表面上。具体而言，“细胞附着”、“细胞粘着”或类似术语是指细胞与表面的相互作用或结合，例如通过培养、或与细胞锚定材料、相容剂(例如纤连蛋白、胶原蛋白、核纤层蛋白、明胶、聚赖氨酸等)相互作用、或两者一起。“贴壁细胞”、“固定化细胞”、或类似术语是指保持与基底外表面结合、固定或某种接触的细胞、细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。这类细胞在培养后能承受或经受清洗和介质交换过程而保持附着，这些过程是很多基于细胞的试验的先决条件。

97.弱贴壁细胞

“弱贴壁细胞”是指在细胞培养中与基底表面相互作用、结合、或接触较弱的细胞、细胞系或细胞系统，例如原核或真核细胞。但是，这些类型的细胞，例如人胚胎肾(HEK)细胞通过清洗或培养基交换的物理扰动方式从基底表面脱离。

98.悬浮细胞

“悬浮细胞”是指优选在培养基中培养，其中细胞在培养过程中不附着或粘着在基底表面的细胞或细胞系。但是，悬浮细胞通常可以通过化学(例如共价结合、或抗体-细胞表面受体相互作用)、或物理方式(例如，由于重力作用沉降到包埋了生物传感器的孔底部)与生物传感器表面接触。因此，悬浮细胞也可用于生物传感器细胞试验。

99.对象

全文中使用的对象或类似术语是指个体。因此，“对象“可以包括，例如驯养的动物如猫、狗等，牲畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)和哺乳动物、人以外的哺乳动物、灵长动物、人以外的灵长动物、啮齿动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其它动物。在一个方面，对象是哺乳动物，例如灵长动物或人。对象可以不是人。

100.可选的

“可选的”或“可选地”或类似术语表示随后描述的事件或情形可以发生或不发生，而且该描述包括事件或情形发生的实例和事件或情形不发生的实例。例如，短语“可选地，组合物可以包含组合”是指组合物可以包含不同分子的组合或不包含组合，从而说明书包括了组合和不存在组合(例如组合中单独的成员)。

101.一

除非上下文中有明确的另外说明，在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“该”或类似术语包括复数指示物。因此，例如“一种药学载体”包括两种或更多载体的混合物等。

102.缩写

可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hr”、表示克的“g”或“gm”、表示毫升的“mL”、表示室温的“rt”、表示纳米的“nm”、表示摩尔的“M”以及类似缩写)。

103.范围

在本文中，范围可以表述为自“约”一具体值始和/或至“约”另一具体值止。表述这样的范围时，另一种实施方式包括自一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，用先行词“约”将数值表达为近似值时，应该理解，该具体值构成另一实施方式。应该进一步理解，范围的各端点不论与另一端点相关还是独立于该另一端点，都是有意义的。还应理解，在此公开了许多数值，每个数值也都公开为“约”具体值，还包括数值本身。例如，如果公开数值“10”，则也公开“约10”。还应理解，当数值公开为“小于或等于”该值，“大于或等于”该值时，也公开如由技术人员适当理解的数值之间可能的范围。例如，如果公开数值“10”，则也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在通篇申请中，提供了许多不同格式的数据，这些数据代表终点和起点以及由这些数据点的任意组合的范围。例如，如果公开具体数据点“10”和具体数据点“15”，应理解，可以认为公开了大于、大于或等于、小于、大于或等于、以及等于“10”和“15”、以及在10-15之间。还应理解，还公开了两个具体单元之间的每个单元。例如，如果公开10和15，则也公开了11，12，13和14。

104.包含

在本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”和该词语的其它形式，如“含有”和“包括”，意味着“包括但不限于”并且不意图排除例如其它添加剂、组分、整数、或步骤。

105.主要由……组成

实施方式中的“主要由……组成”指例如表面组合物、在本公开的生物传感器、制品、装置、或设备表面上制作或使用表面组合物、制剂或组合物的方法，还可包括权利要求中列出的组分或步骤，以及实质上不影响组合物、制品、设备和制造使用本公开的方法中任何一项的基本新性质的其它组分或步骤，如所选的特定反应物、特定添加剂或成分、特定试剂、特定细胞或细胞系、特定表面调节剂或表面条件、特定候选配体、或类似结构、材料或过程变量。可对本发明的组分或步骤的基本性质产生实质影响或可赋予本发明不希望出现的特征的项目包括例如，细胞对生物传感器表面的亲和力降低、刺激对细胞表面受体或胞内受体的异常亲和力、对候选配体或类似刺激的应答的不规则或相反细胞活性、和类似特征。

106.稳定

在用于药物组合物时，术语“稳定”或类似术语一般在本领域理解为表示在特定保存条件下经过给定的期间活性成分的损失低于一定量，通常为10％。组合物被认定为稳定所需要的时间和各产品的用途有关，并由生产所述产品、保持以进行品质控制和检查、运输到批发商或直接到消费者在其最终使用前被再次保存的商业化实践所确定。包括数月时间的安全因子，药物的最短产品寿命一般是一年，优选超过18个月。本文所用术语“稳定”参考了这些市场现实和在容易实现的环境条件例如2℃-8℃冷藏下保存与运输产品的能力。

107.组分

公开了本文所述方法中使用的用于制备所公开组合物的组分和组合物本身。本文公开了这些和其它的材料，应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互关系、组等等而未明确地具体提及这些分子的每个不同的单独的和集合的组合以及这些分子的排列组合时，在本文中具体设想和描述了它们中的每一种情况。因此，如果公开了一类分子A、B、和C且公开了一类分子D、E、和F和分子组合的实施例A-D，则即使没有分别列举每个单独地和集合地视为有意义的组合，也应当认为公开了A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、和C-F。同样，还公开这些组合的任意子集或组合。因此，举例来说，应认为已公开亚组A-E、B-F和C-E。此观念可适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开的组合物的方法。因此，如果存在可进行的多个附加步骤，应当理解可通过所公开方法的任一特定实施方式或实施方式的组合来进行这些附加步骤中的每一个。

108.模拟

本文所用的“模拟”或类似术语是指执行参考对象的一种或多种功能。例如，分子模拟物执行分子的一种或多种功能。

109.或

本文所用的词语“或”或类似术语表示特定列表中的任意成员且还包括该列表中成员的任意组合。

110.出版物

整篇申请中，引用了多个出版物。这些出版物公开的全部内容通过引用纳入本申请中以更完整地描述本申请所属领域的状态。所公开的参考文献基于其讨论中所包含的物质也被单独地和具体地通过引用纳入本文。

111.样品

样品或类似术语是指按本文所述进行试验的动物、植物、真菌等；天然产物、天然产物提取物等；动物的组织或器官；细胞(在对象内的、或直接取自对象、或在培养物中维持的细胞或来自培养细胞系的细胞)；细胞裂解物(或裂解物的部分)或细胞提取物；或含有一种或多种来自细胞或细胞材料的分子(例如多肽或核酸)的溶液。样品还可以是含有细胞或细胞组分的体液或分泌物(例如，但不限于血液、尿液、粪便、唾液、泪液、胆汁)。

112.约

本公开的实施方式中采用对例如，组合物中成分的量、浓度、体积、过程温度、过程时间、产率、流速、压力、和类似数值，及其范围进行修饰的约是指可能发生的数值量的改变，例如，由于制备化合物、组合物、浓缩物或使用制剂所用的常规测量和操作过程；由于这些过程中的偶然性误差；由于用来进行所述方法的起始材料或成分的生产、来源或纯度的差异；和类似因素。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的陈化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。无论是否受术语“约”修饰，所附权利要求书均包括这些量的等同形式。

113.数值

组分、成分、添加剂、细胞类型、标志物和类似方面的公开的具体和优选数值及其范围仅用于说明，它们不排除其它定义数值或定义范围内的其它数值。本发明的组分、设备和方法包括具有本文所述的任何数值或数值的任何组合、具体数值、更具体数值和优选数值的组分、设备和方法。

因此，本文公开的方法、组合物、制品、和机器可以以包含或由其组成、或基本由其组成的方式组合本文讨论的不同组分、步骤、分子和组合物等。例如，它们可用于本文定义的分子包括配体的鉴定方法；本文定义的产生指数的方法；或本文定义的药物发现的方法。

114.复合物和组合物

复合物和组合物在本领域中具有标准含义。应当理解，在任何情况下，具体名称，例如分子、物质、标志物、细胞、或试剂，都公开了包含这些名称、由其组成、和基本由其组成的组合物。因此，当使用具体名称标志物时，应当理解还公开了包含该标志物，由该标志物组成、或基本由该标志物组成的组合物。在适当之处，当给出具体的名称时，应当理解也公开了该名称的复合物。例如，当公开具体的生物材料，例如EGF时，EGF的复合物形式也被公开。

B.组合物、方法、产品、和机器

医药和生物技术受到看似相反目标的挑战：(1)达到更低的新药损耗率和(2)缩短新药进入市场的引入时间。药物发现要求从近乎无限量的化学实体中选出具有所需药理和生理品质的隐蔽分子。不幸的是，药物的选择可以是成本极高且本质上低效的过程。尽管在先进技术上有大量投入，近年中新药批准的数量仍很低。目前的研发生产能力的缺口-医药研发花费相对于每年引入的候选新药数量的增加-已经引起广泛关注，对于该问题及其可能的解决方法有不同意见。

基因组和蛋白质组的最新发展显著增加了新药的潜在靶标数量，这加剧了上述形势。尽管此前针对已知靶标有过成功，但靶标取向的药物发现技术往往不能针对新的靶标(即不是以前药物靶标的分子)提供药物。重要的是，过去十年中全行业平均每年只有两到三个针对这些“创新型”靶标的小分子药物。因此，很多公司重新检查用于药物发现和开发的工具、技术和操作。这种反省突出了对基于系统生物学和系统药理学的药物作用的评估和验证的需求，和对更多生理相关技术的需求，特别是在药物发现中。

1.鉴定分子的方法

本文公开了采用无标记生物传感器细胞试验进行药物发现的方法。具体而言，本文公开了用于药物发现的涉及以无标记生物传感器细胞试验为核心的细胞概况药理学的方法。本方法涉及使用无标记生物传感器，通过直接监控候选药物分子对代表人生理学和人病理生理学的不同种类细胞组的作用，确定候选药物分子的系统细胞药理学，以及确定候选药物分子独立地或者与标志物组分子一起调节各细胞应答刺激生物传感器信号的能力。分子对细胞的直接作用产生其初级概况，而分子对标志物诱导的生物传感器信号的调节产生二级概况。两种概况通常都记录为实时动力学细胞应答。在标志物组作用的多种细胞之间结合不存在分子时的初级概况和分子存在时的二级概况，获得分子针对这些标志物的多组调节概况。例如，全部或部分组的调节概况可结合产生调节指数，例如生物传感器指数，例如DMR指数。比较分子指数和药理学已知调节剂组既定指数，能确定分子干预的细胞受体或靶标或途径。细胞概况药理学方法不仅提供了任意分子的作用模式(例如靶标、途径、激动或拮抗、或毒性)的信息，还能确定其效能、选择性、和系统细胞药理学。

本药物发现方式和方法可使用本文公开的任何实体组分，包括但不限于材料、物质、分子、配体、标志物、分子、组合物、未知分子、已知分子、测试分子、候选药物分子、分子混合物、调节剂、已知调节剂、细胞、激动剂、拮抗剂、库、组、标志物组、细胞组、受体、细胞靶标、确定的途径、经分子处理的细胞、信号途径、附着细胞、弱贴壁细胞、悬浮细胞、生物传感器、和甚至对象。

本药物发现的方式和方法可使用本文公开的任何实体/抽象或信息上相关的组分，包括但不限于应答、细胞应答、生物传感器应答、DMR应答、概况、初级概况、二级概况、调节概况、生物传感器信号、DMR信号、对照、阳性对照、阴性对照、调节剂比较、指数、生物传感器指数、DMR指数、分子生物传感器指数、分子DMR指数、分子指数、调节剂生物传感器指数、调节剂DMR指数、分子调节剂指数、已知调节剂生物传感器指数、已知调节剂DMR指数、标志物生物传感器指数、标志物DMR指数、标志物生物传感器指数、标志物指数、指数相似性、基体、分子药理学、细胞过程、时间段、短的时间段、另一时间段、指示剂、人生理学、人病理生理学、长期生物传感器信号、长期DMR信号、强生物传感器信号、强DMR信号、效能、功效、网状相互作用、化学生物学、细胞试验为核心的细胞概况药理学、系统细胞药理学和细胞概况药理学。

本药物发现的方式和方法可以使用本文公开的任何方法组成，包括但不限于调节、细胞培养、试验、长期试验、短期试验、两步试验、脉冲刺激试验、处理、接触、引发、检查、应答的试验、标准化、鉴定、增强、淘选、调节生物传感器信号、调节DMR信号、和附着。

应当理解，本文中任何组分都可以任意组合使用，本文中至少对上述组分清单中引用的组分具体列举了各种变换。

公开了确定不同种类细胞组的基体，用于基于细胞概况药理学的药物发现。

在某些实施方式中，采用人细胞确定分子，例如候选药物分子的药理学。实践中几乎不可能使用所有的人细胞来确定候选药物的药理学。为了综合候选药物分子的潜力和成药性，可以选择不同的细胞组用于特定的目的。例如，广谱细胞组可用于评估分子的潜在副作用，而特定疾病相关的细胞组可用于确定分子治疗特定疾病的效能和功效。另一方面，来自特定器官的细胞组可用于研究分子的特异性，而特定靶标的细胞组可用于确定分子通过相同靶标发挥作用的广泛应用。已知由于各细胞的特定细胞背景，特定细胞靶标的活性调节可能导致不同的细胞应答(常称为细胞环境依赖性“表型”应答)。药物候选分子可以表现出对相同细胞靶标活性调节的功能选择性，从而在表达相同靶标的细胞间产生不同的细胞应答。

a)信号传导途径和细胞靶标

公开了标志物/细胞靶标/途径组对每种细胞的应用。标志物/细胞靶标/途径的选择首先是预先确定配体组在各种细胞类型中引发生物传感器信号如DMR的能力，然后通过化学生物学调节概况确定系统细胞生物学(例如，配体诱导的靶标调节下游的途径和网状相互作用)和各配体的系统细胞药理学(例如，靶标特异性和效能和功效)。当(1)配体在采用生物传感器细胞试验的细胞中产生强生物传感器信号，(2)配体的生物传感器信号具有由至少一种特定靶标介导的至少一种特定细胞信号传导途径和/或至少一种细胞过程的特征时，配体可定性为标志物。

细胞组中的各种细胞的标志物可以是不同的。例如，细胞1可使用标志物A和B和C，而细胞2可使用标志物D和E和F。在另一种实施方式中，组内的至少两种细胞有至少一种共同标志物。例如，组胺可用作组内A549和A431细胞的标志物。在其它实施方式中，组内各细胞的标志物数量可以不同(例如，细胞1有1种标志物，细胞2有2种标志物，细胞3有2种标志物，细胞4有4种标志物)。在其它实施方式中，组内各细胞的标志物数量可以相同(例如，各细胞有1种标志物，各细胞有2种标志物，或各细胞有3种标志物)。

在实施方式中，标志物组可以选择为完全覆盖主要细胞传导途径(例如一种G_q的标志物、G_i的标志物、一种G_s的标志物、一种EGFR的标志物、一种Toll样受体途径的标志物等等)。在某些实施方式中，根据感兴趣的特定疾病(例如炎性疾病、感染疾病、癌症、糖尿病、肥胖症、神经疾病、自体免疫疾病、哮喘的气道发炎、COPD的气道病理、阿耳茨海默病、自体免疫导致白癜风、结直肠癌、胰腺癌、或病毒引发气道发炎等)，标志物组选择为覆盖特定信号传导途径群(例如，PI3K途径、Akt途径、PKA途径、MAPK途径、JNK途径、toll样受体途径、G_q途径、G_s途径、G_i途径、G_12/13途径、EGFR途径、mTOR途径、或IKK途径等)。

主要的细胞信号传导途径包括，但不限于，14-3-3诱导胞内信号传导(例如细胞周期调节、凋亡)、通过Rho家族GTP酶基于肌动蛋白的运动、cAMP-PKA途径、通过GPCR介导的Gs途径、通过GPCR介导的Gq途径、通过GPCR介导的Gi途径、通过GPCR介导的G12/13途径、AIF途径、Akt信号传导、上皮细胞中的醛固酮信号传导、AMPK酶复合物途径、MHC的抗原加工和呈递、通过死亡受体或HIV1的凋亡、苦味信号传导、cAMP途径、T-辅助细胞中的CD28信号传导、细胞凋亡途径、神经酰胺途径、趋化因子信号传导、CREB途径、细胞周期蛋白和细胞周期调节、eNOS信号传导、ERK信号传导、雌激素调节、FAK信号传导、FGF途径、G-βγ信号传导、GPCR途径、生长激素信号传导、GSK3信号传导、白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-22、IL-3、IL-23、IL-9)途径、NOS信号传导、胰岛素受体途径、整联蛋白途径、干扰素途径、胞内钙信号传导、IP3途径、JAK-STAT途径、JNK途径、MAPK信号传导、线粒体凋亡、mTOR途径、NF-κB途径、NGF途径、Notch信号传导、p38信号传导、p53介导的凋亡、PDGF途径、磷脂酶C途径、PI3K信号传导、PKA信号传导、PKC途径、PTEN途径、Rac1途径、RANK途径、Rap1途径、Ras途径、RhoA途径、RNAi途径、siRNA途径、SMAD信号传导、STAT3途径、SUMO途径、T细胞受体信号传导、TGF-β途径、凝血酶信号传导、TNF信号传导、Toll样受体途径、VEGF途径、和WNT信号传导。由于许多这些途径和信号传导事件中共有很多汇聚点(称为整合点或接点)并相互作用，本文公开的生物传感器细胞试验可以提供关于信号传导和网状相互作用的信息。不必要把所有这些途径包括在本文所述的细胞概况药理学药物发现的标志物/靶标/途径组中。

公开了多种试验用于基于生物传感器细胞概况药理学的发现。在一种实施方式中，采用长期生物传感器细胞试验研究分子对细胞组的长期影响。此处每个类型的细胞仅暴露于分子较长时间(例如，8小时、16小时、24小时、32小时、48小时、72小时)。这一长期试验用于确定分子对健康细胞状态(例如，活力、凋亡、细胞周期调节、细胞粘附程度、增殖)的影响。这一长期试验还包含可直接用于分子诱导细胞信号事件或途径研究的早期细胞信号应答(例如，分子刺激后10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟)。

在另一种实施方式中，标志物存在下的长期生物传感器细胞试验被用于研究分子和标志物对细胞生物学和生理学的长期影响之间的交叉调节。标志物的添加可以在分子之前、同时、和之后。例如，当标志物(例如，H₂O₂)引发细胞组中至少一种细胞的凋亡时，可以采用这种长期试验确定分子是否是保护性的。

在另一种实施方式中，至少采用两步试验，细胞组中每种细胞首先暴露于分子以研究分子诱导的生物传感器信号如DMR信号，然后单独用特定标志物或标志物组处理。该试验常称为双模试验：初始的激动模式和后续的拮抗模式。激动模式设定为确定分子引发生物传感器信号例如DMR信号的能力，而拮抗模式设定为确定分子调节标志物组的生物传感器信号例如DMR信号的能力，每个标志物组用于细胞组中一种细胞。

在另一种实施方式中，可采用脉冲刺激试验，其中细胞仅暴露于分子中极短时间(例如，数秒、或数分钟)。这种脉冲刺激试验可用于研究分子作用于细胞/靶标的动力学，及其对标志物诱导的DMR信号的影响。可以通过在添加分子后的给定时间用液体操作装置简单地将分子溶液替换成细胞试验缓冲液来进行脉冲刺激试验。

2.生成指数的方法

公开了研究分子例如药物候选分子的系统细胞药理学的方法。所述方法包括产生生物传感器信号信号指数例如DMR指数用于直接分析分子的系统细胞药理学，或者基于分子和熟知调节剂(例如PI3K抑制剂、PKA抑制剂、GPCR拮抗剂、RTK抑制剂、EGFR中和抗体、或磷酸二酯酶抑制、PKC抑制剂或激活剂等)诱导的生物传感器信号信号指数例如DMR指数之间模式识别的间接分析。

在一种实施方式中，所述方法包括：(1)在激动模式下采集对分子的生物传感器信号应答例如DMR应答；(2)在存在和没有分子时采集细胞组中对标志物组的生物传感器信号应答例如DMR应答；(3)从各生物传感器信号信号例如DMR信号中消除特定的生物传感器信号应答参数例如DMR参数群；(4)将各参数对阳性对照(即在没有任何分子的情况下经标志物处理的细胞)进行标准化以产生调节百分数(其可表明增强、抑制、或没有调节)；(5)将各参数的调节百分数对标志物/细胞作图产生所述分子的生物传感器信号指数；和(6)针对所述细胞/标志物组，将所述分子诱导的生物传感器信号指数与已知调节剂生物传感器信号指数库，或任何分子诱导的生物传感器信号指数库作比较。

在一种实施方式中，所述方法包括：(1)在激动模式下采集对分子的DMR应答；(2)在存在和没有分子时采集细胞组中对标志物组的DMR应答；(3)从各DMR信号中消除特定的DMR参数群；(4)将各DMR参数对阳性对照(即在没有任何分子的情况下经标志物处理的细胞)进行标准化以产生调节百分数(其可表明增强、抑制、或没有调节)；(5)将各DMR参数的调节百分数对标志物/细胞作图产生所述分子的DMR信号指数；和(6)针对所述细胞/标志物组，将所述分子诱导的DMR信号指数与已知调节剂DMR指数库，或任何分子诱导的DMR指数库作比较。

分子生物传感器信号指数例如DMR指数和调节剂生物传感器信号指数例如DMR指数之间的相似性可用作分子作用模式的指示剂。分子生物传感器信号指数例如DMR指数越接近调节剂生物传感器信号指数例如DMR指数，分子调节调节剂作用的相同靶标的可能性就越大。生物传感器信号指数例如DMR指数中还可包括激动模式下的分子生物传感器信号例如DMR信号。

在某些实施方式中，鉴定出某一指数和另一指数之间，例如分子指数和已知标志物指数之间的相似性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％的分子。可以从概况中例如P-DMR数据产生的任意指数点确定所述相似性。在该示例中，可以用两种方式之一确定相似性：1)各指数的全部P-DMR数据点中至少例如80％相似；或2)各指数的每个数据点相似性至少为80％。

在某些实施方式中，采用传统的模式识别分析将分子指数和标志物指数、调节剂指数、或任何分子指数的库作比较鉴定分子的作用模式。

在某些实施方式中，采用分数矩阵鉴定分子的作用模式。所述分数矩阵与其对应物密切相关，例如在相应细胞中不同分子的初级概况的特征，和不同分子对各标志物的调节概况的本质和百分比。例如，给予更相似的特征更高的分数，给予不相识的特征较低或负的分数。因为调节指数中只有三种调节，正、负和中性，相似性矩阵比较简单。例如，简单的矩阵可以给相同的调节(例如正调节)评分为+1，给不同的调节评分为-1。在另一些实施方式中，可以给具有不同水平的一种调节类型不同的分数。例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、100％、200％等的正调节可以相应评分为+1、+2、+3、+4、+5、+6、+10、+20。相反，对于负调节，可以给出相似但相反的评分。根据这一方法，图9C显示了HA-1077针对标志物组的调节指数，表明PKA/PKG抑制剂HA1077差异性地调节不同标志物诱导的生物传感器应答：在A549细胞中，吡那地尔(-95％)、聚(I:C)(+18％)、PMA(+36％)、SLIGKV-酰胺(+22％)、毛喉素(+18％)、组胺(+26％)；和在A431静息细胞中，肾上腺素(-38％)、烟酸(+8％)、EGF(P-DMR，+19％)、EGF(N-DMR，-20％)、和组胺(-50％)。因此，HA1077调节指数的协同评分可以定为(-9.5，1.8，3.6，2.2，1.8，2.6，-3.8，0.8，1.9，-2，-5)。类似地，对于H8，其协同评分为(-7.2，1.8，2.2，3.2，2，3.8，6.5，-1.6，1，0.3，-2，1.6)。通过比较HA1077和H8的分数，可以推断在两种检测的细胞系中两种分子都显示相似的作用模式。

3.药物发现方法

公开了任何分子包括药物候选分子的系统药理学或系统细胞药理学评估方法。所述方法依赖于细胞/标志物/靶标/途径的选择以产生分子的生物传感器指数，例如DMR指数。分子引发生物传感器信号如DMR信号，和调节标志物诱导生物传感器信号如DMR信号的能力，可结合不同类型试验，系统评估分子的整合药理学。

参考图1，该示意图显示了所公开的用于药物发现的细胞概况药理学方法。该示例中，采用了两种细胞，细胞1和细胞2。这两种细胞可以是相关、或不相关的。对每种细胞，进行两种试验：仅用分子的长期试验，和短期的例如两步(或双模)试验。所述长期试验用于确定分子对健康细胞状态(例如，增殖率、细胞周期调节、毒性、或细胞粘附的改变等)的影响。双模试验包括用以确定两种细胞内分子诱导的生物传感器信号如DMR信号的初始激动模式，和随后用以确定每种细胞中所述分子调节标志物组诱导的生物传感器信号如DMR信号的拮抗模式。在此，每种细胞有自己的标志物组，例如细胞1有标志物A、B和C，或细胞2有标志物D、E和F。各标志物可以通过不同途径产生信号传导，例如在细胞1中对应途径a、b和c、或细胞2中对应途径d、e和f。或者，这些途径可以相互作用，或至少其中两种可以相似或相同。调节概况的组合可用来生成调节指数。和分子的初级概况一起，可以生成分子针对2种细胞和6种标志物的生物传感器指数，例如DMR指数。生物传感器指数如DMR指数，进一步用于确定分子药理学，通过针对生物传感器指数库如已知调节剂库的DMR指数进行模式识别。

参考图2，该示意图显示了基于生物传感器细胞概况药理学的方法如何用于确定分子药理学。该方法由细胞开始，针对能通过特定途径(例如Gq偶联组胺1受体介导的信号传导)引发细胞信号传导的标志物组测试分子，最后通过与已知调节剂诱导的生物传感器信号指数库如DMR指数库的比较进行模式识别(或特定数据点)，从而确定分子得以作用的特定靶标。因此可以确定分子的整合药理学。

公开的细胞概况药理学采用无标记生物传感器，特别是光生物传感器，产生细胞应答单独刺激或与标志物分子组一起刺激的初级概况。各标志物分子激活受体或细胞靶标，产生细胞内的生物传感器信号。公开了确定和筛选分子药理学的方法，采用以生物传感器为核心的测量，该方法包括：

1).选择细胞组，其中基于基体选择所述细胞；

2).确定各种细胞中的细胞靶标组和标志物组，其中标志物分子对细胞靶标的调节不仅通过确定的途径产生信号传导，还引起可被无标记生物传感器检测的生物传感器信号；

3).用分子处理各细胞；

3a)用标志物组处理各细胞以生成组中各标志物的初级概况；

4).监控短时间段的细胞应答以生成分子的初级概况；

5).将标志物组分别添加到经分子处理的细胞以生成分子影响各标志物信号的二级概况，其中各标志物为特定的剂量(例如，EC₅₀、EC₈₀、EC₉₀、EC₉₅或EC₁₀₀)；

6).监控另一时间段的细胞应答；

6a)比较标志物组中各标志物在所述分子存在下的二级概况和各标志物的相应初级概况；

7).生成所述分子在全组细胞中针对标志物组的生物传感器指数。

8).比较所述分子的生物传感器指数与具有已知药理学的调节剂的生物传感器指数，其中所述分子生物传感器指数与所述调节剂生物传感器指数的相似性是所述分子作用模式的指示剂。

9)可选地，生成所述分子在细胞内没有和存在标志物下的长期生物传感器信号。

公开的细胞概况药理学采用无标记光生物传感器以产生细胞应答单独刺激或与标志物分子一起刺激的初级概况。各标志物分子激活受体或细胞靶标，引起细胞内的DMR信号。公开了确定和筛选分子药理学的方法，采用以生物传感器为核心的测量，该方法包括：

1).选择细胞组，其中所述细胞基于基体选择。

2).确定各种细胞中的细胞靶标组和标志物组，其中标志物分子对细胞靶标的调节不仅通过确定的途径引起信号传导，还引起可被无标记生物传感器检测的DMR信号；

3).用分子处理各细胞；

4).监控短时间段的细胞DMR应答产生分子的初级DMR概况；

5).将标志物组分别添加到经分子处理的细胞以生成分子影响各标志物信号的二级DMR概况，其中各标志物为特定的剂量(例如，EC₅₀、EC₈₀、EC₉₀、EC₉₅或EC₁₀₀)；

6).监控另一时间段的细胞DMR应答；

7).生成所述分子在全组细胞中针对标志物组的DMR指数。

8).比较所述分子的DMR指数与具有已知药理学的调节剂的DMR指数，其中所述分子DMR指数与所述调节剂DMR指数的相似性是所述分子作用模式的指示剂。

9)可选地，生成所述分子在细胞内没有和存在标志物下的长期DMR信号。

不同于高度依赖使用细胞系统和接触点测量(例如细胞生长速率、或特定细胞因子的释放)的基于传统系统生物学和系统药理学的药物发现，本公开的方法使用不同种类天然细胞或工程细胞组，与基于无标记生物传感器的动力学测量相结合，用于研究分子药理学和病理药理学。传统系统生物学方法常使用大规模分析工具进行鉴定，例如蛋白微阵列、DNA微阵列、或质谱。

还公开了采用天然或工程细胞系统用于细胞概况药理学的方法。可通过将不同细胞类型组合在一起把疾病相关复杂性改造进细胞系统，并通过同时激活多种途径探明网状调节和突显特性。例如，用于炎性疾病的细胞系统方法可包括上皮细胞与血单核细胞，和复杂细胞因子或免疫刺激环境的组合。

系统生物学，特别是信号传导途径的阐明和动态分析，为药物发现提供了新的框架。通过在迭代方法中整合实验、数学和计算科学，得以洞察这些大量、差异、相互作用组分的组合行为。通过这一对疾病分子机理的相关了解，系统方法进一步推进调节和代谢网络的治疗性调节的鉴定和确认，从而有助于鉴定候选药物的靶标和生物标志物，以及‘脱靶’效应和副作用。例如，本文公开的方法能使用系统生物学方法研究分子或物质。

本文公开的方法还具有基于传统系统生物学方法的优点。例如，在各系统中细胞、刺激物和读出信息的组合，一起试验的系统组合可用于以最少的测量检测和区分尽可能多的疾病调节剂。本文公开的药物发现方法再次将生物学摆在首位，并在整个发现过程中应用生物学知识：该方法根据在复杂细胞系统或模拟感兴趣疾病状态中的不同活性细胞、途径和网络的细胞组中阐明的生物学来鉴定成功品并优化先导物。该方法中，采用候选药物本身进行确认，而不是靶基因或靶蛋白。

4.生物传感器和生物传感器试验

无标记细胞试验常使用生物传感器监控活细胞中分子诱导的应答。分子可以是天然产生或是合成的，可以是纯化的或未纯化的混合物。生物传感器常利用传感器，例如光、电、热量、声、磁、或类似传感器将与生物传感器接触的细胞内的分子识别事件或分子诱发的变化转化成可定量的信号。这些无标记生物传感器可用于涉及鉴定分子复合物如何随时间形成和解离的分子相互作用分析，或用于涉及鉴定细胞如何对刺激应答的细胞应答分析。可用于本方法的生物传感器包括，例如，光生物传感器系统如表面等离振子共振(SPR)和共振波导光栅(RWG)生物传感器、共振镜、椭圆计，和电生物传感器系统如生物阻抗系统。

a)SPR生物传感器和系统

SPR依靠棱镜把覆盖入射角范围的一角偏振光导入装有导电金属膜(例如金)的平面玻璃基材上以激发表面等离子体。所产生的渐消波与金层中的游离电子云相互作用并被吸收，产生电荷密度波(即表面等离子体)并导致反射光强度的减弱。产生最新强度的共振角随传感器表面的反面上接近金层溶液的折射率而变化。

b)RWG生物传感器和系统

RWG生物传感器可包括，例如基材(例如玻璃)、包埋了光栅或周期性结构的波导薄膜、和细胞层。RWG生物传感器利用通过衍射光栅的方式将光共振偶联进入波导，导致在溶液-表面界面的全内反射，进而在界面产生电磁场。这一电磁场本质是渐消的，表示它从传感器表面指数衰减；它衰减到初始值的1/e的距离称为贯穿深度，它随具体的RWG生物传感器的设计而变化，但通常在约200纳米左右。这类生物传感器利用这种渐消波鉴定传感器表面上或靠近该表面的细胞层由配体诱导的变化。

RWG仪器可以根据角度变化或波长变化测量细分为不同系统。在波长变化测量中，采用具有恒定角度的覆盖入射波长范围的偏振光照射波导，特定波长的光被偶联进入并沿波导放大。或者，在角度变化仪器中，用单色光照射传感器并测量光的共振偶联角度。

共振条件受与生物传感器表面直接接触的细胞层影响(例如细胞融合、粘附和状态)。当配体或分析物与活细胞内的细胞靶标(例如，GPCR、激酶)相互作用时，细胞层内局部折射率的任何变化可以通过共振角(或波长)的变化检测出。

Corning Epic系统采用RWG生物传感器进行无标记生化或细胞试验(康宁公司，纽约州康宁)。所述Epic系统由RWG读板仪和SBS(生物分子筛选学会)标准微量滴定板组成。读板仪的检测器系统利用集成光纤测量入射光的波长变化，该变化是细胞内配体诱导变化的结果。一系列照射-检测头以线性方式排列，从而能从384孔微孔板的列中各孔同时采集反射光谱。扫描整块板使得每个传感器被多次访问，每列被依序访问。采集入射光的波长用于分析。所述仪器可包括温控单元以尽可能减少因温度波动导致的入射光伪变化。测得的应答代表细胞群的平均应答。系统的不同部分例如样品加载可以自动化，也可以多通路化，例如用96孔或384孔微量滴定板。可以用机载的液体处理器或外接的液体处理附件进行液体操作。具体地，在各孔底部培养了细胞的细胞试验板的孔内直接添加或吸入分子溶液。细胞试验板包含一定体积试验缓冲液覆盖细胞。在分子添加步骤中还可以加入通过吸上放下数次完成的简单混合步骤。

c)电生物传感器和系统

电生物传感器由基材(例如，塑料)、电极、和细胞层组成。在这种电检测方法中，在阵列于基材上的小金电极上培养细胞，并按时跟踪系统的电阻抗。阻抗是对细胞层电导率变化的测量。通常，在电极或电极阵列上施加固定频率或变频的微小恒定电压，随时间监控流经电路的电流。配体诱导的电流变化提供了细胞应答的测量。用于全细胞感测的阻抗测量最初于1984年实现。从那时起，基于阻抗的测量被应用于研究广泛的细胞事件，包括细胞粘着和伸展、细胞微动、细胞形态变化、和细胞死亡。经典阻抗系统的缺陷在于因使用小检测电极和大参比电极导致的高试验变化。为克服这一变化，最新一代的系统，例如CellKey系统(MDS赛科斯(MDS Sciex)，加利福尼亚州南旧金山)和RT-CES(ACEA生物科学公司(ACEA Biosciences Inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥)采用具有微电极阵列的集成电路。

d)高空间分辨率生物传感器成像系统

光生物传感器成像系统，包括SPR成像系统、椭圆计成像系统、和RWG成像系统，提供了高空间分辨率，可用于本公开的实施方式中。例如，SPRimagerII(GWC技术公司)采用棱镜偶联SPR，在固定的入射角进行SPR测量，并用CCD相机采集反射光。记录表面的变化作为反射性的变化。因此，SPR成像同时采集阵列中所有元件的测量。

基于RWG生物传感器的扫频波长光解调系统可用于以成像为基础的应用。该系统中，采用快速可调激光源照射传感器或在微孔板形式中的RWG生物传感器阵列。可以通过检测激光波长扫描时传感器上反射的光能随时间的变化构建传感器光谱，用计算机化共振波长解调模型分析所测数据得到固定有受体或细胞层的生物传感器的空间解析图像。使用图像传感器自然生成基于成像的解调方案。可以无需移动部件获得二维无标记图像。

或者，可以采用具有横向磁力或p-偏振光TM₀模式的角度调查系统。该系统由发射系统和接收系统组成，发射系统产生光束阵列使其中每个以约200μmx3000μm或200μmx2000μm的维度照射RWG传感器，基于CCD相机的接收系统用于记录从这些传感器反射光束的角度变化。通过分光器和衍射光学镜片的组合获得阵列的光束。该系统能每3秒对最多49个传感器(在7x7孔传感器阵列中)同时测样，或每10秒对最多整个384孔微孔板进行同时测样。

或者，还可使用扫描波长解调系统。该系统中，采用覆盖恒定角度入射波长范围的偏振光照射并扫描整个波导光栅生物传感器，可同时记录各位置的反射光。通过扫描，也可以获得整个生物传感器的高分辨率图像。

5.活细胞内的动态质量再分布(DMR)信号

通过细胞靶标对刺激的细胞应答可以由下游信号网络的空间和时间动态编码。因此，实时监控细胞信号传导的整合能提供用于细胞生物学和生理学理解的生理学相关信息。

光生物传感器包括共振波导光栅(RWG)生物传感器，能检测动态细胞物质再分布相关的集成细胞应答，从而提供研究细胞信号传导的非侵入性手段。所有光生物传感器的共同点在于它们能测量传感器表面或极接近该表面的局部折射率的变化。原则上，几乎所有光生物传感器都可用于细胞感测，因为它们能使用渐消波鉴定细胞内配体诱导的变化。渐消波是电磁场，由光在溶液-表面界面的全内反射产生，它通常延伸到溶液内很短的距离(约数百纳米)，其特征深度称为贯穿深度或感测容积。

近来，开发出理论和数学模型描述在活细胞应答配体刺激中测得光学信号的参数和特性。这些模型基于3层波导系统与已知细胞生物物理的结合，将配体诱导的光信号与通过受体介导的特定细胞过程联系起来。

因为生物传感器测量受入射光照射区域细胞的平均应答，可以采用细胞高度融合层以获得最佳试验结果。由于与生物传感器的短贯穿深度相比细胞尺寸较大，传感器配置考虑用非传统的三层系统：基材、具有光栅结构的波导膜和细胞层。因此，配体诱导的有效折射率(即，测得的信号)变化可以是，以一级形式，直接与细胞层底部折射率变化成比例：

ΔN＝S(C)Δn_c

其中S(C)为对细胞层的灵敏度，Δn_c为生物传感器感测的配体诱导的细胞层局部折射率变化。因为细胞内给定体积的折射率主要由生物分子如蛋白质的浓度决定，Δn_c可以假定为与配体诱导的局部细胞靶标浓度或感测体积内的分子组件浓度的变化直接成比例。考虑到渐消波从传感器表面延伸的指数衰减性质，配体诱导的光信号受下式支配：

ΔN = S (C) αd \underset{i}{Σ} Δ C_{i} [e^{\frac{- z_{i}}{Δ Z_{C}}} - e^{\frac{- z_{i + 1}}{Δ Z_{C}}}]

其中，ΔZ_c为进入细胞层的贯穿深度，α为特定折射增量(蛋白质为约0.18/mL/g)，z_i为质量再分布发生的距离，和d是细胞层内片层的假想厚度。在此细胞层在竖直方向上分成等间距的片层。上述等式表明配体诱导的光信号是离传感器表面不同距离的质量再分布的加合，各自对总应答的贡献不相等。此外，测得的波长或角度变化信号主要对发生在垂直于传感器表面方向上的质量再分布敏感。因为其动态本质，它也称为动态质量再分布(DMR)信号。

6.细胞和生物传感器

细胞依靠多种细胞途径或机制处理、编码和整合它们接收的信息。不同于用光生物传感器特异性测量分析物与蛋白靶标结合的亲和分析，活细胞更为复杂和动态。

为研究细胞信号传导，可以将细胞与生物传感器的表面接触，这能通过细胞培养实现。这些培养的细胞可以通过三种类型接触附着在生物传感器表面：焦点接触、贴近接触和胞外基质接触，其中每种具有与表面的特征分离距离。其结果是，基础细胞膜常位于表面约10-100nm以外。对于悬浮细胞，细胞可以通过细胞表面受体的共价偶联或细胞表面受体的特异性结合、或重力导致的简单沉降而与生物传感器表面接触。因此，生物传感器能感测细胞的底部部分。

在很多情况下，细胞表现出表面依赖性粘着和增殖。为获得可靠的细胞试验，需要包被生物传感器表面以增强粘着和增殖。然而，表面性质会对细胞生物学有直接影响。例如，表面结合的配体能影响细胞的应答，基材的机械柔量同样影响，机械柔量确定材料在细胞施加的力作用下如何变形。由于培养条件(时间、血清浓度、融合度等)不同，不同表面和不同条件得到的细胞状态可能不同。因此，需要努力控制细胞状态以开发基于生物传感器的细胞试验。

细胞是相对尺寸较大(通常在数十微米范围内)的动态物体。正如在组织培养中用延时显微镜在亚细胞分辨率下和生物阻抗测量在纳米水平下所观察到的，即使没有刺激，细胞也在不断进行微动-细胞结构的动态移动和重塑。

在未刺激条件下，用RWG生物传感器检测细胞一般得到DMR应答几乎为净零。这部分是因为光生物传感器的低空间分辨率，这是由大尺寸激光点和长传播长度偶联光决定的。激光点的尺寸决定所研究区域的尺寸-且通常在一个时间只能追踪一个分析点。因此，生物传感器通常测量位于光入射区域的细胞大群体的平均应答。虽然细胞在单细胞水平进行微动，细胞的大群体产生平均为净零的DMR应答。此外，在哺乳动物细胞内胞内大分子是高度有序且空间限定于适当位点。细胞上和细胞内蛋白质定位的严格控制决定了特定细胞功能和应答，因为定位使细胞能调节蛋白质与其合适伙伴相互作用的特异性和效率并将蛋白质激活和失活机制进行空间隔离。因为这种控制，在未刺激条件下，在感测体积内细胞的局部质量密度可以达到平衡状态，从而导致光应答为净零。为获得一致的光应答，所检测细胞可以在传统培养条件下培养一段时间，使得多数细胞刚好完成单次分裂循环。

活细胞具有感测和应答外源信号的精细能力。以前认为细胞信号传导通过线性路径作用，环境信号引发线性反应链，产生单个明确的应答。但是，研究显示对外界刺激的细胞应答要复杂得多。显然，细胞接收的信息会被处理和编码成信号传导蛋白的磷酸化和拓扑移位的复杂时间和空间模式。将蛋白空间和时间导向到适当位点对于调节蛋白-蛋白相互作用的特异性和效率至关重要，因此决定了细胞信号传导和应答的时间和强度。关键的细胞决策，例如细胞骨架重组、细胞周期检测点和凋亡，取决于激活信号传导蛋白的精确时间控制和相对空间分布。因此，通过细胞靶标例如G蛋白偶联受体(GPCR)介导的细胞信号传导常以有序且受调节的方式进行，并由一系列空间和时间事件组成，其中很多导致细胞的局部质量密度变化或局部细胞物质再分布。当这些变化或再分布在感测体积内发生时，可以采用光生物传感器直接实时跟踪。

7.DMR信号作为活细胞生理应答

与用于受体生物学研究的传统药理学方法的比较显示，当配体对细胞系统中表达的受体特异时，配体诱导的DMR信号是受体特异性、剂量依赖性和可饱和的。对于大量G蛋白偶联受体(GPCR)配体，发现功效(根据EC₅₀值测得)的与采用传统方法测得的功效几乎相同。此外，DMR信号表现出预期的脱敏模式，因为脱敏和再次致敏是所有GPCR共有的现象。此外，DMR信号还保持了GPCR配体的保真度，这与采用传统技术得到的结果类似。另外，生物传感器能区分全激动剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂和变构调节剂。总之，这些发现表明DMR能监控活细胞中的生理应答。

8.DMR信号含有活细胞内配体-受体对的系统细胞生物学信息

用配体刺激细胞引起一系列空间和时间事件，非限制性的例子包括配体结合、受体激活、蛋白募集、受体内化和循环、第二信使交替、细胞骨架重塑、基因表达、细胞粘附变化。因为各细胞事件有其自身特点(例如，动力学、持续时间、幅度、质量移动)，而生物传感器主要对涉及感应体积内质量再分布的细胞事件敏感，这些细胞事件能差异性地影响总DMR信号。化学生物学、细胞生物学和生物物理学方法可用来阐明配体诱导DMR信号的细胞机理。近来，直接将化学物质用于介入特定的细胞信号传导组件的化学生物学已经用于解决生物学问题。这可能是由于鉴别了大量特定控制很多不同种类细胞靶标的调节剂。该方法已用于信号传导及其通过受体介导的网状相互作用的作图，包括表皮生长因子(EGF)受体，和G_q-与G_s-偶联受体。

EGFR属于受体酪氨酸激酶家族。EGF结合EGFR并刺激其内脏蛋白质-酪氨酸激酶活性，启动信号传导级联，原则上涉及MAPK、Akt和JNK途径。在EGF刺激后，有很多事件导致A431细胞内的质量再分布，A431是内源性过度表达EGFR的细胞系。已知EGFR信号传导取决于细胞状态。结果EGF诱导的DMR信号也取决于细胞状态。通过0.1％胎牛血清培养20小时得到的静息细胞中，EGF刺激导致DMR信号有三个不同序列阶段：(i)信号增强的正阶段(P-DMR)，(ii)转变阶段，和(iii)衰减阶段(N-DMR)。化学生物学和细胞生物学研究显示EGF诱导的DMR信号主要与Ras/MAPK途径相关，该途径通过MEK进行并引起细胞脱离。两条证据提示，P-DMR主要是由于募集胞内靶标到细胞表面的活化受体处。首先，阻断发动蛋白或网格蛋白活性对P-DMR事件的幅度影响极小。发动蛋白和网格蛋白是EGFR激活的两个下游组件，在EGFR内化和信号传导执行中起关键作用。其次，阻断MEK活性部分减弱P-DMR事件。MEK是MAPK途径的重要组件，在EGF刺激后，它首先从细胞质移位到细胞膜，然后与受体一起内化。

另一方面，N-DMR事件是由于细胞脱离和受体内化。荧光图像显示EGF刺激引起大量受体内化和细胞脱离。已知阻断受体内化或MEK活性可防止细胞脱离，受体内化同时需要发动蛋白和网格蛋白。这表明阻断发动蛋白或网格蛋白会抑制受体内化和细胞脱离，而阻断MEK活性仅抑制细胞脱离，但不抑制受体内化。正如预期，发动蛋白或网格蛋白的抑制剂完全抑制了EGF诱导的N-DMR(～100％)，而MEK抑制剂仅部分弱化N-DMR(～80％)。荧光图像还证实阻断发动蛋白的活性但不阻断MEK，影响了受体内化。

9.DMR信号含有配体作用于活细胞的系统细胞药理学信息

由于DMR信号是集成的细胞应答，由很多涉及细胞物质在细胞底部的动态再分布的细胞事件影响组成，配体诱导的生物传感器信号如DMR信号含有系统细胞药理学信息。已知GPCR常在细胞内表现丰富活动，并且很多配体能诱发有利细胞机理特定部分的操作偏向并显示出途径偏向的功效。因此，取决于受体下游细胞事件如何测量和用作配体药理学读出信息，配体很可能具有多种功效。实践中很难用传统细胞试验系统性表示GPCR配体的信号传导能力，传统细胞试验大多数为途径偏向并仅试验单个信号传导事件。但是，因为无标记生物传感器细胞试验对细胞信号传导的现有知识没有要求，而且对途径无偏向和途径灵敏，这些生物传感器细胞试验能研究任何配体的配体选择性信号传导和系统细胞药理学。

10.生物传感器参数

无标记生物传感器如RWG生物传感器或生物阻抗生物传感器能实时跟踪配体诱导的细胞应答。非侵入性和无操作的生物传感器细胞试验不要求对细胞信号传导的现有知识。所得生物传感器信号包含涉及受体信号传导和配体药理学的重要信息。可以从细胞受刺激的动力学生物传感器应答中提取多种参数。这些参数包括，但不限于，总体动态、阶段、信号幅度、和动力学参数包括从一个阶段到另一阶段的转变时间和各阶段的动力学(参见Fang，Y.和Ferrie，A.M.(2008)“label-free optical biosensor for ligand-directed functional selectivityacting on β2 adrenoceptor in living cells(无标记光生物传感器用于活细胞内β2肾上腺素受体的配体导向功能选择性)”，FEBS Lett.582，558-564；Fang，Y.等，(2005)“Characteristics of dynamic mass redistribution of EGF receptor signaling inliving cells measured with label free optical biosensors(用无标记光生物传感器测得的活细胞内EGF受体信号传导的动态质量再分布的特征)”.Anal.Chem.，77，5720-5725；Fang，Y.等，(2006)“Resonant waveguide grating biosensor forliving cell sensing(用于活细胞感测的共振波导光栅生物传感器)”.Biophys.J.，91，1925-1940)。

11.DMR参数

a)生物传感器输出参数

本文讨论了多种不同的生物传感器输出参数。例如，确定刺激诱导的细胞内定向质量再分布动力学的六个参数可以是：总体动态(即图形)、应答的阶段(在A431静息细胞中EGF诱导的DMR信号的具体实施例中，涉及细胞应答有三个主要阶段：正动态质量再分布(P-DMR)、负动态质量再分布(N-DMR)、和恢复正动态质量分别(RP-DMR))、动力学、各阶段总持续时间、各DMR事件的总幅度、和从P-到N-DMR阶段或从N-DMR到RP-DMR阶段的转变时间。动态质量再分布常称为动态细胞物质再分布或定向质量再分布。可以从共振峰获得其它生物传感器输出参数。例如，可以采用峰位置、强度、峰形和半峰宽(PWHM)。还可以从生物传感器的共振带图像获得生物传感器输出参数。五种附加特征：带形、位置、强度、分布和宽度。对于本文公开的采用生物传感器的任何细胞试验应用，所有这些参数可独立使用或一起使用。使用任意参数的子集或组合可为给定试验或具体试验的给定变化产生特征，例如用于细胞受体试验的特征，和进一步用于基于EGF受体的试验的特定特征。

(1)刺激诱导的定向质量再分布动力学的相关参数

有多种生物传感器输出参数涉及刺激诱导DMR的动力学。这些参数考察当发生对细胞的刺激事件时生物传感器数据输出发生变化的速率。刺激事件是能改变细胞状态的任何事件，举例来说，如向培养基中添加分子、从培养基中除去分子、改变温度或改变pH、或对细胞引入辐射。刺激事件能引起刺激效果，这可以是由刺激事件对细胞产生的任何效果，例如定向质量再分布。刺激事件可以是分子、化学物质、生化物质、生物物质、聚合物。所述生化物质或生物物质可以是肽、合成肽、或天然产生的肽。例如，很多不同的肽作为信号分子，包括促炎肽缓激肽、蛋白酶凝血酶、和血压调节肽血管紧张素。尽管这三种蛋白质的序列和生理学不同，通过不同细胞表面受体发挥作用，它们共用一类称为G蛋白偶联受体(GPCR)的细胞表面受体。GPCR的其它多肽配体包括：加压素、催产素、促生长素抑制素、神经肽Y、GnRH、促黄体生成激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、食欲素、硬骨鱼紧张肽II、内啡肽、脑啡肽等。GPCR是广泛且不同的基因家族，不仅对肽配体应答，还对小分子神经递质(乙酰胆碱、多巴胺、5-羟色胺和肾上腺素)、光、增味剂、味道、脂质、核苷酸和离子应答。GPCR使用的主要信号传导机制是和G蛋白GTP酶蛋白相互作用，其与包括胞内钙释放和cAMP生成在内的下游第二信使系统偶联。肽GPCR使用的胞内信号传导系统和所有GPCR所使用的相似，常根据与其相互作用的G蛋白和被激活的第二信使系统进行分类。对Gs偶联的GPCR，由受体激活的G蛋白Gs刺激下游活化腺苷酸环化酶和生成环化AMP，而Gi偶联的受体抑制cAMP的生成。cAMP生成的一个关键结果是蛋白激酶A的激活。Gq偶联受体刺激磷脂酶C，释放IP3和二酰甘油。在ER内IP3与受体结合导致胞内钙的释放，随后激活蛋白激酶C、钙调蛋白依赖性途径。除了这些GPCR、GPCR的第二信使信号传导系统以外，GPCR途径显示与其它信号传导途径(包括酪氨酸激酶生长因子受体和MAP激酶途径)的串话。受体酪氨酸激酶如EGF受体或黏着斑复合物的反式激活可通过衔接蛋白She、Grb2和Sos，以及下游Map激酶激活Erk1和Erk2来刺激ras激活。Src激酶还能在GPCR激活ras和map激酶途径中起到关键的中介作用。

可能发生一些刺激事件但数据输出没有改变。这种情况仍是刺激事件，因为细胞的条件在某些方面已经改变，这可能导致细胞或细胞培养中的定向质量再分布或变化。

应当理解对本文公开的任何试验或细胞条件都能确定具体的特征。本文对很多不同试验公开了大量“特征”，但对于本文进行的任何试验，该试验的“特征”可以确定。对于任何给定试验可能有多于一个“特征”并且其中每个都能如本文所述确定。在采集生物传感器输出数据并考察一个或多个参数后，可以得到给定试验的特征。需要进行多次实验以识别最优特征，并且需要在不同条件下进行实验以找出最优特征，不过这能够完成。应当理解，本文公开的任何方法可含有步骤用于例如“识别”或“确定”或“提供”添附在该方法上的特征。

(a)总体动态

数据输出的总体动态是可供考察的一个参数。该总体动态参数观察数据采集的完整动力学情况。总体动态可供观察的一个方面是数据输出的曲线形状随时间的变化。因此，由数据输出产生的曲线形状在发生刺激事件时或者被改变或者保持不变。改变的方向表明总体质量分布；例如正DMR(P-DMR)阶段表明在传感器的渐消尾部内的质量增加；净零的DMR提示在传感器渐消尾部内几乎没有净质量变化；而负DMR表明在传感器渐消尾部内的净质量减少。

采用光生物传感器所得刺激诱导细胞应答的总体动态可以由单个阶段(P-DMR或N-DMR或净零DMR)、或两个阶段(例如，所述两个阶段可以是这三种阶段的任意组合)、或三个阶段或多个解冻(例如，在时间过程中可以出现超过一个P-DMR阶段)。

(b)应答的阶段

可作为时间函数观察的另一参数是在数据输出中发生的阶段变化。无标记生物传感器产生数据输出，可供作图生成曲线。该曲线具有转变点，例如数据从增加状态变为减少状态或相反。这些变化可称为阶段转变，举例来说，它们发生的时间和它们采取的形状可用作生物传感器输出参数。例如，可以有P-DMR、净零DMR、N-DMR、或RP-DMR。P-DMR、N-DMR、和RP-DMR的幅度可以作为单独的生物传感器输出参数进行测量(例如参见图6A、B和C)。

(c)动力学

另一生物传感器输出参数可以是数据输出任何方面的动力学。例如，完成阶段转变的速度。例如，阶段转变多快完成或完成数据输出耗时多长。另一可测量的动力学例于是数据输出整个阶段占用的时间长度。另一例子是P-和N-DMR阶段之一或两者的总持续时间。另一例子是P-和N-DMR阶段之一或两者达到总幅度的速度或所需时间。另一例子可以是从P-到N-DMR阶段的转变时间τ。还可以测量P-DMR和N-DMR事件或阶段的动力学。

(2)共振峰的相关参数

给定导模的共振峰是通过考察例如光强度与偶联光进入生物传感器的角度，或光强度与进入生物传感器的偶联光的波长之间关系而产生的一种数据输出。光波导光模光谱是通过考察光强度与偶联光进入生物传感器的角度关系而产生的一种数据输出，采用大角度范围的光照射生物传感器的方式并监测入偶联的强度随角度的变化。在该光谱中，多个导模的多个共振峰共同出现。由于共振峰和OWLS光谱的原理相同，当发生特定波长的光或当光的产生使其以特定角度射到生物传感器上时，可以在生物传感器中互换采用给定导模的共振峰或多个导模的OWLS光谱，光源发射的光与生物传感器偶联并且这种偶联增强了生物传感器上的信号。这种随偶联光的角度或波长变化的强度改变称为共振峰。传感器不同的给定模会产生具有不同特征的相似共振峰。有许多不同参数定义给定模式的共振峰或共振光谱，可与该峰相关用于DMR或细胞效应的评估。下面讨论其中的子集。

(a)峰位置

当用数据输出作图时，共振峰出现在例如广偶联进入生物传感器的定波长或特定入射角。该峰发生的角度或波长位置会在刺激事件的应答中由于质量再分布或细胞事件而改变。例如，存在特定受体如EGF受体的潜在生长因子时，培养细胞的共振峰的位置会提高或降低偶联角度或偶联波长，这会造成共振峰中心位置改变。应当理解峰强度位置处可以测得，这也是一个良好的测量点，还可以测量共振峰上任意点的位置，例如，75％峰强度或50％峰强度或25％峰强度或66％峰强度或45％峰强度(认为公开了从1-100％峰强度的所有水平)。但是，当使用峰强度以外的点时，总会有个峰强度之前的位置和峰强度之后的位置都在，例如45％峰强度。因此，对任何峰强度以外的强度，在峰内总是有两个位置产生所述强度。这些非峰强度的位置可用作生物传感器输出参数，但需要简单知道所述强度的位置是在峰强度之前或峰强度之后。

(b)强度

正如共振峰特定强度的位置可用作生物传感器输出参数，强度本身的量也可以是生物传感器输出参数。一种具体地相关强度是给定模式的共振峰的最大强度。和位置相似，所述最大强度的量级会根据对细胞或细胞培养有特定影响的刺激事件的存在而改变，这种改变可以测得并用作特征。正如共振峰的位置，也可在峰内的任何强度或位置测得共振峰强度。例如，可以采用最大强度的50％或最大强度的30％或最大强度的70％或最大强度的1％和100％之间任意百分值的强度作为生物传感器输出参数。类似的，和强度的位置相似，若采用最大强度以外的强度，例如最大强度的45％，在共振峰内总会有两个位置具有该强度。正如强度位置参数，可以采用非最大强度，只是必须考虑所述强度是最大值前的强度或是最大值后的强度。

例如，当初始的细胞融合约为50％(约50％融合时，传感器表明的细胞往往产生最大的PWHM值)时，抑制剂和激活剂的同时存在导致培养后半峰宽(PWHM)降低；但是，另一生物传感器输出参数，例如总体角度变化(即共振峰的中心位置)可用于区分抑制剂和激活剂和完全无效的分子。PWHM是在峰最大强度(高度)一半处的峰上两点间连线的长度，如图6B所示。例如，当所有传感器上的细胞密度基本一致或大致相同时，细胞增殖的抑制剂产生的角度变化往往小于完全未受处理的细胞，而激活剂产生的角度变化往往大于细胞未经任何处理的传感器。当所有分子的浓度相同时，可以通过分子对PWHM值的影响确定分子抑制(作为抑制剂)或刺激(作为激活剂)细胞增殖的效能或能力。与共振峰中心位置的变化联用，预先确定的PWHM变化值可用来过滤出抑制剂或激活剂。取决于检测给定模式共振峰所用解调系统，PWHM的单位或数值可以不同。例如，对于角度解调系统，单位可以是度。例如，PWHM变化的度数可以是千分之一、千分之二、千分之三、千分之五、千分之七、或千分之十。

(c)峰形

可采用的另一生物传感器输出参数是总体峰形、或在某强度“之间”或该处的峰形。例如，可采用最大峰强度一半、或任何其它强度(例如30％、40％、70％、或88％、或20-100％之间的任何百分值)处的峰形作为生物传感器输出参数。形状可以用特定强度之下或之上的峰面积鉴定。例如，在在最大峰强度的一半处，有一个峰前强度点和一个峰后强度点。可以在这两点间划线，可以确定共振峰内该线上面的面积或共振峰内该线下面的面积并成为生物传感器输出参数。应当理解给定峰的积分面积也可用于分析分子作用于细胞的影响。

另一种涉及形状的生物传感器输出参数可以是特定峰强度的共振峰宽度。例如，可以通过测量50％峰强度的峰前强度点和50％峰强度的峰后点之间连线的尺寸确定最大峰强度一半处的共振峰宽(HMPW)。该测量可用作生物传感器的输出参数。应当理解可以用这一方式确定20到100％峰强度之间任何强度的的共振峰宽度。(实施例可参见附图，例如图6B)。

(3)生物传感器共振带图像的相关参数

目前，多数光生物传感器一次一项地监控靶分子与固定在传感器表明的探针分子的结合、或者传感器表面的细胞粘着或细胞活力。对于多个生物传感器上的结合事件或细胞粘着或细胞活力，研究人员通常以时序的方式监控这些事件。因此，不同传感器之间的直接比较是个挑战。此外，这些监测系统不论是波长或是角度调查都采用小点(～100-500μm直径)的激光照射传感器。应答或共振峰代表照射区域的平均细胞应答。对于96孔生物传感器微孔板(例如康宁的Epic微孔板)，各RWG传感器约为3x3mm²并位于各孔底部，而对于384孔形式的微孔板，传感器尺寸一般为1x1mm²。因此，采用现有传感器技术所得应答仅代表传感器表面的一小部分。理想地，检测系统应不但能同时监控附着在多个生物传感器上的活细胞的应答，还能对各传感器上的较大区域或多个区域进行信号解调。

通过成像光学解调系统(例如CCD相机)得到的共振带是通过考察，例如在单个传感器上限定位置反射(即出偶联的)光强度相对物理位置，产生的数据输出类型。反射光与入偶联光直接相关。或者，可以通过扫描解调系统采集共振带，采用小激光点照射传感器，以一维或二维形式扫描整个传感器、并采集给定导模的共振峰。最后可重新组成共振峰或光强度随传感器内位置的变化以形成传感器的共振带。在生物传感器中，当产生特定波长的光或者当产生光使之以特定角度射到生物传感器上时，出偶联光随传感器表面或接近传感器表面的折射率的变化而改变，这种改变导致成像系统采集的各传感器的共振带的特征改变。此外，培养后细胞在整个传感器上的不均匀粘着可以采用共振带直接显现(例如，参见图1中圈注的共振带)。在理想的多孔生物传感器微孔板中，各传感器的位置相对其它生物传感器的位置标准化；即传感器通过微孔板中整行或整列各孔的中心对齐。因此，所得共振带图像可用作细胞粘着或应答刺激的细胞变化的内部参比。因此，各给定模式传感器的共振带提供了另外的参数，可用于与该带相关的DMR或细胞影响评估。下面讨论其中的子集。

(a)带形

另一可采用的生物传感器输出参数是各给定模式生物传感器的共振带形状。所述形状由跨越各传感器较大区域的强度分布定义。所述形状可用于指示所粘附细胞的均一性或所述较大区域内对刺激应答的细胞改变(例如，如图1所示，各共振带代表跨越整个大小为约200mmx3000mm的传感器的应答)。

(b)位置

和给定模式的各传感器共振峰的位置类似，各共振带的位置可用作生物传感器输出参数。可以采用成像软件定量强度以产生各带最大强度的中心位置。该位置可用于检测应答刺激或分子处理的细胞变化。

(c)强度

正如共振带的位置，采用成像系统采集的出偶联光强度可用作生物传感器输出参数。整个带的平均强度或成像带中各像素的绝对强度可用于检测细胞粘附的质量并评价细胞应答。

(d)分布

采用成像系统采集到的具有限定角度或波长的出偶联光的分布可用作生物传感器输出参数。该参数可在无固定细胞或探针分子时用于评估传感器本身的表面性质，也可检测传感器表面整个被照区域中细胞粘附的质量。同样，该参数还可在整个区域的细胞密度一致时用于检查分子对细胞影响的均一性；或在受照区域内某一部分与其它部分的细胞密度不同时用于检测细胞密度对分子诱导的细胞应答的影响。

(e)宽度

正如给定模式共振峰的PWHM，采用成像系统获得的共振带的宽度可用作生物传感器输出参数。该参数和共振峰的PWHM值具有几乎相同特征，进而共享有用信息内容，区别在于，本参数能获得传感器受照区域多个部位的多个带宽，而不是只有一个PWHM用于共振峰。与其它通过共振带成像获得的参数相似，宽度可用于上述应用。

对于本文公开的采用生物传感器的任何细胞试验给定应用，所有这些参数可独立使用或一起使用。使用参数的任何子集或组合可为给定试验或具体试验的给定变化产生特征，例如用于细胞受体试验的特征，和进一步用于基于EGF受体试验的特定特征。

12.方法

公开了用于鉴定分子的方法，其包括：采集分子的生物传感器应答生成初级概况；在分子存在下采集细胞组中标志物组的生物传感器应答生成二级概况；从各生物传感器信号中提取特定生物传感器参数群；将各生物传感器参数对阳性对照标准化以生成调节比较；将至少一种生物传感器参数的调节比较对标志物组或细胞组作图以生成分子调节指数；可选地，联用分子的初级概况和分子调节指数以生成分子生物传感器指数；和可选地，比较所述分子生物传感器指数与调节剂生物传感器指数库。

还公开了采用生物传感器细胞试验筛选分子的方法，其包括：选择细胞组；选择标志物组，各组标志物用于细胞组中的一种细胞；用分子处理组内的每种细胞产生经分子处理的细胞组；监控生物传感器应答以产生所述分子的初级概况组，每种细胞一个概况；将标志物组中各标志物单独添加到经分子处理的细胞组中的每种细胞中，其中各标志物为特定剂量；监控生物传感器应答以产生分子影响标志物生物传感器信号的二级概况组，每个标志物一个概况；对全组细胞并针对标志物组生成分子生物传感器指数；可选地，比较分子生物传感器指数与已知调节剂生物传感器指数，其中分子生物传感器指数和调节剂生物传感器指数之间的相似性是分子作用模式的指示剂。

公开了鉴定分子的方法，其包括：用一组已知配体比较、淘选细胞组以确定已知配体是否在给定细胞类型中引发强生物传感器信号，选择引发强生物传感器信号的配体作为标志物以产生给定细胞类型的标志物库，确定各标志物在特定细胞类型中引发生物传感器信号能力的效能和功效，确定各标志物在特定细胞类型中引发的信号传导途径和网状相互作用，减选各细胞类型的标志物组，进行试验以检测分子在细胞组中引发生物传感器信号的能力从而生成所述分子的初级概况组，并检查分子在细胞组中调节标志物诱导的生物传感器信号的能力以生成二级概况组或所述分子针对标志物组的调节概况，生成分子生物传感器指数，和可选地，比较所述分子的生物传感器指数和已知调节剂生物传感器指数库。

公开了用于鉴定分子的方法，其包括：采集分子的DMR应答生成初级概况；在分子存在下采集细胞组中标志物组的DMR应答生成二级概况；从各生物传感器信号中提取特定DMR参数群；将各DMR参数对阳性对照标准化以生成调节比较；将至少一种DMR参数的调节比较对标志物组或细胞组作图以生成分子调节指数；可选地，联用分子的初级概况和分子调节指数以生成分子DMR指数；和可选地，比较所述分子DMR指数与调节剂DMR指数库。

还公开了生物传感器检测DMR的方法，进一步包括识别与分子生物传感器指数中一个或多个分子调节概况相似的调节剂生物传感器指数中的一个或多个标志物调节概况，其中当分子生物传感器指数与调节剂生物传感器指数相似时所述分子和所述调节剂共用相似的作用模式；其中步骤a)在激动模式下进行；其中步骤d)中的阳性对照包含细胞的样品仅用标志物处理时产生的标志物初级概况；其中调节比较包括增强；其中调节比较包括抑制；其中调节比较包括无调节；其中调节剂生物传感器指数库包含分子调节指数；其中调节剂生物传感器指数库包含不同分子但在相同细胞组中针对相同标志物组；其中分子生物传感器指数和调节剂生物传感器指数之间的相似性用作作用模式的指示剂；其中相似性是基于分子生物传感器指数之间的模式识别分析；其中相似性是基于分子调节指数之间的模式识别分析；其中相似性是基于分子调节指数的分数矩阵；其中细胞组与特定疾病、特定细胞靶标、特定起源相关或是代表特定的人生理或病理生理；其中细胞组中包括至少一种细胞系统；其中细胞系统包含两类细胞；其中所述标志物组从配体库中选择，每个标志物产生表明细胞中特定细胞信号传导途径的生物传感器信号；其中所述步骤e)中标志物的特定剂量包含其在细胞内引起生物传感器信号的EC₅₀、EC₈₀、EC₉₀、EC₉₅或EC₁₀₀中的至少一个浓度，还包含在没有或存在标志物情况下在细胞中产生长期分子生物传感器信号，其中标志物在向细胞添加分子之前、同时、或之后添加，其中细胞组包含与特定疾病相关的细胞种类、来自特定来源的细胞种类、与特定靶标相关的细胞种类、或与特定生理功能相关的细胞种类，其中细胞组包含天然细胞、工程细胞、转化细胞、永生细胞、原代细胞、胚胎干细胞、成人干细胞、肿瘤干细胞、或干细胞衍生细胞，其中步骤(a)包括将细胞与特定剂量的分子接触，其中步骤(b)包括将细胞与特定剂量的标志物组中的标志物接触；其中步骤(b)包括将细胞与特定剂量的分子接触，其中特定剂量是分子选自1μM、5μM、10μM、或50μM的某个浓度，其中特定剂量是分子选自1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、或100μg/ml的某个浓度，其中特定剂量是标志物在细胞内引发其生物传感器信号的EC₅₀、EC₈₀、EC₉₀、EC₉₅、或EC₁₀₀，其中步骤(b)包括将细胞与配体接触一段时间，然后将细胞与标志物接触，其中步骤(b)包括将细胞与标志物接触一段时间，然后将所述细胞与所述分子接触，其中步骤(b)包括将细胞同时与标志物和分子接触；其中步骤(d)包括比较(1)标志物的初级概况的P-DMR幅度和分子针对标志物的二级概况的P-DMR幅度、(2)标志物的初级概况的N-DMR幅度和分子针对标志物的二级概况的N-DMR幅度、(3)标志物的初级概况的RP-DMR幅度和所述分子针对标志物的二级概况的RP-DMR幅度、或其组合，其中所述调节比较包括调节差异、调节百分数、或其组合。

公开了生成指数的方法，其包括：采集分子针对超过一种标志物的调节概况；并在指数中列出分子的调节比较。

还公开了一种方法，其中在一种细胞中对多种标志物获得调节指数，其中在多种细胞中对一种标志物获得调节指数，其中在多种细胞中对多种标志物获得调节指数，其中对多种标志物获得调节指数。

还公开了药物发现的方法，其包括：比较未知分子的指数和已知调节剂的指数，确定未知分子配体指数是否与已知调节剂指数相似。

公开了鉴定分子的方法，其包括：将细胞与标志物接触，测试细胞对标志物的应答以得到初级概况；将细胞与标志物和分子接触，测试细胞对标志物和分子的应答以得到调节概况。

公开了鉴定分子的方法，其包括：将细胞与标志物和分子接触，测试细胞对标志物和分子的应答。

还公开了方法，进一步包括在之前的步骤后合成所述分子的步骤，进一步包括制备所述分子衍生物库的步骤，其中在机器上进行一个或多个步骤，其中机器是一般计算机，其中机器是生物传感器。

公开了制备组合物的方法，其包括合成分子，其中所述分子表征为分子，其中所述分子指数与调节剂指数相似，并能采用本文提供的方法识别。

公开了通过本文公开的过程和方法生成的产物。

V.实施例

A.实验过程

1.材料

ADP、ATP、UTP、UDP、腺苷、精胺、组胺、肾上腺素、反油酸、脂氧素A4、烟酸、吡那地尔、poly(I:C)、毛喉素、和表皮生长因子(EGF)购自密苏里州圣路易斯的西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.)。佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、HA1077、H-8、LY294002、槲皮素、U0126、AG1478、BML-265、粗糠柴苦素、和由80种激酶抑制剂组成的BioMol激酶库从生物分子国际公司(BioMol International Inc)获得。缓激肽、肾上腺髓质素、SFLLR-酰胺、血管紧张素、神经肽Y、和SLIGKV-酰胺从加利福尼亚州托兰斯的巴化美洲公司(BaChem Americas Inc.)获得。细胞培养兼容的Epic384生物传感器微孔板从康宁公司获得。

2.细胞培养

所有细胞系都从美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州玛纳萨斯)(American Type Cell Culture(Manassas，VA))获得。细胞培养基如下：补充10％胎牛血清(FBS)、4.5g/l葡萄糖、2mM谷氨酰胺、和抗生素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)用于人表皮样癌A431和人肺癌A549。

细胞在生物传感器微孔板中生长，每孔中约1-2x10⁴个3-15次传代的细胞悬浮在50μl相应的培养基中，并在37℃和空气/5％CO₂下培养约1天。A431有所不同，它通过在无血清DMEM中连续培养经受约20小时的饥饿，其它细胞类型不经饥饿直接进行试验。所有细胞在试验时的融合度为约95％到100％。

3.光生物传感器系统和细胞试验

使用Epic波长解调系统(纽约州康宁的康宁公司)进行全细胞感测。该系统由温度控制单元、光学检测单元、和用机器人的机载液体操作单元组成。所述检测单元以集成光纤为核心，能以约15秒的时间间隔对细胞应答进行动力学测量。

RWG生物传感器能检测靠近传感器表面的局部折射率的微小变化。由于细胞内局部折射率随密度及其生物物质(例如，蛋白质，分子复合物)分布而变化，生物传感器利用其渐消波非侵入性地检测天然细胞内配体诱导的动态质量再分布。渐消波延伸入细胞并随距离呈指数衰减，产生约150纳米的特征感测量，提示任何通过受体激活介导的光应答仅代表渐消波取样的细胞部分的平均值。受体激活下游许多细胞事件的集合确定配体诱导DMR的动力学和幅度。

对于生物传感器细胞试验，通过用HBSS(1x汉克斯平衡盐溶液(Hanksbalanced salt solution)，添加20mM Hepes，pH 7.1)稀释保存的浓缩溶液制得分子溶液，并转移到384孔聚丙烯分子保藏板以准备分子源板。当进行两步试验时，分别制备分子和标志物的源板。平行地，细胞用HBSS清洗两次并保持在30μl HBSS中以准备细胞试验板。然后将细胞试验板和分子与标志物源板在读板系统的厢内孵育。孵育约1小时后，记录细胞试验微孔板中所有生物传感器的波长基线并标准化到0。然后，进行2-10分钟连续记录以确立基线，并确保细胞达到稳态。随后，通过用机载液体处理器将10μl标志物溶液吸入细胞试验板引发细胞应答。

为研究分子对标志物诱导应答的影响，用固定剂量(一般为EC₈₀或EC₁₀₀)的标志物进行第二刺激。在第二刺激开始前，再次标准化微孔板中所有生物传感器的共振波长以确立第二基线。两次刺激通常分隔约1小时。所有研究在受控温度(28℃)下进行。进行至少两组独立实验，各组至少有三个重复样。发现实验的变异系数＜10％。

B.实施例1：基于细胞概况药理学的药物发现的概述

第一，选择两种上皮癌细胞系以阐明药物发现的细胞概况药理学方法。上皮层是感染的初始屏障，是先天免疫的重要参与者。感染过程中所有病原体必须找到一种方式经气道、胃肠道、泌尿生殖道、或皮肤切口(或灼伤处)通过上皮层。所述两种细胞系是人气道上皮细胞A549和人皮肤上皮细胞A431。

第二，采用已知配体(例如，GPCR激动剂、受体酪氨酸激酶激动剂、Toll样受体(TLR)激动剂、蛋白激酶C(PKC)激活剂、腺苷酸环化酶激活剂、磷酸二酯酶抑制剂、离子通道开放剂或激活剂、肌动蛋白破坏剂、或细胞凋亡剂等)进行了靶标淘选研究以确定已知配体是否能在所选细胞类型中引发强DMR信号。

第三，用配体在各细胞类型中引发DMR信号的能力确定各配体效能和功效。

第四，通过化学生物学和细胞生物学方法的联用确定各特定细胞类型中由各配体引发的信号传导途径和网状相互作用。

第五，对各细胞类型，根据这些标志物引发的信号传导途径和其它因素(例如疾病特异性靶标或途径)，从这些配体的集合中选出标志物组。通常，能引起强生物传感器信号如DMR信号的配体含有特定途径信息，随后成为标志物。可以为给定类型的细胞识别出标志物库。值得注意的是，对特定细胞靶标或受体可以使用多于一种标志物。例如，对A431中的β2肾上腺素能受体，可以选择肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、沙美特罗(salmeterol)、CGP12177和吲哚洛尔(pindolol)可选作标志物。

第六，进行一系列试验检测分子在细胞组中引发DMR信号的能力(即，分子的初级概况)，和分子在细胞组中改变所述标志物诱导DMR信号的能力(即，分子的二级概况)。

第七，生成分子针对细胞/标志物组的DMR指数。

第八，针对相同细胞/标志物组比较分子DMR指数与已知调节剂DMR指数。

C.实施例2：A549细胞中靶标淘选识别的标志物/靶标

进行靶标淘选研究以探索(1)A549细胞是否内源性地表达所选配体组的受体；和(2)确定用配体组靶向这些受体是否引起强DMR信号。

首先，选出靶向GPCR的配体组，各为10μM浓度，并用Epic系统通过DMR测量检查它们对A549细胞的作用。所述配体组包括四种P2Y激动剂ADP、AT、UTP和UDP、腺苷受体激动剂腺苷、钙感应受体激动剂精胺、组胺受体激动剂组胺、肾上腺素能受体激动剂肾上腺素、游离脂肪酸受体激动剂反油酸、脂氧素受体激动剂脂氧素A4、缓激肽受体激动剂缓激肽、肾上腺髓质素(adrenodullin)受体激动剂肾上腺髓质素、PAR1激动剂SFLLR-酰胺、血管紧张素受体激动剂血管紧张素、神经肽Y受体激动剂神经肽Y、和PAR2激动剂SLIGKV-酰胺。如图3A和3B所示，所有这些配体在A549中引起强DMR信号。

其次，选出第二配体组，并用Epic系统通过DMR测量检查它们对A549细胞的作用。所述组包括蛋白激酶C激活剂PMA、内源性K_ATP离子通道激活剂吡那地尔、腺苷酸环化酶激活剂毛喉素、和内源性Toll样受体(TLR)激活剂聚(I:C)。如图8所示，这组配体在A549中引起强DMR信号。

确定这些配体在A549细胞中引发强DMR信号后，通过采用Epic系统获得A549细胞对标志物的剂量依赖性应答确定各标志物的效能和功效。

随后，采用化学生物学和细胞生物学方法进一步检测引起各配体DMR信号的细胞信号传导途径。结果显示，所有这些配体诱导的DMR信号包含特定的但不同的信号传导途径信息。因此，所有这些配体可选作A549细胞的标志物。这些标志物的全部或部分集合可组成A549的标志物组。

D.实施例3：A431细胞中表皮生长因子受体的系统细胞生物学分析

对A431部分静息细胞进行Epic细胞试验，细胞通过在含血清培养基中培养1天然后在含0.1％胎牛血清的培养基中进行20小时的饥饿培养获得。所述试验表明，A431细胞的EGF刺激引起DMR信号，其具有两个不同序列阶段：(i)信号增强的正阶段(P-DMR)，和(ii)衰减阶段(N-DMR)。化学生物学和细胞生物学研究显示，这一EGF诱导的DMR信号主要与Ras/MAPK途径相关，该途径通过MEK进行并导致细胞脱离(Fang，Y.等，(2005)“Characteristicsof dynamic mass redistribution of EGF receptor signaling in living cells measuredwith label free optical biosensors(用无标记光生物传感器测得的活细胞内EGF受体信号传导的动态质量再分布的特征)”，Anal.Chem.，77，5720-5725)。

在此，随后采用波长解调Epic系统检查A431完全静息细胞中EGFR的系统细胞生物学。EGF悬浮在含有0.1％无蛋白酶与无脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)的1xHBSS中。在最适条件下，A431静息细胞中EGF引发了剂量依赖性应答(数据未显示)。如图4所示，EC₈₀(～32nM)的EGF在完全静息细胞中导致不同的强DMR信号。EGF DMR信号由三个阶段组成：初始的P-DMR事件，接着是N-DMR事件和恢复P-DMR(RP-DMR)事件。作为对比，图4所示的阴性对照中，仅试验缓冲液(即载剂)未引发任何显著的DMR信号。图4中，各DMR信号表示32个重复样的平均应答。

然后，采用第二组试验探测EGF的靶标特异性和信号传导途径。如图5所示，用BML-265或AG1478预处理的A431静息细胞几乎完全阻断了32nMEGF诱导的DMR信号。这提示EGF DMR信号是由于EGFR的激活，因为BML-265和AG1478都是EGFR酪氨酸激酶抑制剂。图5还显示，用U0126预处理A431静息细胞显著并选择性地减弱了N-DMR和RP-DMR信号。这提示N-DMR事件至少部分通过MAPK途径进行，可能是由于MEK-FAK介导的细胞脱离，因为U0126是MEK激酶抑制剂。图5还显示，用粗糠柴苦素预处理的细胞特异地导致早期P-DMR事件和部分早期N-DMR事件的截短。这提示EGF DMR信号中的早期DMR应答是由于EGFR下游PKC途径的激活，因为粗糠柴苦素是PKC抑制剂。

最后，采用80种标志物的BioMol激酶抑制剂库系统探测EGF DMR信号。用10微摩尔浓度的各激酶标志物处理A431完全静息细胞约1小时。在分子预处理后，测量EGF诱导的DMR信号。从各应答中提取三种DMR参数，P-DMR、N-DMR和RP-DMR的幅度，并对激酶调节剂作图。如图6A、6B、和6C所示，这些不同的激酶抑制剂差异性地调节不同EGF DMR参数。这提示EGF DMR缺失包含A431静息细胞中EGFR介导的信号传导的系统细胞生物学信息。

E.实施例4：A431和A549细胞中不同标志物组诱导的DMR信号

将第一标志物组在各标志物浓度接近EC₈₀或EC₁₀₀下与A431静息细胞接触，并用EPIC获得DMR测量。该标志物组选自用Epic细胞试验在A431细胞中识别的标志物库。该组包括表皮生长因子(EGF)、肾上腺素、烟酸、和组胺。这些标志物中每个都引起广泛的细胞信号传导。联用Epic细胞试验和与上述EGFR DMR相似的化学生物学与细胞生物学方法，我们确定了A431细胞中产生各标志物诱导DMR信号的途径和网状相互作用。主要观察总结如下。表皮生长因子是A431细胞中内源性EGF受体的天然激动剂，该受体的激活引起各种细胞信号传导，包括PLC-PI3K途径、MAPK途径、STAT途径、和PKC途径。肾上腺素是A431细胞中内源性β2肾上腺素能受体的天然激动剂，该受体的激活引发cAMP-PKA途径。烟酸是A431中内源性GPR109A受体的天然激动剂，该受体的激活引向Gi介导的信号传导和MAPK途径。组胺是A431中内源性组胺1型受体(H1R)的天然激动剂，该受体的激活引向Gi介导的信号传导和PKC途径。图7显示通过Epic细胞试验确定的A431完全静息细胞应答第一标志物组刺激的DMR信号。每个DMR信号代表4个重复样的平均应答。

将第二标志物组在各标志物浓度接近EC₈₀或EC₁₀₀下与A549细胞接触，并用EPIC获得DMR测量。该组包括聚(I:C)、SLIGKV-酰胺、吡那地尔、PMA、组胺、和毛喉素。这些标志物中每个都引起广泛的细胞信号传导。联用Epic细胞试验和与上述EGFR DMR相似的化学生物学与细胞生物学方法，我们确定了使A549细胞中产生各标志物诱导DMR信号的途径和网状相互作用。主要观察总结如下。聚(I:C)是A549中内源性Toll样受体的激动剂，该受体的激活引发IKK途径和AKT途径。SLIGKV-酰胺是A549中内源性蛋白酶激活受体亚型2的激动剂，该受体的激活引起G_q-、G_i-和G_12/13介导的信号传导。吡那地尔是A549中内源性ATP敏感(K_ATP)钙离子通道的激动剂，该通道的激活引起Rho-和JAK-介导的信号传导。PMA是蛋白激酶C(PKC)的激活剂，该激酶的激活引发PKC途径和脱粒。组胺是内源性组胺受体(主要为H1R，并可能是H3R)的天然激动剂，该受体的激活引起双重信号传导，可能通过A549中G_q和G_i介导的信号传导。毛喉素是腺苷酸环化酶的激活剂，该酶的激活在A549中引发cAMP-PKA途径。图8显示通过Epic细胞试验确定的A549细胞应答第二标志物组刺激的DMR信号。每个DMR信号代表4个重复样的平均应答。

F.实施例5：配体的DMR指数

生成4种配体分子的DMR指数。A431静息细胞和A549增殖细胞分别暴露于配体分子约1小时以产生其初级概况，然后通过用固定浓度(如图7和8所述)的各标志物再刺激1小时左右以产生在两种细胞中分子针对标志物组的二级概况。接着，选择一个或多个特定DMR参数作为读数绘制分子的DMR指数图。对A549中吡那地尔的DMR应答，选取N-DMR的幅度(即，刺激后30分钟的幅度)。对A549中聚(I:C)的DMR应答，选取后期DMR的幅度(即，刺激后50分钟的幅度)。对A549中的PMA应答，选取后期DMR的幅度(即，刺激后50分钟的幅度)。对A549中SLIGKV-酰胺的DMR应答，选取P-DMR的幅度(即，刺激后20分钟的幅度)。对A549中的毛喉素应答，选取P-DMR的幅度(即，刺激后50分钟的幅度)。对A549中的组胺应答，选取早期DMR的幅度(即，刺激后10分钟的幅度)和后期应答(即，刺激后30分钟的幅度)。对A431中的肾上腺素应答，选取P-DMR的幅度(即，刺激后50分钟的幅度)。对A431中的烟酸应答，选取P-DMR的幅度(即，刺激后3分钟的幅度)。对A549中的EGF DMR应答，选取P-DMR(即，刺激后4分钟的幅度)和N-DMR幅度(即，刺激后4分钟到40分钟之间的衰减幅度)。对A431中的组胺应答，选取P-DMR的幅度(即，刺激后3分钟的幅度)。通过将细胞中所述分子针对所述标志物的二级概况对相同标志物作用于相同细胞的初级概况标准化，计算得到针对各标志物的所述标志物调节百分数。

如图9、10、11、和12所示，配体分子的DMR指数可以包括两种应答：两种细胞系中的激动模式应答(即，配体引发的初级概况)，和拮抗模式DMR指数(即，配体针对两组标志物的二级概况，各用于一个细胞系)。

图9显示了已知配体PKA/PKG抑制剂HA1077的DMR指数。HA1007在A549和A431细胞中都引发相似的N-DMR信号。HA1077几乎完全弱化了A549中的吡那地尔应答，部分弱化了A431中的肾上腺素应答，并部分弱化了A431中的组胺应答。但是，HA1077显著增强了A549中的PMA应答和组胺应答。

图10显示了另一已知配体PKA/PKG抑制剂H-8的DMR指数。与HA-1077相比，H-8产生相似的DMR指数。但是，H-8弱化A431细胞中组胺应答和肾上腺素应答的效果较低。这些结果表明两种抑制剂调节相同的靶PKA。

图11显示了已知配体PI3K抑制剂LY294002的DMR指数。LY294002选择性地部分弱化A431中的EGF应答，但增强A431中的组胺应答。如图12所示，另一PI3K抑制剂槲皮素产生相似的DMR指数。这些结果表明两种抑制剂调节相同的靶PI3K。

如图9、10、11和12所示，HA1077或H-8的DMR指数与LY294002或槲皮素的DMR指数显著不同，提示HA1077与H-8靶向的细胞靶标和LY290042或槲皮素不同。

G.实施例6：制备用于EPIC系统试验的A431和A549细胞

1.目的：

本方法提供了如何解冻、传代、接种和准备两种不同贴壁细胞系(A431和A549)的指南，用于通过Epic系统进行分子的细胞概况药理学分析。

2.方法的原理和推荐：

a)原理：

(1)当细胞暴露于某些分子时，它们会发生反应，其方式能通过Epic系统检测和监控。不论是因为胞吞作用、凋亡、细胞运输或细胞重排，这些运动可以在RWG生物传感器的感测体积上观察并跟踪。

(2)目前采用两种细胞系研究这些效应。A549是贴壁细胞系，是染色体众数为12的亚三倍体人细胞，出现在24％的细胞中并为上皮形态。A431细胞是从人表皮样癌衍生的贴壁细胞，也显示上皮形态。

b)推荐：

所用A549和A431细胞的传代数都应在2-15之间。更高的传代数可能引起生物传感器应答的变动。

3.设备和设置

a)A431细胞系(#CRL-1555，ATCC，Manassas，VA(弗吉尼亚州马纳萨斯))

b)A549细胞系(#CRL-185，ATCC，Manassas，VA)

c)DMEM(#10566-016，Invitrogen，Carlsbad，CA(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德))

胎牛血清，认证级、热灭活(#10082-139，Invitrogen，Carlsbad，CA)

e)青霉素-链霉素液体(100X)(#15140-122，Invitrogen，Carlsbad，CA)

f)遗传霉素(100x)(#10131-027，Invitrogen，Carlsbad，CA)

g)胰蛋白酶-EDTA(0.25％胰蛋白酶与EDTA 4Na)1X(#25200-056，Invitrogen，Carlsbad，CA)

h)1M HEPES缓冲溶液(#15630-080，Invitrogen，Carlsbad，CA)

i)汉克斯平衡盐溶液(1xHBSS)，1X含钙和镁，但无酚红(#14025-092，Invitrogen，Carlsbad，CA)

j)Z序列、Z-pak(#8320312，Beckman-Coulter，Fullerton，CA(贝克曼库尔特公司，加利福尼亚州富勒敦))

k)Dilu-Vial(#3-341-13，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA(费歇尔科学公司，宾西法尼亚州匹兹堡))

l)康宁25cm²透气盖细胞培养瓶(T-25)(#430639，Corning Inc.，Corning，NY(康宁公司，纽约州康宁))

m)康宁75cm²透气盖细胞培养瓶(T-75)(#430641，Corning Inc.，Corning，NY)

n)库尔特计数器(Coulter Counter)Z1(Z1 D型，Beckman-Coulter，Fullerton，CA)

o)康宁Epic 384孔生物传感器微孔板细胞培养兼容件(#5040，Corning Incorporated，Corning，NY)

p)康宁384孔聚丙烯分子贮存板(#3656，CorningIncorporated，Corning，NY)

4.溶液和试剂

a)完全DMEM(cDMEM)

(1)DMEM

(2)10％胎牛血清

(3)100ug/ml青霉素-链霉素(1X)

b)细胞试验缓冲液

(1)HBSS(含10mM Hepes的1xHBSS，pH 7.1)

5.步骤

a)初始细胞繁殖(从T-25瓶中分传/传代细胞)

(1)将完全DMEM培养基置于37℃水浴使其温至37℃

(2)将胰蛋白酶/EDTA 0.25％室温放置

(3)吸出旧培养基

(4)通过添加2ml(T-25)0.25％胰蛋白酶/EDTA到培养瓶中并轻柔往复摇动培养瓶来清洗瓶中的细胞

(5)吸出胰蛋白酶/EDTA

(6)向瓶中添加2ml(T-25)0.25％胰蛋白酶/EDTA

(7)在37℃、CO₂(5％)培养箱中孵育3-5分钟(A549)或8-12分钟(A431)或直至细胞开始从表面脱离，切勿往复摇动培养瓶，这样会导致细胞成团。

(8)向T-25培养瓶中添加3ml完全培养基并在瓶中上下吸放多次以分散细胞。

(9)可以分传入新培养瓶

(a)1∶10稀释(A431)-向新T-75瓶的15mlcDMEM中添加1.5ml新分散的细胞-细胞分传之间间隔约5天。

(b)1∶15稀释(A549)-向新T-75瓶的14mlcDMEM中添加1ml新分散的细胞-细胞分传之间间隔约4天。

(10)将T-75培养瓶放入设定为37℃、95％湿度的CO₂(5％)培养箱，直至在显微镜下视觉检查发现细胞达到＞90％融合-可以再次繁殖(分传)

b)细胞繁殖(从T-75瓶中分传/传代细胞)

(1)将完全培养基置于37℃水浴使其温至37℃

(2)将胰蛋白酶/EDTA 0.25％室温放置

(3)吸出旧培养基

(4)通过添加3ml(T-75)0.25％胰蛋白酶/EDTA到培养瓶中并轻柔往复摇动培养瓶来清洗瓶中的细胞

(5)吸出胰蛋白酶/EDTA

(6)向瓶中添加3ml(T-75)0.25％胰蛋白酶/EDTA

(7)在37℃、CO₂(5％)培养箱中孵育3-5分钟(A549)或8-12分钟(A431)或直至细胞开始从表面脱离，切勿往复摇动培养瓶，这样会导致细胞成团

(8)几乎所有细胞从培养瓶表面脱离后，添加12ml(T-75)完全培养基至细胞。通过在瓶中上下吸放数次分散细胞。

(9)可以分传入新培养瓶

(a)1∶10稀释(A431)-向新T-75瓶的14mlcDMEM中添加1.5ml新分散的细胞-细胞分传之间间隔约5天。

c)细胞计数

(1)打开贝克曼库尔特颗粒计数器

(2)在计数容器中装入10ml稀释液

(3)向所述10ml中添加50μl细胞

(4)按开始按钮，开始计数

(5)结束时计数器会显示结果

(6)进行两次计数-若计数差异超过约5％则进行更多次

(7)确定原液中细胞/ml的浓度：

[(细胞数)(10ml)]/[(0.05ml样品)(0.5ml库尔特取样体积)]或(细胞数)(400)

(8)总细胞数＝细胞浓度细胞/ml*细胞总体积

d)细胞接种

(1)收获后，收集T-75瓶中的细胞

(2)细胞数量计数

(3)室温下以约2000rpm离心细胞5分钟

(4)吸出培养基

(5)在50ml离心管中用cDMEM培养基将细胞重悬到最终接种浓度，A431为400,000个细胞/ml，A549为320,000个细胞/ml

(6)用自动移液器向384孔生物传感器板各孔中添加50μl细胞

(7)确保没有气泡陷在孔底部

(8)需要通过吸出气泡并加回孔中来除去每个气泡

(9)平板在层流通风橱中孵育至少15-30分钟

(10)以37℃和95％湿度在5％CO₂培养箱中孵育细胞直至达到所需融合度，一般要过夜

e)A431细胞饥饿

(1)进行试验前一天，细胞需要饥饿至少16小时

(2)将无血清培养基(含1X青霉素/链霉素的DMEM)37℃放置

(3)轻拍平板将所有血清培养基倒入适当容器中，或采用洗板机

(4)添加50μl无血清培养基到各孔

(5)重复步骤(3)和(4)一次

(6)以37℃、95％湿度在5％CO₂培养箱中孵育细胞至次日

6.准备Epic Beta系统上的实验

a)采用Biotek ELx405UCW洗板机清洗细胞

(1)从CO2培养箱中取出有细胞的细胞试验平板

(2)揭除板盖

(3)用50μl HBSS由洗板机清洗细胞两次

(4)添加50μl HBSS/孔

(5)吸出足量缓冲液以留下40μl

b)盖上板盖

c)将带盖平板放入Epic仪器的厢内至少1小时

7.设置参数并在Epic Beta系统上进行实验

a)选择适当的试验参数，包括数据采集速率(一般为15秒/读取)和基线时间(约2分钟)和试验时间(约60或90分钟)

b)选择适当的机器人参数，包括化合物源板类型、移除板盖、化合物添加与混合、和放回板盖

c)更换吸头(CyBio Cat # OL2001-25-250)

d)装载源板(分子板)和测试板(细胞试验板)

e)键入“Plate ID”-平板名称

f)采用标准方案(Standard Protocol)运行“Assay Protocol”-每次扫描为对试验平板底部两次扫掠的平均

(a)预扫描120秒作为基线

(b)添加10μl的5X浓度所述分子

(c)另外扫描2400秒(约1小时)

g)卸载源板和测试板

VI.参考文献

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Claims

1.一种鉴定分子的方法，该方法包括：

a.采集细胞组中分子的无标记生物传感器应答生成初级概况，其中所述初级概况是在所述分子接触细胞时生物传感器的应答；

b.在所述分子存在情况下采集细胞组中配体组内配体的无标记生物传感器应答生成二级概况，其中所述配体是能与生物分子结合并形成复合物用于生物学目的的分子，其中所述二级概况是细胞在所述分子存在时对配体的生物传感器应答；

c.从所述初级概况和二级概况提取特定生物传感器参数群；

d.将各生物传感器参数对取自初级概况的所述生物传感器参数标准化以产生调节比较；

e.将至少一个生物传感器参数的调节比较对所述配体组或所述细胞组作图以产生分子调节指数；

f.联用所述分子的初级概况和所述分子调节指数以产生分子生物传感器指数；以及

g.将所述分子调节指数或分子生物传感器指数与调节剂生物传感器指数库比较。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括识别与所述分子生物传感器指数中一种或多种分子调节概况相似的所述调节剂生物传感器指数中一种或多种配体调节概况。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述分子生物传感器指数与所述调节剂生物传感器指数相似时，所述分子与所述调节剂共享相似的作用模式。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a在激动剂模式下进行。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物传感器参数是动态物质再分布DMR参数。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节剂生物传感器指数库包括分子调节指数。

7.一种采用无标记生物传感器细胞试验进行药物发现的方法，该方法包括：

a.比较未知分子的生物传感器指数与已知调节剂的生物传感器指数，其中所述未知分子的生物传感器指数是未知分子作用于细胞组的概况和所述分子针对配体组的调节概况，每组配体针对细胞组中的一种细胞，而已知调节剂的生物传感器指数是已知调节剂作用于细胞组的概况和所述已知调节剂针对配体组的调节概况，每组配体针对细胞组中的一种细胞；

b.确定未知分子生物传感器指数是否与已知调节剂生物传感器指数相似；其中所述生物传感器检测动态物质再分布DMR信号。

8.一种制备组合物的方法，该方法包括合成分子，其中所述分子用权利要求1所述方法测定的分子调节剂指数或分子生物传感器指数与调节剂生物传感器指数相似。

9.一种产品，通过权利要求8所述的过程制备。