CN102277364A - 融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE及其应用 - Google Patents

Abstract

一种编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因，由编码人凝血因子VII轻链的基因和编码力达霉素辅基蛋白的基因连接而成，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。一种表达融合蛋白LhFVII-LDP的重组质粒，含有编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因。所述融合蛋白LhFVII-LDP，由上述重组质粒表达而成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。所述强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE，由氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示的融合蛋白LhFVII-LDP和烯二炔发色团AE构成。所述融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE可在制备治疗肿瘤的药中应用。

Description

融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE及其应用

技术领域

本发明涉及一种针对组织因子的融合蛋白、强化融合蛋白及其在制备治疗肿瘤(癌症)的药中的应用与制备方法。 

背景技术

组织因子(tissue factor，TF)是一种在正常组织血管内皮细胞不表达，但在实体瘤新生血管内皮细胞和恶性肿瘤细胞表面特异性高表达的肿瘤细胞表面受体，是肿瘤治疗的重要靶点。力达霉素(lidamycin，LDM)，也叫C1027，是由我国湖北省潜江市土壤中分离得到的一株放线菌(Streptiomyces globisporus C-1027，菌种保藏号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。力达霉素的分子由两部分组成：一部分为烯二炔发色团(AE，相对分子质量为843Da)，具有很强的细胞毒作用，但不稳定；另一部分为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP，相对分子质量为10500Da)，对烯二炔发色团的稳定起保护作用。所述发色团和辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合具有特异性和牢固性，二者可以拆分和进行分子重建，重建后的分子与天然分子活性类似。体内动物实验表明，力达霉素(LDM)对小鼠结肠癌细胞CT-26的移植瘤有非常显著的疗效，对Bel-7402和Hce-8693等多种人肿瘤细胞的移植瘤均有显著疗效(中国抗生素杂志，1994，19：164-8)。分子药理学研究表明，其主要作用机制是引起特异DNA断裂，从而诱导细胞凋亡。由于力达霉素具有很强的细胞毒作用，在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞也有杀伤作用，致使动物耐受剂量受到限制。然而正是由于其很强的细胞毒作用，力达霉素可用作制备靶向药物的高效“弹头”药物。 

人凝血因子VII(human factor VII，hFVII)的蛋白质分子由406个氨基酸残基组成，分子量约为50kD。其分子包含四个结构域：N末端膜结合的γ羧基谷氨酸结构域(Gla结构域)，两个表皮生长因子(EGF)样结构域和一个C端丝氨酸蛋白酶结构域。迄今为止，尚未见以人凝血因子VII或其轻链作为药物的靶向结构域及人凝血因子VII或其轻链与力达霉素构成的强化融合蛋白的相关报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种编码融合蛋白LhFVII-LDP的基因、表达融合蛋白LhFVII-LDP的重组质粒及融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE，本发明的再一目的是证明融 合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE具有与肿瘤细胞表面组织因子结合的活性，为制备靶向肿瘤治疗药物提供一种新方法。 

本发明所述编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因，由编码人凝血因子VII轻链(light chain of human factor VII，简称LhFVII)的基因和编码力达霉素辅基蛋白(lidaprotein，简称LDP)的基因连接而成，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。 

本发明所述表达融合蛋白LhFVII-LDP的重组质粒，含有编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因，该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。 

本发明所述融合蛋白LhFVII-LDP，由上述重组质粒表达而成，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，分子量约为33kDa。 

本发明所述强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE，由氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示的融合蛋白LhFVII-LDP和烯二炔发色团(active enediyne，简称AE)构成。所述烯二炔发色团与融合蛋白LhFVII-LDP中的力达霉素辅基蛋白(LDP)结合。 

本发明通过实验证明：融合蛋白LhFVII-LDP具有与人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人肝癌细胞等肿瘤细胞表面组织因子结合的活性。融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人肺癌A549细胞、人结肠癌HCT-116和HT-29细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞具有杀伤力；强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE与力达霉素相比，对肺癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌的抑瘤率明显提高。因此，本发明所述融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE可在制备治疗肿瘤的药中的应用。可以通过将本发明所述的融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE添加药学上可接受的载体或赋形剂或可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。 

本发明具有以下有益效果： 

1、本发明所述融合蛋白LhFVII-LDP和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE与其受体——组织因子结合的亲和力强(Kd值在10^-8～10^-11M)，并且可被内吞进入细胞，对肿瘤细胞具有良好的靶向性，有望成为新型高效的靶向抗肿瘤药物，本发明为肿瘤药物的制备提供了一种新方法。 

2、人凝血因子VII轻链是人体的天然成分，本发明以其为靶向结构域可以有效降低药物的免疫原性。 

3、融合蛋白LhFVII-LDP可以直接通过基因工程技术在大肠杆菌细胞内表达获得，生产成本较低，有利于工业化生产。 

附图说明

图1是本发明所述编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因的全长序列PCR扩增电泳图，图中， 1泳道：DNA分子量标记(1Kb、Marker1，购自天根公司)；2泳道：编码人凝血因子VII轻链的序列；3泳道：编码力达霉素辅基蛋白LDP的序列；4泳道：编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因的序列。 

图2是本发明所述重组质粒(pET19blhfVIIldp)的一种示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。 

图3是本发明所述重组质粒(pET19blhfVIIldp)的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1泳道：DNA分子量标记(Marker1，购自天根公司)；2泳道：用限制性内切酶(NdeI和XhoI)双酶切重组质粒(pET19blhfVIIldp)后所得的pET19b载体片段(5717bp)和编码融合蛋白LhFVII-LDP的DNA片段(858bp)；3泳道：DNA分子量标记(1Kb，购自天根公司)。 

图4是本发明所述重组质粒(pET19blhfVIIldp)在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(proteinRuler I，购自北京自全式生物技术有限公司)；2泳道：诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP后的菌体经超声波破碎后的可溶性部分，箭头所指为融合蛋白LhFVII-LDP的电泳条带；3泳道：诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP后的菌体经超声波破碎后的不可溶性部分，箭头所指为融合蛋白LhFVII-LDP的电泳条带；4泳道：诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP后的菌体总蛋白，箭头所指为融合蛋白LhFVII-LDP的电泳条带；5泳道：诱导之前未表达融合蛋白LhFVII-LDP的菌体总蛋白。 

图5是诱导表达的融合蛋白LhFVII-LDP的western-blot鉴定分析图，其中，1泳道：诱导之前未表达融合蛋白LhFVII-LDP的菌体总蛋白；2泳道：诱导表达融合蛋白LhFVII-LDP后的菌体总蛋白，箭头所指为融合蛋白LhFVII-LDP。 

图6是经亲合层析纯化后的各馏分中融合蛋白LhFVII-LDP的SDS-PAGE鉴定分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(#SM0431，购自Fermentas)；2-10泳道：纯化后的9个馏分，泳道中条带为纯化后的融合蛋白LhFVII-LDP。 

图7是本发明所述的融合蛋白LhFVII-LDP与人肺癌NCI-H292细胞、人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞表面表达的组织因子结合后的免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，IP)分析图，其中，1泳道：NCI-H292细胞总蛋白经免疫共沉淀后的产物；2泳道：融合蛋白LhFVII-LDP与NCI-H292细胞共孵育后的总蛋白经免疫共沉淀后的产物；3泳道：HepG2细胞总蛋白经免疫共沉淀后的产物；4泳道：融合蛋白LhFVII-LDP与HepG2细胞共孵育后的总蛋白经免疫共沉淀后的产物；5泳道：MDA-MB-231细胞总蛋白经免疫共沉淀后的产物；6泳道：融合蛋白LhFVII-LDP与MDA-MB-231细胞共孵育后的总蛋白经免疫共沉淀后的产物；7泳道：融合蛋白LhFVII-LDP经免疫共沉淀后的产物；8泳道：融合蛋白LhFVII-LDP。 

图8是本发明所述的融合蛋白LhFVII-LDP与烯二炔发色团AE强化后的产物(LhFVII-LDP-AE)的高效液相色谱(HPLC)分析图。 

图9是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP和LDM抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中， 

control：注射生理盐水的实验组； 

LDM 0.05：注射剂量为0.05mg/kg的LDM的实验组； 

LhFVII-LDP 10：注射剂量为10mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组； 

LhFVII-LDP-AE04：注射剂量为0.4mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE的实验组； 

LhFVII-LDP-AE 0.4+LhFVII-LDP 10：同时注射剂量为0.4mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE和10mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组； LhFVII-LDP-AE 0.8：注射剂量为0.8mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE的实验组。 

图10是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP和LDM抑制人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中， 

control：注射生理盐水的实验组； LDM0.05：注射剂量为0.05mg/kg的LDM的实验组； 

LhFVII-LDP 10：注射剂量为10mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组； LhFVII-LDP-AE 02：注射剂量为0.2mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组； 

LhFVII-LDP-AE 0.4：注射剂量为0.4mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组。 

图11是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP和LDM抑制人结肠癌细胞HCT-116裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中， 

control：注射生理盐水的实验组； 

LhFVII-LDP(0.6)：注射剂量为0.6mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组； 

LDM(0.05)：注射剂量为0.05mg/kg的LDM的实验组； 

LhFVII-LDP-AE(0.15)：注射剂量为0.15mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组； 

LhFVII-LDP-AE(0.3)：注射剂量为0.3mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组； 

LhFVII-LDP-AE(0.6)：注射剂量为0.6mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组。 

图12：是本发明所述的强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE、融合蛋白LhFVII-LDP和LDM抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤生长的肿瘤生长曲线图，其中， 

control：注射生理盐水的实验组； LDI(0.05)：注射剂量为0.05mg/kg的LDM的实验组； 

LhFVII-LDP(0.3)：注射剂量为0.3mg/kg的融合蛋白LhFVII-LDP的实验组； 

LhFVII-LDP-AE(0.15)：注射剂量为0.15mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组； 

LhFVII-LDP-AEE(0.3)：注射剂量为0.3mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组； 

LhFVII-LDP-AE(0.45)：注射剂量为0.45mg/kg的强化融合蛋白LhFVII-LDM的实验组。 

本发明将表达LhFVII-LDP的菌株命名为lhfVII-LDP-pET19b-Rosetta-gami B(DE3)pLysS， 并送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号：CGMCC NO.4528，保藏日期：2011年1月5日。 

具体实施方式

实施例1：编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因的克隆 

引物1：5’-TAACCATGGGCCATCATCATCATCATCACGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCG-3’ 

               Nco I 

引物2：5’-CCACCACTGCCGCCGCCGCCGCTACCACCACCACCTCGGCCTTGGGGTTTGCTGGCATT-3’ 

                    Linker：GGGGS×3连接肽 

引物3：5’-GTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCAGTGGTGGCGGTGGCTCTGCGCCCGCCTTCTCCGTC-3’ 

                      Linker：GGGGS×3连接肽 

引物4：5’-TATCTCGAGTTAGCCGAAGGTCAGAGCCACGT-3’ 

              Xho I 

以上引物由英俊生物技术有限公司合成。 

以人凝血因子VIIcDNA(广州复能基因有限公司)为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增，得到长521bp、含有人凝血因子VII轻链和GGGGS×3连接肽编码序列的DNA片段(见图1)，引物1序列中引入Nco I酶切位点，引物2序列中引入GGGGS×3连接肽编码序列。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书，反应体系(50ul)如下： 

水蒸水：31.5ul 

5×反应buffer：10ul 

dNTP Mix：4ul 

引物1(10mM)：1ul 

引物2(10mM)：1ul 

人凝血因子VII cDNA(100ng/ul)：2ul 

Primer star DNA聚合酶：0.5ul 

以含有编码力达霉素辅基蛋白(LDP)基因的质粒pEFL(专利申请号：03150240.7，公开号：CN 1475506A)为模板，以引物3和引物4进行PCR扩增，得到长383bp、含有GGGGS×3连接肽和LDP编码序列的DNA片段(见图1)，引物3引入GGGGS×3连接肽编码序列，引物4引入Xho I酶切位点。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书，反应体系(50ul)如下： 

水蒸水：31.5ul 

5×反应buffer：10ul 

dNTP Mix：4ul 

引物3(10mM)：：1ul 

引物4(10mM)：1ul 

质粒pEFL(100ng/ul)：2ul 

Primer star DNA聚合酶：0.5ul 

以上述两次PCR扩增得到的DNA片段为模板，用引物1和引物4进行重叠PCR扩增得到长872bp，含有人凝血因子VII轻链、GGGGS×3连接肽和LDP编码序列的融合基因片段lhfVIIldp(见图1)。PCR反应条件参照Primer star DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书，反应体系(50ul)如下： 

水蒸水：31.5ul 

5×反应buffer：10ul 

dNTP Mix：4ul 

引物1：：1ul 

引物4：1ul 

第一次PCR扩增所得的编码LhFVI I的DNA片段(100ng/ul)：1ul 

第二次PCR扩增所得的编码LDP的DNA片段(100ng/ul)：1ul 

Primer star DNA聚合酶：0.5ul 

实施例2：表达融合蛋白LhFVII-LDP的重组质粒的构建 

将实施例1克隆的lhfVIIldp融合基因片段进行NcoI/XhoI双酶切，将酶切基因片段连接到经同样酶切的pET-19b载体(Novagen公司产品)中(见图2)，然后将连接产物转化E.coliDH5α，37℃培养后挑取单克隆，小量培养后提取质粒，进行NcoI/XhoI双酶切鉴定(鉴定结果见图3)。将鉴定无误的质粒送北京华大基因研究中心对插入的融合基因片段进行测序，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。将测序结果正确的含lhfVIIldp融合基因的重组质粒命名为pET19blhfVIIldp。 

实施例3：重组质粒在大肠杆菌中的表达 

将实施例2构建的重组质粒pET19blhfVIIldp转化大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)pLysS(Novagen公司产品)，挑取单克隆于LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀≈0.6，取15ul菌液冻于-20℃，然后加入终浓度0.8mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)继续培养6h，取7.5ul菌液冻于-20℃。另取5ml诱导后菌液，4000rpm×3min离心，弃上清，用600ulPBS(配制方法： 称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L)重悬，将重悬后的菌液进行超声波破碎，16000g离心30min，分别取上清和沉淀样品存于-20℃。将上述诱导前、诱导后的上清和沉淀样品进行SDS-PAGE检测，分析目的蛋白的表达情况及存在形式(见图4)。然后对目的蛋白进行western-blot鉴定(见图5)。结果显示IPTG诱导后融合蛋白有明显表达，在上清和沉淀中都有目的蛋白存在，说明蛋白有可溶性表达。将表达LhFVII-LDP的菌株命名为lhfVII-LDP-pET19b-Rosetta-gami B(DE3)pLysS，并送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类：大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏编号：CGMCC NO.4528，保藏日期：2011年1月5日。 

实施例4：融合蛋白LhFVII-LDP的亲和层析纯化 

用binding buffer(20mM磷酸钠，500mM NaCl，1mM DTT，0.1mM PMSF，pH7.4)重悬洗涤IPTG诱导表达后的含融合蛋白LhFVII-LDP的菌体沉淀(制备方法同实施例3)。4000rpm×3min离心，弃上清，100ml binding buffer/L表达菌液重悬菌体。超声波破碎菌体，4℃，48400g离心1小时，收集上清，置于冰上。按纯化仪器(AKTA prime，GE公司产品)说明书清洗蛋白纯化系统，装上1ml的HisTrap affinity column(GE公司产品)。用5ml binding buffer，以1ml/min流速平衡柱子，直至A₂₈₀回到基线且稳定。以1ml/min流速上样，10倍柱体积bindingbuffer洗涤柱子，直至A₂₈₀回到基线且稳定。按HisTrap affinity column说明书采用线性梯度洗脱目的蛋白，根据A₂₈₀收集洗脱成分，进行SDS-PAGE分析(分析结果见图6)。将含有目的蛋白的洗脱液用PBS透析，超滤浓缩得高浓度目的蛋白——融合蛋白LhFVII-LDP。蛋白定量显示，每升表达菌液可得纯度在95％以上的目的蛋白约30mg。 

实施例5：融合蛋白LhFVII-LDP与组织因子的结合活性检测 

向对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231、人肺癌H292、人肝癌HepG2细胞培养基中加入融合蛋白LhFVII-LDP至终浓度16ug/ml，37℃5％CO₂孵育2h，PBS洗细胞3次，用细胞刮刀刮下细胞，4℃，3000rpm离心5min收集细胞沉淀，加入300ul lysis buffer(20mM Tris-HCl，PH 7.9，150mM NaCl，10mM KCl，0.5mM EDTA，0.5％NP-40，10％Glycerol，1.5mM MgCl₂，0.5mMPMSF，2mM DTT，2.5mM CaCl₂)，冰上裂解10min，涡旋振荡，2min/次，共5次，17000g 4℃离心5min，吸取上清。取适量上清液，向其中加入10ug/ml的组织因子抗体，4℃共孵育2h。取10ul protein A beads，800ul lysis buffer洗涤两次。将洗涤后的protein A beads加入上述蛋白反应混合液中，4℃孵育2h。4℃，700g离心2min，弃上清，加入800ul lysis buffer洗涤两次。4℃，700g离心2min，弃上清，加入60ul 1×蛋白SDS-PAGE上样buffer，75℃孵育5min，17000g离心5min。取上清至新的EP管，用鼠抗人凝血因子VII单克隆抗体进行western  blot检测。结果(检测结果见图7)显示大肠杆菌表达的LhFVII-LDP融合蛋白具有与肿瘤细胞表面组织因子结合的活性。 

实施例6：强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE的制备 

取力达霉素冻干品10mg，加入5ml-20℃冷甲醇振摇5min，-20℃放置1小时，中间振荡一次，0℃，1200rpm离心20min，上清液中含发色团，沉淀物为辅基蛋白，重复提取2次。自然蒸发浓缩甲醇溶液，上述操作需4℃低温、避光进行。 

取一定体积和浓度的融合蛋白溶于0.01mol/L磷酸盐(pH 7.0)缓冲液中，加入发色团溶液，融合蛋白与发色团的摩尔比为1∶5，融合蛋白LhFVII-LDP溶液与发色团溶液的体积比为50∶1，室温摇床缓慢振摇12小时进行分子组装，将反应液以PD-10(Sephadex G-25柱，Pharmacia产品)层析分离，经280nm紫外检测后收集强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE，经高效液相色谱(HPLC)分析，分析结果见图8。 

实施例7：LDM、融合蛋白LhFVII-LDP、强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用检测比较 

取对数生长期的人肺癌A549、人结肠癌HCT-116、人肝癌HepG2、人结肠癌HT-29和人乳腺癌MDA-MB-231细胞消化计数，3000个细胞/孔铺于96孔板，在37℃含有5％CO₂的培养箱中培养24小时，10倍稀释各检测样品，每种细胞的每个样品浓度设3个平行孔。继续培养72小时后，向每孔加入以PBS溶解的四甲基偶氮唑盐微量酶MTT20ul(5mg/ml)，37℃继续培养4小时后，吸弃上清，加入150ul二甲基亚砜，室温摇动15分钟，酶标仪上测定570nm的光吸收值A。每次实验均设无药对照孔和无细胞空白孔各3孔。按下列公式计算细胞的存活率及样品的半数生长抑制浓度IC₅₀值： 

计算结果为：强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人肺癌A549、人结肠癌HCT-116、人肝癌HepG2、人结肠癌HT-29、人乳腺癌MDA-MB-231细胞作用48小时的IC₅₀值分别为0.15nM、0.43nM、0.50nM、0.19nM和2.39nM；LDM对上述几种肿瘤细胞作用48小时的IC₅₀值分别为0.14nM、0.94nM、0.60nM、0.24nM、3.41nM；融合蛋白LhFVII-LDP对上述几种肿瘤细胞作用48小时的IC₅₀值分别为2.58nM、33.23nM、17.76nM、11.85nM、34.54nM。计算结果表明，强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE的体外细胞毒作用比力达霉素强，未经强化的融合蛋白LhFVII-LDP对这几种细胞也有一定的杀伤作用，不过比力达霉素和强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE要弱的多。 

实施例8：LDM、融合蛋白LhFVII-LDP、强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的生长抑制作用比较 

取体外培养的1×10⁷个人肝癌HepG2细胞，接种于Balb/c nu/nu裸小鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)左侧腋窝皮下，传2-3代后，取腋下传代肿瘤，切成1.5mm³左右的小块，接种于裸小鼠左侧腋窝皮下，待肿瘤生长至100～300mm³后根据肿瘤大小随机分组(n＝8)，并开始按表1所述剂量进行尾静脉给药一次，每周测量2次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝ab²/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(见图9)。给药后第35天，处死动物，取皮下瘤，按如下公式计算抑瘤率 

抑瘤率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％。 

计算结果见表1，计算结果表明，强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤有显著疗效，剂量为0.8mg/kg的LhFVII-LDP-AE的实验组的抑瘤率达66.1％，0.4mg/kg LhFVII-LDP-AE和10mg/kg LhFVII-LDP混合给药组的抑瘤率为62.1％，剂量为0.4mg/kg LhFVII-LDP-AE的实验组的抑瘤率为57.5％，高于0.05mg/kg(耐受剂量)的力达霉素的抑瘤率(54.4％)。 

表1.强化融合蛋白对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤的生长抑制作用(实验第35天) 

*p＜0.05vs.control    **p＜0.01vs.control    ▲p＜0.05vs.LhFVII-LDP 

实施例9LDM、融合蛋白LhFVII-LDP、强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用比较 

取体外培养的1×10⁷个人肺癌A549细胞，接种于Balb/c nu/nu裸小鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)左侧腋窝皮下，传2-3代后，取腋下传代肿瘤，切成1.5mm³左右的小块，接种于裸小鼠左侧腋窝皮下，待肿瘤生长至100～300mm³后根据肿瘤大小随机分组(n＝8)，并开始按表1所述剂量进行尾静脉给药一次，间隔7天再给药一次，共给药两次，每周测量2次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝ab²/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线 (见图9)。给药后第30天，处死动物，取皮下瘤，按如下公式计算抑瘤率 

抑瘤率＝(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100％。 

计算结果见表2，计算结果表明，强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤有显著疗效。实验第30天，0.4mg/kg组的LhFVII-LDP-AE抑瘤率达91.8％。融合蛋白LhFVII-LDP也有较好的抑瘤效果，在10mg/kg剂量时抑瘤率达76.1％，均高于0.05mg/kg(耐受剂量)的力达霉素的抑瘤率(73.7％)。 

表2.强化融合蛋白对人肺癌细胞A549裸鼠移植瘤的生长抑制作用(实验第30天) 

*p＜0.01vs.control    △p＜0.01vsLDM    ▲p＜0.01vs.LhFVII-LDP 

实施例10：LDM、融合蛋白LhFVII-LDP、强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人结肠癌细胞HCT-116裸鼠移植瘤的生长抑制作用比较 

取体外培养的1×10⁷个人结肠癌细胞HCT-116细胞，接种于Balb/c nu/nu裸小鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)左侧腋窝皮下，传2-3代后，取腋下传代肿瘤，切成1.5mm³左右的小块，接种于裸小鼠左侧腋窝皮下，待肿瘤生长至100～300mm³后根据肿瘤大小随机分组(n＝8)，并开始给药，对照组给200ul生理盐水；LhFVII-LDP组剂量为0.6mg/kg；LDM组剂量为0.05mg/kg(耐受剂量)；三个LhFVII-LDP-AE剂量组的剂量分别为0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.6mg/kg。每周测量2次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝ab²/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(见图11)。并按如下公式计算抑瘤率： 

抑瘤率＝(对照组瘤体积-实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％ 

计算结果为：实验第21天，强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE在0.6mg/kg、0.3mg/kg和0.15mg/kg剂量时，抑瘤率分别为84.5％、61.6％和43.5％；融合蛋白LhFVII-LDP剂量为0.6mg/kg的抑瘤率为24.6％；力达霉素剂量为0.05mg/kg(耐受剂量)的抑瘤率为55.9％。 

计算结果表明，强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人结肠癌细胞HCT-116裸鼠移植瘤有显著疗效，其中剂量为0.6mg/kg的LhFVII-LDP-AE的实验组的抑瘤率达84.5％，显著高于力达霉素剂 量为0.05mg/kg(耐受剂量)的抑瘤率。 

实施例11：LDM、融合蛋白LhFVII-LDP、强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长抑制作用比较 

取体外培养的1×10⁷个人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞，接种于Balb/c nu/nu裸小鼠(购自中国医学科学院实验动物中心)左侧腋窝皮下，传2-3代后，取腋下传代肿瘤，切成1.5mm³左右的小块，接种于裸小鼠左侧腋窝皮下，待肿瘤生长至100～300mm³后根据肿瘤大小随机分组(n＝8)，并开始给药，对照组给200ul生理盐水；LhFVII-LDP组剂量为0.3mg/kg；LDM组剂量为0.05mg/kg(耐受剂量)；三个LhFVII-LDP-AE剂量组的剂量分别为0.15mg/kg、0.3mg/kg和0.45mg/kg。每周测量2次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝ab²/2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(见图12)。并按如下公式计算抑瘤率： 

抑瘤率＝(对照组瘤体积-实验组瘤体积)/对照组瘤体积×100％ 

计算结果为：实验第21天，强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE在0.45mg/kg、0.3mg/kg和0.15mg/kg剂量时，抑瘤率分别为80.0％，52.5％和44.5％；融合蛋白LhFVII-LDP剂量为0.3mg/kg的抑瘤率为22.1％；力达霉素剂量为0.05mg/kg(耐受剂量)的抑瘤率为40.9％。 

计算结果表明，强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE对人结肠癌细胞HCT-116裸鼠移植瘤有显著疗效，其中剂量为0.45mg/kg的LhFVII-LDP-AE的实验组的抑瘤率达80％，显著高于力达霉素剂量为0.05mg/kg(耐受剂量)的抑瘤率。 

实施例12：病理组织检查 

使用对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤生长有显著抑制作用的各组实验动物，取心，肺左叶，肝左叶，脾，胰腺，左肾及肾上腺，十二指肠，左股骨等主要脏器进行病理组织检查，病理检查结果显示：各脏器均无明显病理变化。 

Claims (6)

1.一种编码融合蛋白LhFVII-LDP的融合基因，其特征在于该基因由编码人凝血因子VII轻链的基因和编码力达霉素辅基蛋白的基因连接而成，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

2.一种表达融合蛋白LhFVII-LDP的重组质粒，其特征在于它含有权利要求1所述的基因。

3.一种融合蛋白LhFVII-LDP，其特征在于它由权利要求2所述重组质粒表达而成，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

4.一种强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE，其特征在于它由权利要求3所述融合蛋白LhFVII-LDP和烯二炔发色团AE构成。

5.权利要求3所述融合蛋白LhFVII-LDP在制备治疗肿瘤的药中的应用。

6.权利要求4所述强化融合蛋白LhFVII-LDP-AE在制备治疗肿瘤的药中的应用。

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