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CN102239411A - 通过使用gi蛋白受体来分类和诊断脊柱侧凸的方法 - Google Patents

通过使用gi蛋白受体来分类和诊断脊柱侧凸的方法 Download PDF

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Abstract

描述了用于诊断发展脊柱侧凸(例如青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的倾向和鉴定基于Gi蛋白偶联受体活性的调节来治疗脊柱侧凸的化合物的方法。该方法包括测定表达Gi蛋白偶联受体的细胞与配体的阻抗信号的改变。为了鉴定用于治疗的化合物，使细胞与测试化合物和配体接触。若存在所述测试化合物时相对于不存在测试化合物时阻抗更高，则测试化合物可用于治疗脊柱侧凸。

Description

通过使用GI蛋白受体来分类和诊断脊柱侧凸的方法
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求于2008年10月10日提交的美国临时申请61/104,442和2009年7月27日提交的美国临时申请61/228,769的优先权，其整体引入本文作为参考。
关于联邦政府赞助研究或开发的声明
无。
发明领域
本发明涉及发展脊柱侧突(例如青少年特发性脊柱侧凸(AIS))倾向的诊断以及用于鉴定治疗脊柱侧凸的化合物的筛选方法。
发明背景
脊柱侧凸是一种疾病，其患者的脊柱从一侧弯向另一侧，也可能是旋转的。它是异常的脊柱侧向弯曲。在X射线下，典型脊柱侧凸的个体的脊柱相对于直线更像“S”或“C”形。
脊柱畸形，尤其是脊柱侧凸是儿童和少年畸形矫正的最常见类型，而特发性脊柱侧凸(AIS)是脊柱侧凸的最常见形式。青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的病因学还不清楚。AIS在数量和严重程度上主要影响女孩，但是一些研究表明其具有遗传倾向，遗传的类型依然是不确定的(Axenovich TI等人，Am J Med Genet 1999，86(4)：389-394；Wise CA等人，Spine 2000，25(18)：2372-2380；Blank RD等人，Lupus 1999，8(5)：356-360；Giampietro PF等人，Am J Med Genet 1999，83(3)：164-177)。已提出若干不同的观点以更好的定义该病因学(Machida M.，Spine 1999，24(24)：2576-2583；Roth JA等人，J Biol Chem 1999，274(31)：22041-22047；Hyatt BA等人，Nature 1996，384(6604)：62-65；von Gall C等人，Eur J Neurosci 2000，12(3)：964-972)。遗传、生长激素分泌、结缔组织结构、肌肉结构、前庭功能障碍、褪黑激素分泌和血小板微结构是主要的研究领域。现有观点认为，中枢神经系统(CNS)的中枢控制或处理的缺陷影响了脊柱的生长，脊柱对变形的易感性在个体之间是不同的。
很遗憾，目前FDA尚未批准任何方法用于鉴定具有发展IS风险的儿童或少年，从而预测受影响的个体需要治疗以预防或停止该疾病的进展(Weinstein SL，Dolan LA，Cheng JC等人，Adolescent idiopathic scoliosis.Lancet 2008；371：1527-37)。因此，现有治疗，例如安矫形支架或外科矫治直到检测出显著的畸形或证实明显的疾病进展才得以使用，导致治疗延迟和错过最佳时机(Society SR.Morbidity & Mortality Committee annualReport 1997)。在需要治疗的IS患者中，80-90％通过安矫形支架治疗，约1％需要通过脊柱仪器以及胸和/或腰脊柱的融合进行手术以矫正畸形，具有产生并发症的风险(Weiss HR，Goodall D.Rate of complications inscoliosis surgery-a systematic review of the Pub Med literature.Scoliosis.2008；3：9)。现今在美国约有一百万10-16岁的儿童具有一定程度的IS。每6个诊断为脊柱侧凸的儿童中有一个的弯曲程度已达到需要主动治疗的地步。每年在北美要进行约29,000例脊柱侧凸手术，导致显著的心理和生理疾病(Goldberg MS，Mayo NE，Poitras B等人，The Ste-Justine AdolescentIdiopathic Scoliosis Cohort Study.Part I：Description of the study.Spine1994；19：1551-61；Poitras B，Mayo NE，Goldberg MS等人，The Ste-JustineAdolescent Idiopathic Scoliosis Cohort Study.Part IV：Surgical correctionand back pain.Spine 1994；19：1582-8)。
因此需要对具有涉及脊柱畸形(例如脊柱侧凸，例如AIS)疾病的个体分类的方法，诊断对脊柱侧凸的倾向以及鉴定用于预防或治疗所述疾病的化合物的方法。
本说明书涉及大量的文献，其内容整体引入本文作为参考。
发明概述
本发明首次证实，来自脊柱侧凸患者(特发性脊柱侧凸患者)的细胞在G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导方面具有广泛损伤。在某些不同的GPCR和不同的细胞类型，包括形成骨的细胞、形成肌肉的细胞以及血细胞中均检测到该损伤。
多种激素、神经递质和生物活性物质通过位于细胞膜的特异性受体控制、调节或调整生物体功能。许多所述受体通过激活与该受体偶联的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)来介导细胞内信号的传递。所述受体总称为G蛋白偶联受体(″GPCR″)。GPCR与特异性信号转导分子结合能引起受体的构象变化，产生能结合和活化G蛋白的形式，由此触发级联的细胞内事件，最终导致生物响应。通常，GPCR与G蛋白作用以调节细胞内第二信使如环式AMP、磷酸肌醇、二酰基甘油和钙离子的合成。
更具体而言，根据本发明，提供了一种测定测试化合物对预防或治疗脊柱侧凸(例如特发性脊柱侧凸(IS)，例如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸、青少年特发性脊柱侧凸或成人脊柱侧凸)是否有效的方法，所述方法包括：(a)使表达与抑制性鸟嘌呤核苷酸结合(Gi)蛋白偶联的受体(至少一种受体)的细胞与所述受体的配体在所述测试化合物存在或不存在情况下接触；(b)测定所述配体在该细胞中诱导的信号强度；其中若存在所述测试化合物时相对于不存在该化合物时信号水平更高，表明所述测试化合物可用于预防或治疗脊柱侧凸(例如特发性脊柱侧凸，例如AIS)。
该方法可用于筛选能普遍调节Gi-蛋白信号转导损伤的化合物。然而，其也可用于确定何种化合物对于调节，尤其是减少或消除特定患者群或患者的细胞内Gi-蛋白信号转导损伤是最有效的。事实上，用于此目的的最有效化合物可能在患者间各不相同。本发明的筛选方法因此可用于鉴定哪种化合物在消除特定患者群、尤其是某个患者的Gi-蛋白信号转导损伤中最为有效。
本发明还提供了一种用于诊断个体发展脊柱侧凸(例如特发性脊柱侧凸，例如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸、青少年特发性脊柱侧凸(AIS))倾向的方法(例如体外方法)，包括：
(a)使来自所述个体的表达与抑制性鸟嘌呤核苷酸结合(Gi)蛋白偶联的受体的细胞与所述受体的配体接触；
(b)测定所述配体在该细胞中诱导的信号强度；
(c)将所述信号与相应的参比信号进行比较；
(d)基于该比较来确定所述倾向。
本文所用的术语“发展脊柱侧凸的倾向”是指个体发展脊柱侧凸(即脊柱畸形)和/或在将来发展成更严重的脊柱侧凸的遗传或代谢倾向。
另一方面，本发明提供了对具有特发性脊柱侧凸、例如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸、青少年特发性脊柱侧凸(AIS)的人类患者分类的方法，包括：
(a)使来自所述个体的表达与抑制性鸟嘌呤核苷酸结合(Gi)蛋白偶联的受体的细胞与所述受体的配体接触；以及
(b)测定所述配体在该细胞中诱导的信号强度，其中根据所述测定步骤的结果能够将具有特发性脊柱侧凸(例如AIS)的个体划分在一个特发性脊柱侧凸的亚组中。
在一个实施方案中，上述特发性脊柱侧凸是AIS。在一个实施方案中，AIS个体(i)若信号强度为对照个体的细胞中测定的相应信号强度的约34％或以下，则归于亚组1，(ii)若信号强度为对照个体的细胞中测定的相应信号强度的约34％和约57％之间，则归为亚组2，和(iii)若信号强度为对照个体的细胞中测定的相应信号强度的约57％和约80％之间，则归为亚组3。
因此，本发明的方法还可有利地用于确定例如疾病的类型和/或严重程度，或所述疾病潜在缺陷的性质(即个体的“分类”或“分层”)。尤其感兴趣的是治疗或预防特发性脊柱侧凸(例如AIS)最有效的药物是否随着不同类型和/或严重度的特发性脊柱侧凸个体而变化。因此，本发明用于分类的方法可以为特定患者更好地选择所用药物。该方法也可用于已诊断的脊柱侧凸患者(例如成人脊柱侧凸)的分类/分层。
在一个实施方案中，上述个体是可能发展成脊柱侧凸、例如特发性脊柱侧凸(例如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸或青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的候选者。本文中术语“可能发展成脊柱侧凸的候选者”包括至少父母之一具有脊柱侧凸(例如青少年特发性脊柱侧凸)的个体(例如儿童)。在其他因素中，年龄(青年)、性别和其他家族前辈是已知能增加发展脊柱侧凸风险的因素，在一定程度上用于评价发展成脊柱侧凸的风险。在某些个体中，脊柱侧凸在短时间内迅速发展至需要矫正手术的程度(通常为当畸形达到科布角≥50°时)。当诊断为脊柱侧凸例如AIS时(当脊柱侧凸明显时)，现有可采取的措施包括观察(当科布角为约10-25°时)、矫形装置(当科布角为约25-30°)以及手术(超过45°)。更可靠的确定进展风险能够1)选择适当的饮食，以排除某些已知促进脊柱侧凸的食物；2)选择最佳的治疗剂；和/或3)选择最小侵入性的治疗，例如姿势训练、矫形装置，或较少侵入性的手术或无融合手术(不融合脊椎、保留脊柱运动性的手术)。本发明包括根据确定的发展脊柱侧凸的风险来选择最有效和最小侵入性的已知预防或治疗措施。
本发明的方法可使用表达一种或多种与Gi蛋白(也称为Giα亚基)偶联的受体的细胞。本文中，“受体”是指野生型受体和/或保留野生型受体活性(即GPCR介导的活性)的片段和变体。与Gi蛋白偶联的GPCR(下文中称为GiPCR)包括，例如CD47、血清素受体(5-HT)、腺苷受体、肾上腺素能受体、大麻素受体、组胺受体、前列腺素受体和多巴胺受体。图15为适合用于本发明方法的GiPCR非穷举的列表。
在一个实施方案中，上述与Gi蛋白偶联的受体是血清素受体、α-肾上腺素能受体、腺苷受体、大麻素受体或其任意组合。在另一个实施方案中，上述受体是5-HT1A、α2-AD、A3或CB2。在另一个实施方案中，上述受体不是褪黑激素受体(例如MT2)。
在一个实施方案中，上述方法使用超过一种的与Gi蛋白偶联的受体。在另一个实施方案中，上述方法使用超过一种特异性结合与Gi蛋白偶联的受体的配体。在另一个特定的实施方案中，各配体对于与Gi蛋白偶联的不同受体具有特异性(例如2、3、4、5或6个配体)。图16是GiPCR配体的非穷举的列表。在特定的实施方案中，本发明使用的配体不是MT2配体。
本发明的方法可使用任何表达一种或多种Gi偶联受体和/或Gi蛋白的样品(例如细胞，组织)。所述细胞可天然或重组表达一种或多种Gi偶联受体和/或Gi蛋白。对于重组表达，编码GiPCR的核酸和/或编码Gi蛋白的核酸被引入适当的细胞，所述细胞在使蛋白表达的条件下孵育。本文所用细胞天然表达一种或多种Gi蛋白偶联的受体，根据个体的收集的可能性部分选择。因此，可有利地获得诸如成骨细胞、破骨细胞、外周血单核细胞(PBMC)(主要包括淋巴细胞以及单核细胞)和成肌细胞的细胞并方便地用于本发明的方法。血细胞(例如PBMC，血小板(血小板)等)尤其容易获得并提供了更快的测试。本发明的方法可使用任何血细胞，只要其含有至少一种与Gi蛋白偶联的GPCR受体。在一个实施方案中，细胞获得或衍生自特发性脊柱侧凸(例如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸或青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的个体。对于本发明，PBMC不需要在培养物中获得，因为本文所述方法可在含有新鲜或冷冻PBMC的细胞混悬液中进行。
根据本发明的特定方面，可使用给定的Gi-蛋白偶联受体的任何配体。GiPCR的配体(例如天然或合成的)是本领域公知的，某些所述配体可从商业上获得(例如从Tocris Bioscience获得)。图15给出了单独或与其他配体组合的适用于本发明方法的GiPCR配体的非穷举的列表。在一个特定的实施方案中，上述配体是所述受体的已知激动剂。在一个实施方案中，上述配体是(a)用于5-HT1A受体的1-[3-(3，4-亚甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基-哌嗪马来酸盐(已知为BP554马来酸盐)，(b)用于α2-AD受体的5-溴-N-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基)-6-喹喔啉胺(已知为UK14304)，(c)用于A3受体的1-脱氧-1-[6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核糖脲酰胺(已知为IB-MECA)；(d)用于CB2受体的N-环己基-7-氯-1-[2-(4-吗啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-甲酰胺(已知为CB65)。
应当理解，上述方法可筛选多种不同的测试化合物。测试化合物包括大量的化学种类，但通常为有机分子，优选为分子量50到约2500道尔顿的有机小分子。测试化合物包含与蛋白结构相互作用所必需的官能团，尤其是氢键，通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个所述官能团。测试化合物通常包含环碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构，其被一个或多个上述官能团所取代。测试化合物还可以是生物分子，包括肽类(例如靶向于一种或多种涉及通过Gi蛋白偶联受体的信号转导的缺陷蛋白的肽)，核酸(例如寡核苷酸，例如靶向于涉及通过Gi蛋白偶联受体的信号转导的缺陷基因的反义分子)、抗体、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或其组合。测试化合物可从广泛来源获得，包括合成或天然的化合物库。例如，有多种方法可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸的表达和寡肽。或者，可获得或方便地制备细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。此外，可通过常规化学、物理和生化方法方便地修饰天然或合成制备的库和化合物，并可用于产生组合库。已知的药理学活性剂可用于定向或随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
在一个实施方案中，参比信号是从对照个体中获得的相应样品(例如细胞)中获得的信号，所述对照个体例如为未患有脊柱侧凸(例如特发性脊柱侧凸，如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸或青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的个体，或不倾向于发展成脊柱侧凸的个体。此时，来自个体细胞中的信号相对于相应参比信号较低，表明所述个体倾向于发展成脊柱侧凸，而较高或基本相同的信号表明所述个体不易发展成脊柱侧凸。
在另一个实施方案中，上述参比信号是从个体(例如年龄和/或性别匹配的)中获得的相应样品(例如细胞)中获得的信号，所述个体患有脊柱侧凸(例如特发性脊柱侧凸，如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸或青少年特发性脊柱侧凸(AIS))，或已知易于发展成脊柱侧凸。此时，来自个体细胞中的信号相对于相应参比信号较低或基本相同，表明所述个体易于发展成脊柱侧凸，而较高的信号表明所述个体不易发展成脊柱侧凸。
在一个实施方案中，相应的样品是与来自个体的细胞同种类型的细胞(例如，实验样品和参比样品均为淋巴细胞)。在一个实施方案中，实验在含有实验样品和对照样品的板中进行(例如96孔、384孔等)。在另一个实施方案中，所述板还含有来自健康个体和组1、2和3的个体的参比样品。
在一个实施方案中，较低或较高的信号是指相对于参比信号而言从实验样品(从测试的个体获得的样品)中获得的信号的差异至少为约10％，在其他实施方案中至少为约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％或200％。在一个实施方案中，基本相同的信号是指与参比信号相比，差异小于10％的信号，在其他实施方案中为差异小于9％、8％、7％、6％或5％的信号。
配体(例如激动剂)诱导的信号强度的变化可使用任何方法检测。测定GiPCR介导的信号(例如细胞内响应)幅度或强度的方法是本领域公知的。信号的强度可以通过例如测定诸如第二信使(例如cAMP、Ca2+)或基因产物(例如mRNA或蛋白质)的分子水平进行确定，所述基因产物的水平在配体触发受体后被调节。信号的强度也可以通过例如测定配体触发受体后的蛋白-蛋白相互作用的变化(例如通过荧光共振能量转移[FRET]或生物发光共振能量转移[BRET])进行确定。其他测定通过GiPCR介导的信号强度的方法包括，例如测定cAMP水平(Medhurst等人，2003.In：J Neurochem.，84)，使用GIRK-铊流试验测定铊流(Niswender等人，2008；In：Mol Pharmacol.73(4))，膜片钳(Saugstad等人，1996.In：J.Neurosci.16)，使用[35S]GTPγS标记试验测定GTPγS结合(Riobo等人，2006.In：Proc Natl Acad Sci USA，103)，以及测定阻抗的变化(Peters等人，2007.In：J Biomol.Screen.12：312-9)。在一个实施方案中，所述信号强度使用受体触发后发生的细胞内阻抗的变化(例如细胞介电谱[CDS])进行测定。所述测定例如可使用实时细胞电子传感(RT-CESTM)技术(ACEA Biosciences Inc.，San Diego，CA，USA)(Huang等人，Analyst，2008，133(5)：643-648；Solly等人，Assay Drug Dev.Technol，2004，2(4)：363-372)或使用CellKeyTM技术(MDS Sciex，Concord，Ontario，加拿大)进行，如下文所述的方法。
在一个实施方案中，所述方法以适合于高通量试验的模式进行，例如96-或384-孔板模式，可使用适当的机器人(例如移液机器人)和仪器。
本发明还提供了用于实施上述方法的试剂盒。所述试剂盒可包括，例如一种或多种用于测定Gi蛋白偶联受体信号的试剂，以及用于进行个体试验的缓冲液、细胞、对照样品(例如来自健康个体的样品，组1、2和3的患者的参比样品)、容器等。在需要时，所述试剂盒的各成分可放置在分开的容器中，或者某些相容的成分可预先在单个容器中组合。
除上述成分外，所述试剂盒通常还包括使用试剂盒的成分来实施所述方法的说明书。用于实施所述方法的说明书通常记录在适当的记录介质上。例如，说明书可印制在诸如纸张或塑料的基质上。这样，说明书可以以包装插页的形式放置在试剂盒、试剂盒的容器或其成分容器的标签内(即与包装或亚包装一起)等。在其他实施方案中，说明书以电子存储数据文件的形式存在于适当的计算机可读存储介质中，例如CD-ROM、磁盘等。在其他实施方案中，说明书实际并不存在于试剂盒内，而是提供从远程获得它的手段，例如通过因特网提供。该实施方案的一个实例是包括web网址的试剂盒，其中说明书可从所述网址阅读和/或下载。对于说明书而言，获得说明书的手段记录在适当的基质上。
另一方面，本发明提供了用于预防和/或治疗脊柱侧凸(例如特发性脊柱侧凸，如婴儿特发性脊柱侧凸、幼年特发性脊柱侧凸或青少年特发性脊柱侧凸(AIS))的方法，包括向个体施用有效量的通过上述筛选方法鉴定的化合物(和/或包含化合物的组合物)。
组合物(例如药物组合物)通过将上述筛选方法鉴定的化合物(例如肽类、小分子)与任何适当的药用载体/赋形剂或药用载体/赋形剂的组合一起配制来制备。可制备任何施用途径的制剂，例如静脉内、肌内、皮下、口服、直肠、阴道、透皮、经粘膜、舌下等。
在一个实施方案中，上述个体是哺乳动物，在另一个实施方案中是人。
通过阅读以下借助附图仅以举例方式给出的非限制性的特定实施方案的说明，本发明的其他目的、优点和特征将是很明显的。
附图简述
附图中：[重新编号的页面]
图1显示了Gi蛋白在CDS检测的褪黑激素信号转导中的作用。图中的数据来自最大阻抗响应，对应于一式三份进行的3次独立实验的平均值±SE；
图2显示来自对照个体(非IS)和IS患者的成骨细胞用福司柯林预处理，以诱导腺苷酸环化酶活性和随后的cAMP生成。细胞随后用递增浓度的褪黑激素激发，通过褪黑激素降低cAMP水平的能力评估褪黑激素信号转导的功能状态。使用无褪黑激素存在下福司柯林诱导的cAMP生成来标准化数据；
图3显示了经特异性配体活化后从AIS患者或对照个体获得的成骨细胞上表达的不同的Gi蛋白偶联受体的响应，其通过细胞介电谱(CDS)测定。与对照(＊)、组3(Ψ)或组2(Ω)的比较如下：＊，Ψ，Ω，p＜0.05；＊＊，ΨΨ，ΩΩ，p＜0.01；＊＊＊，ΨΨΨ，p＜0.001；
图4使用不同的配体比较了Gi偶联蛋白信号转导障碍，以细胞介电谱(CDS)测定的最大响应百分比表示。对来自对照个体(非IS)和IS患者(组1、2和3)的成骨细胞应用递增浓度的褪黑激素、碘代褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca和CB65。通过CDS在CellKeyTM仪器中测定随后的细胞响应。从最大阻抗强度产生曲线。根据对照患者细胞的最大响应来标准化数据，用一式两份进行的三次独立实验的平均值±SE表示；
图5显示了经特异性配体活化后从AIS患者或对照个体获得的成肌细胞上表达的不同的Gi蛋白偶联受体的响应，其通过细胞介电谱(CDS)测定。与对照(＊)、组3(Ψ)或组2(Ω)的比较如下：＊，Ψ，Ω，p＜0.05；＊＊，ΨΨ，ΩΩ，p＜0.01；＊＊＊，ΨΨΨ，p＜0.001；
图6使用不同的配体比较了Gi偶联蛋白信号转导障碍，以细胞介电谱(CDS)测定的最大响应百分比表示。对来自对照个体(非IS)和IS患者(组1、2和3)的成肌细胞应用递增浓度的褪黑激素、碘代褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca和CB65。通过CDS在CellKeyTM仪器中测定随后的细胞响应。从最大阻抗强度产生曲线。根据对照患者细胞的最大响应来标准化数据，用一式两份进行的三次独立实验的平均值±SE表示；
图7显示了经特异性配体活化后从AIS患者或对照个体获得的PBMC上表达的不同的Gi蛋白偶联受体的响应，其通过细胞介电谱(CDS)测定。与对照(＊)、组3(Ψ)或组2(Ω)的比较如下：＊，Ψ，Ω，p＜0.05；＊＊，ΨΨ，ΩΩ，p＜0.01；＊＊＊，ΨΨΨ，p＜0.001；
图8使用不同的配体比较了Gi偶联蛋白信号转导障碍，以细胞介电谱(CDS)测定的最大响应百分比表示。对来自对照个体(非IS)和IS患者(组1、2和3)的PBMC(主要含有淋巴细胞)应用递增浓度的褪黑激素、碘代褪黑激素、BP554、UK14304、IB-meca和CB65。随后通过CDS在CellKeyTM仪器中测定细胞响应。从最大阻抗强度产生曲线。根据对照患者细胞的最大响应来标准化数据，用一式两份进行的三次独立实验的平均值±SE表示；
图9显示在24#家族的PBMC中检测到Gi偶联受体对配体刺激响应的改变，该家族所有已显示成员的最大阻抗通过细胞介电谱(CDS)测定。＊＊＊表示p＜0.001；
图10显示在4个家族的PBMC中检测到Gi偶联受体对配体刺激响应的改变：23、24、29和39。该家族所有已显示成员的最大阻抗通过细胞介电谱(CDS)测定。＊＊＊表示p＜0.001；
图11显示了来自对照个体和属于功能组1、2和3的AIS患者的成骨细胞中获得的值的范围，使用(A)300μM褪黑激素，(B)300μM碘代褪黑激素，(C)300μM BP554，(D)300μM UK14304，(E)300μM IB-meca和(F)300μM CB65，其通过细胞介电谱(CDS)测定；
图12显示了从对照个体和A)AIS患者或B)无症状风险患者的PBMC中获得的值的范围，使用300μM碘代褪黑激素，其通过细胞介电谱(CDS)测定。各个点代表每个个体3个孔的平均值，试验的变异系数通常小于10％；
图13A)显示了经特异性配体活化后从无症状风险患者、AIS个体和对照个体获得的PBMC上表达的不同的Gi蛋白偶联受体的响应，在时间0(T0)和18个月后(T18)通过细胞介电谱(CDS)测定。B)提供了对无症状风险患者获得的PBMC(主要含有淋巴细胞)上褪黑激素受体的响应的单个图；
图14显示了对照个体和AIS个体(组1、2和3)的成骨细胞中GPRC信号转导，使用不同配体Gs、Gi和Gq以确定所述信号转导是否对Gi偶联受体具有特异性；
图15显示了已知的Gi蛋白偶联受体列表；以及
图16显示了已知的Gi蛋白偶联受体的配体列表。
说明性的实施方案描述
本发明通过下列非限制性的实施例进一步详细说明。
实施例1
个体临床特征(对照、AIS和无症状者)
已检查的健康个体(对照)、AIS个体和无症状个体的临床特征分别如下表I-III所示。
表I.健康对照个体的临床数据
Figure BDA0000066528990000121
Figure BDA0000066528990000131
Figure BDA0000066528990000141
＊所有报道的数据来自第一收集日。
表II.AIS患者的临床数据
Figure BDA0000066528990000142
Figure BDA0000066528990000151
Figure BDA0000066528990000161
Figure BDA0000066528990000171
＊所有报道的数据来自第一收集日。
表III.所研究的无症状风险个体的临床数据
Figure BDA0000066528990000172
Figure BDA0000066528990000181
Figure BDA0000066528990000191
＊所有报道的数据来自第一收集日。
实施例3-4和8-10所用的分离细胞的个体的临床特征
圣-贾斯丁医院、蒙特利尔儿童医院、蒙特利尔Shriners儿童医院和McGill大学的机构审查委员会批准了该研究。所有参与者的父母或法定监护人签署了知情同意书，未成年人表示同意。所有IS患者接受参与该研究的六名矫形外科医师之一的检查。若病史和体格检查与IS诊断一致则认为是受影响的患者，放射照相显示，脊椎旋转冠状平面中最小弯曲度为10度。下表IV显示了这些个体的人口统计学和临床特征概述。这些个体也包括在上文表II中。
一些其父母之一患有IS感染的年轻无症状儿童也收入该研究以评价该试验在无症状人群中的效果。各个体在圣-贾斯丁大学医院经同一矫形外科医师临床检查，以进行IS的早期检测。这些个体也包括在上文表III中。
从其父母或法定监护人获得书面知情同意书后，从蒙特利尔小学招募健康的儿童作为对照；未成年人同样表示同意。该募集由蒙特利尔英语学校委员会、Affluent学校委员会和所有上述机构审查委员会所批准。每个正常个体经同一矫形外科医师使用脊柱侧凸测量器进行Adam前屈试验(表IV)，以在进入该研究前排除任何隐藏的脊柱侧凸。这些个体也包括在上表I中。
表IV-实施例3-4和8-10中AIS个体的临床特征概述
Figure BDA0000066528990000192
Figure BDA0000066528990000201
实施例2
材料和方法
在临床上明确定义的AIS患者中获得的多种细胞类型(成骨细胞、成肌细胞和PBMC(主要包括淋巴细胞))中研究了Gi蛋白偶联受体的响应，并与年龄和性别匹配的对照个体(未患有脊柱侧凸)进行比较。
研究了三种人群：IS患者，无任何脊柱侧凸家族史的健康对照和父母至少一人为脊柱侧凸患者的无症状后代，其被认为具有脊柱侧凸的风险。招募了44名IS患者组(19名AIS患者，其曲率超过45°，25名AIS患者，其曲率在10°和29°之间)(上表II)，以及42名健康对照个体(上表I)和30名无症状脊柱侧突风险儿童(上表III)，每6个月检查一次。所有个体为高加索人。
成骨细胞和成肌细胞
骨样本在手术期间从脊椎获得(根据所进行的手术从T3到L4而变化)，而用作非脊柱侧凸对照骨样本创伤例获自其他解剖学位置(胫骨或股骨，一例为髂嵴活检)。根据以前文献所述(Moreau A，Wang DS，Forget S等人，Melatonin Signaling Dysfunction in Adolescent Idiopathic Scoliosis.Spine2004；29：1772-81；Azeddine等人，2007 Molecular determinants of melatoninsignaling dysfunction in adolescent idiopathic scoliosis.Clin Orthop RelatRes.2007，462：45-52)分离的成骨细胞和成肌细胞在37℃/5％CO2下于补充有10％胎牛血清(FBS)和100μg/mL链霉素的MEM中培养。在实验前，将细胞以5x104/孔的密度接种到CellKeyTM标准96-孔板中，生长24小时，在标准条件下孵育(37℃/5％CO2)。在一些平板中，在CDS试验前16h进行百日咳毒素(100ng/mL，Sigma，Oakville，ON，加拿大)处理。孵育过夜后，将平板放置在CellKeyTM系统上，在试验开始前将生长培养基更换为试验缓冲液(Hanks，含有20mM HEPES和0.1％BSA的平衡盐溶液)。随后将细胞在室温下平衡30分钟。添加前测定5分钟以获得基线读数。随后，使用集成流控系统向96孔中同时加入配体(褪黑激素、2-碘代褪黑激素、BP554马来酸盐、UK14304、IB-MECA和/或CB65)。内源性受体的活化导致阻抗变化，其在加入液体并混合后即刻发生。CellKeyTM系统的快速更新率(2s)使得可以检测这些阻抗的即时变化。加入配体后，阻抗测定可收集10分钟到15分钟，以监测与配体相互作用的细胞响应，并产生所用信号转导机制的特征性CellKeyTM响应曲线。
PBMC
血液样本从患者和对照组获得，收集在含有EDTA的血液收集管中，随后在Ficoll-Plaque(GE Healthcare，Mississauga，ON，加拿大)溶液中离心获得PBMC(主要含有淋巴细胞)。PBMC部分冷冻保存在含有10％DMSO的FBS中，保藏在液氮中，直到解冻和试验。从储备组织培养瓶收集PBMC，用测试缓冲液洗涤3次。通过ficoll-Hypaque密度梯度离心从肝素化的外周血分离细胞，在补充有10％FBS、100μg/mL链霉素和1％植物凝集素的RPMI 1640培养基中培养。在37℃/CO2孵育48小时后，细胞用测试缓冲液洗涤3次，接种到CellKeyTM小96-孔板中。通常，每孔加入平均1x105至1.5x105个细胞，在室温下放置30分钟。这导致电极顶部产生单层细胞。细胞沉积后，将细胞板放置在仪器上，在5分钟的基线测定后按下文所述开始试验。所有试验在28℃下进行。
细胞介电谱(CDS)
使用CellKeyTM技术，通过细胞介电谱(CDS)测定不同配体对其受体诱导的响应(MDS Sciex，San Francisco，CA，USA)。CellKeyTM系统在完整的解决方案内集成了专门的阻抗测量系统、常规96孔微量板、原位96孔流控技术，以及环境控制和常规采集和分析软件(MDS Sciex)，其与商用的机器人平台是相容的。对沉积于底部含有电极的96孔微量板内的单层细胞应用1KHz至10MHz的24个频率的小电压，以2s的更新率测定产生的电流。系统可进行温度调节，试验在28-37℃进行，例如本文中通常为28℃。原位流体添加和更换通过96孔头流体递送装置以5-500μL范围进行。除细胞板定位外，CellKeyTM系统还包括两台用于96-或384-孔化合物板的附加工作站。试验建立、操作及数据采集和分析均通过CellKeyTM软件控制。
使用CellKeyTM技术，可精确地量化低受体表达条件下(例如当使用患者的原代和第一代细胞)的天然或合成配体的激动剂和拮抗剂活性。
成骨细胞的cAMP试验
将来自IS患者和对照个体的成骨细胞一式四份接种在24-孔板中(1x105个细胞每孔)，如先前所述进行试验(Moreau A，Wang DS，Forget S等人，Melatonin Signaling Dysfunction in Adolescent Idiopathic Scoliosis.Spine 2004；29：1772-81)。所有试验均一式两份进行。
统计分析
每个个体进行一式两份的三次试验，结果是这些测量的平均值±SE。试验变异系数通常低于10％。所有浓度响应曲线使用GraphPadTM(SanDiego，CA)通过非线性回归分析。统计分析用单向方差分析(ANOVA)进行多重比较，随后进行Newman-Keuls的事后检验。概率值低于0.05认为是显著的。
数据表示为平均值±SE。平均值的多重比较使用单向方差分析(ANOVA)进行，随后使用GraphPadTM Prism 4.0软件进行Dunnett事后检验。只有P值＜0.05被认为是显著的。
实施例3
CDS检测褪黑激素信号转导中Gi蛋白介导途径的相关部分
CDS检测褪黑激素信号转导中Gi蛋白介导途径的相关部分的能力通过用百日咳毒素(PTX)阻断该途径进行确定。该毒素使异源三聚体Gi蛋白的αi亚基发生ADP-核糖基化，由此阻断其活性。在抑制Gi蛋白的αi亚基的100ng/mL PTX存在或不存在的情况下，使MG63成骨细胞系缺乏血清16小时。细胞随后用10uM褪黑激素或碘代褪黑激素在37℃温育5分钟。根据材料和方法部分所述使用CellKeyTM测定细胞响应。
图1的结果显示，PTX处理显著抑制了褪黑激素或碘代褪黑激素刺激后CDS测定的MG63成骨细胞系中的细胞响应。对褪黑激素的抑制程度为约75％，碘代褪黑激素为约90％，表明Gi蛋白对CDS测定的褪黑激素信号转导的重要作用。
实施例4
通过cAMP和CDS测定的褪黑激素损伤比较
来自健康对照和三名严重IS患者(科布角＞45°的手术例)的第一代成骨细胞用福司柯林预处理来诱导腺苷酸环化酶活性和随后的cAMP生成。随后用递增浓度的褪黑激素刺激细胞，通过褪黑激素降低cAMP水平的能力评估褪黑激素信号转导的功能状态。使用无褪黑激素存在下福司柯林诱导的cAMP生成来标准化数据。正如预期，与健康对照个体相比，IS患者的成骨细胞用福司柯林刺激后对褪黑激素的响应显示高cAMP生成(图2)。此外，三名IS患者之间的该生成程度不同。这些数据与先前的结果一致(Goldberg MS，Mayo NE，Poitras B等人，The Ste-Justine AdolescentIdiopathic Scoliosis Cohort Study.Part I：Description of the study.Spine1994；19：1551-61.)，因此证实这些患者的成骨细胞中存在不同程度的褪黑激素信号转导障碍。
随后通过研究不同浓度的褪黑激素和碘代褪黑激素对这些细胞CDS响应的效果，评价了CDS试验检测该缺陷的能力。对来自健康对照个体(对照)和IS患者(组1、2和3)的成骨细胞和PBMC(主要包括淋巴细胞)应用递增浓度的褪黑激素或碘代褪黑激素。随后在CellKeyTM仪器中通过CDS测定细胞响应。根据最大阻抗强度产生曲线。根据对照患者细胞的最大响应值标准化数据，用一式两份进行的三次独立实验的平均值±SE表示。获得的结果显示，褪黑激素和碘代褪黑激素在对照和IS患者的成骨细胞中以浓度依赖的方式诱发了类似的响应。然而，IS成骨细胞中响应的强度显著较低(图4)。另一方面，还观察到三名IS患者中CDS响应的程度具有显著差异。这些结果表明，IS中褪黑激素信号转导障碍和患者之间该缺陷的差异可通过CDS在IS患者中检测。
有趣的是，使用CDS对褪黑激素或碘代褪黑激素响应的PBMC筛选显示了与成骨细胞类似的特征(图4和图8)，表明褪黑激素信号转导障碍同样发生在PBMC中。
实施例5
分离自IS和对照个体的不同细胞类型中不同Gi偶联受体的响应比较
如图3至8所示，相对于来自正常、无脊柱侧凸个体的细胞，分离自AIS患者的成骨细胞、成肌细胞和PBMC用对不同Gi蛋白偶联受体(MT2、5-HT1A、α2-AD、A3或CB2)特异性的配体刺激后具有改变的响应(即刺激后阻抗变化)，由此表明IS患者具有Gi蛋白介导的信号转导的普遍损伤。如下表V所示，在所有试验的IS个体(I期和II期)的细胞中检测到受损的Gi蛋白偶联的受体响应。同样，来自12/31无症状风险个体(具有IS父母的个体)显示Gi蛋白偶联受体响应的缺陷。有趣的是，12名检测到Gi蛋白偶联的受体响应受损的个体中有4名后来通过X射线分析检测到脊柱侧凸症状，表明受损/缺陷的Gi蛋白偶联受体响应可用于IS(或IS倾向)的预后。
表V：对照、AIS和无症状风险个体中获得的数据概述
Figure BDA0000066528990000251
实施例6
从AIS家族成员获得的细胞中Gi偶联受体响应的测定
图9-10显示，从患有IS的母亲和女儿中分离的PBMC(主要包括淋巴细胞)中检测到不同Gi偶联受体响应的改变，但分离自未患病的父亲和儿子的细胞中未改变。有趣的是，从母亲和女儿获得的细胞中测定的Gi偶联受体响应非常类似(组2，如下文所定义)，表明该缺陷由母亲遗传给女儿。同样，尽管接受了手术以减小脊柱曲率，母亲仍然具有该缺陷。女儿的临床数据如下：年龄13.5，弯曲特征：右胸，科布角：6。
实施例7
基于成骨细胞中测定的Gi偶联受体响应的AIS个体分层/分类
图11显示了使用不同的Gi偶联受体配体在来自对照(n＝3)和IS个体(n＝9)的成骨细胞中测定的平均值的范围。最小值(min)和最大值(max)代表给定患者/对照个体的一式两份进行的三次独立测量的平均值(总共6个值)。所有检测的AIS个体与对照个体相比显示较低的Gi偶联受体响应，但在AIS个体中通常观察到三种类型的响应(如图3-8所示的AIS个体的三种不同的曲线)，因此可分成三组。具有最低值(低Gi偶联受体响应)的AIS个体归为亚组1，具有最高值(“高”Gi偶联受体响应，但通常低于对照个体)归为亚组3，介于组1和3之间的值的AIS个体(“中等”Gi偶联受体响应)归为亚组2。下表VI总结了使用不同配体获得的数据(dZiec值和对照％)。列出了一式两份(n1和n2)进行的3次独立试验。
表VI：基于Gi偶联受体响应的AIS个体的分层/分类
褪黑激素
Figure BDA0000066528990000261
碘代褪黑激素
Figure BDA0000066528990000262
IB-meca
CB65
Figure BDA0000066528990000273
Figure BDA0000066528990000281
BP554
Figure BDA0000066528990000282
UK14304
Figure BDA0000066528990000283
Figure BDA0000066528990000291
表VII：不同配体在成骨细胞中每组最小和最大值与对照个体最小和最大值之间的差异。根据图11A-F中所示数据计算。
Figure BDA0000066528990000292
Figure BDA0000066528990000301
实施例8
基于PBMC中测定的Gi偶联受体响应的IS个体分层/分类
对患有(n＝45)(参见表II)或不患有AIS(n＝42)(参见表II)的个体组进行试验以确定基于细胞的CDS测定的灵敏性和特异性，该试验通过研究每个个体的PBMC(主要包括淋巴细胞)的褪黑激素信号转导功能状态而实现。
如上述实施例2中所述从对照个体、IS个体中分离PBMC。通过细胞介电谱(CDS)测定了300μM碘代褪黑激素的信号转导效应。
图12A显示，与健康志愿者(对照)相比，所有的IS患者具有更低的碘代褪黑激素响应。褪黑激素也获得了类似的结果(数据未显示)，表明该测定的高选择性。实验条件下，健康志愿者PBMC中测定的对碘代褪黑激素的最小响应强度为124欧姆。试验的AIS患者CDS响应无一到达该强度。IS患者中测定的最大强度为110欧姆，最小值为16欧姆。因此，正常/健康个体对碘代褪黑激素的褪黑激素信号转导响应高于120欧姆。组1的IS患者CDS响应范围为10-40欧姆，组2中为40-80欧姆，组3的IS患者为80-120欧姆。在所有试验的AIS患者中，分别有11％(5/44)、30％(13/44)和59％(26/44)属于功能组1、2和3。根据其CDS响应，可毫无疑义地对这些患者进行分类。组1的CDS响应平均值为27.86±4.18，组2为65.71±3.42，组3为97.94±1.36，对照组为155.17±3.91。这些差异是极显著的(P＜0.001)。这些结果表明，使用CDS测定进行的基于PBMC中褪黑激素信号转导的功能试验不仅能有效区分IS患者和健康个体，还能区分不同的功能组。这些结果证明了该功能试验作为诊断工具的灵敏性、特异性和动态范围。关于PBMC中碘代褪黑激素也参见表VII，其显示了在各组中观察到的最小和最大值与对照个体的最小和最大值差异。
表VIII：在PBMC中对碘代褪黑激素观察到的每组最小和最大值与对照个体最小和最大值之间的差异。根据图12A中所示数据计算数值。
  碘代褪黑激素  绝对dZiec   ％对照信号(最小值/最大值)
  组1   最小值差异  36/124   29％
  最大值差异  16/225   7％
  组2   最小值差异  75/124   60％
  最大值差异  49/225   22％
  组3   最小值差异   110/124   89％
  最大值差异   86/1125   38％
实施例9
在PBMC中预测发展成IS的风险
对健康的对照(n＝42)(表I)或认为具有发展该疾病的风险的个体(n＝30)(表III)进行了试验，以确定该试验预测发展成IS的能力。
PBMC分离自上述实施例2中的无症状风险个体。300μM碘代褪黑激素在这些细胞中的信号转导效应通过细胞介电谱(CDS)测定，与上述实施例6中所述健康对照者的测定结果进行比较。
至少父母之一为脊柱侧凸的无症状儿童的PBMC的功能性筛选显示该类人群中可检测到褪黑激素信号转导缺陷(图12B)。所有测试的无症状儿童中，有60％(19/31)显示正常强度范围内的CDS响应(＞120欧姆)，40％的CDS响应下降(12/31)。后者被认为更易于发展成脊柱侧凸。放射照相证实，这12名高风险儿童中，4名(33％)在24个月后发展成脊柱畸形，平均科布角为11.7°(数据未显示)。19例正常范围者无一发展成脊柱侧凸。
已知至少父母之一为脊柱侧凸的无症状儿童IS患病率升高。上述结果确认了这一点，证实此类儿童更易于发展成IS。所测试的无症状儿童中有40％预测为具有发展成脊柱侧凸的风险(即12/31)，他们中有33％在数月后发展成脊柱畸形。例如，表III中的无症状患者#3116(那时9岁)，在11岁时弯曲模式为右胸和左腰，科布角为9-14°。
其余的67％疑似儿童未发现脊柱畸形的明显特征可能与其年龄有关。实际上，认为脊柱畸形发生在10-16岁的儿童中。然而，进入本研究的无症状儿童的平均年龄为10.2±3.2岁，其进行了24个月的随访。因此，期间并非所有测试的儿童都达到了发展成脊柱畸形的适当年龄。
在所有测试的儿童中(包括10岁或更大的(脊柱侧凸在约10岁出现))，具有正常褪黑激素信号转导的无症状儿童和无脊柱侧凸家族史的对照儿童在研究期间均未出现任何脊柱畸形。
实施例10
无症状风险个体中Gi偶联受体响应的测定
图13A和B显示，可能在18个月内检测到无症状风险个体(n＝31)(父母之一患有AIS的个体)的PBMC(主要包括淋巴细胞)中Gi偶联受体响应的缺陷。同样，缺陷的强度在该时期内得以维持(即个体在第一时间点(t0)和18个月后(t18)显示类似的响应)，表明该缺陷不随时间进展。
实施例11
成骨细胞中Gi偶联的受体响应的测定
将成骨细胞以5x104/150uL每孔的密度接种在CellKeyTM标准96-孔微量板中，在标准条件下孵育(37℃/5％CO2)。孵育过夜后，将平板放置在CellKeyTM系统上，用测定缓冲液(Hanks，含有20mM HEPES和0.1％BSA的平衡盐溶液)更换生长培养基后开始试验。细胞随后在室温下平衡30分钟。在该阶段终点，将板放置在系统上，添加前测量5分钟，获得基线读数。随后，使用集成的流控系统向所有96孔中同时加入福司柯林、异丙肾上腺素、褪黑激素或缓激肽。化合物的加入导致阻抗变化，其在加入流体并混合后立即开始。阻抗测量在28℃进行15分钟。图14显示AIS中的GPCR信号转导是对Gi偶联受体具有特异性的。各组之间在异丙肾上腺素存在下观察到的Gs-偶联GPCR响应的差异以及在福司柯林存在下的cAMP生成的差异通过缺少功能性Gi得以解释。细胞内Gi大约超过Gs的10倍。因此，如果某些Gi是非功能性的，那么在福司柯林存在下它不能抑制cAMP的生成，并且因此Gs-偶联的响应似乎也受到影响。
尽管本发明通过特定的实施方案在上文中进行了描述，但它可以在不偏离如所附的权利要求书所定义的本发明主旨和性质的情况下进行修改。

Claims (60)

1.一种用于确定测试化合物是否能有效治疗脊柱侧凸的方法，所述方法包括：
(a)使表达与抑制性鸟嘌呤核苷酸结合(Gi)蛋白偶联的受体的细胞与所述受体的配体在所述测试化合物存在或不存在情况下接触；
(b)测定所述配体在该细胞中诱导的信号强度；
其中若存在所述测试化合物时相对于不存在该化合物时信号水平更高，表明所述测试化合物可用于治疗脊柱侧凸。
2.权利要求1的方法，其中所述脊柱侧凸是特发性脊柱侧凸。
3.权利要求1或2的方法，其中所述特发性脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。
4.权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述细胞从患有AIS的个体获得。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述信号是所述细胞的阻抗变化。
6.权利要求5的方法，其中所述阻抗变化通过细胞介电谱(CDS)测定。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述细胞是成骨细胞、成肌细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
8.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述细胞是PBMC。
9.权利要求8的方法，其中所述细胞是淋巴细胞。
10.权利要求1-9的方法，其中所述受体是血清素受体、α-肾上腺素能受体、腺苷受体或大麻素受体。
11.权利要求10的方法，其中所述血清素受体是5-HT1A。
12.权利要求10的方法，其中所述α-肾上腺素能受体是α2-AD。
13.权利要求10的方法，其中所述腺苷受体是A3。
14.权利要求10的方法，其中所述大麻素受体是CB2。
15.权利要求1-14任一项所述的方法，其中所述配体是激动剂。
16.权利要求11的方法，其中所述配体是1-[3-(3，4-亚甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基哌嗪马来酸盐(BP554马来酸盐)。
17.权利要求12的方法，其中所述配体是5-溴-N-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基)-6-喹喔啉胺(UK14304)。
18.权利要求13的方法，其中所述配体是1-脱氧-1-[6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核糖脲酰胺(IB-MECA)。
19.权利要求14的方法，其中所述配体是N-环己基-7-氯-1-[2-(4-吗啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-甲酰胺(CB65)。
20.权利要求1-19任一项所述的方法，包括测定由至少两种不同配体诱导的信号强度。
21.权利要求1-20任一项的方法，包括测定至少两种不同的Gi蛋白偶联受体的信号强度。
22.一种用于诊断个体发展脊柱侧凸倾向的方法，包括：
(a)使来自所述个体的表达与抑制性鸟嘌呤核苷酸结合(Gi)蛋白偶联的受体的细胞与所述受体的配体接触；
(b)测定所述配体在该细胞中诱导的信号强度；
(c)将所述信号与相应的参比信号进行比较；以及
(d)基于该比较来确定所述倾向。
23.权利要求22的方法，其中所述脊柱侧凸是特发性脊柱侧凸。
24.权利要求23的方法，其中所述特发性脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。
25.权利要求22或23的方法，其中所述信号是所述细胞的阻抗变化。
26.权利要求25的方法，其中所述阻抗变化通过细胞介电谱(CDS)测定。
27.权利要求22-26任一项所述的方法，其中所述细胞是成骨细胞、成肌细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
28.权利要求22-26任一项所述的方法，其中所述细胞是PBMC。
29.权利要求28的方法，其中所述细胞是淋巴细胞。
30.权利要求22-29任一项的方法，其中所述受体是血清素受体、α-肾上腺素能受体、腺苷受体或大麻素受体。
31.权利要求30的方法，其中所述血清素受体是5-HT1A。
32.权利要求30的方法，其中所述α-肾上腺素能受体是α2-AD。
33.权利要求30的方法，其中所述腺苷受体是A3。
34.权利要求30的方法，其中所述大麻素受体是CB2。
35.权利要求22-34任一项所述的方法，其中所述配体是激动剂。
36.权利要求31的方法，其中所述配体是1-[3-(3，4-亚甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基哌嗪马来酸盐(BP554马来酸盐)。
37.权利要求32的方法，其中所述配体是5-溴-N-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基)-6-喹喔啉胺(UK14304)。
38.权利要求33的方法，其中所述配体是1-脱氧-1-[6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核糖脲酰胺(IB-MECA)。
39.权利要求34的方法，其中所述配体是N-环己基-7-氯-1-[2-(4-吗啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-甲酰胺(CB65)。
40.权利要求22-39任一项所述的方法，包括测定由至少两种不同配体诱导的信号强度。
41.权利要求22-40任一项的方法，包括测定至少两种不同的Gi蛋白偶联受体的信号强度。
42.权利要求24-41任一项的方法，其中所述个体是可能发展成青少年特发性脊柱侧凸的候选者。
43.对具有特发性脊柱侧凸的人类个体分类的方法，包括：
(a)使来自所述个体的表达与抑制性鸟嘌呤核苷酸结合(Gi)蛋白偶联的受体的细胞与所述受体的配体接触；以及
(b)测定所述配体在该细胞中诱导的信号强度，其中根据所述测定步骤的结果能够将具有特发性脊柱侧凸的个体划分在一个亚组中。
44.权利要求43的方法，其中所述特发性脊柱侧凸是青少年特发性脊柱侧凸(AIS)。
45.权利要求43或44的方法，还包括基于测定步骤的结果为所述个体选择治疗。
46.权利要求43-45任一项的方法，其中所述信号是所述细胞阻抗的变化。
47.权利要求46的方法，其中所述阻抗的变化通过细胞介电谱(CDS)测定。
48.权利要求43所述的方法，其中所述细胞是成骨细胞、成肌细胞或外周血单核细胞(PBMC)。
49.权利要求43-48任一项的方法，其中所述受体是血清素受体、α-肾上腺素能受体、腺苷受体或大麻素受体。
50.权利要求49的方法，其中所述血清素受体是5-HT1A。
51.权利要求49的方法，其中所述α-肾上腺素能受体是α2-AD。
52.权利要求49的方法，其中所述腺苷受体是A3。
53.权利要求49的方法，其中所述大麻素受体是CB2。
54.权利要求43-53任一项所述的方法，其中所述配体是激动剂。
55.权利要求50的方法，其中所述配体是1-[3-(3，4-亚甲二氧基苯氧基)丙基]-4-苯基哌嗪马来酸盐(BP554马来酸盐)。
56.权利要求51的方法，其中所述配体是5-溴-N-(4，5-二氢-1H-咪唑-2-基)-6-喹喔啉胺(UK14304)。
57.权利要求52的方法，其中所述配体是1-脱氧-1-[6-[[(3-碘苯基)甲基]氨基]-9H-嘌呤-9-基]-N-甲基-β-D-呋喃核糖脲酰胺(IB-MECA)。
58.权利要求53的方法，其中所述配体是N-环己基-7-氯-1-[2-(4-吗啉基)乙基]喹啉-4(1H)-酮-3-甲酰胺(CB65)。
59.权利要求43-58任一项所述的方法，包括测定由至少两种不同配体诱导的信号强度。
60.权利要求43-59任一项的方法，包括测定至少两种不同的Gi蛋白偶联受体的信号强度。
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