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CN102212019B - 支化水溶性聚合物及其缀合物 - Google Patents

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CN102212019B CN201110071874.2A CN201110071874A CN102212019B CN 102212019 B CN102212019 B CN 102212019B CN 201110071874 A CN201110071874 A CN 201110071874A CN 102212019 B CN102212019 B CN 102212019B
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Abstract

本发明提供了可允许两个或多个水溶性聚合物缀合于另一物质的支化水溶性聚合物。该支化聚合物提供了获取在单一位点缀合于两个或多个水溶性聚合物的治疗剂的途径。该支化聚合物基于属于简单支化烷基结构的支化点，反应性侧链氨基酸和反应性侧链氨基酸的小肽和糖。还提供了制备明确并可预定的分子量的单分散聚(乙二醇)的方法，以及聚(乙二醇)的合理的末端官能化的方法。还提供了该支化水溶性聚合物与不同物质，例如肽、脂类、糖脂和小分子的缀合物。

Description

支化水溶性聚合物及其缀合物
相关申请的交叉引用
本申请是2003年3月14日提出的US临时专利申请No.60/454,993，2003年5月29日提出的US临时专利申请No.60/474,094，以及2003年10月7日提出的US临时专利申请No.60/509,752的非临时提交，各申请的内容在本文全面引入供参考。
技术领域
本发明涉及支化水溶性聚合物以及由这些支化聚合物形成的缀合物。
背景技术
亲水性聚合物，比如聚(乙二醇)(缩写PEG，还称为聚(环氧乙烷)，缩写PEO)与分子和表面的缀合在生物技术和医药领域具有可观的用途。根据其最通常的形式，PEG是在各末端用羟基终端的线形聚合物：
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中n通常是大约3到大约4000。许多末端官能化衍生物在文献中是已知的，并且可以市购。例如，参见Shearwater Polymers，Inc.“Polyethylene Glycol Derivatives”目录。
在两个末端的每一个具有不同基团的PEG物质是特别有效的化合物。例如，异双官能PEG可用作交联剂。而且，在一个末端例如用烷基“封端”(比如甲氧基)的PEG分子使分子的羟基末端被转化为大量的反应性有机官能团的任何一个。
以下所示的环氧乙烷和环氧丙烷的无规或嵌段共聚物在化学结构上与PEG紧密相关，它们可以在PEG的许多应用中代替PEG。
HO-CH2CHRO-(CH2CHRO)n-CH2CR-OH
其中各R独立地是H或CH3。
在治疗活性物质和水溶性聚合物之间的缀合物的形成已经证明是用于改进治疗剂的药代动力学和药效动力学的颇富成效的策略。例如，参见Dunn和Ottenbrite，“Polymeric Drugs and Drug DeliverySystems”：ACS Symposium Series 469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。例如，PEG用于衍生化肽治疗剂的应用已经证实可减低肽的免疫原性并延长在循环中的清除时间。例如，US专利No.4,179,337(Davis等人)涉及偶联于聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇的非免疫原性肽，比如酶和肽激素。每摩尔肽使用10-100摩尔聚合物，并保持至少15％的生理活性。
PEG-肽缀合物的许多其它实例在本领域中是已知的。PEG及其衍生物连接于肽的主要方式是通过肽氨基酸残基的非特异结合。例如，US专利No.4,088,538公开了以共价键连接于PEG的酶的酶活性聚合物-酶缀合物。类似地，US专利No.4,496,689公开了α-1蛋白酶抑制剂与聚合物比如PEG或甲氧基聚(乙二醇)(“mPEG”)的共价键连接的复合物。Abuchowski等人(J.Biol.Chem.252：3578(1977)披露了mPEG与牛血清白蛋白的胺基的共价连接。WO93/15189(Veronese等人)涉及通过将蛋白水解酶连接于大分子抑制剂来保持聚乙二醇改性的蛋白水解酶的活性的方法。该缀合物目的用于医学应用。US专利No.4,414,147披露了通过将干扰素缀合于二羧酸的酸酐，比如聚(乙二醇丁二酸酐)而减低其疏水性的方法。PCT WO87/00056公开了PEG和聚(乙氧基化)多元醇缀合于诸如β-干扰素，白介素-2和免疫毒素之类的蛋白的方法。EP 154,316公开并要求了化学改性淋巴因子，比如含有直接键接于该淋巴因子的至少一个伯氨基的PEG的IL-2。US专利No.4,055,635公开了以共价键连接于聚合物质比如多糖的蛋白水解酶的水溶性复合物的药物组合物。
将PEG连接于肽的另一方式是通过在肽上的糖基残基的非特异氧化。被氧化的糖用作将PEG结构部分连接于肽的位点。例如，M′Timkulu(WO 94/05332)公开了肼-或氨基-PEG用于将PEG加成到糖蛋白的用途。糖基结构部分被无规地氧化成相应的醛，它们随后偶联于氨基-PEG。
在上述各方法中，聚(乙二醇)以无规、非特异的方式加成到肽骨架上的反应性残基。通常，用PEG衍生化导致了肽活性的损失，这直接归因于用于缀合该水溶性聚合物的化学过程的非选择性性质。
与在水溶性聚合物和生物分子之间形成缀合物有关的另一难题是反应性水溶性聚合物试剂在一个以上的位点标记生物分子的能力。虽然通常希望每一缀合物包括一个以上的水溶性聚合物结构部分，但生物分子活性的减低程度常常与键接于生物分子的聚合物结构部分的数目成正比。因此，获取每分子包含两个或多个水溶性聚合物结构部分的反应性、支化物质具有重要意义。通过使用支化分子，一个以上的水溶性聚合物能够缀合于生物分子，而无需干扰生物分子上的一个以上的位点。
基于聚(乙二醇)的支化聚合物在本领域中是已知的。例如，Greenwald等人(WO 98/41562)公开了基于1，3-二氨基-2-丙醇核的支化PEG。Morpurgo及其同事在Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72(1996)中论述了基于赖氨酸核的支化PEG的用途。类似的基于赖氨酸的支化PEG被Guiotto等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180(2002)所制备。Harris等人(US专利No.5,932,462)还制备了基于赖氨酸的支化PEG。Martinez等人(US专利No.5,643,575)描述了许多基于各种核结构的支化PEG物质以及这些物质与生物活性材料的缀合物(US专利No.6,113,906)。
聚合物，比如聚(乙二醇)已知是作为杂分散群体存在的，其包括了一定范围的聚合物链长和分子量。当制备治疗制剂时，很显然，希望采用具有最小的杂分散性的聚合物来确保制剂之间的一致性和重现性。在本领域中已知几乎没有制备单分散PEG样品的方法。Loiseau等人公开了定义明确的PEG分子的合成。该方法采用保护/去保护策略，这对于制备大量的基本单分散PEG来说不是最佳的。因此，除了支化聚(乙二醇)聚合物以外，制备单分散PEG和将该单分散材料引入到支化聚合物中的方法是特别理想的。
本发明回应了对于支化水溶性聚合物和单分散PEG物质的需求，打开了获取新型治疗缀合物，例如肽缀合物的途径，并且解决了对于更稳定且治疗有效的治疗物质的需求。对于用改性基团比如水溶性聚合物改性治疗用生物分子的工业上实用的方法仍然存在着需求。特别有意义的是其中缀合物具有比未改性治疗剂改进的性能的方法。本发明满足了这些和其它需求。
本发明的简述
本发明提供了基于多种结构的核的支化水溶性聚合物。本发明的支化聚合物提供了通过单一连接位置将两个或多个水溶性聚合物结构部分连接于另一物质的手段。本发明通过参考支化PEG分子来举例说明。PEG作为代表性水溶性聚合物集中描述是为了说明清楚，不应被认为限制本发明。技术人员会认识到，本文所述的支化物质可以用基本上任何水溶性聚合物来制备。除了PEG以外，其它示例性水溶性聚合物包括聚(丙二醇)。
在第一个方面，本发明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物：
WSP-Y-Rx
其中WSP是水溶性聚合物。符号Y表示连接基，例如键，或含有酰胺、羧酸酯、脲烷、硫醇、取代或未取代烷基等的结构部分。示例性连接基包括：键，(CH2)n，(CH2)mC(O)O(CH2)n，(CH2)mC(O)NH(CH2)n，(CH2)mOC(O)NH(CH2)n，(CH2)mO(CH2)n，(CH2)mNH(CH2)n，和(CH2)mS(CH2)n，其中m和n是独立地选自0-6的整数。Rx是水溶性聚合物，连接于水溶性聚合物的取代或未取代烷基结构部分；连接于水溶性聚合物的氨基酸或氨基酸的二聚体；或者连接于水溶性聚合物的糖或糖核苷酸。WSP和Rx的水溶性聚合物组分可以是相同的水溶性聚合物或不同的水溶性聚合物。
用于本发明的化合物的示例性水溶性聚合物包括m-PEG，PEG，m-PPG，PPG，聚唾液酸，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，可生物降解的聚合物(例如聚交酯，聚甘油酯)，和官能化PEG，例如末端官能化PEG。
在一个示例性实施方案中，Y是取代烷基，以及本发明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物：
其中X和Y是独立地选自OR1，NR2R3，SR4，COOR5，CONR6R7，OCONR6R7，取代和未取代的烷基，以及取代和未取代的芳基中的成员。Z1是选自OR1′，NR2′R3′，SR4′，COOR5′，CONR6′R7′，取代和未取代烷基，以及取代和未取代芳基中的成员。符号R1，R4和R5代表水溶性聚合物。R2，R3，R6和R7是独立地选自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代杂芳基，取代和未取代杂环烷基，反应性官能团，以及水溶性聚合物中的成员，前提是选择这些基团，使得根据通式I的化合物包含至少两个水溶性聚合物结构部分。符号R1′，R2′，R3′，R4′，R5′，R6′和R7′表示独立地选自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代杂芳基，取代和未取代杂环烷基，反应性官能团，载体分子和水溶性聚合物中的基团。
在另一个示例性实施方案中，Z1包括糖基(saccharyl)结构部分。糖基结构部分可以是活化糖基结构部分，例如核苷酸糖。此外，Z1能够包括直接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分，或者通过其与连接于氨基酸的糖基残基的缀合而间接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分。
本发明还提供了基于氨基酸或寡聚氨基酸(例如二肽，三肽，四肽)的支化聚合物。示例性氨基酸型支化聚合物具有选自下列之中的通式：
其中R11，R11′，R12，R12′，R13′和R13′独立地选自H，取代或未取代烷基和水溶性聚合物，前提是选择这些基团，使得上述化合物包括至少两个水溶性聚合物结构部分。R14是选自OH，反应性官能团，含糖结构部分的基团或连接于载体分子的基团中的一种。A是选自NH，O和S中的一种。下标“s”表示1-5的整数。
在以上通式中所述的各化合物可用于其它物质(例如核酸，肽，糖等)的化学PEG化。形成PEG(和含有PEG的物质)之间的缀合物的方法通常在本领域中是已知的。例如，参见Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in ChemistrySeries，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
在另一个示例性实施方案中，R14包括糖基结构部分。该糖基结构部分可以是活化糖基结构部分，例如核苷酸糖。此外，R14能够包括直接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分，或者通过其与连接于氨基酸的糖基残基的缀合而间接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分。
在又一个方面，本发明提供了基于糖核(“支型核”)的支化水溶性聚合物。技术人员清楚，糖核可以具有任何结构。用于本发明的这方面的示例性糖包括GlcNAc，Gal，Sia，Fuc，Glc，Gal NAc，GalNH2，GlcNH2等。
本发明的示例性化合物具有以下通式：
糖-O-(L-WSP)2
其中L是连接基和WSP是水溶性聚合物。
在另一个示例性实施方案中，本发明的糖基支化水溶性聚合物具有以下通式：
核苷酸-糖-O-(L-WSP)2
根据本发明的该方面的另一示例性化合物(基于唾液酸核)具有以下通式：
其中R16和R16′是选自H，乙酰基和通式(I)中的成员：
以及R17，R18，R19和R19′是独立地选自H，OH，NH2，NHAc和根据通式I的结构部分中的成员。在通式I中，Z2是选自O，S，CH2和S中的一种。R11如上所述，以及下标“a”表示0-20的整数，前提是R16，R16′，R17，R18，和R19的至少两个具有根据通式I的结构。R11还可以是连接于载体分子的基团或键接于载体分子的键。R15是选自H和活化基团，例如磷酸核苷酸中的一员。
在另一个方面，该支化聚合物基于半乳糖或N-乙酰基半乳糖，其具有以下通式：
其中R15-R19如上所述，R15-R19的至少两个是根据通式I的结构部分。
具有如上所示的通式的其它示例性糖衍生的结构是甘露糖和基于葡萄糖的支化水溶性聚合物。
此外，R15可以包括连接于肽的氨基酸的键，或连接于糖基结构部分的键，该糖基结构部分直接键合于肽的氨基酸，或通过缀合于连接氨基酸的糖基残基而间接键合于肽的氨基酸。
本发明还提供了制备聚(乙二醇)分子的基本单分散群体的方法。该方法包括让具有明确的分子量的PEG分子，例如PEG200与至少2当量的也具有明确分子量的双官能活化PEG，例如PEG200接触，从而产生PEG的单分散样品，例如PEG 600：
G是离去基团，比如磺酸酯或tresylate酯。PEG600的单分散样品然后可以与双官能活化PEG200接触，形成单分散PPEG100。或者，单分散PEG600可以转化为相应的双官能化衍生物，再与至少2当量的单分散二羟基-PEG600反应，产生单分散PEG1800。重复本发明的方法，直到获得所需大小的单分散PEG为止。可以设计该合成，使得在起始原料和产物之间的分子量差允许通过尺寸排阻色谱法而分离任何未反应或部分反应的材料。
而且，作为对制备改性水溶性聚合物，比如聚(乙二醇)的改进方法的需求的回应，本发明提供了化学活化和延长聚合物骨架的方法。单活化PEG分子可用于将PEG缀合于各种物质，例如靶向结构部分，治疗用结构部分，抗肿瘤药物，细胞毒素，放射剂，氨基酸类，糖等。
因此，在另一个方面，本发明提供了活化水溶性聚合物，尤其聚(乙二醇)及其结构类似物的分步组装的方法。该方法提供了获得单官能化和双官能化PEG分子的方便途径。
因此，在一个示例性实施方案中，本发明提供了制备聚(乙二醇)的方法。下面概述了该方法：
a.R-Y/(酸或碱)；b.活化，例如甲苯磺酰化，卤-去羟基化，例如HX或SOX2，以及与PEGm反应；c.活化(R′)，例如用氯甲酸对硝基苯基酯。
其中，下标m和n独立地表示1-100,000。
在步骤a中，起始二醇与活化基团(R-Y)接触，该活化基团与二醇的羟基结构部分反应。Y通常是离去基团，使R安放在PEG分子的羟基结构部分之一上。在步骤b中，所得加合物的游离羟基通过其转化为磺酸酯类的基团来活化。活化的PEG物质与作为起始PEG(“PEGm”)的相同或不同聚合度的另一PEG结构部分接触。为了使其连接于另一物质，RO-PEG(n+m)任选在游离羟基结构部分处活化。
本发明的化合物可用于通过一个或多个可获得的反应性残基在治疗剂上的直接化学PEG化，形成底物比如治疗剂，例如肽，脂类，糖脂的水溶性聚合物缀合物。本发明的化合物也容易引入到可以在底物，例如治疗剂的酶介导的糖-PEG化中采用的活化的糖缀合物中。
本发明还提供了本发明的一个或多个支化水溶性聚合物缀合于其上的治疗剂的药物制剂。还提供了治疗疾病的方法，这些疾病通过给予治疗剂和本发明的支化水溶性聚合物之间的缀合物来改善或治愈。
本发明的其它方面、优点和目的可以从以下的详细说明中了解到。
附图简述
本发明的详细说明
缩写
PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰氨基半乳糖基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰氨基葡糖基；Man，氨基甘露糖基；ManAc，氨基甘露糖基乙酸酯；Sia，唾液酸；和NeuAc，N-乙酰基神经胺基(N-acetylneuraminyl)。
定义
除非另有规定，否则本文所使用的全部技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员的一般理解相同的含义。通常，在本文和细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学和交叉学科的实验工序中使用的命名法是众所周知和本领域常用的那些。核酸和肽合成采用标准技术。该技术和工序一般按照本领域的普通方法和各种一般参考文献来进行(一般参见，Sambrook等人，MOLECULAR CLONING；A LABORATORY MANUAL，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，该文献引入本文供参考)，它们在整个文件中被提供。在本文和分析化学的实验工序以及下述有机合成中采用的命名法是本领域众所周知和常用的那些。化学合成和化学分析采用标准技术或它们的改进。
本文所使用的术语“糖缀合(glycoconjugation)”是指改性糖物质与肽的氨基酸或糖残基的酶介导的缀合。“糖缀合”的亚属是“糖-PEG化”，其中改性糖的改性基团是聚(乙二醇)，以及它的烷基衍生物(例如m-PEG)或反应性衍生物(例如H2N-PEG，HOOC-PEG)。
术语“唾液酸”是指九碳羧基化糖的家族的任何成员。唾液酸家族的最常见的成员是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬酮糖吡喃糖-1-酸(galactononulopyranos-1-onic acid)，常缩写为Neu5Ac，NeuAc或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰基-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-壬酮糖酸(nonulosonic acid)(KDN)(Nadano等人(1986)，J.Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包括了9-取代的唾液酸比如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac，9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的评述，例如参见Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，New York(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化工序中的合成和用途公开在1992年10月1日出版的国际申请WO92/16640中。
“肽”是指聚合物，其中单体是氨基酸并通过酰胺键连接在-起，或者称之为多肽。另外，非天然氨基酸，例如β-丙氨酸，苯基甘氨酸和高精氨酸也被包括。非基因编码的氨基酸也可以在本发明中采用。此外，已经被改性成包含反应性基团，糖基化位点，聚合物，治疗用结构部分，生物分子等的氨基酸也可以在本发明中采用。在本发明中使用的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。L-异构体一般是优选的。另外，其它拟肽(peptidomimetics)也可用于本发明。本文所使用的“肽”是指糖基化肽和非糖基化肽。还包括了被表示肽的体系不完全糖基化的肽。关于一般评述，参见Spatola，A.F.，CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。
术语“肽缀合物”是指本发明的物质，其中肽与如本文所述的改性糖进行糖缀合。作为代表性实例，该肽是具有不存在于野生型肽中的O-连接的糖基化位点的突变肽。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的拟氨基酸。天然存在的氨基酸是由遗传密码所编码的那些氨基酸，以及后来改性的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，以及O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，具有键接于氢，羧基，氨基和R基团的α碳，例如高丝氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基锍。这些类似物具有改性R基团(例如正亮氨酸)或改性肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。拟氨基酸是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。
如本文所使用的术语“改性糖”是指天然存在或非天然存在的碳水化合物，用本发明的支化水溶性聚合物改性，可以酶促加成到肽、脂类、糖脂等的氨基酸或糖基残基上。改性糖选自许多酶底物，包括、但不限于糖核苷酸(一磷酸酯，二磷酸酯和三磷酸酯)，活化糖(例如卤化糖，糖基甲磺酸酯)和既未活化也未核苷酸化的糖类。“改性糖”用“改性基团”(它是本发明的支化聚合物)共价官能化。选择用改性基团官能化的位置，使得它不阻碍“改性糖”酶促加成到肽或其它底物上。
术语“水溶性”是指在水中具有可检测到的溶解度的结构部分。检测和/或定量水溶性的方法在本领域中是众所周知的。示例性水溶性聚合物包括肽，糖类，聚(醚)，聚(胺)，聚(羧酸)等。肽可以具有由单一氨基酸组成的混合序列，例如聚(赖氨酸)。示例性多糖是聚(唾液酸)。示例性聚(醚)是聚(乙二醇)，例如m-PEG。聚(乙烯亚胺)是示例性聚胺，以及聚(丙烯酸)是代表性聚(羧酸)。
术语“聚(乙二醇)”，“PEG”，“聚(丙二醇)”和“PPG”以它们的一般意义使用，它们还包括了该母体化合物的衍生物，例如单烷基物质，例如m-PEG，m-PPG，反应性物质，N-羟基丁二酰亚胺，对硝基苯基碳酸酯(p-NP)，HOBT衍生物，和胺类。还包括在这些术语范围内的是包含两个或多个改性的物质，例如p-NP-PEG-OMe等。
本文所使用的术语“糖基连接基”是指糖基残基，作用剂(例如水溶性聚合物，治疗用结构部分，生物分子)以共价键连接于它。在本发明的方法中，“糖基连接基”以共价键连接于糖基化或非糖基化肽，从而将作用剂连接于肽上的氨基酸和/或糖基残基上。“糖基连接基”一般通过“改性糖”与肽的氨基酸和/或糖基残基的酶促连接而由“改性糖”产生。“完整的糖基连接基”是指由糖基结构部分衍生的连接基，其中连接缀合物的各糖单体不被降解，例如不被氧化，例如不被偏高碘酸钠所氧化。本发明的“完整糖基连接基”可以通过从母体糖结构中增加糖基单元或除去一个或多个糖基单元而由天然存在的寡糖产生。
本文所使用的“药学可接受的载体”包括任何材料，当与缀合物结合时，保持了缀合物的活性，并且不与患者的免疫系统反应。实例包括、但不限于标准药物载体的任何一种，比如磷酸盐缓冲的盐水溶液，水，乳液比如油/水乳液，以及各种类型的润湿剂。其他载体还可以包括消毒液，片剂，包括包衣片剂和胶囊。典型地，这些载体含有赋型剂比如淀粉，牛奶，糖，某些类型的粘土，明胶，硬脂酸或它的盐，硬脂酸镁或硬脂酸钙，滑石，植物脂肪或油，树胶，二醇类，或其它已知的赋型剂。此类载体还可以包括香味剂和颜色添加剂或其它成分。包括此类载体的组合物通过公知的普通方法来配制。
本文所使用的“给药”是指口服给药，作为栓剂给药，局部接触，静脉内，腹膜内，肌内，损伤区，或皮下给药，吸入给药，或植入患者体内的缓释设备，例如微渗透泵。给药可通过任何途径，包括非肠道和透过粘膜方式(例如口服，经鼻，经阴道，经直肠或透皮)，尤其通过吸入。非肠道给药包括例如静脉内，肌内，小动脉内，真皮内，皮下，腹膜内，心室内，和颅内。而且，如果注射用于治疗肿瘤，例如，诱发细胞凋亡，可以直接给药给肿瘤和/或肿瘤周围的组织。其它输送方式包括、但不限于使用脂质体配制剂，静脉内输入，透皮贴剂等。
术语“分离的”是指大体上或基本上不含用于生产该材料的组分的材料。对于本发明的肽缀合物，术语“分离的”是指大体上或基本上不含正常在用于制备肽缀合物的混合物中该材料所伴有的组分的材料。“分离的”和“纯”可以互换使用。典型地，本发明的分离的肽缀合物具有优选按范围表示的一定纯度。肽缀合物纯度范围的下限是大约60％，大约70％或大约80％，而纯度范围的上限是大约70％，大约80％，大约90％或超过大约90％。
当肽缀合物超过大约90％纯度时，它们的纯度也优选按范围表示。纯度范围的下限是大约90％，大约92％，大约94％，大约96％，或大约98％。纯度范围的上限是大约92％，大约94％，大约96％，大约98％或大约100％纯度。
纯度通过任何技术公认的分析方法来测定(例如，在银染色的凝胶上的谱带强度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，HPLC或类似方式)。
本文所使用的“群体的基本上各成员”描述了本发明的肽缀合物的群体的特性，其中将选择的百分率的加到多肽上的改性糖加到肽上的多个相同的受体位点上。“群体的基本上各成员”说到了在缀合于改性糖的肽的位点的“均匀性”，是指至少大约80％，优选至少大约90％和更优选至少大约95％均匀的本发明的缀合物。
“均匀性”是指改性糖缀合于其上的受体结构部分的群体的结构一致性。因此，在其中各改性糖结构部分缀合于结构与每个其他改性糖所缀合的受体位点相同的受体位点的本发明的肽缀合物中，该肽缀合物被说成是大约100％均匀的。均匀性通常按范围来表示。肽缀合物的均匀性范围的下限是大约60％，大约70％，或大约80％，而纯度范围的上限是大约70％，大约80％，大约90％，或超过大约90％。
当肽缀合物超过或等于大约90％均匀性时，它们的均匀性也优选按范围表示。均匀性的范围的下限是大约90％，大约92％，大约94％，大约96％或大约98％。纯度范围的上限是大约92％，大约94％，大约96％，大约98％或大约100％均匀性。肽缀合物的纯度一般通过本领域技术人员已知的一种或多种方法，例如液相色谱法-质谱法(LC-MS)，基质辅助激光解吸时间飞行质谱(MALDITOF)，毛细管电泳等。
当提到糖肽物质时，“基本均匀的糖形”或“基本均匀的糖基化形式”是指被所研究的糖基转移酶(例如岩藻糖基转移酶)糖基化的受体结构部分的百分率。例如，在α1，2-岩藻糖基转移酶的情况下，如果在本发明的肽缀合物中基本上所有(如以下所定义)的Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸基化类似物被岩藻糖基化，则具有基本均匀的岩藻糖基化形式。本领域的技术人员清楚，起始原料可以含有糖基化受体结构部分(例如岩藻糖基化Galβ1，4-GlcNAc-R结构部分)。因此，计算的糖基化百分率包括用本发明的方法糖基化的受体结构部分，以及已经在起始原料中糖基化的那些受体结构部分。
在“基本均匀”的以上定义中的术语“基本”一般是指特定糖基转移酶的至少大约40％，至少大约70％，至少大约80％，或更优选至少大约90％，还更优选至少大约95％的受体结构部分被糖基化。
术语“大规模”和“工业规模”可互换使用，是指在一个反应周期结束时产生了至少大约250mg，优选至少大约500mg和更优选至少大约1g的糖缀合物的反应周期。
不论是用作键还是显示与键垂直，符号表示所显示的结构部分连接于分子的剩余部分，固体载体等的位置。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。一般，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并包括在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以以多种结晶或非晶形式存在。一般，对于由本发明所设想的应用，所有物理形式是等效的，并且是在本发明的范围内。
本发明的某些化合物具有非对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单一异构体包括在本发明的范围内。
本发明的化合物可以作为单一异构体(例如对映体，顺-反式，位置，非对映异构体)或作为异构体的混合物。在一个优选的实施方案中，化合物作为基本上单一异构体制备。制备基本上异构纯化合物的方法在本领域中是已知的。例如，富含对映体的混合物和纯对映体化合物可以通过使用纯对映体的合成中间体与保持手性中心的立体化学不变或导致其完全转换的反应来制备。或者，最终产物或合成途径中的中间体可以被解析为单一立体异构体。转换或保持特定立体中心不变的技术以及用于解析立体异构体的混合物的那些技术在本领域中是公知的，并且明显是在本领域的技术人员选择适当的方法用于特定情况的能力范围内。通常，可参见Furniss等人(ed s.)，VOGEL′SENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5TH ED.，LongmanScientific and Technical Ltd.，Essex，1991，pp.809-816；和Heller，Acc.Chem.Res.23：128(1990)。
本发明的化合物还可以在构成此类化合物的一个或多个原子处含有非自然比例的原子同位素。例如，这些化合物可以用放射性同位素，例如氚(3H)，碘-125(125I)或碳-14(14C)标记。不论是否具有放射性，本发明的化合物的所有同位素变型意图包括在本发明的范围内。
如果取代基用从左到右书写的它们的普通化学式来表示，它们同样包括了由从右到左书写结构式所获得的化学相同的取代基，例如-CH2O-还可以书写为-OCH2-。
除非另有规定，否则本身或作为另一取代基的一部分的术语“烷基”是指直链或支链，或环状烃基，或者它们的结合物，其可以是全饱和的、单或多不饱和的，可以包括二价(“亚烷基”)和多价基团，具有指定的碳原子数(即C1-C10是指1-10个碳原子)。饱和烃基的实例包括、但不限于诸如以下之类的基团：甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，叔丁基，异丁基，仲丁基，环己基，(环己基)甲基，环丙基甲基，类似物和异构体，例如正戊基，正己基，正庚基，正辛基等的类似物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括、但不限于乙烯基，2-丙烯基，巴豆基，2-异戊烯基，2-(丁二烯基)，2，4-戊二烯基，3-(1，4-戊二烯基)，乙炔基，1-和3-丙炔基，3-丁炔基，以及高级类似物和异构体。除非另有规定，否则术语“烷基”还意图包括在以下更详细定义的烷基的那些衍生物，比如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称为“同烷基(homoalkyl)”。
用于本发明的示例性烷基含有大约1到大约25个碳原子(例如甲基，乙基等)。具有≤8个碳原子的直链、支化或环状烃链将在本文称为“低级烷基”。另外，本文所使用的术语“烷基”进一步包括在烃链片段的一个或多个碳原子上的一个或多个取代基。
术语“烷氧基”，“烷基氨基”或“烷硫基”(或硫代烷氧基)以它们的通常意义使用，是指分别经由氧原子、氨基或硫原子连接于分子的剩余部分的那些烷基。
除非另有规定，本身或与另一术语结合的术语“杂烷基”是指直链或支链，或者环状含碳基团，或者它们的结合物，由所述数目的碳原子和选自O、N、Si、P和S中的至少一个杂原子组成，其中氮、磷和硫原子任选被氧化，以及氮杂原子任选被季化。杂原子O、N、P、S和Si可以位于杂烷基的任何内部位置或者烷基连接于分子的剩余部分的位置。实例包括、但不限于-CH2-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3，-CH2-CH2-N(CH3)-CH3，-CH2-S-CH2-CH3，-CH2-CH2-S(O)-CH3，-CH2-CH2-S(O)2-CH3，-CH＝CH-O-CH3，-Si(CH3)3，-CH2-CH＝N-OCH3，和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多两个杂原子可以是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，本身或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂烷基”是指由杂烷基衍生的二价基团，例如、但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于亚杂烷基，杂原子还可以占据链末端的一个或两个(例如亚烷氧基，亚烷基二氧基，亚烷基氨基，亚烷基二氨基等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基，连接基的无取向用其中连接基的化学式书写的方向来表示。例如化学式-C(O)2R′-表示-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。
除非另有规定，本身或与其它术语结合的术语“环烷基”和“杂环烷基”分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状变型。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环连接于分子的剩余部分的位置。环烷基的实例包括、但不限于环戊基，环己基，1-环己烯基，3-环己烯基，环庚基等。杂环烷基的实例包括、但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌啶基，4-吗啉基，3-吗啉基，四氢呋喃-2-基，四氢呋喃-3-基，四氢噻吩-2-基，四氢噻吩-3-基，1-哌嗪基，2-哌嗪基等。
除非另有规定，术语“芳基”是指多不饱和芳族结构部分，其可以是单环或多环(优选1-3个环)，稠合在一起或共价键连接。术语“杂芳基”是指含有选自N、O和S中的1-4个杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，以及氮原子任选被季化。杂芳基可以通过杂原子连接于分子的剩余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基，1-萘基，2-萘基，4-联苯基，1-吡咯基，2-吡咯基，3-吡咯基，3-吡唑基，2-咪唑基，4-咪唑基，吡嗪基，2-唑基，4-唑基，2-苯基-4-唑基，5-唑基，3-异唑基，4-异唑基，5-异唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，5-苯并噻唑基，嘌呤基，2-苯并咪唑基，5-吲哚基，1-异喹啉基，5-异喹啉基，2-喹喔啉基，5-喹喔啉基，3-喹啉基，四唑基，苯并[b]呋喃基，苯并[b]噻吩基，2，3-二氢苯并[1，4]二嗪-6-基，苯并[1，3]-间二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环体系各自的取代基选自下述可接受的取代基。
为了简便起见，当与其它术语结合使用时(例如芳氧基，芳硫氧基(arylthioxyl)，芳烷基)，术语“芳基”包括如以上定义的芳基和杂芳基。因此，术语“芳烷基”包括其中芳基连接于烷基的那些基团(例如苄基，苯乙基，吡啶基甲基等)，包括所述烷基中碳原子(例如亚甲基)被例如氧原子置换的那些烷基(例如苯氧基甲基，2-吡啶氧基甲基，3-(1-萘氧基)丙基等)。
以上各术语(例如“烷基”，“杂烷基”，“芳基”和“杂芳基”)包括所述基团的取代和未取代形式。以下提供了各类基团的优选的取代基。
烷基和杂烷基(包括常常称为亚烷基、链烯基、亚杂烷基、杂链烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)的取代基一般被称为“烷基取代基”，它们可以是选自、但不限于以下基团中的各种基团的一个或多个：-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-卤素，-SiR′R″R′″，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R′″，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″R′″)＝NR″″，-NR-C(NR′R″)＝NR′″，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，-CN和-NO2，数目是0到(2m′+1)，其中m′是在这种基团中的碳原子的总数。R′，R″，R′″和R″″各自优选独立表示氢，取代或未取代杂烷基，取代或未取代芳基，例如被1-3个卤素取代的芳基，取代或未取代烷基，烷氧基或硫代烷氧基，或芳烷基。当本发明的化合物包括一个以上的R基团时，例如，当存在一个以上的这些基团时，各R基团独立地选择，各R′，R″，R′″和R″″基团同样独立地选择。当R′和R″连接于同一个氮原子时，它们可以与该氮原子结合，形成5、6或7元环。例如，-NR′R″意图包括、但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从取代基的以上论述可以看出，本领域的技术人员清楚，术语“烷基”意图包括含有键接于非氢基的基团的基团，比如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3等)。
与对于烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基一般被称为“芳基取代基”。这些取代基例如选自：卤素，-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-卤素，-SiR′R″R′″，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R′″，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″R′″)＝NR″″，-NR-C(NR′R″)＝NR′″，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，-CN和-NO2，-R′，-N3，-CH(Ph)2，氟(C1-C4)烷氧基，和氟(C1-C4)烷基，数目是0到在芳环体系上的开放化合价的总数；其中R′，R″，R″″和R″″优先独立地选自氢，取代或未取代烷基，取代或未取代杂烷基，取代或未取代芳基和取代或未取代杂芳基。当本发明的化合物包括一个以上的R基团时，例如，当存在一个以上的这些基团时，各R基团独立地选择，各R′，R″，R′″和R″″基团同样独立地选择。在以下的路线图中，符号X表示如上所述的“R”。
在芳基或杂芳基的相邻原子上的两个取代基可以任选被化学式-T-C(O)-(CRR′)q-U-的取代基代替，其中T和U独立地是-NR-，-O-，-CRR′-或单键，以及q是0-3的整数。或者，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选被化学式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B独立地是-CRR′-，-O-，-NR-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NR′-或单键，以及r是1-4的整数。这样形成的新环的单键之一可以任选被双键代替。或者，在芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选被化学式(CRR′)s-X-(CR″R′″)d-的取代基代替，其中s和d独立地是0-3的整数，以及X是-O-，-NR′-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-或-S(O)2NR′-。取代基R，R′，R″和R′″优选独立地选自氢或取代或未取代(C1-C6)烷基。
本文所使用的术语“杂原子”包括氧(O)，氮(N)，硫(S)，磷(P)和硅(Si)。
术语“氨基”或“胺基”是指基团-NR′R″(或-N+RR′R″)，其中R，R′和R″独立地选自氢，烷基，取代烷基，芳基，取代芳基，芳烷基，取代芳烷基，杂芳基和取代杂芳基。取代的胺是其中R′或R″不是氢的胺基。在伯氨基中，R′和R″均是氢，而在仲氨基中，R′或R″的任何一个(但不是两个)是氢。另外，术语“胺”和“氨基”可以包括氮的质子化和季化变型，包括基团-N+RR′R″和它的生物学相容性阴离子抗衡离子。
除非另有规定，本身或作为另一取代基的一部分的术语“卤代”或“卤素”是指氟，氯，溴或碘原子。另外术语比如“卤代烷基”意图包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基意图包括、但不限于三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，4-氯丁基，3-溴丙基等。
本文所使用的术语“连接基”或“L”是指包括了选自C、N、O、S和P中的1-20个非氢原子的单一共价键或系列稳定的共价键，以共价键将水溶性聚合物或支化水溶性聚合物连接于另一结构部分比如化学反应性基团或缀合物质，包括生物和非生物物质。示例性连接部分包括含有-C(O)NH-，-C(O)O-，-NH-，-S-，-O-等的结构部分。“可裂解的连接基”是具有可被反应的结果或条件所断裂的一个或多个可裂解基团的连接基。术语“可裂解的基团”是指通过裂解连接所要脱去的结构部分与缀合物的剩余部分的键而使缀合物的一部分例如水溶性聚合物从缀合物的剩余部分脱去的结构部分。这种裂解是化学性质的，或酶介导的。示例性酶促裂解基团包括天然氨基酸或用天然氨基酸终端的肽序列。
除了酶促裂解基团以外，包含一个或多个可被非酶作用剂的作用所裂解的位点。示例性非酶促裂解剂包括、但不限于酸，碱，光(例如硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基，苯偶姻酯)和热。许多可裂解基团在本领域中是已知的。例如参见Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761：152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.，265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.，261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，143：1859-1867(1989)。而且，多种可裂解的双官能(同双官能和异双官能)间隔臂(spacer arm)可以市购。
示例性可裂解基团酯是可以通过试剂例如氢氧化钠裂解的可裂解基团，获得了含羧酸酯的片段和含羟基的产物。
该连接基可以用来将该化合物连接于缀合物的另一组分，比如导向结构部分(例如抗体，配体，非共价蛋白结合基团等)，分析物，生物分子，药物等。
“非共价蛋白结合基团”是与完整或变性多肽以联合方式相互作用的结构部分。该相互作用在生物环境中可以是可逆或不可逆的。将“非共价蛋白结合基团”引入到本发明的荧光化合物中提供了具有以非共价方式与多肽相互作用的能力的化合物。示例性非共价相互作用包括疏水-疏水和静电相互作用。示例性“非共价蛋白结合基团”包括阴离子基团，例如磷酸根，硫代磷酸根，膦酸根，羧酸根，硼酸根，硫酸根，砜，硫代硫酸根，和硫代磺酸根。
本文所使用的“核酸”是指DNA，RNA，单链，双链或更高度聚集的杂交基序，以及它们的任何化学变体。变体包括、但不限于提供了将附加电荷、极化性、氢键键合、静电相互作用和立体易变性(fluxionality)引入到核酸配体主体或整个核酸配体的化学基团的那些。此类变体包括、但不限于肽核酸(PNA)，磷酸二酯变体(例如硫代磷酸酯，甲基膦酸酯)，2′-位糖变体，5-位嘧啶变体，8-位嘌呤变体，环外胺变体，4-硫尿核苷的取代，5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代；骨架修饰，甲基化，非正常的碱基配对组合比如isobase，异胞苷和异胍等。核酸还可以包括非天然碱基，例如硝基吲哚。变体还可以包括3′和5′变体比如用猝灭剂，荧光团或其它结构部分封端。
本文所使用的术语“反应性基团”是指能与其它化学基团起反应以形成共价键的基团，即，在适合的反应条件下可共价反应的基团，并且通常构成了其它物质的连接位置。该反应性基团是在本发明的化合物上的可与在不同化合物上的官能团反应以形成共价键，获得荧光或荧光标记组分的结构部分，比如羧酸或丁二酰亚胺酯。反应性基团通常包括亲核体，亲电体和光活化基团。
示例性反应性基团包括、但不限于烯烃，炔烃，醇，酚，醚，氧化物，卤化物，醛，酮，羧酸，酯，酰胺，氰酸酯，异氰酸酯，硫氰酸酯，异硫氰酸酯，胺，肼，腙，酰肼，重氮，重氮盐，硝基，腈，硫醇，硫化物，二硫化物，亚砜，砜，磺酸，亚磺酸，缩醛，酮缩醇，酸酐，硫酸酯，次磺酸，异腈，脒，酰亚胺，亚氨酸酯，硝酮，羟胺，肟，异羟肟酸，硫代异羟肟酸，丙二烯类，原酸酯，亚硫酸酯，烯胺，炔胺，脲类，假脲类，氨基脲，碳化二亚胺类，氨基甲酸酯，亚胺，叠氮化物，偶氮化合物，氧化偶氮化合物，以及亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些，例如N-羟基丁二酰亚胺酯，马来酰亚胺等。制备这些官能团的每一种的方法在本领域中是公知的。它们用于特定目的的应用或为了特定目的而做出的改变是在本领域的技术人员的能力范围内(例如参见Sandler和Karo，eds.ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS，Academic Press，SanDiego，1989)。
术语“靶向基团”是指(1)能够主动地将它所连接的实体(例如荧光结构部分)引向目标区域，例如细胞；或(2)优选被动地被目标区域吸附或在目标区域内夹带的结构部分。靶向基团可以是小分子，预期包括非肽和肽。靶向基团还可以是高分子，包括、但不限于糖类，凝集素，受体，受体的配体，蛋白比如BSA，抗体，聚(醚)，树枝状大分子，聚(氨基酸)等。
本文所使用的“载体分子”是指连接本发明的化合物的任何分子。代表性载体分子不带限制地包括蛋白(例如酶，抗体)，糖蛋白，肽，糖(例如单糖，寡糖和多糖)，激素，受体，抗原，底物，代谢物，过渡态类似物，辅助因子，抑制剂，药物，染料，营养物，生长因子等。“载体分子”还表示可能不被认为在“分子”的经典定义范围内的物质，例如固体载体(例如合成载体，色谱载体，膜)，病毒和微生物。
序言
本发明提供了支化水溶性聚合物和支化水溶性聚合物的缀合物。该缀合物在本发明的支化水溶性聚合物和包含该支化水溶性聚合物可以缀合于其上的反应性基团的物质之间形成。用于本发明的水溶性聚合物的示例性缀合物配对物包括肽，糖肽，脂类和糖脂。示例性缀合物是其中携带本发明的支化水溶性聚合物的改性糖直接或间接(例如通过介入糖基残基)连接于肽的糖基化位点上。还提供了生产本发明的缀合物的方法。
本发明的缀合物和形成缀合物的方法这里参考肽和糖肽缀合物来举例说明。论述的焦点是为了清楚说明，不应被认为将本文所公开的支化水溶性聚合物的用途限制在形成这种缀合物的用途上。本领域的技术人员会认识到，本发明的支化水溶性聚合物可用于形成各种支化水溶性聚合物缀合物。
如在前面的部分中所述，共价PEG化的本领域公认的化学方法依靠通过氨基酸或碳水化合物上的反应性基团的化学缀合。通过仔细设计缀合物和反应条件，已经使用化学介导的缀合策略制备了有效的缀合物。聚合物与蛋白或糖蛋白的化学缀合的主要缺点是活化聚合物的选择性的缺乏，这常常导致聚合物在影响蛋白或糖蛋白生物活性在位点上连接。已经开发了几种方法来解决位点选择性缀合化学，然而，仅仅开发出了适合于各种重组蛋白的一种通用的方法。
与本领域公认的方法相反，本发明提供了支化水溶性聚合物的高度选择性位点定向的糖缀合，例如糖-PEG化的新型手段。在本发明的示例性实施方案中，支化水溶性聚合物的位点定向连接通过特异性肽序列的体外酶促糖基化来完成。糖缀合可以采用能够将物质支化水溶性聚合物-糖基，例如PEG-唾液酸转移到糖基化位点的糖基转移酶，例如唾液酸基转移酶通过酶促法进行(“糖-PEG化”)。
支化水溶性聚合物
在第一个方面，本发明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物：
WSP-Y-Rx
其中WSP是水溶性聚合物。符号Y表示连接基，例如键，或含有酰胺、羧酸酯、脲烷、硫醇、取代或未取代烷基等的结构部分。示例性连接基包括：键，(CH2)n，(CH2)mC(O)O(CH2)n，(CH2)mC(O)NH(CH2)n，(CH2)mOC(O)NH(CH2)n，(CH2)mO(CH2)n，(CH2)mNH(CH2)n，和(CH2)mS(CH2)n，其中m和n是独立地选自0-6的整数。Rx是连接于水溶性聚合物的取代或未取代烷基结构部分；连接于水溶性聚合物的氨基酸或氨基酸的二聚体；或者连接于水溶性聚合物的糖或糖核苷酸。WSP和Rx的水溶性聚合物组分可以是相同的水溶性聚合物或不同的水溶性聚合物。
用于本发明的化合物的示例性水溶性聚合物包括m-PEG，PEG，m-PPG，PPG，聚唾液酸，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，聚交酯，聚甘油酯，和官能化PEG，例如末端官能化PEG。
在一个示例性实施方案中，Y是取代烷基，以及本发明提供了具有以下通式的支化水溶性聚合物：
其中X和Y是独立地选自OR1，NR2R3，SR4，COOR5，CONR6R7，OCONR6R7，取代和未取代的烷基，以及取代和未取代的芳基中的成员。Z1是选自OR1′，NR2′R3′，SR4′，COOR5′，CONR6′R7′，取代和未取代烷基，以及取代和未取代芳基中的成员。符号R1，R4和R5代表水溶性聚合物。R2，R3，R6和R7是独立地选自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代杂芳基，取代和未取代杂环烷基，反应性官能团，以及水溶性聚合物中成员，前提是选择这些基团，使得根据通式I的化合物包含至少两个水溶性聚合物结构部分。符号R1′，R2′，R3′，R4′，R5′，R6′和R7′表示独立地选自H，取代和未取代烷基，取代和未取代芳基，取代和未取代杂芳基，取代和未取代杂环烷基，反应性官能团，载体分子和水溶性聚合物中的基团。
在另一个示例性实施方案中，Z1包括糖基(saccharyl)结构部分。糖基结构部分可以是活化糖基结构部分，例如核苷酸糖。此外，Z1能够包括直接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分，或者通过其与连接于氨基酸的糖基残基的缀合而间接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分。
以下给出了根据通式I的本发明的示例性化合物：
其中R14是OH或反应性官能团。示例性反应性官能团是C(O)Q′，其中选择Q′，使得C(O)Q′是反应性官能团。Q′还可以包括载体分子(“配体”)。Q′的示例性物质包括卤素，NHS，五氟苯基，HOBT，HOAt，和对硝基苯基。下标“m”和下标“n”是独立选自1-20,000中的整数。
上述化合物以及本发明的其它化合物可容易地由诸如以下之类的起始原料来制备：
以下给出了获取本发明的化合物的示例性途径：
以下给出了获取本发明的化合物的另一示例性途径：
本发明还提供了基于氨基酸或寡聚氨基酸(例如二肽，三肽，四肽)的支化聚合物。示例性氨基酸型支化聚合物具有选自下列之中的通式：
其中R11，R11′，R12，R12′，R13和R13′独立地选自H，取代或未取代烷基和水溶性聚合物，前提是选择这些基团，使得上述化合物包括至少两个水溶性聚合物结构部分。R14是选自OH，反应性官能团，含糖结构部分的基团或连接于载体分子的基团中的一种。A是选自NH，O和S中的一种。下标“s”表示1-5的整数。A是选自NH、O和S中的一员。
在以上通式中所述的各化合物可用于其它物质(例如核酸，肽，糖等)的化学PEG化。形成PEG(和含有PEG的物质)之间的缀合物的方法通常在本领域中是已知的。例如，参见Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in ChemistrySeries，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
在另一个示例性实施方案中，R14包括糖基结构部分。该糖基结构部分可以是活化糖基结构部分，例如核苷酸糖。此外，R14能够包括直接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分，或者通过其与连接于氨基酸的糖基残基的缀合而间接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分。
本发明的示例性组合物包括：
比如：
其中“m”，“n”和“t”是独立地选自1-20,000中的整数；和R14如上所述。
其它示例性化合物包括：
比如：
在下表中给出了基于氨基酸结构的其它组合物：
在上表中给出的图中，符号a和b独立地表示1-10的数值。符号m和o独立地表示1-10,000的数值。符号X表示OH，H，Q(活化基团)以及生物结构部分，比如蛋白，糖，脂类，或核苷酸。
在另一个示例性实施方案中，R14包括糖基结构部分。该糖基结构部分可以是活化糖基结构部分，例如核苷酸糖。此外，R14可以包括直接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分，或者通过其与连接于氨基酸的糖基残基的缀合而间接连接于肽的氨基酸的糖基结构部分。
在又一个方面，本发明提供了基于糖核(“支型核”)的支化水溶性聚合物。技术人员清楚，糖核可以具有任何结构。用于本发明的这方面的示例性糖包括GlcNAc，Gal，Sia，Fuc，Glc，Gal NAc，GalNH2，GlcNH2等。
本发明的示例性化合物具有以下通式：
糖-O-(L-WSP)2
其中L是连接基和WSP是水溶性聚合物。
本发明的其它示例性化合物具有以下通式：
(C6H10O4)-(OC(O)-L-WSP)2
其中C6H10O4是糖支型芯，其中两个糖OH结构部分被转化为OC(O)-连接基-WSP。
本发明的又一示例性化合物具有以下通式：
核苷酸-糖-O-(L-WSP)2
在另一示例性实施方案中，本发明的糖基支化水溶性聚合物具有以下通式：
Nu-O-(C6H9O3)-(OC(O)-L-WSP)2
其中Nu是核苷酸。
根据本发明的该方面的另一示例性化合物(基于唾液酸核)具有以下通式：
其中R16和R16′是选自H，乙酰基和通式(I)中的成员：
以及R17，R18，R19和R19′是独立地选自H，OH，NH2，NHAc和根据通式I的结构部分中的成员。在通式I中，Z2是选自O，S，CH2和S中的一种。R11如上所述，以及下标“a”表示0-20的整数，前提是R16，R16′，R17，R18，和R19的至少两个具有根据通式I的结构。R11还可以是连接于载体分子的基团或键接于载体分子的键。R15是选自H和活化基团，例如磷酸核苷酸中的一员。
在另一个示例性实施方案中，通式I的连接基具有以下结构式：
在又一个示例性实施方案中，通式I的连接基具有以下结构式：
其中Z3是选自NH，O和S中的一员。
在一个示例性实施方案中，Z2是NH。
在再一个示例性实施方案中，本发明提供了具有以下结构的化合物：
其中L是如本文所定义的连接基。
在另一个方面，支化聚合物基于半乳糖或N-乙酰基半乳糖，其具有以下通式：
其中R15-R19如上所述，R15-R19的至少两个是根据通式I的结构部分。
此外，R15可以包括连接于肽的氨基酸的键，或连接于糖基结构部分的键，该糖基结构部分直接键合于肽的氨基酸，或通过缀合于连接氨基酸的糖基残基而间接键合于肽的氨基酸。
以下提供了制备本发明的支化糖芯水溶性聚合物的示例性方案：
以下给出了制备本发明的糖芯支化水溶性聚合物的另一示例性方案：
单分散聚(乙二醇)
本发明还提供了单分散高分子量PEG和制备聚(乙二醇)分子的基本单分散群体的方法。该方法包括让具有明确分子量的PEG分子例如PEG200与至少2当量的也具有明确分子量的双官能活化PEG，例如PEG200接触，从而产生PEG的单分散样品，例如PEG 600：
G是离去基团，比如磺酸酯或tresylate酯。PEG600的单分散样品然后可以与双官能活化PEG200接触，形成单分散PPEG100。或者，单分散PEG600可以转化为相应的双官能化衍生物，再与至少2当量的单分散二羟基-PEG600反应，产生单分散PEG1800。重复本发明的方法，直到获得所需大小的单分散PEG为止。可以设计该合成，使得在起始原料和产物之间的分子量差允许通过尺寸排阻色谱法而分离任何未反应或部分反应的材料。
而且，作为对制备改性水溶性聚合物，比如聚(乙二醇)的改进方法的需求的回应，本发明提供了化学活化和延长聚合物骨架的方法。单活化PEG分子可用于将PEG缀合于各种物质，例如靶向结构部分，治疗用结构部分，抗肿瘤药物，细胞毒素，放射剂，氨基酸类，糖等。
因此，在另一个方面，本发明提供了活化水溶性聚合物，尤其聚(乙二醇)及其结构类似物的分步组装的方法。该方法提供了获得单官能化和双官能化PEG分子的便捷途径。
在步骤a中，起始二醇与活化基团(R-Y)接触，该活化基团与二醇的羟基结构部分反应。Y通常是离去基团，使R安放在PEG分子的羟基结构部分之一上。在步骤b中，所得加合物的游离羟基通过其转化为磺酸酯类的基团来活化。活化的PEG物质与作为起始PEG(“PEGm”)的相同或不同聚合度的另一PEG结构部分接触。为了使且其连接于另一物质，RO-PEG(n+m)任选在游离羟基结构部分处活化。
本发明的单分散PEG容易通过本领域公认的方法来活化，活化的衍生物可以用来形成缀合物。或者，该单分散PEG被引入到用来形成缀合物的本发明的支化PEG中。
水溶性聚合物
选择的肽的亲水性通过与极性分子比如含胺、酯、羟基和多羟基的分子缀合来提高。代表性实例包括、但不限于聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，和聚醚，例如聚(乙二醇)，m-聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，m-聚(丙二醇)，和其它O-烷基聚(亚烷基二醇)结构部分。优选的水溶性聚合物基本上是非荧光的，或者发出最小量的荧光而不适合在分析中用在荧光标记剂。而且，通常优选使用不属于天然存在的糖的聚合物。该优选的例外情况是使用通过共价连接另一实体(例如聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，生物分子，治疗用结构部分，诊断用结构部分等)改性的天然存在的糖。在另一个示例性实施方案中，治疗用糖结构部分缀合于连接臂，以及糖-连接臂盒(cassette)随后用本发明的方法缀合于肽。
用于活化水溶性聚合物和糖的方法和化学过程以及用于将糖和聚合物缀合于各种物质的方法在文献中有述。通常使用的活化聚合物的方法包括官能团用溴化氰，高碘酸盐，戊二醛，双环氧化物，表氯醇，二乙烯基砜，碳化二亚胺，磺酰卤，三氯三嗪等的活化(参见R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTALS ANDAPPLICATIONS，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRYOF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITY LIGANDTECHNIQUES，Academic Press，N.Y.等人，Eds.POLYMERIC DRUGS ANDDRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Ser ies Vol.469，AmericanChemical Society，Washington，D.C.1991)。
许多水溶性聚合物是本领域的技术人员所已知的，并且可用于实施本发明。术语水溶性聚合物包括诸如以下之类的物质：糖(例如右旋糖苷，直链淀粉，透明质酸，聚(唾液酸)，乙酰肝素，肝素等；聚(氨基酸)；核酸；合成聚合物(例如聚(丙烯酸)，聚(醚)，例如聚(乙二醇)；肽，蛋白等。本发明可以用任何水溶性聚合物实施，唯一的限制是该聚合物必须包含可以连接缀合物的剩余部分的位点。
用于活化聚合物的方法还可以在WO 94/17039，US专利No.5,324,844，WO 94/18247，WO 94/04193，US专利No.5,219,564，US专利No.5,122,614，WO 90/13540，US专利No.5,281,698和WO93/15189中找到，以及为了缀合活化聚合物和肽，例如凝血因子VIII(WO 94/15625)，血红蛋白(WO 94/09027)，携氧分子(US专利No.4,412,989)，核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。
优选的水溶性聚合物是其中在聚合物的样品中大部分聚合物分子具有大约相同的分子量的那些；这些聚合物是“单分散”的。
本发明进一步参考聚(乙二醇)或单甲氧基-聚(乙二醇)(m-PEG)缀合物来举例说明。可以获得关于PEG的官能化和缀合的几篇评论和专论。例如，参见Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)；和Bhadra等人，Pharmazie，57：5-29(2002)。
可用于形成本发明的缀合物的聚(乙二醇)是线性或支化的。任何分子量，例如5Kd，10Kd，20Kd和30Kd的PEG结构部分可用于本发明。
反应性官能团
PEG(或其它连接基)的反应性衍生物用于将一个或多个肽结构部分连接于该连接基的用途在本发明的范围内。本发明不受反应性PEG类似物的身份来限制。聚(乙二醇)的许多活化衍生物可以市购，并且在文献中有述。选择和如果需要合成可用来制备可用于本发明的底物的适当的活化PEG衍生物完全是在本领域的技术人员的能力范围内。参见Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，252：3582-3586(1977)；Jackson等人，Anal.Biochem.，165：114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111：659-667(1983))，tresylate(Nilsson等人，Methods Enzymol.，104：56-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12：119-128(1990))；N-羟基丁二酰亚胺衍生的活性酯(Buckmann等人，Makromol.Chem.，182：1379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，180：1381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7：175-185(1984)；Katre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：1487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，51：4310-4315(1991)；Boccu等人，Z.Naturforsch.，38C：94-99(1983)，碳酸酯(Zalipsky等人，POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15：100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141-152(1985))，甲酸咪唑酯(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，131：25-33(1983))；Berger等人，Blood，71：1641-1647(1988)，4-二硫代吡啶类(Woghiren等人，Bioconjugate Chem.，4：314-318(1993))，异氰酸酯(Byun等人，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和环氧化物(US专利No.4,806,595，授权给Noishiki等人(1989)。其它连接基包括在氨基和活化PEG之间的脲烷键。参见Veronese等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11：141-152(1985)。
可用于实施本发明的反应基团和反应类型通常是生物缀合物化学领域中公知的那些。用反应性糖结构部分获得的目前有利的反应类型是在相对温和条件下进行的那些。这些包括、但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)，亲电取代(例如烯胺反应)以及在碳-碳和碳-杂原子多重键上的加成(例如，Michael反应，Diels-Alder加成)。这些和其它有用的反应例如在March，ADVANCEDORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances inChemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982中有述。
从糖核或改性基团上侧挂的有用的反应性官能团包括、但不限于：
(a)羧基及其各种衍生物，包括、但不限于N-羟基丁二酰亚胺酯，N-羟基苯并三唑酯，酰卤，酰基咪唑，硫酯，对硝基苯基酯，烷基，链烯基，炔基和芳族酯；
(b)羟基，其可以转化为例如酯，醚，醛等；
(c)卤代烷基，其中卤素可以后来被亲核基团例如胺，羧酸根阴离子，硫醇阴离子，碳阴离子，或烷氧基离子置换，从而导致新基团在卤素原子的官能团上以共价键连接；
(d)亲二烯体基团，它能够参与Diels-Alder反应，例如马来酰亚胺基团；
(e)醛或酮基团，使得后续衍生化可通过形成羰基衍生物，例如亚胺，腙，缩氨基脲或肟类，或通过诸如格利雅加成或烷基锂加成之类的机理来进行；
(f)用于随后与胺反应，例如形成磺酰胺的磺酰卤基团；
(g)硫醇基团，它例如可以转化为二硫化物或与酰基卤反应；
(h)胺或巯基，它例如可以进行酰化，烷基化或氧化；
(i)链烯烃，它们例如可以进行环加成，酰化，迈克尔加成等；和
(j)环氧化物，它们例如可以与胺和羟基化合物反应。
可以选择反应性官能团，使得它们不参与，或者干扰组装反应性糖核或改性基团所必需的反应。或者，反应性官能团可以通过提供保护基而被保护，以免参与反应。本领域的技术人员知道如何保护特定官能团，使得它不干涉选择的一组反应条件。关于有效的保护基的实例，例如参看Greene等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。
肽缀合物
本发明的化合物的应用通过它们在形成支化水溶性聚合物的肽缀合物中的用途来举例说明。论述的焦点是为了清楚说明。技术人员明白，该论述与使用本发明的支化水溶性聚合物形成各种缀合物的方法相关。在示例性实施方案中，化学反应性支化水溶性聚合物通过本领域已知的方法或其变型而缀合于肽上的互补反应性基团。
在另一示例性实施方案中，支化水溶性聚合物包括作为支型核的糖结构部分，或者，该支化水溶性聚合物连接于糖。糖是将糖基支化水溶性聚合物(或糖-支化水溶性聚合物缀合物)转移到肽的氨基酸或糖基残基的酶的底物。本领域的技术人员清楚，上述方法不限于用肽实施，而是广泛适用于其它物质，例如脂类，糖脂，糖核其它治疗用结构部分。
本发明的缀合物通过支化水溶性聚合物改性的糖与糖基化或非糖基化肽的酶促连接来形成。改性糖直接加入到糖基化位置，或直接或间接(例如通过一个或多个糖基残基)连接于糖基化位置的糖基残基。
当在肽(或糖基残基)和糖的改性基团之间插入时，支化水溶性聚合物-改性糖成为本文所谓的“糖基连接基”。糖基连接基可以是“完整的”，或者它可以在支化水溶性聚合物与糖的连接过程中改变，例如氧化和还原胺化。使用酶比如糖基转移酶的高选择性，本发明方法提供了在一个或多个特定位置携带支化水溶性聚合物的肽。因此，根据本发明，改性糖直接连接于肽链上的选择位置，或者，改性糖连接于糖肽的碳水化合物结构部分。其中改性糖键接于糖肽碳水化合物并且直接键接于肽骨架的氨基酸残基的肽也是在本发明的范围内。
与已知的化学和酶促肽加工策略不同，本发明提供了具有基本上均匀的衍生方式的肽-和糖肽-缀合物；在本发明中采用的酶一般对肽的特定氨基酸残基或氨基酸残基的组合有选择性。本发明的缀合物也能够以大规模制备。因此，本发明提供了大规模制备具有预选择均匀衍生化方式的糖肽的实用方法。这些方法特别适合于治疗用肽的改性，包括、但不限于在细胞培养细胞(例如哺乳动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，真菌细胞，酵母细胞或原核细胞)或转基因植物或动物中在生产过程中不完全糖基化的糖肽。
肽的支化水溶性聚合物缀合物一般被表征为具有增高的治疗半衰期，例如，由于减低的清除率，或减低的被免疫或网状内皮系统(RES)摄取的速率。而且，在本发明的缀合物的肽组分上的抗原决定簇用支化水溶性聚合物来屏蔽，减少或消除了宿主对该肽的免疫反应。使用适当的改性糖的导向剂与肽的选择性连接还可以用来将肽导向对特定导向剂特异的特定组织或细胞表面受体。
治疗用糖肽的体内半衰期还可以用包括聚乙二醇(PEG，m-PEG)和聚丙二醇(PPG)的支化水溶性聚合物增强。例如，蛋白用支化PEG的化学改性(PEG化，m-PEG化)增加了它们的分子尺寸和降低了它们的表面-和官能团-易接近性，后者各自取决于连接于蛋白的PEG的大小。肽用水溶性聚合物的改性一般被公认为改进血浆半衰期和蛋白水解稳定性，以及降低免疫原性和肝摄取的有前景的策略(Chaffee等人，J.Clin.Invest.89：1643-1651(1992)；Pyatak等人，Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29：113-127(1980))。已经报道了白介素-2的PEG化提高了其体内的抗肿瘤潜能(Katre等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84：1487-1491(1987))以及由单克隆抗体A7得到的F(ab′)2的PEG化改进了其肿瘤定位(Kitamura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.28：1387-1394(1990))。因此，在另一个优选实施方案中，通过本发明的方法用水溶性聚合物衍生化的肽的体内半衰期相对于非衍生化肽的体内半衰期提高。
本发明的缀合物的肽体内半衰期的增加最佳地作为该量增加的百分率范围来表示。百分率增加的范围的下限是大约40％，大约60％，大约80％，大约100％，大约150％或大约200％。该范围的上限是大约60％，大约80％，大约100％，大约150％或超过大约250％。
在示例性实施方案中，在肽和选择结构部分之间的连接包括位于肽和水溶性聚合物之间的完整糖基连接基。如本文所述，水溶性聚合物与糖结构部分的连接(或糖支型核的使用)提供了被适当的转移酶识别的“改性糖”，它将改性糖连接于肽。当在肽和选择结构部分之间插入时，改性糖的糖组分成为“糖基连接基”，例如“完整糖基连接基”。该糖基连接基由任何单糖或寡糖形成，在用水溶性聚合物改性之后，它是适当的转移酶的底物。
本发明的缀合物通常对应于以下通式：
其中符号a、b、c、d和s表示正的非零整数；以及t是0或正整数。“试剂”是本发明的支化水溶性聚合物。或者，糖-试剂通过基于糖支型核的支化水溶性聚合物来提供。该连接基可以是下文各种连接基的任何一种。或者，该连接基可以是单键或“零级连接基”。肽的身份不是限制的。
在示例性实施方案中，该水溶性聚合物是PEG，m-PEG，PPG或m-PPG，以及该支化水溶性聚合物经由完整的糖基连接基以共价键连接于肽。糖基连接基以共价键连接于肽的氨基酸残基或糖基残基。或者，该糖基连接基连接于糖肽的一个或多个糖基单元。本发明还提供了其中糖基连接基(例如GalNAc)连接于氨基酸残基(例如Thr或Ser)的缀合物。
除了提供通过酶促加成的完整糖基连接基形成的缀合物以外，本发明提供了其取代方式高度均匀的缀合物。使用本发明的方法，可以形成肽缀合物，其中在本发明的缀合物的群体中基本上所有的改性糖结构部分连接于结构相同的氨基酸或糖基残基。因此，在第二个方面，本发明提供了具有支化水溶性聚合物结构部分群体的肽缀合物，这些结构部分通过糖基连接基，例如完整糖基连接基以共价键连接于肽。在本发明的优选缀合物中，该群体的基本上各成员经由糖基连接基键接于肽的糖基残基，以及糖基连接基所连接的肽的各糖基残基具有相同的结构。
本发明还提供了具有通过完整糖基连接基以共价键连接的支化水溶性聚合物结构部分的群体的肽缀合物。在优选的实施方案中，支化水溶性聚合物结构部分的群体的基本上各成员经由完整的糖基连接基键接于肽的氨基酸残基，以及具有连接于其上的完整糖基连接基的各氨基酸残基具有相同结构。
本发明还提供了与上述那些类似的缀合物，其中该肽经由完整糖基连接基进一步缀合于治疗用结构部分，诊断用结构部分，靶向结构部分，毒素结构部分等。上述结构部分各自可以是小分子，天然聚合物(例如，多肽)或合成聚合物。
在又一个实施方案中，本发明提供了由于存在作为缀合物的组分的导向剂，选择性定位于特定组织中的缀合物。在一个示例性实施方案中，该导向剂是蛋白。示例性蛋白包括铁传递蛋白(脑，血池)，HS-糖蛋白(骨，脑，血池)，抗体(脑，具有抗体-特异性抗原的组织，血池)，凝血因子V-XII(损伤组织，凝块，癌，血池)，血清蛋白，例如α-酸糖蛋白，胎球蛋白，α-胎儿蛋白(脑，血池)，β2-糖蛋白(肝，动脉粥样硬化斑，脑，血池)，G-CSF，GM-CSF，M-CSF，和EPO(免疫刺激，癌，血池，红血球过度产生，神经保护)，白蛋白(半衰期增加)，IL-2和IFN-α。
在示例性实施方案中，该缀合物在支化水溶性聚合物和糖基化或非糖基化肽之间形成。该聚合物、治疗用结构部分或生物分子经由完整糖基连接基缀合于肽，该连接基插入肽和改性基团(例如水溶性聚合物)之间，并且以共价键连接于二者。该方法包括让肽与含有改性糖和改性糖是其底物的糖基转移酶的混合物接触。该反应在足以在改性糖和肽之间形成共价键的条件下进行。改性糖的糖结构部分优选从核苷酸糖、活化糖和既非核苷酸又未活化的糖中选择。
受体肽(糖基化或非糖基化)通常从头合成，或者在原核细胞(例如细菌细胞，比如E.coli)或真核细胞比如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中重组表达。该肽可以是全长蛋白或片段。而且，该肽可以是野生型或突变的肽。在示例性实施方案中，肽包括将一个或多个共有糖基化位点加入到肽序列的突变。
本发明的方法还提供用于重组生产的不完全糖基化肽的改性。许多重组生产的糖肽被不完全地糖基化，暴露了可能具有不希望有的性能，例如免疫原性、被RES识别的碳水化合物残基。在本发明的方法中使用改性糖，肽可以同时进一步糖基化和例如用水溶性聚合物，治疗剂等衍生化。改性糖的糖结构部分可以是适当缀合于完全糖基化肽中的受体的残基，或者具有所需性能的另一糖基结构部分。
在表1中给出了本发明的缀合物的示例性肽组分。
表1
本发明的缀合物的其它示例性肽组分包括免疫球蛋白家族的成员(例如抗体，MHC分子，T细胞受体等)，细胞间受体(例如整联蛋白，激素或生长因子的受体等)凝集素，和细胞因子(例如白介素)。其它实例尤其包括组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，肾素，凝血因子比如因子V-XII，铃蟾肽，凝血酶，造血生长因子，集落刺激因子，病毒抗原，补体蛋白，α1-抗胰蛋白酶，红细胞生成素，P-选择蛋白糖肽配体-1(PSGL-1)，粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子，抗凝血酶III，白介素，干扰素，蛋白质A和C，纤维蛋白原，赫赛汀(herceptin)，来普汀(leptin)，糖苷酶，HS-糖蛋白，血清蛋白(例如，α-酸糖蛋白，胎球蛋白，α-胎儿蛋白质)，β2-糖蛋白。这多肽名单是示例性的，不是排他性的。缀合物的肽组分还可以包括融合蛋白和嵌合蛋白，包括、但不限于含有由免疫球蛋白比如IgG或免疫球蛋白的片段例如FAb(Fc区)衍生的结构部分的嵌合蛋白。此外，在附录1中给出了可以用本发明的方法改性的示例性肽。本文提供的示例性肽用来提供可以用来实施本发明的肽的选择；因此，它们不是限制性的。技术人员清楚，本发明可以使用可以使用来自任何来源的基本上所有的肽来实施。
本发明的缀合物的肽组分可以是合成或野生型肽，或者它们可以是突变的肽，后者用本领域已知的方法，比如定向诱变来生产。肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。示例性N-连接是改性糖与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物结构部分与天冬酰胺侧链的酶法连接的识别序列。因此，这些三肽序列的任何一种在多肽中的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指一个糖(例如N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖，甘露糖，GlcNAc，葡萄糖，岩藻糖，木糖)与羟基氨基酸，优选丝氨酸或苏氨酸的羟基侧链的连接，虽然还可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
而且，除了肽以外，与本发明的支化水溶性聚合物缀合的缀合物的组分可以是除了肽以外的生物结构(例如糖脂，脂类，鞘氨基醇，神经酰胺，整个细胞等)。
将糖基化位点加入到肽或其它结构可方便地通过改变氨基酸序列，使得它含有一个或多个糖基化位点来完成。该添加可以通过突变或肽的全化学合成来进行。肽氨基酸序列优选通过在DNA水平下的改变，尤其通过以预选择碱基使编码该肽的DNA突变，使得产生翻译为所需氨基酸的密码子来改变。DNA突变优选使用本领域已知的方法来进行。
在示例性实施方案中，糖基化位点通过改组(shuffling)多核苷酸来添加。编码候选的肽的多核苷酸可以用DNA改组工序来调节。DNA改组是递归重组和突变的方法，通过无规分裂相关基因库，随后通过聚合酶链反应类方法重新组装片段来进行。例如，参见Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature370：389-391(1994)；和U.S.专利Nos.5,605,793，5,837,458，5,830,721和5,811,238。
本发明的缀合物还可以包括已经添加或已经除去一个或多个选择糖基残基，此后将改性糖缀合于肽的选择糖基残基的至少一个的肽。例如，当希望将改性糖缀合于不存在于肽上或不以所需量存在的选择糖基残基时，该实施方案是有用的。因此，在将改性糖偶联于肽之前，通过酶促偶联或化学偶联，将选择糖基残基缀合于肽。在另一个实施方案中，糖肽的糖基化方式在缀合改性糖之前在通过从糖肽上除去碳水化合物残基来改变。例如，参见WO 98/31826。
增加或除去存在于糖肽上的任何碳水化合物结构部分用化学法或酶法来完成。化学去糖基化优选通过多肽变体接触化合物三氟甲磺酸或等效化合物来完成。该处理导致了除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)以外的大多数或所有糖的裂解，但保持肽完整。Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118：131(1981)描述了化学去糖基化。在多肽变体上的碳水化合物结构部分的酶促裂解可以通过使用如由Thotakura等人，Meth.Enzymol.138：350(1987)所述的各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来完成。
糖基结构部分的化学加成通过任何技术上公认的方法来进行。糖基结构部分的酶促加成优选使用本文所述的方法的变型，用天然糖基单元代替在本发明中使用的改性糖来进行。加成糖结构部分的其它方法公开在US专利No.5,876,980，6,030,815，5,728,554和5,922,577中。
用于选择糖基残基的示例性连接位置包括、但不限于：(a)N-和O-糖基化的共有位点；(b)属于糖基转移酶的受体的末端糖基结构部分；(c)精氨酸，天冬酰胺和组氨酸；(d)游离羧基；(e)游离巯基比如半胱氨酸的那些；(f)游离羟基，比如丝氨酸，苏氨酸，或羟基脯氨酸的那些；(g)芳族残基，比如苯基丙氨酸，酪氨酸，色氨酸的那些；或(h)谷氨酰胺的胺基。用于本发明的示例性方法描述在1987年9月11日公开的WO 87/05330以及Aplin和Wriston，CRC，CRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)中。
在一个实施方案中，本发明提供了通过连接基连接两个或多个肽的方法。该连接基具有任何有效的结构，可以选自直链和支链结构。优选地，连接于肽的连接基的各末端包括改性糖(即，初生完整的糖基连接基)。
在本发明的示例性方法中，经由包括支化水溶性聚合物连接基的连接结构部分将两个肽连在一起。该结构符合在以上图中所示的通式。如本文所述，本发明的结构包括两个完整的糖基连接基(即s+t＝1)。集中描述包含两个糖基的PEG连接基是为了清楚的目的，不应被认为限制用于本发明的该实施方案的连接臂的身份。
改性糖
改性糖基给体物质(“改性糖”)优先从改性糖核苷酸，活化改性糖和属于既非核苷酸又未活化的简单糖的改性糖中选择。任何合乎需要的碳水化合物结构可以引入到本发明的缀合物中。通常，该结构是单糖，但本发明不限于使用改性单糖；寡糖和多肽也是有用的。
改性基团通过酶方式，化学方式或它们的组合而连接于糖结构部分，从而产生改性糖。糖在允许连接改性结构部分，但仍然可使糖起用于将改性糖结合于肽的酶的底物的作用的任何位置上取代。在一个优选的实施方案中，当唾液酸是糖时，唾液酸被在丙酮酰(pyruvyl)侧链的9位上或正常在唾液酸中乙酰化的胺结构部分的5位上用改性基团取代。
在本发明的某些实施方案中，利用改性糖核苷酸来将改性糖加到肽上。以其改性形式在本发明中采用的示例性糖核苷酸包括一、二或三磷酸核苷酸或它们的类似物。在优选的实施方案中，改性糖核苷酸选自UDP-糖苷，CMP-糖苷，或GDP-糖苷。还更优选，改性糖核苷酸选自UDP-半乳糖，UDP-半乳糖胺，UDP-葡萄糖，UDP-葡糖胺，GDP-甘露糖，GDP-岩藻糖，CMP-唾液酸，或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰基胺衍生物也可用于本发明的方法。
本发明还提供了使用改性糖，例如改性半乳糖，改性岩藻糖，改性GalNAc和改性唾液酸合成改性肽的方法。当采用改性唾液酸时，唾液酸基转移酶或反式唾液酸酶(仅对于α2，3-连接的唾液酸)可以在这些方法中使用。
在其它实施方案中，改性糖是活化糖。可用于本发明的活化改性糖通常是通过合成改变为包含活化离去基团的糖苷。本文所使用的术语“活化离去基团”是指容易在酶调节的亲核取代反应中被置换的那些结构部分。在本领域中已知有许多活化糖。例如，参见Vocadlo等人，In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY，Vol.2，Ernst等人，Ed.，Wiley-VCH Verlag：Weinheim，Germany，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.34：6419(1993)；Lougheed等人，J.Biol.Chem.274：37717(1999)。
活化基团(离去基团)的实例包括氟，氯，溴，甲苯磺酸酯，甲磺酸酯，三氟甲磺酸酯等。用于本发明的优选的活化离去基团是不显著位阻糖苷酶法转移到受体上的那些。因此，活化糖苷衍生物的优选实施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，其中糖基氟化物是特别优选的。在糖基氟化物中，氟化α-半乳糖，氟化α-甘露糖，氟化α-葡萄糖，氟化α-岩藻糖，氟化α-木糖，氟化α-唾液酸，氟化α-N-乙酰基葡糖胺，氟化α-N-乙酰基半乳糖胺，氟化β-半乳糖，氟化β-甘露糖，氟化β-葡萄糖，氟化β-岩藻糖，氟化β-木糖，氟化β-唾液酸，氟化β-N-乙酰基葡糖胺和氟化β-N-乙酰基半乳糖胺是最优选的。
举例来说，可以通过首先将糖乙酰化和然后用HF/吡啶处理来由游离糖制备糖基氟化物。这产生了热力学最稳定的保护(乙酰化)糖基氟化物(即，α-糖基氟化物)的异头物。如果需要不稳定的异头物(即，β-糖基氟化物)，它可以通过用HBr/HOAc或HCl将全乙酰化糖转化为异头溴化物或氯化物来制备。乙酰化糖基氟化物可以通过与温和(催化)碱在甲醇(例如NaOMe/MeOH)中反应来去保护。另外，许多糖基氟化物可以市购。
其它活化糖基衍生物可以使用本领域技术人员已知的普通方法来制备。例如，甲磺酸糖基酯可以通过用甲磺酰氯处理完全苄基化半缩醛形式的糖，随后催化氢化以除去苄基来制备。
在另一个示例性实施方案中，改性糖是具有触角结构的寡糖。在一个优选的实施方案中，触角的一个或多个末端携带改性结构部分。当一个以上的改性结构部分连接于具有触角结构的寡糖时，该寡糖可用于“放大”改性结构部分；缀合于肽的各寡糖单元将多个拷贝的改性基团连接于该肽。如在上图中所示的本发明的典型缀合物的一般结构包括了由采用触角结构制备本发明的缀合物获得的多价物质。许多触角的糖结构在本领域中是已知的，以及本发明方法可以不带限制地用它们来实施。
一般，糖结构部分和改性基团通过使用反应性基团连在一起，该反应性基团通常通过连接方法转化为新的有机官能团或未反应的物质。糖反应性官能团位于糖结构部分的任何位置上。
在以下论述中，阐明了可用于实施本发明的改性糖的许多具体例子。在示例性实施方案中，唾液酸用作连接改性基团的糖核。论述集中在唾液酸衍生物是为了清楚说明，不应被认为是本发明的范围的限制。本领域的技术人员明白，多种其它糖结构部分可以按照与使用唾液酸作为例子所述类似的方式进行活化和衍生化。例如，许多方法可用于改性半乳糖，葡萄糖，N-乙酰基半乳糖胺和岩藻糖来提供几种糖底物，它们容易通过本领域公认的方法来改性。例如，参见Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.6：93(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.65：24(2000)。
在示例性实施方案中，通过本发明的方法改性的肽是在原核细胞(例如E.coli.)，包括酵母和哺乳动物细胞在内的真核细胞(例如，CHO细胞)，或转基因动物中产生并因此含有N-和/或O-连接的寡糖链的糖肽，它们被不完全唾液酸化。缺乏唾液酸但含有末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可以进行糖PEG化，糖PPG化或者用改性唾液酸改性。
在方案2中，氨基糖苷1用保护氨基酸(例如甘氨酸)衍生物的活性酯处理，将糖胺残基转化为相应的保护氨基酸酰胺加合物。该加合物用醛缩酶处理，形成α-羟基羧酸盐2。通过CMP-SA合成酶的作用，化合物2转化为相应的CMP衍生物，随后催化氢化该CMP衍生物，形成化合物3。通过让化合物3与活化(m-)PEG或(m-)PPG衍生物(例如PEG-C(O)NHS，PPG-C(O)NHS)反应，分别形成4或5，经由形成甘氨酸加合物所引入的胺用作PEG或PPG连接的位点。
方案2
其中X-BWSP是本发明的活化支化水溶性聚合物，以及BWSP是支化水溶性聚合物。
表2给出了用PEG或PPG结构部分衍生化的糖单磷酸酯的代表性实例。表2的某些化合物通过方案4的方法来制备。其它衍生物通过本领域公认的方法来制备。例如，参见Keppler等人，Glycobiology 11：11R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 10：1049(2000)。其它胺反应性PEG和PPG类似物可以市购，或者它们可以通过本领域的技术人员便于获得的方法来制备。
表2
其中R是本发明的支化水溶性聚合物。
可用于实施本发明的改性糖磷酸酯可以在其它位置以及上述那些上被取代。以下给出了唾液酸的目前优选的取代：
其中X是连接基，优先选自-O-，-N(H)-，-S，CH2-和-N(R)2，其中各R是独立地选自R1-R5中的一员。符号Y、Z、A和B各自表示选自以上对于X的身份所述的基团中的基团。X、Y、Z、A和B可以各自独立地选择，因此，它们可以是相同或不同的。符号R1、R2、R3，R4和R5表示H，或者支化水溶性聚合物。另外，这些符号表示键接于支化水溶性聚合物的连接基。
交联基团
用于本发明的方法的改性糖的制备包括将改性基团连接于糖残基和形成稳定的加合物，后者是糖基转移酶的底物。糖和改性基团可以通过零级或高级交联剂来偶联。可用于将改性基团连接于碳水化合物结构部分的示例性双官能化合物包括、但不限于双官能化聚(乙二醇)，聚酰胺，聚醚，聚酯等。用于将碳水化合物连接于其它分子的一般方法在文献中是已知的。例如，参见Lee等人，Biochemistry 28：1856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178：408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.112：8886(1990)和Bednarski等人，WO92/18135。在以下的论述中，在新生改性糖的糖结构部分上的反应性基团进行有利处理。集中论述是为了清楚说明。本领域的技术人员清楚，该论述与在改性基团上的反应性基团相关。
示例性策略包括使用异双官能交联剂SPDP(n-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯将保护巯基引入到糖上和然后将巯基去保护，与在改性基团上的另一巯基形成二硫键。
如果SPDP有害地影响了改性糖用作糖基转移酶底物的能力，一系列其它交联剂之一比如2-亚氨基硫环(2-iminothiolane)或N-丁二酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)用来形成二硫键。2-亚氨基硫环与伯胺反应，立即将未保护的巯基引入到含胺的分子中。SATA还与伯胺反应，但引入了保护的巯基，其后来使用羟胺来去乙酰化，形成游离巯基。在各种情况下，所引入的巯基自由地与其它巯基或保护巯基比如SPDP反应，形成所需的二硫键。
上述策略是用于本发明的连接基的示例，不是限制性的。可以获得其它交联剂，它们可用于将改性基团与肽交联的不同策略。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼和TPMPH((S-(2-硫代吡啶基)巯基-丙酰肼)与预先通过温和的高碘酸盐处理来氧化的碳水化合物结构部分反应，因此在交联剂的酰肼部分和高碘酸盐产生的醛之间形成了腙键。TPCH和TPMPH将2-吡啶基硫酮保护的巯基引入到糖上，它能够用DTT去保护，然后用于缀合，比如形成在组分之间的二硫键。
如果发现二硫键不适于产生稳定的改性糖，可以使用引入了组分之间的更稳定的键的其它交联剂。异双官能交联剂GMBS(N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)丁二酰亚胺)和SMCC(丁二酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷)与伯胺反应，因此将马来酰亚胺基团引入到该组分上。马来酰亚胺基随后可以与在另一组分上的巯基反应，后者可以通过前述交联剂引入，因此形成了在组分之间的稳定硫醚键。如果在组分之间的位阻干扰了任何一种组分的活性或改性糖用作糖基转移酶底物的能力，可以使用交联剂，它在组分之间引入了长间隔臂并包括了前述交联剂的一些的衍生物(即，SPDP)。因此，具有可使用的大量适合的交联剂；它们各自根据其对最佳肽缀合物和改性糖生产所具有的效果来选择。
多种试剂可用来用分子内化学交联剂改性改性糖的组分(关于交联剂和交联工序的评述，参见：Wold，F.，Meth.Enzymol.25：623-651，1972；Weetall，H.H.，和Cooney，D.A.，In：ENZYMES ASDRUGS.(Holcenberg，和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，NewYork，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91：580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17：167-183，1993，它们全部引入本文供参考)。优选的交联剂由各种零长、同双官能和异双官能交联剂获得。零长交联剂包括两个内在化学基团的直接缀合，不引入外来材料。催化二硫键形成的试剂属于这类。另一个例子是诱发羧基和伯氨基缩合，以形成酰胺键的试剂，比如碳化二亚胺，氯甲酸乙酯，Woodward试剂K(2-乙基-5-苯基异唑翁-3′-磺酸盐)，和羰基二咪唑。除了这些化学试剂以外，酶-谷氨酰胺转移酶(谷氨酰基-肽γ-谷氨酰基转移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零长交联剂。该酶催化在蛋白结合的谷氨酰胺酰基残基的羧酰胺基处通常与作为底物的伯氨基的酰基转移反应。优选的同和异双官能试剂分别含有两个相同或两个不同位点，它们可以对氨基、巯基、胍基、吲哚或非特定基团具有反应性。
i.交联剂中的优选特异位点
1、氨基反应性基团
在一个优选实施方案中，在交联剂上的位点是氨基反应性基团。氨基反应性基团的有用的非限制性实例包括N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯，亚氨基酯，异氰酸酯，酰基卤化物，芳基叠氮化物，对硝基苯基酯，醛，和磺酰氯。
NHS酯优先与改性糖组分的伯(包括芳族)氨基反应。组氨酸的咪唑基团已知与伯胺竞争反应，但反应产物是不稳定的和容易水解。该反应涉及胺在NHS的酸性羧基上的亲核攻击，形成酰胺，释放N-羟基丁二酰亚胺。因此，初始氨基的正电荷失去。
亚氨基酯是用于与改性糖组分的胺基反应的最特异的酰化剂。在7-10的pH下，亚氨基酯仅仅与伯胺反应。伯胺亲核攻击亚氨酸酯，形成在高pH下分解成脒或者在低pH下分解为新的亚氨酸酯的中间体。该新亚氨酸酯可以与另一伯胺反应，因此使两个氨基交联，即，推定的双官能反应的单官能化亚氨酸酯的情况。与伯胺反应的主要产物是碱性强于初始胺的脒。初始氨基的正电荷因此被保留。
异氰酸酯(和异硫氰酸酯)与改性糖组分的伯胺反应，形成稳定的键。它们与巯基、咪唑和酪氨酰基的反应获得了相对不稳定的产品。
还可以使用酰基叠氮化物作为氨基特异性试剂，其中亲合组分的亲核胺在弱碱性条件下，例如pH8.5下攻击酸性羧基。
芳基卤化物比如1，5-二氟-2，4-二硝基苯优先与改性糖组分的氨基和酪氨酸苯酚基团反应，而且与巯基和咪唑基团反应。
单羧酸和二羧酸的对硝基苯基酯也是有用的氨基反应性基团。虽然该试剂特异性不是很高，但α-和ω-氨基似乎最快速地反应。
醛比如戊二醛与改性糖的伯胺反应。虽然在氨基与醛的反应时形成了不稳定的Schiff碱，但戊二醛能够用稳定的交联改性该改性糖。在pH6-8，典型的交联条件的pH下环状聚合物经历了脱水，形成α，β-不饱和醛聚合物。然而，Schiff碱是稳定的，当缀合于另一双键时。两个双键的共振相互作用防止了Schiff键的水解。此外，在高局部浓度下的胺能够攻击烯属双键，从而形成稳定的Michael加成产物。
芳族磺酰氯与改性糖组分的各个位点反应，但与氨基的反应是最重要的，形成了稳定的磺酰胺键。
2、巯基反应性基团
在另一个优选的实施方案中，该位点是巯基反应性基团。巯基反应性基团的有用的、非限制性实例包括马来酰亚胺，烷基卤，二硫化吡啶，和硫代邻苯二甲酰亚胺。
马来酰亚胺优先与改性糖组分的巯基反应，从而形成稳定的硫醚键。它们还以慢得多的速率与组氨酸的伯氨基和咪唑基团反应。然而，在pH 7下，马来酰亚胺基团可以被认为是巯基特异性基团，因为在该pH下，简单硫醇的反应速率比相应胺的速率高1000倍。
烷基卤与巯基、硫化物、咪唑和氨基反应。然而，在中性到弱碱性pH下，烷基卤主要与巯基反应，形成稳定的硫醚键。在较高的pH下，与氨基的反应是优先的。
二硫化吡啶经由二硫化物交换而与游离巯基反应，获得混和二硫化物。结果，二硫化吡啶是特异性最高的巯基反应性基团。
硫代邻苯二甲酰亚胺与游离巯基反应，形成二硫化物。
3、羧基反应性残基
在另一个实施方案中，可溶于水和有机溶剂两者的碳化二亚胺用作羧基反应性试剂。这些化合物与游离羧基反应，形成假脲，它然后可以偶联于可获得的胺，形成了酰胺键，这教导了怎样用碳化二亚胺改性羧基(Yamada等人，Biochemistry 20：4836-4842，1981)。
ii.在交联试剂中的优选的非特异性位点
除了位点特异性反应性结构部分以外，本发明打算使用非特异性反应性基团来将糖连接于改性基团。
示例的非特异性交联剂包括可光活化的基团，在黑暗中是完全惰性的，在吸收适当能量的光子时转化为反应性物质。在一个优选的实施方案中，可光活化的基团选自在加热或光解叠氮化物时产生的氮宾类的前体。缺电子氮宾类的反应性极高，能够与包括N-H、O-H、C-H和C＝C在内的各种化学键反应。虽然可以使用三类叠氮化物(芳基、烷基和酰基衍生物)，但芳基叠氮化物目前是优选的。芳基叠氮化物在光解时的与N-H和O-H的反应性要比与C-H的反应性好。缺电子芳基氮宾类快速地环扩大，形成脱氢氮杂其倾向于与亲核体反应，而非形成C-H插入产物。芳基叠氮化物的反应性可以通过在环中提供吸电子取代基比如硝基或羟基来提高。此类取代基将芳基叠氮化物的最大吸收推动到较长的波长。未取代的芳基叠氮化物具有260-280nm范围内的最大吸收，而羟基和硝基芳基叠氮化物吸收超过305nm的大量光线。因此，羟基和硝基芳基叠氮化物是最优选的，因为与未取代的芳基叠氮化物相比，它们允许使用不太有害的光解条件来用于亲和组分。
在另一个优选实施方案中，可光活化基团选自氟化芳基叠氮化物。氟化芳基叠氮化物的光解产物是芳基氮宾类，它们全部进行该基团的特性反应，包括C-H键插入，具有高的效率(Keana等人，J.Org.Chem.55：3640-3647，1990)。
在另一个实施方案中，可光活化的基团选自二苯甲酮残基。二苯甲酮试剂一般比芳基叠氮化物试剂获得了更高交联收率。
在另一个实施方案中，可光活化的基团选自重氮化合物，其在光解时形成缺电子碳烯。这些碳烯类经历各种反应，包括插入到C-H键中，加成到双键(包括芳族体系)中，氢吸引和配位于亲核中心，获得碳离子。
在又一个实施方案中，可光活化基团选自重氮丙酮酸酯。例如，重氮丙酮酸对硝基苯基酯的对硝基苯基酯于脂族胺反应，获得重氮丙酮酸酰胺，后者经历紫外线光解，形成醛。光解的重氮丙酮酸酯改性的亲和组分将如同甲醛或戊二醛一样反应，形成交联。
iii.同双官能试剂
1、与伯胺反应的同双官能交联剂
胺反应性交联剂的合成、性能和应用大量描述在文献中(对于交联工序和试剂的评述，参见上文)。许多试剂可以获得(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular  Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同双官能NHS酯的优选的非限制性实例包括戊二酸二丁二酰亚胺酯(DSG)，辛二酸二丁二酰亚胺酯(DSS)，辛二酸双(磺基丁二酰亚胺酯)(BS)，酒石酸二丁二酰亚胺酯(DST)，酒石酸二(磺基丁二酰亚胺)酯(磺基-DST)，双-2-(丁二酰亚胺氧基羰氧基)乙基砜(BSOCOES)，双-2-(磺基丁二酰亚胺氧基羰氧基)乙基砜(磺基-BSOCOES)，乙二醇双(丁二酰亚胺基丁二酸酯)(EGS)，乙二醇双(磺基丁二酰亚胺基丁二酸酯)(磺基-EGS)，二硫代双(丙酸丁二酰亚胺酯)(DSP)，以及二硫代双(丙酸磺基丁二酰亚胺基酯)(磺基-DSP)。同双官能亚氨基酯的优选、非限制性实例包括丙二酰亚氨酸二甲酯(DMM)，丁二酰亚氨酸二甲酯(DMSC)，己二酰亚氨酸二甲酯(DMA)，庚二酰亚氨酸二甲酯(DMP)，辛二酰亚氨酸二甲酯(DMS)，3，3′-氧二丙酰亚氨酸二甲酯(DODP)，3，3′-(亚甲基二氧基)二丙酰亚氨酸二甲酯(DMDP)，3，3′-(二亚甲基二氧基)二丙酰亚氨酸二甲酯(DDDP)，3，3′-(四亚甲基二氧基)-二丙酰亚氨酸二甲酯(DTDP)，以及3，3′-二硫代双丙酰亚氨酸二甲酯(DTBP)。
同双官能异硫氰酸酯的优选的、非限制性实例包括：对亚苯基二异硫氰酸酯(DITC)，和4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺酸均二苯乙烯(DIDS)。
同双官能异氰酸酯的优选的非限制性实例包括二甲苯二异氰酸酯，甲苯-2，4-二异氰酸酯，甲苯-2-异氰酸酯-4-异硫氰酸酯，3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二异氰酸酯，2，2′-二羧基-4，4′-偶氮苯基二异氰酸酯，和六亚甲基二异氰酸酯。
同双官能芳基卤化物的优选的、非限制性实例包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)，和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基砜。
同双官能脂族醛试剂的优选的、非限制性实例包括乙二醛，丙二醛和戊二醛。
同双官能酰化剂的优选的、非限制性实例包括二羧酸的硝基苯基酯。
同双官能芳族磺酰氯的优选的、非限制性实例包括苯酚-2，4-二磺酰氯，和α-萘酚-2，4-二磺酰氯。
另外的氨基反应性同双官能试剂的优选的、非限制性实例包括赤藓醇双碳酸酯，其可与胺反应，获得双氨基甲酸酯。
2.与游离巯基反应的同双官能交联剂
此类试剂的合成、性能和应用描述在文献中(关于交联工序和试剂的评述，参见上文)。许多试剂可以市购(例如，Pierce ChemicalCompany，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同双官能马来酰亚胺的优选的、非限制性实例包括双马来酰亚胺基己烷(BMH)，N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺，N，N′-(1，2-亚苯基)双马来酰亚胺，偶氮苯基二马来酰亚胺，和双(N-马来酰亚胺基甲基)醚。
同双官能二硫化吡啶的优选的、非限制性实例包括1，4-二-3′-(2′-吡啶二硫基)丙酰胺基丁烷(DPDPB)。
同双官能烷基卤化物的优选的、非限制性实例包括2，2′-二羧基-4，4′-二碘乙酰胺基偶氮苯，α，α′-二碘-对二甲苯磺酸，α，α′-二溴-对二甲苯磺酸，N，N′-双(b-溴乙基)苄基胺，N，N′-二(溴乙酰基)苯基肼，和1，2-二(溴乙酰基)氨基-3-苯基丙烷。
3.同双官能可光活化的交联剂
此类试剂的合成、性能和应用大量描述在文献中(对于交联工序和试剂的评述，参见上文)。这些试剂的一些可以市购(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同双官能可光活化的交联剂的优选的、非限制性实例包括双-β-(4-叠氮基水杨基酰胺基)乙基二硫化物(BASED)，二-N-(2-硝基-4-叠氮基苯基)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)，和4，4′-二硫代双苯基叠氮化物。
iv.异双官能试剂
1、具有二硫化吡啶基结构部分的氨基反应性异双官能试剂
此类试剂的合成、性能和应用大量描述在文献中(对于交联工序和试剂的评述，参见上文)。这些试剂的许多可以市购(例如，PierceChemical Company，Rockford，I11.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，I nc.，Eugene，OR)。
具有二硫化吡啶结构部分和氨基反应性NHS酯的异双官能试剂的优选的、非限制性实例包括N-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)，丁二酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基己酸酯(LC-SPDP)，磺基丁二酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫基)丙酰胺基己酸酯(磺基-LCSPDP)，4-丁二酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，和磺基丁二酰亚胺基6-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基己酸酯(磺基-LC-SMPT)。
2、具有马来酰亚胺结构部分的氨基反应性异双官能试剂
此类试剂的合成、性能和应用大量描述在文献中。具有马来酰亚胺结构部分和氨基反应性NHS酯的异双官能试剂的优选的、非限制性实例包括马来酰亚胺基乙酸丁二酰亚胺酯(AMAS)，3-马来酰亚胺基丙酸丁二酰亚胺酯(BMPS)，N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基丁二酰亚胺酯(GMBS)，N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基磺基丁二酰亚胺酯(磺基-GMBS)，丁二酰亚胺基6-马来酰亚胺基己酸酯(EMCS)，丁二酰亚胺基3-马来酰亚胺基苯甲酸酯(SMB)，间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)，间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基丁二酰亚胺酯(磺基-MBS)，丁二酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，磺基丁二酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)，丁二酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)，和磺基丁二酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。
3、具有烷基卤结构部分的氨基反应性异双官能试剂
此类试剂的合成、性能和应用大量描述在文献中。具有烷基卤结构部分和氨基反应性NHS酯的异双官能试剂的优选的、非限制性实例包括N-丁二酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)，磺基丁二酰亚胺基-(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)，丁二酰亚胺基-6-(碘乙酰基)氨基己酸酯(SIAX)，丁二酰亚胺基-6-(6-((碘乙酰基)-氨基)己酰基氨基)己酸酯(SIAXX)，丁二酰亚胺基-6-(((4-(碘乙酰基)-氨基)-甲基)-环己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)，以及丁二酰亚胺基-4(碘乙酰基)-氨基)甲基环己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
具有氨基反应性NHS酯和烷基二卤化物结构部分的异双官能试剂的优选实例是N-羟基丁二酰亚胺基2，3-二溴丙酸酯(SDBP)。SDBP通过缀合其胺基将分子内交联引入到亲和组分。二溴丙酰基结构部分与伯胺基的反应性通过反应温度来控制(McKenzie等人，Protein Chem.7：581-592(1988))。
具有烷基卤结构部分和氨基反应性对硝基苯基酯结构部分的异双官能试剂的优选的、非限制性实例包括碘乙酸对硝基苯基酯(NPIA)。
其它交联剂是本领域技术人员所已知的。例如，参见Pomato等人，U.S.专利No.5,965,106。选择适当的交联剂用于特定应用是在本领域的技术人员能力范围内。
v.可裂解的连接基
在又一个实施方案中，该连接基具有能够裂解，以从糖残基上释放改性基团的基团。许多可裂解基团在本领域中是已知的。例如，参见Jung等人，Biochem.Biophys.Acta761：152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.143：1859-1867(1989)。而且，各种可裂解的、双官能(同和异双官能)连接基可以从供应商比如Pierce那里市购。
示例性可裂解结构部分可以使用光、热或试剂比如硫醇，羟胺，碱，高碘酸盐等来裂解。而且，作为对内吞的响应，某些优选基团在体内裂解(例如，顺式-乌头基；参见Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.102：1048(1991))。优选的可裂解的基团包括可裂解的结构部分，它是选自二硫化物，酯，酰亚胺，碳酸酯，硝基苄基，苯甲酰基和苯偶姻基团中的成员。
方法
本发明还提供了制备聚(乙二醇)分子的基本单分散群体的方法。该方法包括让具有明确分子量的PEG分子，例如PEG200与至少2当量的也具有明确分子量的双官能活化PEG，例如PEG200接触，从而形成PEG的单分散样品，例如PEG600：
G是离去基团，比如磺酸酯和tresylate酯。PEG600的单分散样品然后可以与双官能活化PEG200接触，形成单分散PEG100。或者，单分散PEG600可以转化为相应的双官能衍生物并与至少2当量的单分散二羟基PEG600反应，形成单分散PEG1800。本发明的方法重复到获得所需尺寸的单分散PEG为止。可以设计该合成，使得在起始原料和产物之间的分子量差允许通过尺寸排阻色谱法分离任何未反应或部分反应的材料。
活化PEG衍生物
本发明还提供了制备聚(乙二醇)衍生物的方法。在方案I中概括了该方法：
a.R-Y/(酸或碱)；b.活化，例如甲苯磺酰化，卤-去羟基化，例如HX或SOX2，以及与PEGm反应；c.活化(R′)，例如用氯甲酸对硝基苯基酯。
其中，下标m和n独立地表示1-100,000的整数。R是选自取代或未取代烷基，取代或未取代杂烷基，取代或未取代芳基，烷基胺，保护烷基胺，或活化基团中的成员，例如三氟甲磺酸根，甲苯磺酸根等。
R′选自取代或未取代烷基，取代或未取代杂烷基，取代或未取代芳基，取代或未取代杂环烷基和取代或未取代杂芳基。当R不包括用于活化它所连接的CH2-O结构部分的离去基团时，R′一般是离去基团，或包括离去基团。
在示例性实施方案中，R是低级烷基，比如甲基。在另一个示例性实施方案中，R′是取代烷基，比如氯甲酸对硝基苯基酯。
在步骤a中，起始二醇与活化基团(R-Y)接触，该活化基团与二醇的羟基结构部分反应。Y通常是离去基团，使R安放在PEG分子的羟基结构部分之一上。在步骤b中，所得加合物的游离羟基通过其转化为诸如卤素例如氯或磺酸酯之类的基团来活化。活化的PEG物质与作为起始PEG(“PEGm”)的相同或不同聚合度的另一PEG结构部分接触。为了使其连接于另一物质，RO-PEG(n+m)任选在游离羟基结构部分处活化。
一般，R基团经由包括反应性官能团的物质连接于PEG结构部分。而且，两个聚(乙二醇)片段通过使用反应性官能团连在一起，它们通过连接方法转化为新的有机官能团或未反应的物质。反应性官能团位于聚(乙二醇)结构部分上的任何位置，但优选在末端之一。
支化聚合物改性的糖与肽的缀合
改性糖使用适当的酶缀合于糖基化或非糖基化肽，以调解该缀合。优选地，选择改性给体糖、酶和受体肽的浓度，使得糖基化进行到受体被消耗为止。虽然就唾液酸基转移酶进行了阐明，但下述考虑一般适用于其它糖基转移酶反应。
使用糖基转移酶合成所需寡糖结构的许多方法是已知的，并且一般适用于本发明。示例性方法例如描述在WO96/32491，Ito等人，Pure Appl.Chem.65：753(1993)，和U.S.Pat.Nos.5,352,670，5,374,541，和5,545,553。
本发明使用单一糖基转移酶或糖基转移酶的结合物来实施。例如，可以使用唾液酸基转移酶和半乳糖基转移酶的结合物。在使用一种以上的酶的这些实施方案中，酶和底物优选在初始反应混合物中合并，或者一旦第一酶促反应结束或者几乎结束，将用于第二酶促反应的酶和试剂加入到反应介质中。通过在单一容器中按序进行两种酶促反应，总收率比其中分离中间体物质的工序改进。而且，减少了附加溶剂和副产物的清除和处理。
在优选的实施方案中，第一和第二种酶各自是糖基转移酶。在另一个优选的实施方案中，一种酶是内糖苷酶。在其它优选的实施方案中，使用两种以上的酶来装配本发明的改性糖蛋白。在将改性糖加成到肽之前和之后，使用酶来改变肽上的任何位置的糖结构。
本发明的缀合物的O-连接的糖基结构部分一般用连接于肽的GalNAc结构部分来产生。GalNAc转移酶的家族的任何成员可以用来将GalNAc结构部分结合于肽(Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA，and Clausen H(2000))。粘液型O-糖基化：O-聚糖占有率的控制通过多肽GalNAc-转移酶的底物特异性来指导(Eds.Ernst，Hart，and Sinay)。Wiley-VCH chapterCarbohydrates inChemistry and Biology-a Comprehension Handbook″，273-292)。GalNAc结构部分本身可以是完整的糖基连接基。另外，糖基残基可以使用一种或多种酶和一种或多种适当的酶的糖基底物来增建，改性糖被加入到增建的糖基结构部分上。
在另一个实施方案中，该方法利用一种或多种外或内糖苷酶。糖苷酶一般是突变体，它被工程化形成糖基键，而非裂解它们。突变体聚糖酶一般包括代替活性位点酸性氨基酸残基的氨基酸残基。例如，当内聚糖酶是内-H时，取代活性位点残基一般是在130位的Asp，在132位的Glu，或它们的组合。氨基酸一般用丝氨酸、丙氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺来代替。
突变体酶通常通过与内聚糖酶水解步骤的逆反应类似的合成步骤来催化该反应。在这些实施方案中，糖基给体分子(例如，所需的寡糖或单糖结构)含有离去基团，以及该反应通过将给体分子加成到蛋白上的GlcNAc残基上来进行。例如，离去基团可以是卤素，比如氟。在其它实施方案中，离去基团是Asn，或Asn-肽结构部分。在其它实施方案中，糖基给体分子上的GlcNAc残基被改性。例如，GlcNAc残基可以包括1，2-唑啉结构部分。
在优选的实施方案中，用于生产本发明的缀合物的各种酶以催化量存在。特定酶的催化量根据酶的底物的浓度以及反应条件比如温度、时间和pH值来改变。测定既定酶在预选择底物浓度和反应条件下的催化量的方式是本领域的技术人员所公知的。
进行以上方法的温度可以是刚好在冰冻以上的温度到最敏感的酶变性的温度。优选的温度范围是大约0到大约55℃，以及更优选是大约20到大约30℃。在另一个示例性实施方案中，本发明方法的一种或多种组分在高温下使用嗜热酶处理。
反应混合物保持受体足以被糖基化，从而形成所需缀合物的时间。缀合物的一些常常可以在几小时后检测，可回收量通常在24小时或更短的时间内回收。本领域的技术人员理解，反应速率取决于可变因素的值(例如酶浓度，给体浓度，受体浓度，温度，溶剂体积)，这些值对于选择体系可以进行优化。
本发明还提供了改性肽的工业规模生产方法。本文使用的工业规模一般产生了至少大约250mg，优选至少大约500mg和更优选至少大约1g的成品、提纯缀合物，优选在一个反应周期结束之后，即，该缀合物不是来自相同、连续重复的合成周期的反应产物的结合物。
在以下的论述中，本发明通过改性唾液酸结构部分与糖基化肽的缀合来举例说明。示例性改性唾液酸用(m-)PEG标记。以下论述集中于PEG改性唾液酸和糖基化肽的使用是为了清楚说明，不是暗示本发明限于这两种配对物的缀合物。技术人员理解，该论述一般适用于除了唾液酸以外的改性糖基结构部分的加成。而且，该论述同样适用于糖基单元用除了PEG以外的试剂(包括其它水溶性聚合物，治疗用结构部分和生物分子)的改性。
酶促方法可以用于将支化聚合物改性的碳水化合物选择性引入到肽或糖肽上。该方法采用含有支化水溶性聚合物的改性糖，并且与适当的糖基转移酶或糖合成酶结合。通过选择获得所需碳水化合物键的糖基转移酶和采用改性糖作为给体底物，该支化水溶性聚合物可以直接引入到肽骨架上，糖肽的现有糖残基上或已经加成到肽上的糖残基上。
唾液酸基转移酶的受体作为天然存在的结构，或者作为重组、酶法或化学法设置的结构存在于所要通过本发明的方法改性肽上，适合的受体例如包括半乳糖基受体，比如GalNAc，Galβ1，4GlcNAc，Galβ1，4GalNAc，Galβ1，3GalNAc，乳-N-四糖，Galβ1，3GlcNAc，Galβ1，3Ara，Galβ1，6GlcNAc，Galβ1，4Glc(乳糖)，以及本领域技术人员已知的其它受体(例如参见Paulson等人，J.Biol.Chem.253：5617-5624(1978))。
在一个实施方案中，唾液酸基转移酶的受体存在于在糖肽的体内合成时改性的糖肽上。此类糖肽可以使用所要求的方法来唾液酸化，不应预选改变糖肽的糖基化方式。或者，本发明的方法可以用来唾液酸化不包括适合的受体的肽；人们首先可以通过本领域技术人员已知的方法改性该肽，以引入受体。
在示例性实施方案中，半乳糖基受体通过将半乳糖残基连接于与肽相连的适当受体，例如Ga lNAc来组装。该方法包括用含有适量的半乳糖基转移酶(例如Galβ1，3或Galβ1，4)和适合的半乳糖基给体(例如UDP-半乳糖)的反应混合物孵化所要改性的肽。使该反应进行到基本上完全，或者，当添加了预定量的半乳糖残基时，终止反应。装配选择糖受体的其它方法是本领域的技术人员显而易见的。
在又一个实施方案中，首先总体或部分“修剪”糖肽连接的寡糖，以暴露唾液酸基转移酶的受体，或者可以添加一个或多个适合的残基以获得适合的受体的结构部分。酶比如半乳糖基转移酶和内切糖苷酶(例如参见US专利No.5,716,812)可用于连接和修剪反应。
在示例性实施方案中，碳水化合物残基在添加改性糖之前“修剪”。例如，将GalNAc-Gal残基重新修剪成GalNAc。携带水溶性聚合物的改性糖缀合于通过“修剪”暴露的一个或多个糖残基。在一个实例中，“修剪”糖肽，经由缀合于水溶性聚合物的糖基结构部分，例如Sia，Gal或GalNAc结构部分，将水溶性聚合物加成到所得O-侧链氨基酸或糖肽聚糖上。将改性糖基结构部分连接于“修剪”的糖肽上的受体位点上。或者，未改性的糖基结构部分，例如Gal可以在O-连接的聚糖末端连接。
在另一个示例性实施方案中，经由具有半乳糖残基的改性糖，将支化水溶性聚合物加成到GalNAc残基上。或者，可以将未改性Gal加成到末端GalNAc残基。
在又一个实例中，使用改性唾液酸将支化水溶性聚合物加成到Gal残基上。
上述示例性实施方案提供了本文所述的方法的能力的说明。使用本发明的方法，可以“削减”和“增加”基本上任何合乎需要结构的碳水化合物残基。改性糖可以加成到如上所述的碳水化合物结构部分的末端，或者它可以介于肽核和碳水化合物末端之间。
在示例性实施方案中，使用聚合物改性的唾液酸将支化水溶性聚合物加成到末端Gal残基上。使用适当的唾液酸基转移酶来加成改性唾液酸。该方法在方案3中总结。
方案3：
在方案4中总结的又一种方法中，封闭的反应性官能团存在于唾液酸中。该封闭反应性基团优选不受用于将改性唾液酸连接于肽的条件的影响。在将改性唾液酸共价连接于肽之后，除去掩闭物，用诸如PEG、PPG、治疗用结构部分、生物分子之类的试剂或其它试剂来缀合肽。该试剂通过其与改性糖残基上的未封闭反应性基团的反应而以特定方式缀合于肽。
方案4
取决于糖肽的寡糖侧链的末端糖(表3)，任何改性糖可以与它的适当的糖基转移酶一起使用。如上所述，引入支化水溶性聚合物结构所需的糖肽的末端糖可以在表达过程中自然引入，或者它可以通过使用适当的糖苷酶，糖基转移酶，或者糖苷酶和糖基转移酶的混合物在表达后生成。
表3
在可供选择的实施方案中，使用已知将糖基残基转移到肽骨架的O-连接的糖基化位点上的糖基转移酶，将改性糖直接加成到肽骨架上。该示例性实施方案在方案5中阐述。可用于实施本发明的示例性糖基转移酶包括、但不限于GalNAc转移酶(GalNAc T1-20)，GlcNAc转移酶，岩藻糖基转移酶，葡萄糖基转移酶，木糖基转移酶，甘露糖基转移酶等。使用该方法可以将改性糖直接加成到缺乏任何碳水化合物的肽，或者现有的糖肽上。在两种情况下，改性糖的加成发生在如由糖基转移酶的底物特异性所规定的肽骨架上的特定位置上，而不是象在使用化学方法改性蛋白的肽骨架过程中发生的无规方式。通过将适当的氨基酸序列工程化到多肽链中，可以将系列试剂引入到缺乏糖基转移酶底物肽序列的蛋白或糖肽中。
方案5
在上述各示例性实施方案中，在将改性糖缀合于肽之后，可以采用一个或多个附加化学或酶法改性步骤。在示例性实施方案中，使用酶(例如岩藻糖基转移酶)将糖基单元(例如岩藻糖)连接于与肽相连的末端改性糖。在另一个实例中，使用酶促反应来“封端”(例如唾液酸化)改性糖未能缀合的位点。或者，采用化学反应来改变缀合的改性糖的结构。例如，缀合的改性糖与稳定或去稳定其与改性糖所连接的肽组分的键的试剂反应。在另一个实例中，在其缀合于肽之后，将改性糖的组分去保护。技术人员清楚，在将改性糖缀合于肽之后的阶段中，具有可用于本发明的方法的系列酶促和化学工序。改性糖-肽缀合物的进一步细节是在本发明的范围内。
在另一个示例性实施方案中，将糖肽缀合于导向剂，例如铁传递蛋白(用于输送肽穿过血脑屏障，以及到达核内体)，肉毒碱(用于将肽输送到肌肉细胞；例如参见LeBorgne等人，Biochem.Pharmacol.59：1357-63(2000)，以及膦酸酯，例如双膦酸酯(用于将肽导向到骨和其它含钙组织；例如参见Modern Drug Discovery，2002年8月，第10页)。可用于导向的其它试剂是本领域的技术人员所显而易见的。例如，葡萄糖、谷氨酰胺和I GF还可用于导向到肌肉。
导向结构部分和治疗用肽通过本文所述的任何方法或者本领域已知的其它方法来缀合。技术人员清楚，除了上述那些以外的肽也可以如本文所述衍生化。在2001年10月10日提交的待审查、共同拥有的US临时专利申请No.60/328,523所附的附录中阐述了示例性肽。
在示例性实施方案中，导向剂和治疗用肽经由连接基结构部分偶联。在该实施方案中，根据本发明的方法，治疗用肽或导向剂的至少一种经由完整的糖基连接基偶联于连接基结构部分。在示例性实施方案中，连接基结构部分包括聚(醚)比如聚(乙二醇)。在另一示例性实施方案中，连接基结构部分包括在将缀合物输送到人体的目标组织或部位之后，在体内降解，从导向剂释放治疗用肽的至少一个键。
在又一个示例性实施方案中，治疗用肽的体内分布通过改变治疗用结构部分的糖形，不用将治疗用肽缀合于导向结构部分来改变。例如，治疗用肽可以通过用唾液酸(或其衍生物)封端糖基的末端半乳糖结构部分而避免被网状内皮系统所摄取。
i.酶
1、糖基转移酶
糖基转移酶以分步方式催化活化糖(给体NDP-糖)在蛋白、糖肽、脂类或糖脂上或生长寡糖的非还原末端上的加成。N-连接的糖肽经由转移酶和脂类连接的寡糖给体Dol-PP-NAG2Glc3Man9以整体转移和随后修剪核的方式合成。在该情况下，“核”糖的性质有些不同于后续连接。本领域已知有大量的糖基转移酶。
用于本发明的糖基转移酶可以是任何一种，只要它能够使用改性糖作为糖给体。此类酶的实例包括Leloir途径糖基转移酶，比如半乳糖基转移酶，N-乙酰氨基葡糖基转移酶，N-乙酰氨基半乳糖基转移酶，岩藻糖基转移酶，唾液酸基转移酶，甘露糖基转移酶，木糖基转移酶，葡糖醛酸基转移酶等。
对于涉及糖基转移酶反应的酶促糖合成，糖基转移酶可以克隆，或者从任何来源分离。许多克隆的糖基转移酶是已知的，它们的多核苷酸序列也是已知的。例如参见“The WWW Guide To ClonedGlycosyltransferases”，(http://www.vei.co.uk/TGN/gt-guide.htm)。糖基转移酶氨基酸序列和可以推论出氨基酸序列的编码糖基转移酶的核苷酸序列也可在各种公众可获得的数据库中找到，包括GenBank，Swiss-Prot，EMBL等。
可以在本发明的方法中使用的糖基转移酶包括、但不限于半乳糖基转移酶，岩藻糖基转移酶，葡萄糖基转移酶，N-乙酰氨基半乳糖基转移酶，N-乙酰氨基葡糖基转移酶，葡糖醛酸基转移酶，唾液酸基转移酶，甘露糖基转移酶，葡糖醛酸转移酶，半乳糖醛酸转移酶以及寡糖基转移酶。适合的糖基转移酶包括由真核细胞以及原核生物获得的那些。
DNA编码的糖基转移酶可以通过化学合成，从适当的细胞或细胞系培养物筛选mRNA的逆转录产物，通过筛选来自适当细胞的基因库，或者通过结合这些工序来获得。mRNA或基因组DNA的筛选可以用由糖基转移酶基因序列产生的寡核苷酸探针来进行。探针可以按照已知并且在普通杂交试验中使用的工序用可检测的基团比如荧光基团，放射性原子或化学发光基团来标记。在替代的方案中，糖基转移酶基因序列可以通过使用聚合酶链反应(PCR)工序来获得，其中PCR寡核苷酸引物由糖基转移酶基因序列产生。参见US专利No.4,683,195(Mullis等人)和US专利No.4,683,202(Mullis)。
糖基转移酶可以在用含有编码糖基转移酶的DNA的载体转化的宿主细胞中合成。载体用于扩增编码糖基转移酶的DNA和/或表达编码糖基转移酶的DNA。表达载体是可复制的DNA结构，其中编码糖基转移酶的DNA序列可操作地连接于能够在适合宿主中表达该糖基转移酶的适合控制序列(control sequence)。对于这种控制序列的需求将根据所选择的宿主和所选择的转化方法而改变。一般，控制序列包括转录启动子，任选的用于控制转录的操纵基团序列，编码适合的mRNA核糖体结合部位的序列，以及控制转录和翻译的终止的序列。扩增载体不需要表达控制区。所需的全部是在宿主中复制的能力，通常由复制的起点和有利于转化体的识别的选择基因所赋予。
在示例性实施方案中，本发明采用原核酶。这种糖基转移酶包括在脂寡糖(LOS)的合成中涉及的酶，它们通过许多革兰氏阴性细菌生产(Preston等人，Critical Reviews in Microbiology23(3)：139-180(1996))。此类酶包括、但不限于物种比如E.coli和鼠伤寒沙门氏菌的rfa操纵子的蛋白，它们包括β-1，6-半乳糖基转移酶和β-1，3-半乳糖基转移酶(例如，参见EMBL Accession Nos.M80599和M86935(E.coli)；EMBL Accession No.S56361(S.typhimurium))，糖基转移酶(Swiss-Prot Accession No.P25740(E.coli)，β1，2-葡萄糖基转移酶(rfaJ)(Swiss-Prot Accession No.P27129(E.coli)和Swiss-Prot Accession No.P 19817(S.typhimurium))，和β1，2-N-乙酰氨基葡糖基转移酶(rfaK)(EMBL Accession No.U00039(E.coli))。氨基酸序列已知的其它葡萄糖基转移酶包括由操纵子比如rfaB(它们已经在微生物比如肺炎克雷伯杆菌，大肠杆菌，鼠伤寒杆菌，肠沙门氏菌(Salmonella enteric)，小肠结肠炎耶尔森菌，麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprosum)中鉴定)，以及铜绿假单胞菌的rhl操纵子编码的那些。
还适用于本发明的是在生产含有乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰基-D-葡糖胺基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，以及Pk血型三糖序列，D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的结构中涉及的糖基转移酶，它们已经在粘膜病原体淋病奈瑟菌(Neisseria gonnorhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的LOS中鉴定(Scholten等人，J.Med.Microbiol.41：236-243(1994))。在这些结构的生物合成中涉及的编码糖基转移酶的脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的基因已经由脑膜炎奈瑟菌免疫型(immunotypes)L 3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18：729-740(1995))和淋病奈瑟菌突变体F62(Gotshlich，J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))识别。在脑膜炎奈瑟菌中，由三个基因lgtA，lgtB和lgE组成的基因座编码了在乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)中添加最后三个糖所需的糖基转移酶(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)：19166-73(1996))。最近，lgtB和IgtA基因产物的酶促活性被证实，提供了所提出的它们的糖基转移酶功能的第一个直接证据(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)：28271-276(1996))。在淋病奈瑟菌中，具有两个其它基因，将β-D-GalNAc加成到乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)结构的末端半乳糖的3位上的lgtD以及将末端α-D-Gal加成到截断LOS的乳糖结构单元，因此产生了Pk血型抗原结构(Gotshlich(1994)上文)的lgtC。在脑膜炎奈瑟菌中，独立的免疫型L1还表达了Pk血型抗原，并且已经表明携带lgtC基因(Jennings等人，(1995)，上文)。奈瑟菌属糖基转移酶和相关基因也描述在USPN 5,545,553中(Gotschlich)。来自幽门螺旋菌的α1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶的基因也已经被鉴定(Martin等人，J.Biol.Chem.272：21349-21356(1997))。还可用于本发明的是空肠弯曲杆菌的糖基转移酶(例如参见http://afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
a)岩藻糖基转移酶
在某些实施方案中，用于本发明的方法的糖基转移酶是岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶是本领域的技术人员已知的。示例性岩藻糖基转移酶包括将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到受体糖的羟基位置的酶。将非核苷酸糖转移到受体的岩藻糖基转移酶也可用于本发明。
在某些实施方案中，受体糖例如是在寡糖糖苷中的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基团中的GlcNAc。适用于该反应的岩藻糖基转移酶包括Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)，它们首先从人乳中被鉴定(参见Palcic等人，Carbohydrate Res.190：1-11(1989)；Prieels等人，J.Biol.Chem.256：10456-10463(1981)；以及Nunez等人，Can.J.Chem.59：2086-2095(1981))，以及Galβ(1→4)GlcNAcβ-α岩藻糖基转移酶(FTIV，FTV，FTVI)，它们在人血清中被发现。FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ岩藻糖基转移酶也已经被鉴定。Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶的重组形式也已经被鉴定(参见Dumas等人，Bioorg.Med.Letters 1：425-428(1991)和Kukowska-Latallo等人，Genes andDevelopment 4：1288-1303(1990))。其它示例性岩藻糖基转移酶例如包括α1，2-岩藻糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.69)。酶促岩藻糖基化可以通过在Mollicone等人，Eur.J Biochem.191：169-176(1990)或U.S.专利No.5,374,655中所述的方法来进行。用于生产岩藻糖基转移酶的细胞还包括用于合成GDP-岩藻糖的酶促体系。
b)半乳糖基转移酶
在另一组实施方案中，糖基转移酶的半乳糖基转移酶。示例性半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，例如参见Dabkowski等人，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等人，Nature 345：229-233(1990)，牛(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.264：14290-14297(1989))，鼠科动物(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA86：8227-8231(1989))，猪(GenBank L36152；Strahan等人，Immunogenetics 41：101-105(1995))。另一适合的α1，3半乳糖基转移酶是在血型B抗原的合成中涉及的那种(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.265：1146-1151(1990)(人))。又一个示例性半乳糖基转移酶是核Gal-T1。
还适用于本发明的方法的是β(1，4)半乳糖基转移酶，例如包括EC2.4.1.90(LacNac合成酶)和EC2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183：211-217(1989))，人(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663(1988))，鼠(Nakazawa等人，J.Biochem.104：165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38：234-242(1994))。其它适合的半乳糖基转移酶例如包括α1，2半乳糖基转移酶(例如来自Schizosaccharomycespombe，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5：519-528(1994))。
c)唾液酸基转移酶
唾液酸基转移酶是可用于重组细胞和本发明的反应混合物的另一类糖基转移酶。生产重组唾液酸基转移酶的细胞还产生CMP-唾液酸，它是唾液酸基转移酶的唾液酸给体。适用于本发明的唾液酸基转移酶的实例包括ST3Gal III(例如鼠或人ST3Gal III)，ST3Gal IV，ST3GalI，ST6Gal I，ST3Gal V，ST6Gal II，ST6Gal NAc I，ST6GalNAc II，和ST6GalNAc III(在本文使用的唾液酸基转移酶命名法如在Tsuji等人，Glycobiology 6：v-xiv(1996)中所述)。称为α(2，3)唾液酸基转移酶(EC2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾液酸基转移酶将唾液酸转移到Galβ1→3 Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal上。参见Van denEijnden等人，J.Biol.Chem.256：3159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982)和Wen等人，J.Biol.Chem.267：21011(1992)。另一示例性α2，3-唾液酸基转移酶(EC2.4.99.4)将唾液酸转移到二糖或糖苷的非还原末端Gal上。参见Rearick等人，J.Biol.Chem.254：4444(1979)和Gillespie等人，J.BioL Chem.267：21004(1992)。其它示例性酶包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸基转移酶(参见Kurosawa等人，Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。
优选地，对于糖肽的碳水化合物的糖基化，唾液酸基转移酶将能够将唾液酸转移到序列Galβ1，4GlcNAc-上，位于完全唾液酸化碳水化合物结构上的末端唾液酸下面的最常见的倒数第二序列(参见表4)。
表4：使用Galβ1，4GlcNAc序列作为受体底物的唾液酸基转移酶
1)Goochee等人，Bio/Technology 9：1347-1355(1991)
2)Yamamoto等人，J.Biochem.120：104-110(1996)
3)Gilbert等人，J.Biol Chem.271：28271-28276(1996)
可用于所要求的方法的唾液酸基转移酶的实例是ST3Gal III，还称为α(2，3)唾液酸基转移酶(EC2.4.99.6)。该酶催化唾液酸转移到Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc的Gal(例如参见Wen等人，J.Biol.Chem.267：21011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.256：3159(1991))，并且导致在糖肽中的天冬酰胺连接的寡糖的唾液酸化。该唾液酸连接于Gal，形成了在两个糖之间的α键。在糖之间的键接(连接)是在NeuAc的2位和Ga l的3位之间。该特定的酶能够从鼠肝中分离(Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982))；人cDNA(Sasaki等人(1993)，J.Biol.Chem.268：22782-22787；Kitagawa& Paulson(1994)，J.Biol.Chem.269：1394-1401)和基因组(Kitagawa等人，(1996)J.Biol.Chem.271：931-938)DNA序列是已知的，有利于通过重组表达来生产该酶。在一个优选的实施方案中，所要求的唾液酸化方法使用鼠ST3Gal III。
用于本发明的其它示例性唾液酸基转移酶包括从空肠弯曲杆菌中分离的那些，包括α(2，3)。例如参见WO99/49051。
除了表5中列举的那些以外的唾液酸基转移酶也可用于唾液酸化工业上重要的糖肽的经济而有效的大规模方法。作为发现这些其它酶的用途的简单试验，不同量的各酶(1-100mU/mg蛋白)与脱唾液酸-α1AGP(1-10mg/ml)反应，以比较所研究的唾液酸基转移酶与牛ST6Gal I，ST3GalIII或该两种糖基转移酶的唾液酸化糖肽的能力。或者，用酶法从肽骨架上释放的其它糖肽或N-连接的寡糖可以代替脱唾液酸-α1AGP用于该评价。具有比ST6Gal I更有效地唾液酸化糖肽的N-连接的寡糖的能力的唾液酸基转移酶可用于肽唾液酸化的实用大规模方法(如在本公开中对ST3Gal III所说明)。
d)GalNAc转移酶
N-乙酰基半乳糖胺基转移酶可用于实施本发明，尤其用于将GalNAc结构部分结合于肽的O-连接的糖基化位点的氨基酸。适合的N-乙酰基半乳糖胺基转移酶包括、但不限于α(1，3)N-乙酰基半乳糖基转移酶，β(1，4)N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.267：12082-12089(1992)和Smith等人，J.Biol Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰基半乳糖胺基转移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.268：12609(1993))。
通过基因工程由克隆的基因生产蛋白比如酶GalNAcT1-XX的方法是公知的。例如参见US专利No.4,761,371。一种方法包括收集足够的样品，然后通过N-末端测序测定酶的氨基酸序列。然后使用该信息来分离编码全长(膜结合)转移酶的cDNA克隆，它在昆虫细胞系Sf9中表达时合成了完全活性酶。然后使用在16种不同蛋白的已知糖基化位点周围的氨基酸的半定量分析，随后进行合成肽的体外糖基化研究来测定酶的受体特异性。该研究工作已经证明，某些氨基酸残基在糖基化肽链段中过度表现，以及在糖基化丝氨酸和苏氨酸残基周围的特定位置中的残基可以比其它氨基酸结构部分对受体效率具有更显著影响。
2、磺基转移酶
本发明还提供了生产包含硫酸化分子，例如硫酸化多肽比如肝素，硫酸乙酰肝素，角叉菜胶(carragnen)和相关化合物的肽的方法。适合的磺基转移酶包括例如软骨素-6-磺基转移酶(由Fukuta等人，J.Biol.Chem.270：18575-18580(1995)所述的鸡cDNA；GenBank Accession No.D49915)，糖胺聚糖N-乙酰氨基葡糖N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶1(Dixon等人，Genomics 26：239-241(1995)；UL 18918)，以及糖胺聚糖N-乙酰氨基葡糖N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶2(在Orellana等人，J.Biol.Chem.269：2270-2276(1994)和Eriksson等人，J.Biol.Chem.269：10438-10443(1994)中所述的鼠科动物cDNA；在GenBankAccession No.U2304中所述的人cDNA)。
3、细胞结合的糖基转移酶
在另一个实施方案中，在本发明的方法中采用的酶是细胞结合的糖基转移酶。虽然许多可溶性糖基转移酶是已知的(例如参见US专利No.5,032,519)，但在与细胞联系时，糖基转移酶通常以膜结合形式存在。所研究的许多膜结合酶迄今被认为是嵌入蛋白；即，它们不能通过超声处理而从膜中释出，需要用于增溶的洗涤剂。表面糖基转移酶已经在脊椎和无脊椎动物细胞的表面上被鉴定，还已经认识到，这些表面转移酶在生理条件下保持了催化活性。然而，更为公认的细胞表面糖基转移酶的功能是细胞间识别(Roth，MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA，1990)。
已经开发了方法来改变由细胞表达的糖基转移酶。例如，Larsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989)，报道了测定细胞表面寡糖结构和它们的关联糖基转移酶的表达的分离克隆的cDNA序列的基因方法。将由已知表达UDP-半乳糖酶：β-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基转移酶的鼠科动物细胞系分离的mRNA的产生cDNA文库转染到COS-1细胞。然后培养转染的细胞，并分析α-1，3-半乳糖基转移酶活性。
Francisco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2713-2717(1992)公开了将β-内酰胺酶锚固于大肠杆菌的外表面的方法。生产由(i)外膜蛋白的信号序列，(ii)外膜蛋白的跨膜段，和(iii)完全成熟的β-内酰胺酶序列组成的三联融合体，获得了活性表面结合的β-内酰胺酶分子。然而，Francisco法仅限于原核细胞体系，根据作者的认识，适当的发挥作用需要完全三联融合。
4、融合蛋白
在其它示例性实施方案中，本发明的方法采用具有与所需糖肽缀合物的合成有关的一种以上的酶活性的融合蛋白。融合多肽可以例如由连接于辅助酶的催化活性区域的糖基转移酶的催化活性区域组成。辅助酶催化区域例如可以催化属于糖基转移酶的给体的核苷酸糖的形成中的步骤，或者催化糖基转移酶循环中涉及的反应。例如，编码糖基转移酶的多核苷酸可以在框内连接于编码在核苷酸糖合成中涉及的酶的多核苷酸。所得融合蛋白然后不仅可以催化核苷酸糖的合成，而且催化糖结构部分转移到受体分子上。该融合蛋白可以是连接于一个可表达的核苷酸序列的双或多循环酶。在其它实施方案中，融合蛋白包括两种或多种糖基转移酶的催化活性区域。例如参见5,641,668。本发明的改性糖肽可以容易地利用各种适合的融合蛋白来设计和生产(例如，参见PCT专利申请PCT/CA98/01180，它作为WO99/31224在1999年6月24日公开)。
5、固定化酶
除了细胞结合的酶以外，本发明还提供了固定在固体和/或可溶性载体上的酶的用途。在示例性实施方案中，提供了根据本发明的方法经由完整糖基连接基缀合于PEG的糖基转移酶。PEG-连接基-酶缀合物任选连接于固体载体。固体担载的酶在本发明的方法中的应用简化了反应混合物的后处理和反应产物的提纯，还可以容易回收酶。糖基转移酶缀合物在本发明的方法中采用。酶和载体的其它结合是本领域技术人员所显而易见的。
肽缀合物的提纯
用以上方法生产的产物可以不用提纯来使用。然而，通常优选回收产物。可以采用用于回收糖基化糖的标准、公知的技术比如薄层或厚层色谱法、柱色谱法、离子交换色谱法或膜过滤。优选使用膜过滤法，更优选采用反渗透膜，或者如在下文和本文引用文献中所述的用于回收的一种或多种柱色谱技术。例如，其中膜具有大约3000到大约10,000的分子量截止的膜过滤可以用于除去蛋白比如糖基转移酶。然后可以使用纳米过滤或反渗透来除去盐和/或提纯产物糖(例如参见WO 98/15581)。纳米过滤膜是通过单价盐，但保留大于约100到约2,000道尔顿的多价盐和不带电荷的溶质的一类反渗透膜，这取决于所使用的膜。因此，在典型应用中，用本发明的方法制备的糖保留在膜中，但污染的盐将通过。
如果改性糖蛋白在分子内产生，作为第一步，例如通过离心或超滤除去颗粒碎片，即宿主细胞或溶解片段；任选地，该蛋白可以用市购蛋白浓缩过滤器浓缩，随后通过选自下列之中的一个或多个步骤分离多肽变体与其它杂质：免疫亲和色谱法、离子交换柱分级(例如用二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺基丙基的基质)，用Blue-Sepharose，CM Blue-Sepharose，MONO-Q，MONO-S，扁豆凝集素(lentil lectin)-Sepharose，WGA-Sepharose，Con A-Sepharose，Ether Toyopearl，Butyl Toyopearl，Phenyl Toyopearl，SP-Sepharose，或protein A Sepharose层析，SDS-PAGE色谱法，硅胶色谱法，色谱聚焦，反相HPLC(例如具有附加脂族基的硅胶)，例如使用Sephadex分子筛或尺寸排阻色谱法的凝胶过滤，用选择性结合多肽的柱子的色谱法，以及乙醇或硫酸铵沉淀。
在培养物中生产的改性糖肽通常通过从细胞、酶等中初始萃取，随后的一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤(例如SP Sepharose)来分离。另外，改性糖蛋白可以通过亲和色谱法来提纯。HPLC还可以用于一个或多个提纯步骤。
蛋白酶抑制剂，例如甲基磺酰氟(PMSF)可以在任何以上步骤中包括，以抑制蛋白水解，以及可以包括抗生素，以防止外来污染物的生长。
在另一个实施方案中，来自产生本发明的改性糖肽的体系的上清液首先使用市购蛋白浓缩过滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元来浓缩。在浓缩步骤之后，可以将该浓缩物施加于适合的纯化基质。例如，适合的亲和基质可以包括结合于适合的载体的肽、凝集素或抗体分子的配体。或者，可以使用阴离子交换树脂，例如具有侧挂DEAE基团的基质或底物。适合的基质包括丙烯酰胺，琼脂糖，右旋糖苷，纤维素，或在蛋白提纯中通常使用的其它类型。或者，可以使用阳离子交换步骤。适合的阳离子交换剂包括含有磺基丙基或羧甲基的各种不溶基质。磺基丙基是特别优选的。
最后，采用疏水RP-HPLC介质，例如具有侧挂甲基或其它脂族基团的硅胶的一个或多个RP-HPLC步骤可以用来进一步提纯多肽变体组合物。各种组合的上述提纯步骤的一些或全部还可以用来提供均匀改性的糖蛋白。
由大规模发酵获得的本发明的改性糖肽可以通过于由Urdal等人，J.Chromatog.296：171(1984)所公开的那些类似的方法来提纯。该参考文献描述了用制备HPLC柱子提纯重组人IL-2的两个按序RP-HPLC步骤。另外，诸如亲和色谱法之类的技术可用来提纯改性糖蛋白。
除了上述缀合物以外，本发明提供了制备这些和其它缀合物的方法。而且，本发明提供了通过将本发明的缀合物给药于具有罹患疾病风险的个体或患者来预防、治疗或改善疾病状态的方法。
药物组合物
缀合于本发明的支化水溶性聚合物的治疗用结构部分具有各种药物应用。例如改性促红细胞生成素(EPO)可以用于治疗一般性贫血，再生障碍性贫血，化疗诱发的损伤(比如对骨髓的损伤)，慢性肾衰竭，肾炎，和地中海贫血症。改性EPO可以进一步用于治疗神经系统紊乱比如脑/脊髓损伤，多发性硬化症和阿尔茨海默病。
第二个例子是α干扰素(IFN-α)，其可用于治疗AIDS和乙肝或丙肝，由各种病毒比如人乳头状瘤病毒(HBV)，冠状病毒，人类免疫缺陷病毒(HIV)，单纯性疱疹病毒(HSV)，和水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的病毒感染，癌比如毛细胞白血病，AIDS相关性卡波西肉瘤，恶性黑色素瘤，滤泡性非霍杰金淋巴瘤，费城染色体(Ph)阳性、慢性粒细胞性白血病(CML)，肾癌，骨髓瘤，慢性髓性白血病，头颈部肿瘤，骨癌，以及子宫颈非典型增生和中枢神经系统(CNS)疾病比如多发性硬化症。另外，根据本发明的方法改性的IFN-α可用于治疗各种其它疾病和状态比如干燥综合症(自身免疫病)，贝切特病(自身免疫炎性疾病)，纤维肌痛(肌与骨骼疼痛/疲劳疾病)，口疮性溃疡(口溃疡)，慢性疲劳综合症，和肺纤维化。
另一例子是β-干扰素，可用于治疗CNS障碍比如多发性硬化症(复发型/缓和型或慢性进行性)，AIDS和乙肝或丙肝，由各种病毒比如人乳头状瘤病毒(HBV)，人类免疫缺陷病毒(HIV)，单纯性疱疹病毒(HSV)，和水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起的病毒感染，耳感染，肌与骨感染，以及癌，包括乳腺癌，脑癌，结肠直肠癌，非小细胞肺癌，头颈部癌，基底细胞癌，子宫颈非典型增生，黑色素瘤，皮肤癌，和肝癌。根据本发明的方法改性的IFN-β还用于治疗其它疾病和状态比如移植排斥(例如骨髓移植)，慢性舞蹈病，结肠炎，脑炎，肺纤维化，黄斑变性，肝硬化，和角膜结膜炎。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是另一例子。根据本发明的方法改性的G-CSF可以在治疗癌的化疗中用作助剂，以及用于防止或缓解与某些医疗过程有关的病情或并发症，例如化疗诱发的骨髓损伤；白血球减少(一般性)；化疗诱发的发热性中性粒细胞减少；与骨髓移植有关的中性粒细胞减少；以及重型慢性中性粒细胞减少。改性G-CSF还可用于移植；外周血细胞动员；在接受骨髓消融(myeloablative)或骨髓抑制化疗的病人中用于收集的外周血祖细胞的动员；以及在急性骨髓性白血病的诱导/巩固治疗之后的中性粒细胞减少，发烧，抗生素使用，住院治疗的持续时间的减少。其它病情或障碍可以用改性G-CSF治疗，包括哮喘和过敏性鼻炎。
作为一个另外的例子，根据本发明的方法改性的人生长激素(hGH)可以用来治疗与生长相关的疾病比如侏儒症，儿童和成人的身材矮小，恶病质/肌肉消耗，一般肌肉萎缩，以及性染色体异常(例如特纳氏综合症)。可以用改性hGH治疗的其它疾病包括：短肠综合征，脂肪营养障碍，骨质疏松症，尿毒症(uraemaia)，烧伤，女性不育症，骨增生，一般糖尿病，II型糖尿病，骨关节炎，慢性阻塞性肺病(COPD)，和失眠症(insomia)。而且，改性hGH还可以用于促进各种过程，例如一般组织再生，骨再生，和伤口愈合，或者作为疫苗助剂。
因此，在另一个方面，本发明提供了药物组合物。该药物组合物包括药物可接受的稀释剂和非天然存在、水溶性聚合物，治疗用结构部分或生物分子和糖基化或非糖基化肽的共价缀合物。该聚合物、治疗用结构部分或生物分子经由完整糖基连接基缀合于肽，该完整糖基连接基介于并以共价键连接于肽与聚合物、治疗用结构部分或生物分子。
本发明的药物组合物适用于各种药物输送体系。适用于本发明的制剂可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mace PublishingCompany，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)中找到。对于用于药物输送的方法的简述，参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。
该药物组合物可以配制用于任何适当的给药方式，例如包括局部，口，鼻，静脉内，颅内，腹膜内，皮下或肌内给药。对于肠胃外给药，比如皮下注射，载体优选包括水，盐水，醇，脂肪，蜡或缓冲剂。对于口服给药，可以使用以上载体的任何一种或固体载体比如甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，钠糖，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖，和碳酸镁。还可以使用可生物降解的基质，比如微球(例如聚乳酸聚乙醇酸)作为本发明的药物组合物的载体。适合的可生物降解的微球例如公开在US专利Nos.4,897,268和5,075,109中。
通常，药物组合物皮下或肠胃外，例如静脉内给药。因此，本发明提供了包含溶于或悬浮于可接受的载体，优选水性载体，例如水，缓冲水，盐水，PBS等的化合物的用于肠胃外给药的组合物。组合物还可以含有洗涤剂比如Tween 20和Tween 80；稳定剂比如甘露醇，山梨醇，蔗糖和海藻糖；和防腐剂比如EDTA和间甲酚。组合物可以含有模拟生理条件所需的药物可接受的助剂，比如pH调节和缓冲剂，张性调节剂，润湿剂，洗涤剂等。
这些组合物可以通过普通灭菌技术来灭菌，或者可以无菌过滤。所得水溶液可以包装，用于直接使用，或者冻干。冻干制剂在给药之前与无菌含水载体合并。该制剂的pH一般是3-11，更优选5-9，最优选7-8。
在一些实施方案中，本发明的糖肽可以引入到由标准囊泡形成脂类所形成的脂质体中。多种方法可供用于制备脂质体，例如描述在Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，U.S.Pat.Nos.4,235,871，4,501,728和4,837,028中。使用各种导向剂(例如本发明的唾液酸基半乳糖苷)的脂质体的导向在本领域中是公知的(参见例如US专利Nos.4,957,773和4,603,044)。
可以采用用于将导向剂偶联于脂质体的标准方法。这些方法一般包括将可活化用于连接导向剂的脂类组分，比如磷脂酰乙醇胺，或者衍生化亲脂性化合物，比如本发明的脂类衍生化糖肽引入到脂质体。
导向机理一般要求导向剂定位在脂质体的表面上，使得目标结构部分可与目标物，例如细胞表面受体相互作用。本发明的碳水化合物可以在使用本领域技术人员已知的方法形成脂质体之前连接于脂类分子(例如，存在于分别具有长链烷基卤化物或具有脂肪酸的碳水化合物上的羟基的烷基化或酰化)。或者，脂质体可以按在形成膜的时候将连接部分首先引入到膜中的方式来制成。该连接部分必须具有亲脂部分，其牢固地在膜中嵌入和锚固。它还必须具有反应性部分，其在脂质体的水性表面上可化学利用。选择反应性部分，使得它在化学上适于与后来添加的导向剂或碳水化合物形成稳定化学键。在某些情况下，可以直接将导向剂连于连接分子，但在大多数情况下，更适合使用第三分子来用作化学桥，因此将膜内的连接分子与从囊泡表面立体伸出的导向剂或碳水化合物连接。
用本发明的方法制备的化合物还可以用作诊断试剂。例如，标记的化合物可以用来定位疑有炎症的患者中的炎症或肿瘤转移的区域。为此，化合物可以用125I，14C或氚标记。
以下实施例提供用来说明本发明的化合物以及方法，但不限制所要求的发明。
实施例
在实施例1-3中使用以下符号。主PEG亚单元由四个乙二醇单元组成。该分子具有194的分子量，在图中被四舍五入为200。以下符号用来代表主PEG亚单元：
主PEG亚单元的结合物可供选择地如以下所示用在官能化末端之间所示的四舍五入分子量来表示。
以下符号用来表示单官能化甲氧基PEG亚单元：
实施例1
单分散PEG和它们的活化形式的制备
单分散或单一分子量PEG如下所示来制备。通过调节所产生的片段的大小，制备了任何尺度的PEG。然后通过烷基化将二醇的一端封端，并活化，用于缀合于生物结构部分比如蛋白、糖、脂类或核苷酸。
离去基团可以连接于主PEG亚单元，以便产生以下所示的活化主PEG。在该反应中，Q可以是与本发明的化学过程相容的任何离去基团。示例性离去基团包括卤素，tresylate，甲苯磺酸根和甲磺酸根。
在产生活化主PEG之后，如下所示，该化合物与主PEG亚单元反应。该产物是第一代PEG延长物。
第二代PEG延长物按照与第一代同样的方式产生。
第三代PEG延长物如下所示产生。
第四代PEG延长物如下所示产生。
PEG延长过程通过让单官能化结构部分与双官能化合物之一反应来终止。在该反应中，单官能化结构部分是与本发明的化学过程相容的任何基团。示例性封端基团包括烷氧基-PEG和烷基。
在以下示例性实施方案中，将离去基团加到甲氧基-PEG亚单元上。该分子然后与第四代PEG延长物反应。
在另一个示例性实施方案中，甲基亚单元加到第四代PEG延长物上。
在封端一个末端之后，PEG延长物的另一端如下所示进行活化用于生物缀合。在该反应中，X是能形成酯的任何离去基团。符号X独立地选自咪唑基，HOBt，HOAt，NHS，和对硝基苯基酯。
最后，PEG延长分子如下所示缀合于生物结构部分。
实施例2
不要求活化单分散PEG必须具有与同它反应的延长分子相同数目的PEG亚单元。在示例性实施方案中，活化的单分散PEG具有比同它反应的延长分子更大数目的PEG亚单元。在以下所示的另一示例性实施方案中，活化单分散PEG具有比同它反应的延长分子更少数目的PEG亚单元。
这些分子的封端方法与在实施例1中所述的方法类似。
实施例3
可以添加过量的活化PEG亚单元，以便产生以下所示的单分散PEG：
n是1-100或1-20,000，取决于来源
通过改变反应剂的比率，所使用的碱，温度，溶剂和浓度，可以调节反应，获得所需的主要分子量(n)。
该方法提供了制备任何大小的单分散PEG的简单、快速、有效方式。提纯通过该方法而被简化，因为单分散PEG的分子量(和因此物理化学特性)存在差别。这允许使用简单、标准的提纯技术比如硅胶、反相纤维素、膜过滤(纳米过滤和超滤)。提纯的PEG二醇然后衍生化为所需的任何官能化形式。
实施例4
烷氧基PEG的生产
以下所示的一般方法用来制备烷氧基PEG或其它单官能化PEG。
在第一个实施方案中，活化双官能化PEG分子如下所示产生：
其中符号n表示1-100,000的数值。符号Q表示与本发明的化学过程相容的任何离去基团。示例性离去基团包括卤素，tresylate，甲苯磺酸根和甲磺酸根。符号X表示与离去基团相容的任何抗衡离子。
该活化双官能化PEG分子如下所示用于延长PEG分子的长度：
其中符号m表示1-100,000的数值。
在第二个实施方案中，如下所示，延长单官能化PEG，然后活化，用于与生物结构部分缀合。
在第一步中，单官能化PEG进行甲苯磺酰化。
其中符号n表示1-100,000的数值。
在第二步中，延长单官能化PEG：
其中符号m表示1-100,000的数值。
在最后的步骤中，如下所示，延长的单官能化PEG化合物活化用于与生物结构部分缀合。
实施例5
用于制备双触角聚合物的其它组合物和方法
本发明的其它双触角结构具有以下通式：
其中符号X表示OH，H，Q(活化基团)，和生物结构部分，比如蛋白，糖，脂类，或核苷酸。符号n表示1-10的数值。术语“聚合物”可以是PEG，mPEG(甲氧基聚乙二醇)，PPG(聚丙二醇)，mPPG，聚谷氨酸，聚天冬氨酸，聚乳酸，和聚唾液酸。
在示例性实施方案中，双触角结构具有以下通式：
其中符号m和n独立地表示1-10,000的数值。符号X表示OH，H，Q(活化基团)，和生物结构部分，比如蛋白，糖，脂类或核苷酸。
在另一个示例性实施方案中，双触角结构具有下式：
其中符号a和b独立地表示1-24的数值。符号m和o独立地表示1-10,000的数值。符号X表示OH，H，Q(活化基团)，以及生物结构部分，比如蛋白、糖、脂类或核苷酸。
虽然参考具体实施方案公开了本发明，但显而易见，在不偏离本发明的真正精神和范围的情况下，本领域的其它技术人员可以设计本发明的其它实施方案和变型。
在本申请中列举的所有专利、专利申请和其它出版物全面引入供参考。

Claims (9)

1.肽，其具有以下通式：
其中，WSP是水溶性聚合物，且
R14是选自OH，反应性官能团，含糖结构部分的基团或连接于载体分子的基团中的一种。
2.根据权利要求1的肽，其中所述水溶性聚合物包括聚(乙二醇)。
3.根据权利要求1或2的肽，其具有以下通式：
其中:
m，n和t独立地选自整数1－20,000。
4.根据权利要求1或2的肽，其中R14包括糖结构部分。
5.根据权利要求4的肽，其中所述糖结构部分是核苷酸糖。
6.根据权利要求4的肽，其中所述糖结构部分缀合于选自第二种肽和脂类中的一种。
7.根据权利要求6的肽，其中所述糖结构部分缀合于选自所述第二种肽的氨基酸和糖基残基中的一种。
8.根据权利要求7的肽，其中所述糖结构部分是在所述肽和所述第二种肽之间的糖基连接基。
9.根据权利要求8的肽，其中所述糖结构部分是在所述肽和所述第二种肽之间的完整糖基连接基。
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