CN102218051A - 丙戊酸钠在制备治疗或改善青光眼视神经病变的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属制药领域，涉及丙戊酸钠在制备治疗或改善青光眼视神经病变的药物中的用途。本发明通过体外细胞培养实验和体内动物实验结果表明，一定浓度的丙戊酸钠能促进体外培养的视网膜神经节细胞存活和提高其轴突的延伸能力，慢性高眼压时，能降低促凋亡基因BAX的表达，促进视网膜神经节细胞存活，以及减轻RGCs的损伤，试验证实了所述的丙戊酸钠可同时针对青光眼视神经病变的多个发病机制保护视网膜神经节细胞，进一步，可作为活性成份制备治疗青光眼视神经病变药物，特别是制备保护网膜神经节细胞的药物；本发明将对青光眼的临床治疗产生重要的应用价值和良好的社会经济效益。

Description

丙戊酸钠在制备治疗或改善青光眼视神经病变的药物中的用途

技术领域

本发明属制药领域，涉及丙戊酸钠在制药中的新的用途，具体涉及丙戊酸钠在制备治疗或改善青光眼视神经病变的药物中的用途。

背景技术

青光眼是一类以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC)凋亡及其轴突渐行性退变为特征的视神经病变，是仅次于白内障的全球第二大致盲眼病。2000 年全球约有6680 万原发性青光眼患者及约600万继发性青光眼患者,其中约670万患者因青光眼致盲；预计到2020年，美国将有超过三百万人患青光眼，至少8万人会最终因此失明。在中国，940万青光眼患者中盲目患者达520万，致盲率几乎逼近白内障。因此，青光眼防治一直是中国和世界眼科学研究的重要领域，具有非常重要的社会、经济意义。

研究表明，青光眼视网膜、视神经损伤的病理基础是RGCs死亡；单纯降低眼压可以从一定程度上缓解病情的发展却不能遏制继发性RGCs死亡及其轴突的溃变。已有研究证实青光眼RGCs死亡及其轴突变性的发病机制复杂，是神经元、神经胶质细胞和眼内微环境等多种致病环节综合作用的最终结局，主要包括：高眼压造成的机械损伤、谷氨酸超负荷引起的谷氨酸兴奋性毒性、肿瘤坏死因子释放、氧化应激、代谢异常、神经营养因子剥夺、胶质细胞激活等。目前临床上的治疗手段，包括降眼压或神经保护剂，往往只能针对上述众多致病因素中的一种来试图延缓RGCs的死亡，极少有能够同时以两个或多个导致RGCs死亡的环节作为治疗靶点的药物或方法，因此临床疗效有限。临床实践需要寻找针对青光眼的复杂发病机制，可同时对多个靶点起作用的药物，使显著提升青光眼视网膜、视神经损伤的治疗效果。

丙戊酸钠（Sodium Valproate， VPA）是临床抗惊厥和抗癫痫的一线药物，已广泛应用近40年，主要用于癫痫、双向性精神障碍的治疗，可迅速透过血脑屏障，疗效确定，安全性好。目前尚未见有关丙戊酸钠能通过多个治疗靶点干预导致青光眼RGCs死亡的多种发病机制、提高保护视网膜神经节细胞及其轴突的效果，尤其是改善或治疗青光眼视神经病变的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供丙戊酸钠（VPA）在制药中的新的用途，具体涉及丙戊酸钠在制备治疗或改善青光眼视神经病变的药物中的用途；

更具体的，本发明提供了丙戊酸钠在制备治疗或改善青光眼视网膜、视神经损伤的药物中的用途，特别是丙戊酸钠在制备保护青光眼视网膜神经节细胞的药物中的用途。

本发明所述的青光眼为原发性开角型青光眼，正常眼压性青光眼（低压性青光眼）。

本发明所述的丙戊酸钠（可市购）属于Ⅰ类HDAC抑制剂，是一种分子量很小的短链脂肪酸，其化学名称为2-丙基戊酸钠，分子式为: C₈H₁₅NaO₂，分子量为: 166.20，具有式（Ⅰ）的分子结构：

（Ⅰ）             。

本发明以体外培养的原代SD大鼠视网膜神经节细胞和慢性高眼压SD大鼠模型为试验对象, 研究观察了丙戊酸钠对体外培养的原代视网膜神经节细胞（RGCs)的数量及其轴突长度、生长速度的作用，以及对慢性高眼压大鼠RGCs的挽救作用；实验结果显示：(1）所述丙戊酸钠能促进体外培养的成年SD大鼠原代RGCs的存活及其轴突生长；加入VPA培养后第3、7天，RGCs数量分别为402±63和389±47，显著多于对照组（P<0.01），轴突平均长度（μm）为68.4±13.1（P<0.01）、114.6±23.5 （P<0.01）；平均轴突生长速率为18.6±5.2（P<0.01）；(2）VPA可提高体外培养的原代RGCs中与细胞存活相关的基因的蛋白和mRNA表达提高，包括Bcl-2、survivin、catenin和hsp70等；(3) 慢性高眼压SD大鼠动物模型玻璃体腔内或腹腔内注射VPA或PBS（对照组）后第1、2、3、8周采用荧光金逆行标记的方法行视网膜铺片计数存活的RGCs数量，结果显示，VPA注射组视网膜铺片上呈现完整的圆形或卵圆形绿色荧光的细胞数量增多，不规则形态的荧光碎片较少，轴突轮廓相对完整，数量增加，以第3和8周时差别最为显著（P<0.01）；（4）慢性高眼压SD大鼠玻璃腔内或腹腔内注射VPA后，视网膜中营养因子BDNF、细胞存活相关基因bcl－2、catenin和survivin、以及与降低谷氨酸兴奋性毒性有关的α-synuclein蛋白的表达分别较PBS注射组提高6.3－7.9、2.6-3.7、2.1-4.2、3.4-5.6、3.1-3.8倍；（5）慢性高眼压SD大鼠玻璃腔内或腹腔内注射VPA后，显著降低视网膜中炎症因子TNF-α含量；PBS组中TNF-α含量为486.2±12.4ng/mg，VPA组为194.7±8.6 ng/mg，差异具有统计学意义（P<0.01）；（6）慢性高眼压SD大鼠玻璃腔内或腹腔内注射VPA后,显著抑制高眼压引起的视网膜胶质细胞过渡激活，胶质细胞激活的标志蛋白OX42和GFAP在视网膜内的含量下降（P<0.01）。

实验结果表明，所述的丙戊酸钠不仅可直接调控RGCs高表达细胞存活基因bcl－2、catenin、SURVIVIN和hsp70，降低BAX表达，促进RGCs存活和轴突延伸，还可以通过对抗或干预青光眼视神经病变发病机制中的谷氨酸兴奋性毒性、胶质细胞过渡激活、炎症因子TNF-α的释放，营养因子BDNF的减少等环节，改善微环境来挽救RGCs。延缓慢性高眼压RGCs及其轴突的进行性退变；所述的丙戊酸钠可作为活性成份制备治疗青光眼视神经病变药物，特别是制备保护RGCs的药物；本发明所述的丙戊酸钠还可用于制备促进视网膜神经节细胞轴突延伸的药物、抑制青光眼视神经病变过程中神经胶质细胞过渡激活的药物、以及降低视网膜谷氨酸兴奋性毒性的药物。

本发明的另一目的，提供一种青光眼视网膜、视神经保护剂，所述的保护剂采用安全有效量的丙戊酸钠为药物活性成分，加以药剂学上必要的辅料，制成普通片剂、肠溶片、缓释片、糖浆、喷淋胶囊、针剂、凝胶、软膏、溶液、混悬液等多种剂型，其给药途径可采用口服、静脉注射、局部滴眼或涂眼、前房内注射、玻璃体腔内注射、或经植入物缓释给药；所述的保护剂可与一种或多种降眼压药物同时或依次给予，或与一种或多种视神经保护剂同时或依次给予。

本发明分别通过体外细胞培养实验和体内动物实验两个方面证实了所述的VPA对RGCs的保护作用；所述的VPA已经在临床上广泛应用近40年，对人体的安全性和药代动力学均已明确，无需临床验证，且能够迅速透过血脑屏障，且不易降解、无毒。本发明提供了VPA在青光眼视神经保护领域的新用途，所述的VPA可同时针对青光眼视神经病变的多个发病机制去保护视网膜神经节细胞，且效果好。本发明的VPA对RGCs的保护作用，将对青光眼临床治疗产生重要的应用价值和良好的社会经济效益，将造福于广大青光眼患者。

附图说明

图1是体外培养的原代RGC加入不同浓度VPA后第3、7天，RGC数量和轴突长度的定量分析，其中，A：加入不同浓度VPA后第3天RGC数量和轴突长度，B：加入不同浓度VPA后 第7天RGC数量和轴突长度。

图2是 Western blot 和Real-time PCR方法检测100 μM VPA加入体外培养的原代RGC后第3天，Bcl-2、survivin、catenin、HSP70和BAX的蛋白和mRNA表达。

图3是慢性高眼压大鼠玻璃体腔或腹腔VPA注射后，视网膜神经节细胞的存活，其中，A是荧光金逆行标记视网膜神经节细胞，B是各组间1、2、3、4周视网膜神经节细胞存活的定量分析。

图4是存活相关蛋白的表达；玻璃体腔注射VPA 3天后，Western检测存活相关的β-catenin、bcl-2和survivin的表达明显上调。

图5表明 VPA显著改善慢性高眼压视网膜微环境，其中，A：VPA提高慢性高眼压视网膜α-synuclein表达水平；B：在VPA作用下，BDNF的蛋白表达水平明显提高，GFAP和OX-42显著降低；C： Elisa方法检测VPA注射到正常或慢性高眼压大鼠玻璃体腔后，视网膜内炎症因子TNF-α的含量。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中所述的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1  VPA促进体外培养的成年SD大鼠视网膜神经节细胞的存活及其轴突生长

一、材料和方法

1、药物：丙戊酸钠（VPA），sigma公司产品。

2、动物：实验动物选用健康SD大鼠（由中国科学院上海实验动物中心提供），雄性，鼠龄8周，体重180～200g，饲养于本院动物中心。

3、主要材料及试剂：胎牛血清（Gibco公司产品），牛血清白蛋白（BSA， Sigma公司产品），Neurobasal培养基和B27（Gibco公司产品），木瓜蛋白酶和卵粘蛋白（Sigma公司产品），重组神经营养因子BDNF和 CNNF（Invitrogen公司产品），碱性成纤维生长因子bFGF（Invitrogen公司产品），谷氨酰胺（Sigma公司产品），OX-42单克隆抗体、 survivin单克隆抗体、Bcl－2单克隆抗体购自Chemicon公司，GFAP多克隆抗体购自Neomarker公司， catenin单克隆抗体购自R&D公司。

4、SD大鼠视网膜神经节细胞纯化培养

SD大鼠眼球常规处理，取视网膜放入盛有PBS的刻度离心管中，PBS洗3次，加入一倍体积的木瓜蛋白酶消化液 37℃消化30分钟后，加入含有卵粘蛋白（2mg/ml）、DNase（0.004%）和BSA（1mg/ml）的溶液，吹打成细胞悬液，离心800rpm/5min，细胞沉淀经卵粘蛋白（10mg/ml）和BSA（10mg/ml）溶液冲洗后再离心，加入磷酸缓冲的0.1% BSA制成细胞悬液；然后将细胞悬液加入到OX－41包被的培养瓶中，室温下放置30min，每隔10min轻轻摇动培养瓶，以确保所有的细胞均与培养瓶包被的部位接触；小心吸取未粘附在培养瓶中的细胞，加入到OX－7包被的离心管中，室温下孵育30min后，以3ml PBS轻轻冲洗离心管5次，再以Neurobasal培养基冲洗粘附细胞，800rpm/5min离心后，收集纯化的RGC细胞；以Neurobasal培养基重悬，按5000cells/孔(500个/cm2)接种到6孔细胞培养板中；RGC用含有谷氨酰胺（1mM），B27（1:50），BDNF（50ng/ml），CNTF（50ng/ml）的Neurobasal胞培养基、37℃、5%CO2培养箱中培养。

5、HDACi对体外培养的RGC细胞的作用

VPA浓度分别为: 1uM，10 uM，50uM，100uM，1mM，纯化的RGC于原代培养24小时后，在培养基中分别加入上述不同浓度的VPA，PBS作为阴性对照。于加入后24h、48h、72h、5d、7d倒置相差显微镜观察并记录RGC的形态、数量和轴突的数量、长度（每个视野选取5个细胞测量）；Westernblot和Real－time PCR方法检测RGCs中与细胞存活相关的基因Bcl-2、survivin的蛋白和mRNA表达。

结果显示：

1、VPA促进体外培养的RGCs存活及其轴突生长

如图1所示，当培养基中加入浓度为1μM或10μM的VPA时，实验组和空白对照组中节细胞数量和轴突长度未见显著差异（P>0.05）。当加入的浓度为50μM、100μM或1mM，节细胞存活数量显著增加，轴突生长速度快，长度增长，与加入TSA时相似。其中以浓度为100μM时效果最明显。第3天和第7天观察，当培养基中加入100μM VPA时节细胞数量分别为402±63（n＝24， P<0.01）和389±47（n＝24， P<0.01）；轴突平均长度（μm）为68.4±13.1（P<0.01）、114.6±23.5 （P<0.01）；平均轴突生长速率为18.6±5.2（P<0.01）。

2、VPA提高体外培养RGCs中与存活相关的蛋白Bcl-2和survivin表达

如图2所示，采用Western blot和real-time方法检测了培养基中加入VPA后24h、48h、72h和7d时RGCs中与存活相关的Bcl-2，survivin、catenin、hsp70和BAX的蛋白和mRNA表达，结果表明，VPA可以分别提高存活基因的蛋白和mRNA表达水平，降低促进凋亡的BAX基因和蛋白表达。

上述实验结果表明，一定浓度的VPA可以促进体外培养的RGCs存活，同时也能提高其轴突的延伸能力，其机制可能跟VPA直接上调与细胞存活相关的基因和蛋白表达有关，如Bcl-2、survivin、catenin。

实施例2  VPA对慢性高眼压SD大鼠视网膜神经节细胞的作用

一、材料和方法

1、药物：丙戊酸钠（VPA），sigma公司产品。

2、动物：实验动物选用健康SD大鼠（由中国科学院上海实验动物中心提供），雄性，鼠龄8周，体重180～200g，饲养于本院动物中心（光照12小时，黑暗12小时）。

3、主要材料及试剂

荧光金：Invitrogen公司产品。

OX-42单克隆抗体、 survivin单克隆抗体购自Chemicon公司，Bcl－2单克隆抗体、GFAP多克隆抗体购自Neomarker公司，α-synuclein和catenin单克隆抗体购自R&D公司。

TNF-α免疫酶联反应试剂盒（Elisa）为Invitrogen公司产品。

二、实验方法

1、SD大鼠慢性高眼压动物模型的制作及分组

大鼠建立模型前早晚各测眼压一次，连续测量1周。10％水合氯醛腹腔麻醉后将大鼠俯卧位固定于手术台上，0.4％倍诺喜眼液行眼表面麻醉，左眼为实验眼，右眼为对照眼。距上方角巩膜缘1-2mm处剪开球结膜，钝性分离筋膜，大鼠眼球颞侧和颞上各有一条浅层静脉，呈Y字型，走行较为笔直。轻轻将静脉分离并9-0无损伤缝线结扎。以近角巩膜缘段血管怒张，远角巩膜缘段血流消失，同时没有出血作为结扎成功的标志。对照眼只分离巩膜外静脉，不作结扎。术后以8-0无损伤医用缝线连续缝合结膜，双眼涂迪可罗眼膏，待大鼠苏醒后放回笼内。术后即刻、术后30 min，l h，12 h，l d，1 wk，2 wk，4 wk，8 wk分别测量各组眼压，测量时间分别为上午10点钟和下午4点钟。并观察术眼的局部表现。大鼠眼压用TONO-PEN测量，每只眼至少测得6个平均值（每个平均值是4次眼压读数的均数），当这些数值的可信区间≥95％时，即作为有效数据用于统计分析。

选取成功建模的60只大鼠随机分成4组：玻璃体腔注射VPA组，腹腔注射VPA组、玻璃体腔注射PBS组和腹腔注射生理盐水组（0.9%氯化钠），每组15只大鼠。

2、大鼠玻璃体腔注射

SD大鼠称重后麻醉用药和步骤同前。双眼滴美多丽以充分散瞳，倍诺喜滴眼作角膜表面麻醉。然后在角膜表面放置一直径约4-5mm的塑料圈，在圈内滴入适量的1％羧甲基纤维素钠模拟前置镜。然后在手术显微镜直视下自角巩膜缘外1mm处直接将微量加样器刺入玻璃体，针头在晶体下方的玻璃体腔内行进约2-3mm，尽量不触及晶体。选择视乳头颞侧2视乳头直径处的玻璃体腔位置推注2μl液体。然后缓慢退出显微加样器，在巩膜表面上留下针孔大小的自闭性隧道。术后用0.1%金霉素眼膏涂双眼，以防止感染和角膜干燥。观察大鼠呼吸情况至其苏醒。

3、给药剂量

VPA玻璃体腔给药的剂量：VPA用PBS稀释成终浓度为0.1mM的溶液，每只眼注射量为2ul，相当于生药量是0.34ug/眼，每周给药一次。对照组每只眼注射相同体积的PBS，每周一次。

VPA腹腔给药剂量：VPA用生理盐水稀释成终浓度为100g/L(10%)的溶液,每1ml含生药0.1g。按大鼠每100g体重300ul（30mg）腹腔注射给药，每日一次，相当于生药量300mg/kg.d；对照组：单位体重给予与VPA相同体积的生理盐水，每日一次。直至实验结束。

4、荧光金逆行标记大鼠RGC

分别取正常和慢性高眼压动物，麻醉方法同前。将大鼠固定在立体定位仪上，常规消毒、处理，暴露颅骨矢状缝和人字缝，30 %双氧水涂抹骨膜，辨认Bregma 点。根据Paxinos大鼠脑立体定位图谱，以Bregma 点为零点，后移6. 3 ±0. 2mm ，旁开1. 40 ±0. 2mm，深度3.50mm定位，分别用牙科电钻造2个直径约1mm 的骨孔。用10μL 微量注射器吸取荧光金（150mg/ml， 溶剂为二甲基酰胺 ），缓慢注入双侧上丘 ，每孔注射5μL，并留针10min 。分层缝合筋膜和皮肤。伤口处涂抹迪可罗眼膏。术毕继续喂养。

5、全视网膜铺片和RGCs 计数

大鼠麻醉和心脏灌注方法同前所述。取出眼球，剪去眼前节，去除玻璃体，放入4 %多聚甲醛后固定1h ，再移至0.01MPBS，眼科显微镜分离视网膜，在视网膜周边做4处垂直于视盘的切口，使其基本划分为四个大小相近的象限，将视网膜神经纤维层面朝上，平铺于载玻片上，75 %缓冲甘油封片，每个象限中从视网膜边缘至视乳头的平均距离 荧光显微镜下观察并拍照。在每个象限距视乳头约1/ 6 、1/ 2 、5/ 6处各随机选取视野，供12个视野，对每个视野中标记的RGCs 进行计数，求RGCs 密度的平均值 (个/mm² )。

6、ELISA方法检测各组视网膜中TNF-α含量，western blot方法检测各组视网膜BDNF、Bcl-2、survivin、catenin和α-synuclein表达，以及胶质细胞激活特异性标志物ox－42和GFAP的表达。

三 实验结果显示

1、如图3所示，玻璃体腔或腹腔内注射VPA对慢性高眼压视网膜神经节细胞具有显著的保护作用；玻璃体腔与腹腔内注射VPA对慢性高眼压视网膜神经节细胞的保护作用未见明显差别，但玻璃体腔给药的剂量要比腹腔给药剂量小；与PBS注射组相比，应用VPA后大鼠视网膜铺片上呈现完整的圆形或卵圆形绿色荧光的细胞数量增多，不规则形态的荧光碎片较少，轴突轮廓相对完整，数量增加，以第3周时差别最为显著（p＜0.01）。

2、VPA上调RGCs中与存活相关基因Bcl-2、survivin和catenin的表达。结果如图3所示，玻璃体腔或腹腔注射VPA后，与视网膜神经节细胞存活相关的蛋白bcl-2、survivin和catenin的表达明显上调，分别是对照组的1.7、2.4和3.8倍。

3、VPA显著改善慢性高眼压视网膜微环境，有利于视网膜神经节细胞存活。

如图5所示，玻璃体腔或腹腔注射VPA后，视网膜α-synuclein蛋白的表达上调，该蛋白表达提高可以降低谷氨酸兴奋性毒性，缓解对视网膜神经节细胞的损伤（如图5A所示）；其次，较对照组相比， VPA组胶质细胞激活的标志物OX－-42和GFAP表达降低，提示VPA可抑制慢性高眼压视网膜胶质细胞的过渡激活；Westernblot检测VPA后视网膜BDNF表达也发生显著升高；此外，因炎症因子TNF-α在慢性高眼压神经节细胞损伤中起重要作用。进一步研究VPA对视网膜TNF-α表达的影响，探讨VPA是否也能从这一角度发挥保护节细胞的作用，结果表明，TNF-α在正常视网膜内平均含量为30.4±5.7 ng/mg蛋白，高眼压时显著升高，约为正常的16倍。VPA对正常视网膜TNF-α表达没有显著影响（p＞ 0.05）（如图5C所示），但可显著降低高眼压视网膜中TNF-α含量。

上述实验结果表明，慢性高眼压时，VPA可以通过上调RGCs中存活基因Bcl-2、survivin、catenin和hsp70的表达，降低促凋亡基因BAX的表达，促进RGCs存活；同时，VPA还可通过改善慢性高眼压时视网膜微环境来减轻RGCs的损伤，包括：VPA提高α-synuclein的表达，降低视网膜谷氨酸兴奋性毒性；VPA降低慢性高眼压视网膜炎症因子TNF-α的释放，提高营养BDNF的表达；抑制视网膜胶质细胞过渡激活，从而保护RGCs。

Claims (9)

1.丙戊酸钠在制备治疗或改善青光眼视神经病变的药物中的用途；所述的丙戊酸钠具有式（Ⅰ）的结构，

 （Ⅰ）              。

2.丙戊酸钠在制备促进视网膜神经节细胞轴突延伸的药物中的用途。

3.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物是抑制青光眼视神经病变过程中神经胶质细胞过渡激活的药物。

4.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物是降低视网膜谷氨酸兴奋性毒性的药物。

5.一种青光眼视网膜、视神经保护剂，其特征在于，所述的保护剂由安全有效量的权利要求1的丙戊酸钠为药物活性成分和药剂学上必要的辅料组成。

6.按权利要求5所述的青光眼视网膜、视神经保护剂，其特征在于，所述的保护剂的剂型为普通片剂、肠溶片、缓释片、糖浆、喷淋胶囊、针剂、凝胶、软膏、溶液或混悬液。

7.按权利要求5或6所述的青光眼视网膜、视神经保护剂，其特征在于，所述的保护剂采用口服、静脉注射、局部滴眼或涂眼、前房内注射、玻璃体腔内注射或经植入物缓释给药途径给药。

8.按权利要求5或6所述的青光眼视网膜、视神经保护剂，其特征在于，所述的保护剂与一种或多种降眼压药物同时或依次给药。

9.按权利要求5或6所述的青光眼视网膜、视神经保护剂，其特征在于，所述的保护剂与一种或多种视神经保护剂同时或依次给药。

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