CN102216779A - 免疫缀合物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备分子缀合物的方法，所述分子缀合物包含肿瘤性疾病中出现的免疫球蛋白和生物标志，特征在于高水平的可再现性(reproducibility)。
Description
描述
本发明描述了合成分子种类(molecular species)的方法即合成缀合物的方法，和优化所述缀合物的反应性的方法，以及其在有关肿瘤诊断方法中的用途。目前肿瘤是继心血管疾病之后导致死亡的第二大因素，且其在世界范围内的发病率逐年增加。尽管在世界不同地区每种特定类型的癌症的分布和发病率非常不同，但是所述发病率在工业化国家显示出非常相似的趋势。在这些国家中，肺和前列腺的肿瘤性疾病在男性群体中报道的癌症病例中占很大部分。在女性群体中，大部分报道的癌症病例是乳腺癌，而肺癌的发病率也在增加中。除了这些性别特异性肿瘤之外，肠道癌和胰腺癌的发病率也在持续增加中，事实上其在过去的50年里已翻番。这些考虑因素显然滋生了对能够发出高器官特异性致瘤性转化信号的特异性标志的寻求的重要性。肿瘤的存在通常会产生特定的分子标志，这是由于经过致瘤性转化的那些细胞中代谢的变化。已知为肿瘤生物标志或者肿瘤相关抗原的这些物质的存在可以应用组织学方法来检测，或者从临床来看更便利地通过对生物体液如血清或者血浆进行分析来检测。然而，在一些情况中，正常生物标志谱的变更也许不是肿瘤性疾病存在的有效指标。这是由于这些变更也许是生活方式、非肿瘤性疾病的结果或者是医原性的(Gion，M.in：″Guida alFutilizzo dei biomarcatori in oncologia″Biomedia Source Books edition，Milan 2002，ITALY)。从诊断角度看，这是健康个体群体内假阳性结果的来源。
本申请人拥有关于癌症诊断的高特异性方法的专利申请，其中生物标志的鉴别在健康对象中不更给出病理状况的指征。更详细地来说：本申请人设计出能在生物标志的存在与对象病理状况之间达到更好的相关性的测试。这些测试从实验证据中开发出来，即在患有肿瘤性疾病的患者血清中，除了存在游离的生物标志(即未与其它辅因子缀合的生物标志)之外，还可以检测到含有其它生物标志的种类。所述种类是所述生物标志与免疫球蛋白即M类免疫球蛋白或者IgM的复合物。因此，已经构思出基于对循环免疫复合物的鉴别的方法，所述循环免疫复合物通过肿瘤标志与特异于其的自身抗体结合而形成，后文称作特异性CIC。这种方法在癌症诊断中极其有用，因为其使得可以将健康对象与患有癌症患者群区别开，且相对于基于游离肿瘤抗原检测的测试而言具有更高的选择性。自身抗体是由免疫系统天然产生的抗体并针对识别为非自身的抗原，即使其是由该生物体正常表达的分子之一。这些自身种类的免疫原性的通常解释涉及到与正常组织相比其在经肿瘤性转化的组织中的异常的高表达(超表达)(Sahin U.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，11810-13)。由于上述原因，对游离肿瘤抗原的分析可具有很差的诊断价值，特别是在需要高特异性时。然而，这些考虑因素不适用于免疫复合物分析，其使得可以以增强的特异性区别健康对象与癌症患者。IC形成对于确定血清或者血浆中游离肿瘤相关抗原的作用是双重的：(i)当所述抗原涉及到CIC中时，其可被掩蔽并因此用正常免疫测定(immunometric)法检测不到，这种状况可以解释假阴性结果的产生。另一方面，从正常细胞中释放的低水平的抗原不能形成稳定且持续的IC。在后者的情况中，游离抗原可被检测而导致假阳性结果。假实验结果的这两个来源均可以被消除，显示出特异性CIC，如下文本发明的一个实施方案中所述。
本发明人设计的诊断方法使得可以通过特异性试剂简便地确定肿瘤相关生物标志。
对于已知其抗原性生物标志的大量肿瘤性疾病进行的研究工作使得可以检测由所述抗原性生物标志与特异于其的自身抗体形成的免疫复合物。所述特异性复合物的检测可用于指定肿瘤的诊断。所述癌症诊断方法是基于在生物液体中对特异性CIC的检测，这是通过将得自对象的样品与针对肿瘤相关抗原的特异性试剂(SR)接触并温育而进行。所述方法包括检测SR-CIC复合物，其中所述复合物的存在表示癌症的存在。经考虑的SR包含多克隆和/或单克隆抗体或者其片段，以用于通过免疫测定方法来揭示出涉及特异性CIC形成并存在于肿瘤性疾病患者血液中的肿瘤标志的存在。用于评价生物液体中CIC含量的所述免疫测定方法的非限制性实例包括：直接、间接或者“夹心”ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射计量测定(RIA)或者“夹心”放射计量测定(IRMA)，或者采用不同技术如“快速近红外光谱”的同类免疫测定法。
在生物液体中检测特异性CIC的免疫酶方法的典型实例包括：
1]将针对游离或者缀合形式的肿瘤标志的特异性试剂(SR)固定在塑料微滴定平板上用于ELISA测定，或者固定在用于诊断目的的颗粒上；
2]将得自患者的生物液体与固定的化合物一起温育；
3]洗涤由固定的化合物与IC形成的复合物；
4]将所述复合物与针对人源的抗体的多克隆或单克隆抗体一起温育，所述抗体与可追踪的标志如酶、生色化合物、荧光化合物、放射性化合物、化学发光化合物、辅酶、或者酶抑制剂缀合；
5]通过合适的洗涤步骤除去过量的抗体；
6]通过合适的试剂检测吸附的抗体。
如本文所用，生物液体是指：通过常规方法以足以进行测定的量得自患者的血清、血浆、淋巴液、腹水、胸膜渗液体(pleuric exudates)、脊髓液等。这些技术在文献中有描述且为本领域技术人员所熟知。
迄今为止已知一些免疫测定方法在性质上相关联。这些方法不能绝对地确定感兴趣分析物的浓度，但是可以将与所述浓度成比例的信号与通过使用已知浓度的一或多种样品作为校准物(calibrator)获得的相似信号进行对比。定量分析的免疫测定方法不能没有校准方法。在临床实践及在诊断过程中，感兴趣的分析物是这样的化合物，其浓度或者其变化与病理状况的发生或者进展相关。在这些化合物中，存在与肿瘤性疾病的发展相关的种类，称作肿瘤标志或者肿瘤相关抗原。所述化合物的标准制备需要将其从天然来源以及其中从得自肿瘤性疾病患者的生物材料中分离；或者，这些种类可以采用重组DNA技术获得。在第一种情况中，所述校准物的制备需要操作和处理人源材料，其在有效的工业方法的实施中具有严重的供应限制和安全性问题。在第二种情况中，重组产物的可利用性解决了任何供应和安全性的问题，然而，重组蛋白质的表达仅对于经充分确定成分和已知序列的分子种类是可行的。然而，与肿瘤性疾病诊断相关的分析物如前述生物标志-自身抗体免疫复合物在本质上是异质的(heterogeneous)，对于其而言作为重组产物表达是不可行的。在现阶段，用于这些化合物定量分析的校准物的产生只可能通过从人源样品提取。引入合成的或者半合成方法获得分子种类以代替通过人源样品提取获得的所述校准物将简化生产过程，增加其安全性标准，同时降低成本并保证更好的批次与批次间的再现性。本发明第一个目的是合成分子种类的方法，所述分子种类在后文称作缀合物，展示出生物标志-IgM免疫复合物的反应性。本发明的方法克服了为获得在癌症检测诊断试剂盒中用作校准物的生物标志-IgM免疫复合物的所有问题。
在表1中，我们报道了所述新方法中感兴趣的生物标志和瘤形成的非限制性实例。
表1
本发明的一个实施方案是可用于以明确或者隐含形式确定至少两种不同生物分子、其官能化(functionalized)或者非官能化(unfunctionalized)的片段、其官能化或者非官能化的序列(后文称作非附属(non accessory)成分)之间作为参数函数的浓度比或者质量比的方法，所述分子、其片段、或其序列在作为交联剂或者支架的至少第三分子或生物分子(后文称作附属(accessory)成分)存在或者不存在时被牵涉到单一的多分散或者单分散分子构建体中，所述构建体后文称作缀合物，通式为AaBbCc…Zz，被赋予了可再现地维持和展示其分别考虑的各成分的部分或者全部化学和免疫化学反应性的性质。所述缀合物被赋予这样的性质，即当通过免疫测定方法联合测定每个有序的n-重(n-uple)或有序对的非附属成分的反应性时，可再现地展示所述反应性，而不缺乏一般性。所述生物缀合物的制备方法包括：
1]如果需要，称作非附属成分的种类的官能化；
2]如果需要，称作附属成分的种类的官能化；
3]应用组合的方法学来鉴别最佳反应条件；
4]在步骤3]中鉴别的条件下合成所述缀合物。
-步骤1需要使用合适的试剂用以引入在起始生物分子的结构中不存在或者不足够的基团。如本文所用，“非附属成分”是指通过采用文献中报道的方法在其中引入了希望的官能团的种类。如本文所用，“官能团”是指在起始生物分子的结构中不存在或者不足够的任何分子部分。这些基团的非限制性实例如下：硫醇，吡啶基二硫化物，叠氮化物，炔烃，烯烃，二烯，生物素，酰肼联氨(hydrazides hydrazine)，醛酮，苯酰甲基卤化物和拟卤化物，伯烷基卤化物和拟卤化物、仲烷基卤化物和拟卤化物，叔烷基卤化物和拟卤化物，芳基、苄基、烯丙基、卤化物和拟卤化物，马来酰亚胺，(His)x序列。条件和方法在文献中有描述且为本领域技术人员所熟知。如本文所用，“官能化的非附属成分”也是指包含至少如下基团之一的生物分子、其片段和序列：硫醇基、胺基、羧基、羟基、咪唑基、苯氧基胍基、苯基。
-步骤2需要使用合适的试剂用以引入在起始生物分子结构中不存在或者不足够的基团。如本文所用，“官能化的附属成分”是指氨基酸聚合物或者其它聚合的种类，其中通过采用文献中报道的方法引入了官能团。如本文所用，“官能团”是指在起始生物分子结构中不存在或者不足够的任何分子部分。这些基团的非限制性实例如下：硫醇，吡啶基二硫化物，叠氮化物，炔烃，烯烃，二烯，生物素，酰肼联氨，醛酮，苯酰甲基卤化物和拟卤化物，伯烷基卤化物和拟卤化物，仲烷基卤化物和拟卤化物，叔烷基卤化物和拟卤化物，芳基、苄基、烯丙基卤化物和拟卤化物，马来酰亚胺、(His)x序列。此外，如本文所用，“附属成分”包含同双官能交联剂。同双官能交联剂的非限制性实例如下：二羧酸的活性酯，如：辛二酸双N-羟基琥珀酰亚胺酯，癸二酸双N-羟基琥珀酰亚胺酯，3，3′-二硫代二丙酸戊二醛，1，4-双[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]丁烷，4，4′-二异硫氰酸酯茋-2，2′二磺酸二钠盐水合物，己二酸二酰肼，双[2-(4-叠氮基水杨酰基氨基)乙基]二硫化物，双[2-(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基氧基)乙基]砜，二甲基3，3′-二硫代丙酸酰亚胺二盐酸盐(3，3′-dithioproprionimidate dihydrochloride)，二甲基庚二亚胺二盐酸盐，乙二醇-双(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)，双(聚乙二醇双[咪唑基羰基])。
如本文所用，“附属成分”也是指异双官能交联剂。异双官能交联剂的非限制性实例如下：官能化羧酸的活性酯，如下列酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯：3-(2-吡啶基二硫代)丙酸，3-马来酰亚氨基苯甲酸，4-(4-马来酰亚氨基苯基)丁酸，4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸，4-马来酰亚氨基丁酸，5-叠氮-2-硝基苯甲酸，6-(4-叠氮-2-硝基苯基氨基)己酸，6-马来酰亚氨基己酸，溴乙酸，碘乙酸，马来酰亚氨基乙酸，S-乙酰硫代乙醇酸，马来酰亚氨基乙基琥珀酸。其它双官能化合物如4-(N-马来酰亚氨基)二苯酮，4-叠氮苯甲酰甲基溴，N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺，N-((2-吡啶基二硫代)乙基)-4-叠氮水杨基酰胺。如本文所用，“附属成分”也是指蛋白质，如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、凝集素、以及其它蛋白质，所述其它蛋白质被赋予了选择性识别在非附属成分结构中天然存在或者人工引入的那些基团的性质。
-步骤3包括：
1)使用非附属成分及附属成分的溶液和缓冲溶液的一系列混合操作。所述混合操作在一或多个反应容器中进行，在后者的情况中，所述反应容器便利地但非必须地按有序的阵列排列。如果需要，所述混合操作后进行一或多个纯化步骤。
2)一或多个免疫测定过程，目的在于评价缀合物合成中使用的每个有序对的非附属成分的反应性。
关于步骤1)，我们认为，作为非限制性实例，指定体积的Q个反应容器便利地排列成有序的m行和n列的阵列(Q＝m×n)，便利地但非必须地由惰性材料的单一对象构成。在典型的实施例中，每个反应室装载了已知浓度A0的蛋白质种类A。所述种类可以是附属或者非附属成分。该过程需要一系列t(t＝1，2，3，……，k)循环，其包括在合适的缓冲液中输送和混合合适的缓冲液或者蛋白质溶液。循环t＝1需要非必须以此顺序进行的如下操作。
a)根据反应阵列的垂直方向系列稀释蛋白质B。所述系列稀释根据由2j1(j1＝0，1，2，……k，其中k＜n-1)所规定的比率从浓度B0开始进行。
b)根据反应容器的水平方向进行种类C的稀释。所述种类C可以是附属或者非附属成分。所述稀释根据比率2i1+hi1(i1＝0，1，2，……k，其中k＜m-1，并方便地选择hi1以使|hi1|＜2i1)进行。种类C的起始浓度为C0。
对于循环t＝2，对应非必须以此顺序进行的如下操作：
a)根据反应阵列的垂直方向系列稀释蛋白质D。所述系列稀释根据2j2(j2＝0，1，2，……k，其中k＜n-1)所规定的比率从浓度D0开始进行。
b)根据反应容器的水平方向进行种类E的稀释。所述种类E可以是附属或者非附属成分。所述稀释根据比率2i2+hi2(i2＝0，1，2，……k，其中k＜m-1，及适当选择hi2，由此|hi2|＜2i2)进行。种类E的起始浓度为E0。
持续进行该过程，直至完成输送所有蛋白质溶液和缓冲液所必需的所有t循环。在该过程结束时，在每个反应室qij中所有考虑的种类的浓度如下：[δA0，δB0*2-j1，δC0*(2i1+hi1)-1，δD0*2-j2，δE0*(2i2+hi2)-1，……]，δ是稀释倍数。
在该过程结束时，使用免疫测定方法测定每个反应室的内容物的反应性。
关于第2)点，最佳条件的选择需要：
a)将针对所述缀合物中包含的非附属成分之一的单克隆或多克隆抗体或者其Fab或F(ab′)2片段固定在塑料微滴定平板上用于ELISA确定。
b)将含有感兴趣的缀合物的样品与固定的抗体或者其片段一起温育。
c)洗涤在所述缀合物与固定的抗体或其片段之间形成的复合物。
d)借助于对非附属成分之一是选择性或特异性的试剂来检测抗体-缀合物复合物的存在，所述非附属成分之一与涉及所述缀合物与固定的抗体或其片段之间的相互作用的不同。鉴别含有具有希望的反应性的缀合物的反应室，以及鉴别相应于含有展示希望的反应性的缀合物的那些qij反应室的反应参数t、jt、it、hitδ、A0、B0、…，Z0。
所有这些方法均为本领域技术人员已知。
-步骤4需要合成在第3阶段期间鉴别的所述缀合物。
制备所述缀合物的优选方法包括：
1]通过对统称为非附属成分的种类的生物素酰化而进行官能化。
2]使用抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或者中性抗生物素蛋白作为附属成分。
3]应用组合方法学以确定获得具有希望的反应性的缀合物的最佳反应条件。
4]根据在所述组合筛选中鉴别的条件合成所述缀合物。
本发明将通过一些非限制性实施例进行描述。
实施例1：显示IgM和SCCA反应性的缀合物
使用生物素酰氨基己酰基-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma-Aldrich B3295-50MG)将SCCA和IgM生物素化，并用PBS将其充分透析。所述生物素化过程中使用的化学和条件为本领域技术人员所熟知。将用于ELISA确定的微滴定平板(Greiner，Medium binding STRIP PLATE)用脱脂奶粉在PBS中的5％溶液(PBS-M)(300μl/孔)处理。在4℃温育12小时后，将平板用含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤。将每个孔均装载如下附属和非附属成分：
a)抗生物素蛋白(Applichem)0-20μg于PBS中；
b)生物素化的IgM，2.5-40μg，优选10μg，生物素化的SCCA，浓度在20-0.05μg/ml的范围。
使平板处于室温1小时。在温育时间之后，测试每个孔的内容物以评估由于缀合物所致的反应性。将ELISA微滴定平板(Greiner 762071，High binding STRIP PLATE)用100μl/孔的多克隆兔抗-SCCA抗体(Xeptagen)以10μg/ml的终浓度处理，并在湿润的室中于4℃温育12小时。将该平板用300μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)(Sigma-Aldrich P-1379)洗涤3次，每个孔中填充300μl含有3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503-1KG)的PBS，并在湿润密闭室中于室温温育2小时。将该平板用PBS-T(300μl/孔)洗涤3次，每个孔中载入100μl的缀合物溶液，并将该平板在室温温育1小时。然后将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，并在每个孔中载入100μl稀释1000倍的抗人IgM-HRP缀合抗体(Sigma-Aldrich A0420-1ML)，将该平板温育1小时。将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，在每个孔中载入150μl的在含有5mM过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的0.2mg/ml的ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-硫磺酸)]。将该平板在37±2℃温育20分钟，用合适的微滴定平板读数器在405nm测量光密度。对应于最大反应性的制备物的条件被用于所述缀合物的预备规模的合成。
实施例2：展示CEA-IgM免疫复合物反应性的缀合物
使用生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma-Aldrich B3295-50MG)对CEA和IgM进行生物素化，并用PBS充分透析。所述生物素化过程中使用的化学和条件为本领域技术人员所熟知。将用于ELISA的微滴定平板(Greiner，Medium binding STRIP PLATE)用脱脂奶粉在PBS中的5％溶液(PBS-M)(300μl/孔)处理。12小时后，将平板用含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤。每个孔均装载如下附属和非附属成分。
a)生物素化的IgM，2.5-40μg，优选10μg，溶解于PBS缓冲液中，
b)生物素化的人CEA，浓度为在PBS中20-0.05μg/ml的范围，在PBS中的0-20μg/孔的抗生物素蛋白(Applichem)。
使平板处于室温1小时。在温育时间之后，测试每个孔的内容物以评估由于所述缀合物所致的反应性。将ELISA微滴定平板(Greiner 762071，High binding STRIP PLATE)用100μl/孔的多克隆兔抗-CEA抗体(Dako A0115)以10μg/ml的终浓度处理，并在湿润室中于4℃温育12小时。将该平板用300μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)(Sigma-Aldrich P-1379)洗涤3次，每个孔中装载300μl含有3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503-1KG)的PBS，并在湿润密闭室中于室温温育2小时。将该平板用PBS-T(300μl/孔)洗涤3次，每个孔中载入100μl缀合物溶液，并将该平板在室温温育1小时。然后将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，并在每个孔中载入100μl的稀释1000倍的10μl/ml抗人IgM-HRP缀合抗体(Sigma-Aldrich A0420-1ML)，将该平板温育1小时。将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，在每个孔中载入150μl的在含有5mM过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的0.2mg/ml的ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-硫磺酸)]。将该平板在37±2℃温育20分钟，用合适的微滴定平板读数器在405nm测量光密度。对应于最大反应性的制备物的条件被用于所述缀合物的预备规模的合成。
实施例3：展示有序对的蛋白质(SCCA-IgM)(CEA-IgM)，(SCCA-CEA)的反应性的缀合物
使用生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma-Aldrich B3295-50MG)将CEA、SCCA和IgM进行生物素化，并用PBS充分透析。所述生物素化过程中使用的化学和条件为本领域技术人员所熟知。将用于ELISA的微滴定平板(Greiner，Medium binding STRIP PLATE)用脱脂奶粉在PBS中的5％溶液(PBS-M)(300μl/孔)处理。12小时后，将平板用含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤。每个孔均装载如下附属和非附属成分：
a)抗生物素蛋白(Applichem)0-20μg于PBS中，
b)生物素化的IgM，2.5-40μg，优选10μg；生物素化的SCCA，浓度为20-0.05μg/ml的范围；生物素酰化的CEA，浓度为在PBS中20-0.05μg/ml的范围。使平板处于室温1小时。在温育时间之后，测试每个孔的内容物以评估由于所述缀合物所致的反应性。
筛选有序对CEA-IgM的反应性
将ELISA微滴定平板(Greiner 762071，High binding STRIP PLATE)用100μl/孔的多克隆兔抗-CEA抗体(Dako A0115)以10μg/ml的终浓度处理，并在湿润室中于4℃温育12小时。将该平板用300μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)(Sigma-Aldrich P-1379)洗涤3次，每个孔中装载300μl含有3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503-1KG)的PBS，并在湿润密闭室中于室温温育2小时。
将该平板用PBS-T(300μl/孔)洗涤3次，每个孔中载入100μl缀合物溶液，并将该平板在室温温育1小时。然后将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，并在每个孔中载入100μl稀释1000倍的抗人IgM-HRP缀合抗体(Sigma-Aldrich A0420-1ML)，将该平板温育1小时。将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，在每个孔中载入150μl的在含有5mM过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的0.2mg/ml的ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-硫磺酸)]。将该平板在37±2℃温育20分钟，用合适的微滴定平板读数器在405nm测量光密度。
筛选有序对SCCA-IgM的反应性
将第二个ELISA微滴定平板(Greiner 762071，High binding STRIP PLATE)用100μl/孔的多克隆兔抗-SCCA抗体(Xeptagen)以10μg/ml的终浓度处理，并在湿润室中在4℃温育12小时。将该平板用300μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)(Sigma-Aldrich P-1379)洗涤3次，每个孔中装载300μl含有3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503-1KG)的PBS，并在湿润密闭室中于室温温育2小时。将该平板用PBS-T(300μl/孔)洗涤3次，每个孔中加入100μl缀合物溶液，并将该平板在室温温育1小时。然后将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，并在每个孔中载入100μl稀释1000倍的抗人IgM-HRP缀合抗体(Sigma-Aldrich A0420-1ML)，将该平板温育1小时。将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，在每个孔中载入150μl的在含有5mM过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的0.2mg/ml的ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-硫磺酸)]。将该平板在37±2℃温育20分钟，用合适的微滴定平板读数器在405nm测量光密度。
筛选有序对SCCA-CEA的反应性
将第三个ELISA微滴定平板(Greiner 762071，High binding STRIP PLATE)用100μl/孔的单克隆小鼠抗-SCCA抗体(Xeptagen)以10μg/ml终浓度为处理，并在湿润室中在4℃温育12小时。将该平板用300μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)(Sigma-Aldrich P-1379)洗涤3次，每个孔中装载300μl含有3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503-1KG)的PBS，并在湿润密闭室中于室温温育2小时。将该平板用PBS-T(300μl/孔)洗涤3次，每个孔中加入100μl缀合物溶液，并将该平板在室温温育1小时。然后将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，并在每个孔中载入100μl的在含有1％BSA的PBS-T中的2μg/ml多克隆兔抗CEA抗体(Dako A0115)，将该平板温育1小时。将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，在每个孔中加入100μl山羊抗兔IgG-HRP缀合抗体(KPL 474-1506)溶液，将该平板温育1小时。将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，在每个孔中加入150μl的在含有5mM过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的0.2mg/ml的ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-硫磺酸)]。将该平板在37±2℃温育20分钟，用合适的微滴定平板读数器在405nm测量光密度。
实施例4：展示AFP-IgM免疫复合物反应性的缀合物
使用生物素酰氨基己酰-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma-Aldrich B3295-50MG)对AFP和IgM进行生物素化，并用PBS充分透析。所述生物素化过程中使用的化学和条件为本领域技术人员所熟知。将用于ELISA的微滴定平板(Greiner，Medium binding STRIP PLATE)用脱脂奶粉在PBS中的5％溶液(PBS-M)(300μl/孔)处理。12小时后，将平板用含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)洗涤。每个孔均装载如下附属和非附属成分
a)抗生物素蛋白(Applichem)0-20μg于PBS中，
b)生物素化的IgM，2.5-40μg，优选10μg；生物素化的AFP，浓度为20-0.05μg/ml的范围。使平板处于室温1小时。在温育时间之后，检测每个孔的内容物以评估由于所述缀合物所致的反应性。将ELISA微滴定平板(Greiner 762071，High binding STRIP PLATE)用100μl/孔的多克隆兔抗-AFP抗体(Dako A008)以10μg/ml的终浓度处理，并在湿润室中于4℃温育12小时。将该平板用300μl/孔含有0.05％Tween 20的PBS(PBS-T)(Sigma-Aldrich P-1379)洗涤3次，每个孔中装载300μl含有3％牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich A4503-1KG)的PBS，并在湿润密闭室中在室温温育2小时。将该平板用PBS-T(300μl/孔)洗涤3次，每个孔中加入100μl缀合物溶液，并将该平板在室温温育1小时。然后将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，并在每个孔中载入100μl稀释1000倍的抗人IgM-HRP缀合抗体溶液(Sigma-Aldrich A0420-1ML)，将该平板温育1小时。将该平板用PBS-T缓冲液(6x300μl/孔)洗涤，在每个孔中载入150μl的在含有5mM过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的0.2mg/ml的ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-硫磺酸)]。将该平板在37±2℃温育20分钟，用合适的微滴定平板读数器在405nm测量光密度。对应于最大反应性的制备物的条件被用于所述缀合物制备规模的合成。
实施例5：使用本发明的对象作为校准物对肝细胞癌(HCC)血清中含有蛋白质SCCA1和/或其变体的特异性ICC及特异于其的自身抗体进行定量确定
将用于ELISA的微滴定平板(Greiner 762071，High binding STRIP PLATE)用100μl在PBS缓冲液中的兔多克隆抗-SCCA抗体(Xeptagen)的溶液于4℃处理12小时。将该平板用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤。在每个孔中加入300μl在PBS中的1％牛血清白蛋白溶液(BSA，Sigma-Aldrich，A-4503)(PBS-1％BSA)。在室温温育2小时后，将平板用PBS-T洗涤6次，并填充100μl不同稀释度的人血清。在相同平板中，使用一系列孔构建用于特异性CIC SCCA-IgM的校准曲线，使用根据实施例1制备的校准物。所跨越的浓度范围为1000-15任意单位/毫升(AU/ml)之间。将该平板在室温温育1小时。用PBS-T溶液洗涤平板6次，加入100μl稀释1000倍的与辣根过氧化物酶缀合的抗人免疫球蛋白的多克隆抗体溶液，在室温温育1小时。在温育时间结束时，将平板用PBS-T溶液洗涤6次，并加入200μl的在含有5mM过氧化氢的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 5.0中的0.2mg/ml生色底物ABTS[2，2′-连氮基-双(3-乙基苯噻唑啉-6-硫磺酸)]的溶液。在37℃不同温育时间(20-30分钟)之后，使用合适的平板读数器(Biorad)读取在405nm的吸光度。样品中SCCA-IgM的浓度通过在标准曲线上对吸光度值进行插值而确定。根据前述方法对来自HCC患者血清的分析证实特异性CIC的存在，而得自健康对象的对照血清结果是阴性的(100％特异性)。因此，参照上文的论述和附表，提出如下权利要求。
Claims (14)
1.一种合成分子种类或者缀合物的方法，所述分子种类或者缀合物被赋予这样的能力，即使得可以明确或者隐含地确定至少两种经方便地官能化的不同分子或者生物分子、其片段或者序列之间的，或者非附属成分之间的浓度比或者质量比；在存在或者不存在作为交联剂、支架或者附属成分的第三分子或者生物分子的情况下被包括到通式AaBbCc.....Zz的单分散性或者多分散性分子对象或者缀合物之中，所述方法被赋予如下性质：(i)据其获得的产物以可再现的方式展示其非附属或者附属成分的部分或者全部免疫反应性；(ii)当联合测试所述反应性时，所述方法使得可再现地优化任何有序的n-重非附属成分的所述反应性，而不依赖于该成分的固有反应性。
2.权利要求1的方法，特征在于将所述浓度或质量比明确或者隐含地定义为一组参数。
3.权利要求1、2的方法，特征在于，至少一种被考虑的非附属成分属于人免疫球蛋白类别，如IgG、IgA、IgE、IgM、IgD，优选IgM，及其片段或者序列。
4.权利要求1、2的方法，特征在于，至少一种被考虑的非附属成分属于与用于病理状况的发生或者进展的选择性或者特异性标志相关的生物分子类别。
5.权利要求4的方法，特征在于所述生物分子是肿瘤标志。
6.权利要求4或5的方法，特征在于，所述生物分子不包含在周转(turnover)条件下能与蛋白质或者非蛋白质属性试剂反应的那些蛋白质，所述试剂自身释放或者通过与其它种类相互作用而释放生色物质、荧光物质、化学发光物质，而所述生物分子可包含肿瘤标志相关的酶或者含有所述酶的复合物。
7.权利要求1、3、4、5的方法，特征在于至少一种附属成分被赋予呈现天然存在或者人工引入的化学反应性的性质，其与由于在称作非附属成分的分子中天然存在的或者人工引入的基团的那种反应性互补。
8.与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于其使用通过一或多项上述权利要求的方法所获得的缀合物。
9.权利要求8的免疫测定方法，特征在于其是免疫酶学方法。
10.权利要求9所述的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于所述免疫酶学方法是ELISA测定。
11.权利要求10的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于所述ELISA测定被用于确定与肿瘤性疾病的诊断相关的种类的浓度或者与之相关的其它性质。
12.权利要求11的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于所述种类是免疫复合物生物标志-自身抗体。
13.权利要求12的免疫测定方法，特征在于所述自身抗体是IgM。
14.权利要求13的与诊断过程相关的免疫测定方法，特征在于其结合一或多种如下的用于各自肿瘤性疾病的标志：
-用于星形细胞瘤的Ki-67；
-用于膀胱癌的纤连蛋白、肝细胞瘤正调节蛋白(HURP)、粘蛋白7(MUC7)、NMP22、NMP22、前列腺干细胞抗原(PSCA)、端粒酶、组织多肽抗原(TPA)；
-用于乳腺癌的CA 15-3、CA 27.29、AFP、CEA、CA 15-3、血浆铜蓝蛋白、TPA、CEA、细胞角蛋白19(CK19)、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物(Maspin)、c-Met细胞色素P450 3A4、上皮糖蛋白2(EGP2)、细胞角蛋白19(Ck 19)、ErbB-2 Her2/Neu MMP-9；
-用于乳腺癌和卵巢癌的人激肽释放酶5(hK5)；
-用于子宫颈鳞状上皮癌的NMP 179；
-用于结肠直肠癌的CEA、细胞角蛋白19(CK1 9)、细胞角蛋白20(CK20)、细胞角蛋白、细胞角蛋白20(CK20)、CEA、鸟苷酸环化酶C(GCC)、Her2/Neu、MUC6、MUC5AC、ReIA、NF-kb；
-用于B细胞淋巴瘤的Bcl-6、CD 10；
-用于子宫内膜癌的CEA；
-用于胃癌的半胱氨酸富集成纤维细胞生长因子受体1(CFR-1)m p27、MIB-I；
-用于胃肠道癌的嗜铬粒蛋白A(CgA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、突触囊泡蛋白(synaptophysin)、Leu-7、βIII-微管蛋白；
-用于头颈癌的细胞角蛋白、上皮膜抗原(EMA)、透明质酸酶(HYAL1)、潜伏膜蛋白1(LMP-1)；
-用于肝细胞癌的α-胎蛋白(AFP)、脱-γ-羧基凝血酶原(DCP)；
-用于肝细胞癌的细胞视黄醇结合蛋白1(CRBP1)、Glypcan-3、端粒酶；
-用于白血病和多发性骨髓瘤的黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)；
-用于肺癌的CEA、嗜铬粒蛋白A、NSE、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)；
-用于肺癌的表皮生长因子受体(EGFR)、M2-PK、CYFRA 21-1、NSE、SCC；
-用于黑色素瘤的神经元特异性烯醇酶(NSE)、S-100B、酪氨酸酶、LDH；
-用于胃肠道癌的细胞角蛋白20(CK20)、前列腺干细胞抗原(PSCA)；
-用于胃癌的Medkine(MK)；
-用于卵巢癌的CA 125、CASA、CA 125；
-用于胰腺癌的CA 19-9；
-用于胰腺癌的存活素(Survivin)、p53、Bcl-2；
-用于的嗜铬细胞瘤的分泌粒蛋白II(Secretogranin II)-衍生的肽EM66；
-用于前列腺癌的GLUT1、GLUT12、胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGBFB2)；
-用于成横纹肌细胞瘤的肌形成蛋白(myogenin)、MyoD1；
-用于甲状腺癌(乳头状癌)的二肽基肽酶IV(DPP IV/CD 26)；
-用于甲状腺癌(乳头状癌)的过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)。
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