CN102215668A - 耐草甘膦的小麦基因型 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过诱变产生耐草甘膦小麦基因型的方法，通过这种方法产生耐草甘膦小麦植株和相关的组合物和方法。

Description

耐草甘膦的小麦基因型

技术领域

本发明属于小麦(Triticum aestivum L.)育种领域，尤其是涉及耐除草剂草甘膦的小麦基因型。

背景技术

杂草竞争是造成小麦生产中产量损失的主要原因。联合山羊草、雀麦草和野生燕麦是西北太平洋(PNW)的小麦生产系统中的主要杂草问题，直播生产完全依赖于化学除草。用于控制这些杂草的大多数除草剂昂贵并且毒性高。根据环境因素和使用的生产系统，干旱、丝核菌根腐病和杂草竞争造成的产量损失在0％至接近100％的范围内。发展抵抗或耐受这些问题中的任意一种的变种会显著降低与小麦生产相关的经济风险因素。目前，通过使用草甘膦去除上年感染的植株来控制绿色桥梁效应，从而对付丝核菌，绿色桥梁效应通常发生于当在将死的杂草和杂草化作物的根上生长的真菌病害转移到出现的谷类作物的根部时(Veseth，″′Green Bridge′Key toRoot Disease Control，″PNW Conservation Tillage Handbook Series No.16，chap.4，″Disease Control，″pp.1-8，1992)。“绿色桥梁效应”现象通常导致显著的植物发育迟缓、减少分蘖和粮食产量损失(Smiley and Wilkins，PlantDis.76：399-404，1992；Hornby et al.，″Take-all and Cereal ProductionSystems，″in：Take-all Disease of Cereals，Cambridge，U.K.：CAB International，pp.103-164，1998)。基于市场接受程度的考虑，通过从商业化进程中去除Roundup Ready

小麦(Monsanto Company，St.Louis，MO)，许多年都不会有耐除草剂转基因小麦。

杂草竞争是商业小麦生产的主要威胁，导致粮食产量降低和粮食质量低劣。尽管可使用耕种来去除杂草，耕种领域的土壤极易受到风和水的侵蚀。由于应用的简便性和有效性，除草剂处理是优选的杂草控制的方法。除草剂还可以在减少耕种或设计为在土壤表面留下大量剩余从而防止侵蚀的直播作物系统中进行杂草控制。小麦中最主要的杂草竞争来源于有高度亲缘关系的草类，如野生燕麦和联合山羊草。不幸的是，难于设计出有效的与种植作物有亲缘关系的问题杂草种类的化学控制方法，因为它们会具有相同的除草剂敏感性。解决该问题的一个方法涉及应用重组基因进行转化从而通过基因改良(GM)(即通过重组DNA和植物转化技术在植物中引入外源基因序列)产生抗如草甘膦(即Roundup

)的广谱除草剂的作物。在该系统中，“在作物中”应用除草剂来控制杂草而不会伤害耐除草剂的作物植株。该方法被用于发展Roundup Ready

大豆、棉花、玉米和加拿大油菜品种，其已在美国Roundup Ready

大豆中取得巨大成功，1997年开始商业生产，到2006年，美国生长的七千五百万英亩中的七千一百万英亩(95％)的大豆都是种植Roundup Ready

品种，显示了该技术的巨大价值(http://nass.usda.gov)。生产者将广泛接受Roundup Ready

大豆的基本原因归功于更高的净利润、扩大除草剂应用窗口、提高作物安全性和由于去除了耕种而降低土壤侵蚀通过。

1997年，Monsanto Corp.开始联合私营育种公司和美国大学开发Roundup Ready

春小麦。因为其它的GM作物已经进入了商业生产，预期Roundup Ready

小麦会容易被接受。但是，小麦的GM技术的消费者知觉显著不同于其它的作物，因为小麦主要用于人类消费而不是饲养动物；因此，发展GM小麦是非常有争议的。根据经济影响评估，研究者认为GM小麦的市场化会导致损失30％至50％的美国的出口市场(Wisner，EconomicsStaff Report，Iowa State University Dept.of Economics，Ames，Iowa，2004)。缺乏消费者的接受，尤其是在美国和亚洲，最终导致包括碾磨工、面包师和农民组织的工业代表禁止在美国生产GM小麦。因此，Monsanto在2004年5月暂停了Roundup Ready

小麦发展计划，取消了在商业小麦领域使用该方法来控制问题杂草的可能性。

可用于发展耐除草剂作物的代替方法不涉及本身的遗传改造。突变育种是涉及使用化学突变剂来提高作物植株中的农业价值性状的遗传多样性的非GM方法。该方法涉及将种子接触化学突变剂，其在该植物的DNA中制造变化，导致新型的可能有用的基因产生，该基因通过正常的有性繁殖从原始突变植物(M1)传递到其后代(M2)。使用传统的交叉杂交技术将通过突变育种产生的有用的基因整合到改良的品种中。化学诱导的变种不被认为是GM，因为未使用转化(即，基因工程)来将理想的基因插入到宿主植物的DNA中。耐受除草剂咪唑啉酮(Immi)的耐除草剂Clearfield

小麦是通过突变育种产生的最著名的小麦品种。见美国专利第6,339,184号。最初在化学诱导的突变体鉴定的耐受基因来源于法国冬小麦品种(Newhouse et al.，Plant Physiol.100：882-886，1992)，随后通过传统育种被转移到其它品种中。2003年，第一个耐Immi冬小麦品种在Colorado进入商业生产，现在美国的每个冬小麦主产区都有Clearfield品种。(http://www.nass.usda.gov/)。2006年，Oregon州立大学公开的一种Clearfield品种-ORCFlOl占到了Washington州的软质白色冬小麦种植面积的6％，在以后几年里预期Clearfield

品种的种植面积会稳定上升。Clearfield

品种产生的粮食是非管制的；因此，它可以以没有身份保护或标签需要的大宗商品销售。突变育种还被成功用于发展抵抗白粉病(Kinaneand Jones，Euphytica 117：251-260，2001)，叶锈病和杆锈(Williams et al.，CropScience 32：612-617，1992，Friebe et al.，Crop Science 34：400-404，1994，Kerber and Aung，Crop Science 35：743-744，1995)，和黄锈病和褐锈病的小麦品种。

美国专利第7,087,809描述了通过在草甘膦溶液中浸泡非诱变的小麦种子并且筛选耐草甘膦的植物来获得耐草甘膦小麦。

熟知的用于通过GM方法制造耐草甘膦大豆和玉米的″RoundupReady

″基因是由编码以草甘膦作为目标的酶-EPSP合成酶的细菌基因的突变造成的(Dill，Pest Manag.Sci.61：219-224，2005)。一个或两个基因中自然产生的突变将草甘膦抗性赋予在大量使用草甘膦的区域中生长的杂草(Zelaya et al.，Theor.Appl.Genet.110：58-70，2004；Owen and Zelaya，PestManag.Sci.61：301-311，2005)。此外，克隆的水稻EPSR合成酶基因的PCR突变显示单点突变(C317T，P106L；即，核苷酸317的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶脱氧核苷的单一核苷酸变化导致EPSP蛋白的氨基酸106从脯氨酸变成赖氨酸的氨基酸变化)当被转化进并且在得到的转基因植物中表达时赋予草甘膦耐性(Zhou et al.，Plant Physiol.140：184-195，2006)。该脯氨酸密码子在小麦EPSP合成酶中是保守的。但是，该领域中的大多数科学家还是持有优选发展耐草甘膦作物的GM方法的观点，因为由甲基磺酸乙酯(EMS)诱导的产生耐草甘膦植物的突变至今还未在任何植物种类中得到鉴定(Jander et al.，Plant Physiol.131：139-146，2003；Dill，Pest Manag.Sci.61：219-224，2005)。筛选了125,000株突变的拟南芥植物没有重新找到单耐草甘膦植物(Jander et al.，Plant Physiol.131：139-146，2003)。作者认为“可能由EMS诱导的单碱基变化不能在拟南芥中产生草甘膦抗性”。需要新型的耐草甘膦但是不含有通过重组DNA技术引入到植物基因组中的外源DNA的小麦品种。本发明满足了该需要和其它需要。

发明内容

发明简述

我们发展了小麦突变和育种方法从而产生耐草甘膦小麦基因型。通过该方法获得的多种小麦基因型耐受高水平的草甘膦，在某些情况下，是商业施用量的二、三甚至四倍或更多。

根据本发明的一个方面，提供了小麦植株或其部分，该小麦植株或其部分耐受大田中3.36kg/ha或更多的施用量的草甘膦的异丙胺盐，其中该小麦植株没有外源重组DNA。即，没有通过重组DNA技术操纵(如克隆，与其它的DNA序列，如启动子或载体序列等连接)的非植物DNA或植物DNA，将其通过转化直接引入小麦植株或通过引入用于小麦植株育种的小麦植株来间接引入小麦植株。根据另外一个实施方案，该小麦植株或其部分包含对3.36kg/ha或更多的草甘膦的异丙胺盐产生抗性的单基因突变。

根据本发明的另外一个实施方案，提供了小麦植株或其部分，其包含产生草甘膦抗性的突变，其中所述的突变来源于选自由：IGT07002-0、IGT07003-No.1-0、IGT07005-No.1-0、IGT07006-0、IGT07011-0-0、IGT07013-0-0、IGT07022-0-0、IGT07027-0-0、IGT07028-0-0、IGT07029-0-0、IGT07030-0-0、IGT07031-0-0、IGT07064-0-0、IGT07073-0-0、IGT07074-0-0、IGT07087-0、IGT07091-0、IGT07092-0、EGT07073-0、EGT07081-0、EGT07100-0、EGT07111-0、EGT07118-0、EGT07130-0、EGT07132-0、EGT07138-0、EGT07139-0、EGT07140-0、EGT07143-0、EGT07146-0、EGT07149-0、EGT07154-0、EGT07155-0、EGT07156-0、EGT07158-0、EGT07162-0、EGT07180-0、Re-Mut 3.1 M3Bulk、Re-Mut 3.2 M3 Bulk、Re-Mut 3.3 M3 Bulk、Re-Mut 3.4 M3 Bulk、Re-Mut 3.5 M3 Bulk、Re-Mut GTL 3.4-10、Macon M2 Bulk FR2 1-10、MaconFR1-16 M4 Bulk、Macon FR3-1 M2、TaraFR1-15-57、TaraFR1-15-94、TaraFR1-20-2、Tara 0.4.1、Tara 0.4.2、Tara 0.4.3、Tara 0.4.4、Tara 0.4.5、Tara 0.4.6、Alpowa M2 Bulk FR2 1-32、Louise M2 Bulk FR21-45、Louise Double Mutated M2 Bulk FR2 1-13、Louise FR3-1、LouiseFR1-33-6、Louise FR1-42、Louise FR1-43、Louise FR1-62、LouiseFR1-65-2和Hollis FR1-9-14和其后代构成的组中的耐草甘膦小麦基因型。

根据另外一个实施方案，这样的小麦植株或其部分耐受大田中施用量为每公顷0.84公斤酸当量(kg ae/ha)，1.68kg ae/ha、2.52kg ae/ha或3.36kg ae/ha或更多的草甘膦的异丙胺盐。

根据这样的小麦植株或其部分的另外一个实施方案，突变是隐性突变。

可通过重新诱变具有产生草甘膦耐性的突变的植株，并且选择具有原始突变和产生草甘膦耐性的第二突变的植株从而在耐草甘膦植株中引入一个以上的突变。或者，在“基因聚合”方法中，可通过植株与其它具有产生草甘膦耐性的不同突变(例如，其基因组中的第二位点上的独立突变，无论是在相同或是不同的基因中)的植株的交叉杂交，并且在获得的后代中选择具有两种草甘膦耐性突变的植株，从而在具有产生草甘膦耐性的植物中引入第二突变。作为另外一个可选的，突变之一可为转基因性状，其通过如下详细描述的重组DNA技术被引入到小麦植株中。

因此，根据另外一个实施方案，这样的小麦植株或其部分包含至少两个产生草甘膦耐性的不同突变，其中所述的至少两个不同的突变之一来源于所述的耐草甘膦小麦基因型。根据这样的小麦植株或其部分的另外一个实施方案，所述的至少两个的不同突变都来自于所述的耐草甘膦小麦基因型。根据这样的小麦植株或其部分的另外一个实施方案，所述的至少两个不同的突变是不同的小麦基因的突变。

根据另外一个实施方案，这样的小麦植株或其部分包含选自由：雄性不育、对草甘膦以外的其它除草剂的抗性、抗虫性、抗病性(包括，但是不限定于丝核菌根腐病抗性)；蜡质淀粉；改良脂肪酸代谢、改良植酸代谢、改良碳水化合物代谢、改良蜡质淀粉含量、改良面筋含量和改良水胁迫耐性构成的组中的性状。

根据另外一个实施方案，提供了这样的小麦植株的种子。根据另外一个实施方案，这样的种子是纯育品系的。根据另外一个实施方案，通过种植这样的种子产生小麦植株或其部分。

根据另外一个实施方案，提供了小麦植株或其部分，其具有如上所述的本发明的小麦植株的所有生理和形态特征。还提供了产生包含产生草甘膦耐性的突变和一个或多个额外的理想性状(包括草甘膦耐性性状和其它类型的性状)的小麦植株的方法。因此，根据本发明的另外一个实施方案，提供了产生耐草甘膦植株的方法，其包含：(a)将选择的小麦品种的植株与如上所述的耐草甘膦小麦植株进行杂交从而产生多个后代；(b)选择耐草甘膦的后代。根据这样一个的实施方案，该方法包含：(a)将由如上所述的本发明的耐草甘膦小麦植株的种子生长的植株与所述的选择的小麦品种的植株进行杂交从而产生F1后代植株；(b)选择具有草甘膦耐性性状的F 1后代植株；(c)将选择的F1后代植株与所述的选择的小麦品种的植株进行杂交从而产生回交后代植株；(d)选择具有草甘膦耐性性状和所述的选择的小麦基因型的生理和形态特征的回交后代植株从而产生选择的回交后代植株；和(e)连续重复步骤(c)和(d)三次或更多次从而产生选择的第四或更高的回交后代植株，其包含草甘膦耐性性状和所述的选择的小麦基因型的所有生理和形态特征(当在相同的环境条件下种植时，以5％的显著水平确定的)。根据本发明的另外一个实施方案，提供了产生草甘膦耐性植株的方法，其包含：(a)将由权利要求3的耐草甘膦小麦植株的种子生长的植株与所述的选择的小麦品种的植株进行杂交，从而产生F1后代植株，其中选择的小麦品种包含理想性状；(b)选择具有理想性状的F1后代植株从而产生选择的F1后代植株；(c)将选择的后代植株与所述的耐草甘膦小麦基因型的植株进行杂交从而产生回交后代植株；(d)选择具有理想性状和所述的耐草甘膦小麦基因型的生理和形态特征的回交后代植株，从而产生选择的回交后代植株；和(e)连续重复步骤(c)和(d)三次或更多次，从而产生包含理想性状和耐草甘膦小麦基因型的所有生理和形态特征的选择的第四或更高的回交后代植株(当在相同的环境条件下种植时，以5％的显著水平确定的)。根据另外一个这样的实施方案，理想性状选自由：雄性不育、除草剂抗性、抗虫性、抗病性(包括，但是不限定于丝核菌根腐病抗性)和蜡质淀粉构成的组。

技术人员会明白可以应用本发明的方法从而获得其它禾本种类的耐草甘膦突变体，如包括但是不限定于黑小麦、黑麦、大麦、小米、玉米、水稻、高粱等的谷类粮食作物。

通过以下的详细描述、附图和权利要求，本发明的前述和其它方面会变得更清楚。

除非另有说明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解相同的意义。虽然与本文中描述的相似或等效的方法和材料可被用于操作或试验本发明，下文中描述了合适的方法和材料。本文提到的所有的公开、专利申请、专利和其它的参考都通过引用其全文结合到本中作为参考。在有争议的情况下，包括定义的本说明书会规定约束。此外，材料、方法和实施例只是为了说明而不是要限定。

发明详述

根据本发明的一个实施方案，提供了耐草甘膦小麦品种。术语“耐草甘膦”(或者“抗草甘膦”)在本文中用于表示植株或其部分(如种子)在其抗草甘膦除草剂的作用的能力上显著异于对照植株，包括，但是不限定于提高存活、更高的生长率、更高的产量等。

可用多种分析方法来确定纯合稳定性、表型稳定性和小麦品种的鉴定。对于具有商业价值的特殊性状，如，例如草甘膦耐性，其必须是可遗传和稳定表达的。

最古老和传统的分析方法是观察表型性状。通常在田间实验中收集数据，检验小麦植株的完整生活史。最经常观察的表型性状是如种子产量、麦穗结构、颖苞结构、种子结构、抗倒伏性、抗病性、成熟等的性状。

除了表型观察，还可通过分离分析或应用生物技术来检验植株基因型。有多种可用的实验室技术用于分析、比较和描述植物基因型的特征；其中有凝胶电泳、同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、随机引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异性扩增区(SCAR)、扩增片断长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)(其也被称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)。凝胶电泳尤其适用于小麦。通过麸朊、麦谷蛋白、清蛋白和球蛋白和总蛋白的提取物的电泳来鉴定小麦品种是可能的(Bietz，pp.216-228，″Geneticand Biochemical Studies of Nonenzymatic Endosperm Proteins″In Wheat andWheat Improvement，ed.E.G.Heyne，1987)。

小麦品种Louise的说明书

通过选择来源于如实施例1描述的小麦品种Louise的耐草甘膦植株获得小麦基因型GT Louise。使用传统技术进行进一步回交从而产生源于小麦基因型GT Louise的纯育的耐草甘膦小麦品种。“Louise”软质白色春小麦(Triticum aestivum L.)(PI 634865)，由于其出色的最终应用品质、高粮食产量能力、对地方种的锈条病(由Puccinia striiformis Westend.f.sp.Tritici造成)的高温成熟植株抗性和对小麦瘿蚊的部分抗性(Mayetiola destructor(say))，于2005年8月在华盛顿州的中到高雨量(年平均降雨量＞400mm)、无灌溉小麦产区作为软质白色春小麦品种“Zak”的替代品被公开(Kidwell等，Crop Sci.42：661-662，2002)。

Louise是来源于′Wakanz′(PI 506352)/′Wawawai′(PI 574538)杂交的F_4:5穗列选择(F4:5 head row selection)，其产生于1992年。使用以下改良的纯系谱-混合育种法来发展早代后代。F1植株的批量种子(30g)被用于建立F2试验区。随机从个体F2植株选择100个穗，40g的批量种子的子样本被用于建立F3试验区。整批收获F3试验区的种子，60g的子样本被用于建立F4试验区。大约150个F4植株的单个穗被分别脱粒从而建立F4:5穗列族。在一般适应、植株高度和粮食表观的列中的选择之后，整批收获每个选择的穗列中的30至50个植株的种子从而获得用于粮食产量评估试验的F46种子。在WA，Pullman的苗圃场发展F1、F2、F4和F5后代，而在WA，Lind的Lind旱地实验站发展F3后代。根据表型均匀，2003年在WA，Othello从灌溉下生长的1100个F4:11穗列的再选择产生Louise的原种。选择的穗列在收获时被集中起来，产生了563kg的原种。

Louise是中等高度、半矮杆栽培品种。它具有松的、尖端细、斜弯曲的具有白芒和白色颖苞的穗，颖苞为长而宽，具有中度细尖肩和窄喙。Louise具有椭圆形的白色、软质和光滑的谷粒。Louise的种子具有中等尺寸的胚，其具有窄的中等深度的沟、角颊和中度非卷的麦毛。

2003和2004年在从2:00am的4℃至2:00pm的20℃逐渐变化的低昼夜温差循环下进行的温室育苗试验(Chen和Line，Phytopathology82：1428-1434，1992)中，检测了对小麦锈条病种类PST-37、PST-43、PST-45、PST-78和PST-98的反应。Louise容易感染所有的种类，显示其不具有全阶段(育苗)抗性。但是，当在成熟植株阶段，在从2:00am的10℃至2:00pm的35℃逐渐变化的高昼夜温差循环下进行与PST-78和PST-100试验时，Louise具有高抗性，显示它具有高温、成熟植株(HTAP)抗性(Chen和Line，Phytopathology 85：567-572，1995)。2001年至2004年，在华盛顿州的各个地点进行的大田试验中，Louise显示了对目前在美国的太平洋西北地区的主要锈条病类别病毒种类的无种类特异性的HTAP抗性，包括PST-78、PST-98和PST-100。根据Idaho大学进行的使用了含有在PNW发现的三个主要生物型的集合的昆虫筛选试验，Louise对小麦瘿蚊生物型E、F和GP的抗性是混杂的(65％)。根据WA，Pullman的品系和自然领地为患评价，Louise不易抵抗俄罗斯小麦aphid[Diur aphis noxia(Mordvilko)]。在休耕地、未灌溉和灌溉的条件下，重复大田试验评价Louise。2002至2004年，在Washington、Oregon和Idaho进行的非灌溉和灌溉田的评价中，Lousie的粮食产量通常与参加测试的软质白色春小麦相等或更高。在Washington州经过3年进行的51次试验中，Louise的平均粮食产量是3702kg ha-1，其显著高于(PO.05)Zak(3232kg ha-1和Alturas(3581kg ha-1)的平均产量(Souza等，Crop Sci.44：1477-1478，2004)，可与Alpowa(3668kg ha-1)、(PI 566596)和Nick(3742kg ha-1)(WestBred LLC的专有品种)相比较。根据中度和高雨量地区(年平均降雨量＞400mm)的24位置-年份的数据，Louise的平均粮食产量(4952kg ha-1)与Alpowa(4905kg ha-1)和Nick(4831kg ha-1)持平，显著高于(P＜0.05)Alturas(4690kg ha-1)和Zak(4280kg ha-1)。

根据51次试验，Louise的平均粮食体积比重是757kg m-3，其显著高(P0.05)于Zak(750kg m-3)，与Alturas(756kg m-3)和Nick(763kg m-3)相似，显著低于(P0.05)Alpowa(771kg m-3)。Louise、Zak、Alpowa、Alturas和Nick的千粒重平均值分别是50.1、44.5、44.7、34.7和36.4g。Louise的平均植株高是80cm，其分别高于Zak(76cm)、Alpowa(74cm)、Nick(72cm)和Alturas(71cm)4cm、6cm、8cm和9cm。灌溉种植时Louise的倒伏率(5％至10％)与Alpowa(5％至10％)可相比，高于Nick(2％至5％)和Alturas(2％至5％)，低于Zak(25％至30％)。Louise结穗比Zak(年积日(DOY)168)早一天，与Alpowa(DOY 167)相同，比Alturas(DOY 166)晚一天，比Nick(DOY 165)晚两天。

在WA，Pullman的USDA-ARS美国西部小麦品质实验室WesternWheat Quality Laboratory进行的试验中，使用2002至2004年Washington州的育种和商业品种测试试验中生产的粮食，Louise的粮食蛋白含量(117gkg-1)与Alpowa和Alturas(116g kg-1)的相似，低于Nick(120g kg-1)和Zak(123g kg-1)。Louise的出粉率(671g kg-1)可与Zak(667g kg-1)、Alturas(666g kg-1)和Nick(665g kg-1)相比较，显著高于(P0.01)Alpowa(640gkg-1)。Louise的面粉灰分含量(3.6g kg-1)与Alpowa(3.5g kg-1)相似，显著低于(P0.01)Zak(3.9g kg-1)、Alturas(3.7g kg-1)和Nick(3.8g kg-1)。Louise的平均磨粉品质(84.0)高于Zak(81.4)、Alpowa(80.6)、Alturas(82.4)和Nick(81.5)。Louise的Mixograph吸水率与Zak和Nick(531g kg-1)的相同，略低于Alpowa(534g kg-1)，显著低于(P＜0.01)Alturas(544g kg-11)。当在各个生产区比较时，Louise的平均饼干直径(9.7cm)可与Zak(9.7cm)相比较，大于Alpowa(9.3cm)、Alturas(9.5cm)和Nick(9.5cm)，Louise的平均松糕体积(1305cm3)小于Zak(1322cm3)和Alpowa(1362cm3)，大于Alturas(1225cm3)和Nick(1230cm3)。

Louise的基础种子由粮食和土壤科学部和Washington州农业研究中心管理下的Washington州粮食提高协会(Washington State Crop ImprovementAssociation)保存，并且存放于美国国家植物种质体系(National PlantGermplasm System)。

区域适应性

当提到区域适应性，该术语被用于描述具有非常适合于该小麦基因型的环境条件的地点。区域适应性基于多个因素，例如：抽穗期、耐冬性、抗虫性、抗病性和耐旱性。区域适应性不表示小麦基因型会在适应区域内的每个地点生长，或它在该区域外不生长。例如，美国的适应区域(使用标准的二字母代号表示州)包括：(a)北部区域，包括DE、IL、IN、MI、MO、NJ、NY、OH、PA、WI州和Ontario、加拿大；(b)中南部，包括AR、KY、MO boot heel和TN州；(c)东南部，包括NC、SC和VA州；和(c)美国南部诸州，包括AL、GA、LA和MS州。但是，本发明的小麦基因型可以在适应区域之内和之外生长，无论是在美国或在美国之外。

小麦育种

通过利用植物授粉方法的技术来育种大田作物。如果花粉从一朵花传递到同一植株的相同的或另外一朵花，该植株是自花授粉的。当同一家族或品系中的个体被用于授粉，植株是同胞授粉的。如果花粉来自不同家族或品系的不同植株上的花朵，植株是异花授粉的。本文中的术语“异花授粉”不包括自花授粉或同胞授粉。小麦植物(Triticum aestivum L.)被公认为是天然自花授粉的，但是能够进行异花授粉，在自然中很少发生(小麦的天然异型杂交水平是大约5％)。因此，介入授粉控制机制对于建立优良的品种是关键的。

两个不同的纯合品系之间的杂交产生均一的杂交植株群体，其多个基因位点是杂合的。两个在多个基因位点不同的杂合植株的杂交产生基因不同而且不均一的植株群体。不管其亲本，自花授粉并且经过多代选择类型的植株在几乎所有的基因位点上变成纯合的了，并且产生纯育后代的均一群体。术语“纯合植物”在这里定义了在其位点具有95％或更多的纯合基因的植物。术语“同系交配”或“纯育”在本文中用于表示纯合植物或纯合植物类。

育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、要被提高的性状的遗传性、商业应用品种的类型(例如，F1杂交品种、纯系品种等)。对于高度遗传的性状，选择在单一位置评价的优秀个体植株就会是有效的，而对于低遗传性的性状，选择应基于从相关植株的家族的重复评价获得的平均值。常用的选择方法包括系谱选择法、改良的系谱选择法、混合选择和轮回选择。

遗传的复杂性影响育种方法的选择。一般来说，育种以两个基因型的杂交(杂交育种)开始，每个基因型具有一个或多个理想的特性，该特性在另外一种基因型中是缺失的或者与另外一种基因型互补。如果两个原始的亲本不提供所有需要的特性，可以通过更多的杂交包括进来其它源。在每个连续的杂交后代中，F1→F2；F2→F3；F3→F4；F4→F5，等，植株自交从而提高该品系的纯合性。一般，在育种计划中，进行五代或者更多的选择，并且自交从而获得纯合植株。

系谱育种通常用于提高自花授粉的作物。具有理想的、互补的性状的两个亲本杂交从而产生F1。通过自交或者与一或多个F1同胞相交产生F2群体。可开始在F2群体中进行最优个体的选择，然后开始在F3中，选择最优家族中最优个体。可在F4代中开始家族的重复测试从而提高低遗传性状的选择有效性。在同系繁殖(即F5、F6和F7)的后期，测试最优品系或表型相似品系的混合物作为新品种公开的可能性。

回交育种法已用于将遗传简单的品质性状从供体亲本传递给理想的纯合品种，其被用作回交亲本。要被转移的性状的来源被称为供体亲本。在最初的杂交之后，选择具有理想性状或供体亲本的性状的个体，然后与回交亲本重复杂交(回交)。得到的植株被认为具有回交亲本的特性(例如，品种)以及理想的性状或从供体亲本转移的性状。该方法被广泛用于育种抗病品种。

每个育种计划应包括育种程序的有效性的周期性、目标性评价。评价标准根据对象和目标变化，但是应包括根据与合适的标准比较的选择品种的年度收获，后期育种品系的总体值，每单位投入(例如，每年、每花费一美元等)产生成功品种的数量。

多种轮回选择技术被用于提高多个基因控制的数量遗传性状。自花授粉作物中的轮回选择的应用取决于授粉的容易性和从每个成功杂交收获的杂交后代的数量。回交选择可被用于提高自花授粉或异花授粉作物的群体。通过杂交几个不同的亲本来确定或创造杂合个体的遗传可变群。根据个体的优异性、出色的后代或优秀的组合能力选择最佳的植株。选出的植株杂交从而产生新的群体，其中继续进行选择轮回。可从群体中选择植株，自花授粉从而产生新的品种。

另外一个育种方法是单粒传法。在严格的意义上来说，该方法是指种植分离群体，从每个植株收获一粒种子的样本，使用单粒样本来种植下一代。当该群体从F2发展到纯育的理想水平，来源于该品系的植株会分别追溯到不同的F2个体。每一代中，群体中的植株数量会下降，这是因为某些种子不能发芽，或某些植株不能产生至少一粒种子。因此，当世代进度完成，不是所有群体中原始抽样的F2植株都能由有后代代表。在多种子法中，小麦育种者通常从群体中的每个植株收获一个或多个麦穗，并且将它们一起脱粒形成混合。该批种子中的一部分被用于种植另一代，一部分备用。该方法已被称为改良的单粒传法。在收获时期，多种子法被用来节省劳力。通过机器脱粒麦穗显著快于单粒法通过手工从每一个麦穗分离一颗种子。多粒法还使每一纯育世代种植同等数量的种子类群成为可能。收获足量的种子从而弥补那些不能发芽或不产种子的植株。还可采用混合育种法。在混合育种法中，种植F2群体。成批收获该类群的种子，种子的样本用于种植下一季。可重复该轮回数次。一般来说，当认为个体植株具有高水平的纯合度时，为了可能作为品种应用而选择、测试和提高个体植株。如淀粉凝胶电泳、同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、随机引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异性扩增区(SCAR)、扩增片断长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)(其也被称为微卫星)和单核苷酸多态性(SNP)的分子标记技术可被用于植物育种方法中。一种应用的分子标记是数量性状座位(QTL)定位。QTL定位是标记的应用，已知其紧密连接于在数量性状上具有可测量效果的等位基因。育种方法中的选择是基于连接于植物基因组的正影响等位基因的标记的累积和/或连接于负影响等位基因的标记的消灭。

在育种过程中，分子标记还可被用于数量和数量性状的选择。例如，紧密连接于等位基因的标记或包含感兴趣的实际等位基因中的序列的标记可被用于在回交育种程序过程中选择包含感兴趣的等位基因的植株。该标记还可用于选择回交亲本的基因组，以供体亲本的标记为比较。使用该方法可将保留在选择植株的供体亲本的基因组的量最小化。它还可被用于降低回交方法中与回交亲本回交的数量(Openshaw等.Marker-assistedSelection in Backcross Breeding.In：Proceedings Symposium of the Analysisof Molecular Marker Data，5-6Aug.1994，pp.41-43.Crop Science Society ofAmerica，Corvallis，OR)。选择方法中的分子标记的应用通常被称为遗传标记增强选择(Genetic Marker Enhanced Selection)或遗传标记辅助选择Marker-Assisted Selection。

双单倍体的产生也可在育种计划中被用于发展纯合品系。通过将纯合植株的一套染色体二倍化产生双单倍体，从而产生完全纯合的个体。这是优选的，因为该方法省略了从杂合源获得纯合植株所需要的自交世代。已经在小麦中发展了制造双单倍体的多种方法(Laurie，D.A.和S.Reymondie，Plant Breeding，1991，V.106：182-189.Singh，N.et al.，Cereal ResearchCommunications，2001，v.29：289-296；Redha，A.et al.，Plant Cell Tissue andOrgan Culture，2000，v.63：167-172；U.S.Pat.No.6,362,393)。尽管纯系品种是用于商业小麦生产的小麦主导形式，也使用杂交小麦。借助于细胞质雄性不育、核基因雄性不育或化合物来产生杂交小麦。以将这三种雄性不育体系的各种组合应用于产生杂交小麦。可在几种参考书籍之一中找到其它的通常用于不同的性状和作物的育种方法的描述(例如，Allard，Principles ofPlant Breeding，1960；Simmonds，Principles of Crop Improvement，1979；editor Heyne，Wheat and Wheat Improvement，1987；Allan，″Wheat″，18章，Principles of Crop Development，vol.2，Fehr editor，1987)。

彻底检测有希望的高代育种品系，并且与代表商业目标区的环境中的合适标准进行比较。最好的品系作为新品种的候选；那些在一些性状上仍有缺陷的可被用作产生用于进一步选择的新群体的亲本。最困难的任务是识别遗传上优良的个体，因为真正的遗传型值会被其它的混杂植物性状或环境因素掩盖。识别优良的基因型的一个方法是观察其相对于其它实验基因型和广泛种植的标准品种的表现。一般，单一的观察不是决定性的，所以必须重复观察从而提供对其遗传价值的更好的估量。

育种者使用多种方法来帮助确定应该从分离的群体中选择哪个植株和最终哪个品系会被用于商业化。除了种质的知识和育种者使用的其它技术，部分选择程序取决于实验的设计以及统计分析的应用。实验设计和统计分析被用于辅助确定哪个植株、哪个植株族和最终哪个品系在感兴趣的一个或多个性状上显著更好或显著差异。实验设计方法被用于控制误差，从而更精确地确定两个品系之间的差异。统计分析包括计算平均值，确定变异来源的统计显著性，和计算适当的方差分量。通常，百分之五或百分之一的显著水平被用于确定特定性状产生的差异是真实的或是由于环境或实验误差。

植物育种是植物的遗传操作。小麦育种的目标是发展新型的、独特的和优良的小麦品种。在小麦育种计划的实际应用中，育种者最初选择并且杂交两个或多个亲本品系，随后重复自交和选择，产生多个新的遗传组合。理论上，育种者通过杂交、自交和自然诱导的突变可以产生数以十亿计的不同遗传组合。育种者在细胞水平上不能直接控制。因此，两个育种者永远不会发展两个完全相同的品系。

每年，植物育种者选择种质来发展下一代。在独特和不同的地理、气候和土壤条件下种植该种质，然后在生长季节的过程中和结束时进一步进行选择。

正确的测试应该检测主要缺点并且建立相对于目前品种优越或更高的水平。除了显示优异的表现，还必须具有对新品种的需求。新品种必须适合工业标准，或者必须创造新的市场。引入新品种可能还给种子生产者、种植者、加工者和消费者造成用于特别的广告和销售的附加费用，改变种子和商业生产操作，和新产品应用。新品种公开前的测试应该考虑研究和发展的成本以及最终品种的技术优越性。简单、经济地生产种子也必须是可行的。这些通向销售和分布的最终步骤的过程从进行第一次杂交的时间起会花费六至十二年。因此，发展新品种是一个费时的过程，其必需精确的前瞻性规划、资源的有效利用和最小化重点方向的变化。小麦(Triticumaestivum L.)是重要和有价值的大田作物。因此，小麦育种者坚持的目标是发展稳定、高产的小麦品种，其在农艺上是可靠的并且在其预期应用上具有良好的磨粉和烘焙特性。为了实现这个目标，小麦育种者必须选择和发展具有产生优良品种的性状的小麦植株。

任何已知的性状可以通过使用具有理想性状的供体亲本的育种来被引入到小麦品种中。这样的理想性状的一个实施例是对丝核菌根腐病的抗性。共同美国临时专利申请第60/771,402号，其通过引用结合到本文中，描述了通过突变育种来发展对丝核菌根腐病具有抗性的小麦植株，并且其可以用于具有草甘膦耐性和丝核菌根腐病抗性的小麦的育种。

草甘膦配制和喷射测试

在一个实施方案中，进行草甘膦耐性的温室或大田评价。术语“草甘膦”在本文中被用于共同表示母体除草剂N-膦酰甲基甘氨酸(或被称为草甘膦酸)，其盐或酯，或在植物组织中转化为N-膦酰甲基甘氨酸或提供离子形式的N-膦酰甲基甘氨酸(或被称为草甘膦离子)的化合物。直观地，Franz的美国专利第3,799,758和4,405,531号中公开了可用于本文的水溶性草甘膦盐，其公开通过引用结合到本文中作为参考。可用于本发明的草甘膦盐包括但是不限定于碱金属盐，例如钠或钾；铵盐；C1-16烷基铵盐，例如二甲基胺或异丙胺；C1-16烷醇铵盐，例如单乙醇胺；C1-16烷基锍盐，例如三甲基锍；其混合物等。草甘膦酸分子有三个具有不同pKa值的酸位；因此，可以使用单、双和三元盐，或其任意的混合物，或任意的中和中间水平的盐。

草甘膦盐类具有商业重要性，部分是因为它们是水溶性的。多种铵、烷基铵、烷醇铵、烷基锍和碱金属盐是高度水溶性，从而使配制剂可以为高度浓缩的水溶液，其可在使用时在水中稀释。

这样的浓缩水溶液可含有每升约50至约500克的草甘膦，表达为酸当量(g a，e，/l)。也可使用更高浓度的草甘膦，例如约300至约500g a，e，/l。

选择针对环境的合适的量和使用合适的添加剂是取得对草甘膦产品的一致的控制的关键考虑。目前销售几种不同浓度的草甘膦，因此重要的是根据使用的产品来调整量。草甘膦的标签通常以两种方式来表示浓度：(a)磅/gal的草甘膦和(b)磅/gal的酸当量的草甘膦。例如，Roundup Ultra

含有4磅/gal的草甘膦的异丙胺盐，但是只有3磅/gal的酸当量草甘膦。第一个值包括了与草甘膦配制的盐的重量，而第二个只测量存在多少的草甘膦。因为盐类对野草控制没有作用，酸当量是表示浓度和灭野草能力的更准确的方法。

草甘膦盐还可以例如粉末、小颗粒、小丸或药片的形式配置成水溶性或水分散组合物。这样的组合物通常被称为干制剂，尽管术语“干”不应在本文中理解为表示完全没有水。一般，干制剂含有少于按重量计5％的水，例如按重量计约0.5％至约2％的水。这样的制剂在使用时溶解或分散在水中。

预期的草甘膦干制剂可包含按重量计约5％至约80％的草甘膦，表示为酸当量(％a.e.)。优选以上范围内更高的草甘膦浓度，例如约50％至约80％a.e。尤其可用于制造干制剂的草甘膦盐是钠或钾盐。

本发明的植物处理组合物和液体干浓缩组合物可可选地包含一种或多种需要的赋形剂成分。尤其有用的草甘膦组合物的赋形剂成分是表面活性剂，其有助于水喷雾剂保持在植物叶子相对不沾水的表面上，还有助于草甘膦穿透叶子的蜡质外层(外皮)，从而接触叶子中的活组织。表面活性剂还可执行其它有用的功能。

对于可用于本发明的草甘膦组合物的活性剂的类型和化学类别没有限制。非离子、阴离子、阳离子和两性类型或这些类型中的超过一种的组合都可以应用于特定情况。但是，通常的情况是如果有活性剂的话，活性剂中的至少一种应该为阴离子以外的，即，活性剂中的至少一种应该为非离子型、阳离子型或两性型。

通过其所属领域的一般技术人员可选择合适的表面活性剂(不限定于以上所述的类别)的标准参考来源包括Gower出版的Handbook of IndustrialSurfactants(第二版，1997)，MC Publishing Company出版的McCutcheon′sEmulsifiers and Detergents(北美和国际版，1997)，美国化妆品和香料协会出版的International Cosmetic Ingredient Dictionary(第六版，1995，卷1和2)。

本发明的组合物的其它可选成分包括改良颜色、粘性、凝胶特性、冰点、收湿性、结块行为、溶解速度、分散性或其他制剂特性的药剂。

市售的草甘膦制剂的实施例包括，但是不限定于，那些由Monsanto公司出售的Roundup

、Roundup Ultra

、Roundup CT、Roundup Extra

、Roundup Biactive

、Roundup Bioforce

、Rodeo

、Polaris

、Spark

和Accord

除草剂，它们全部含有作为其异丙铵盐的草甘膦；Monsanto公司出售的Roundup Dry和Rival除草剂，其含有作为其铵盐的草甘膦；Monsanto公司出售的Roundup Geoforce

，其含有作为其钠盐的草甘膦；Zeneca Limited销售的Touchdown

除草剂，其含有作为其三甲基锍盐的草甘膦。

选择对生物有效的草甘膦制剂施用量是在一般农业技术人员的能力范围内的。所属领域的技术人员也会认识到个体植株条件、天气条件和生长条件会影响在操作本发明的方法中取得的结果。草甘膦超过20年的应用和相关于这种应用的出版的研究提供了大量的信息，通过其控制杂草的操作者可选择在特定环境条件下对处于特定生长阶段的特定种类具有杀灭效用的草甘膦施用量。

在一个实施方案中，将含草甘膦的除草剂施用于具有本发明的耐草甘膦性状的植物，评价该植物对草甘膦除草剂的耐性。草甘膦的任意制剂可被用于测试植物。例如，可使用如Roundup Ultra

的草甘膦组合物。评价植物的草甘膦耐性的测试参数会根据因素的数量改变。因素应包括，但是不限定于，草甘膦制剂的类型、制剂中使用的草甘膦的浓度和量、植物的类型、应用过程中植物的发展阶段、环境条件、施用方法、特定制剂的施用次数。例如，可在温室环境下使用喷雾方法来测试植物。使用RoundupUltra

的测试范围可包括，但是不限定于8oz/英亩至256oz/英亩。优选的商业效益的范围可为根据作物和植物发展阶段的16oz/英亩至64oz/英亩Roundup Ultra。可以以至少一次的草甘膦制剂施用用来喷雾作物。对于小麦的测试，可以在3至5叶期施用32oz/英亩Roundup Ultra，根据被测试的小麦的类型，随后可为收获前或收获后的施用。对于每种作物可优化测试参数从而找到包含产生理想的具有商业效益的草甘膦耐受水平的本发明构建的特殊植株。

基于参考的目的，商业施用量是32oz/A的Roundup Ultra

，其相当于0.84kg ae/ha或0.75lbs.ae/A。例如，在北卡罗来纳州州立大学的AlanYork的《Sorting Through the Glyphosate Jungle》中提供了对于草甘膦各种制剂、其草甘膦浓度和当量应用率的讨论，，见http://www.ces.ncsu.edu/martin/gl yphosate.html。

组织培养和再生

可通过组织培养和再生来进行本发明的耐草甘膦小麦基因型的进一步繁殖。各种小麦组织的组织培养和由其的再生是熟知的和被广泛出版的。关于各种小麦组织培养方法的综述可见Maheshwari等的《In Vitro Cultureof Wheat and Genetic Transformation-Retrospect and Prospect》(CriticalReviews in Plant Sciences，14(2)：pp149-178，1995)。因此，本发明的另外一个方面提供了从其上生长并且分化产生能够具有本发明的耐草甘膦小麦基因型的生理和形态特征的小麦植株的细胞。如本文所用，术语“植物部分”包括植物原生质体，从其再生小麦植株的植物细胞组织培养物，植物愈伤组织，植物块和植物或植物部分中完整的植物细胞，如胚、花粉、果皮、种子、花、小花、穗(head)、穗(spike)、叶、根、根尖、花药等。该术语还包括植物的产品，包括但是不限定于面粉、淀粉、油、麦芽等。

分离的耐草甘膦基因序列及其应用

本发明还考虑的是包含当在小麦植株中表达时提供小麦植株除草剂抗性的基因。无论是来自不同种类或是来自同一种类的，通过使用转化被插入到基因组中的任何DNA序列在本文中都被称为“转基因”。

所属领域的一般技术人员可遗传定位、识别、分离和测序包含负责产生小麦植株草甘膦耐性的突变的基因序列。见，例如：Plant Genomes：Methods for Genetic and Physical Mapping，J.S.Beckmann和T.C.Osborn，1992，Kluwer Academic Publishers；Genome Mapping in Plants，Paterson，1996，Harcourt Brace and Co.；Wheat Genome Mapping，A.Kalinski，1996，Diane Publishing Co.；和Methods in Molecular Biology，Vol.82，ArabidopsisProtocols，Martinez Zapater和Salinas，1998，Humana Press。分离的编码产生自然产生的除草剂耐性的核酸编码负责造成植物耐受除草剂的蛋白质。然后，该分离的核酸可被用于：(1)识别其它的可能包含自然产生的提供小麦植株除草剂抗性的突变的核酸；(2)通过基因工程，将该分离的核酸引入到缺乏除草剂抗性的小麦植株；(3)将该分离的核酸插入到合适的载体中，该载体可以在小麦植株中表达；和(4)将该载体插入到植物细胞中(例如，小麦植物细胞)。

本发明还考虑制造DNA构建体，其包含具有编码产生除草剂抗性的基因、可操作地连接到植物基因表达控制序列的分离核酸序列。“DNA构建体”在本文中被定义为构建的(非自然产生的)可用于在宿主细胞中引入DNA的DNA分子，该术语包括嵌合基因、表达盒和载体。

如本文所用，“可操作地连接”表示以编码的蛋白质能够被表达的方式连接DNA序列(包括序列的顺序、序列的方向、多种序列的相对间距)。可操作地将表达控制序列连接到编码序列的方法在所属领域中是熟知的。见，例如Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，N.Y.，1982；；和Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。

“表达控制序列”是以任何方式参与转录和翻译控制的DNA序列。合适的表达控制序列和制造和使用它们的方法在所属领域是熟知的。

表达控制序列包括启动子。启动子可以为诱导型或组成型。它可以是自然产生的，可以由多种自然产生的启动子的部分构成，或者可以是部分或完全合成的。对于启动子结构的研究提供了启动子设计的指导，如Harleyand Reynolds，Nucleic Acids Res.，15，2343-2361，1987。而且，启动子相对于转录起始的位置可以被优化，见，例如Roberts等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：760-764，1979。许多适合用于植物的启动子在所属领域中是熟知的。

例如，用于植物的合适的组成型启动子包括植物病毒启动子，如花生褪绿条纹病毒(PCISV)启动子(美国专利第5,850,019号)；花椰菜花叶病毒(CaMV)35S和19S启动子(Odell等.，I 313：3810-812，1985)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利第5,563,328号)；玄参花叶病毒(FMV)的全长转录启动子(美国专利第5,378,619号)；来自如水稻actin(McElroy et al.，Plant Cell 2：163-171，1990)、遍在蛋白质(Christiansen等，Plant MoI.Biol.12：619-632，1989)，and(Christiansen等，Plant MoI.Biol.18：675-689，1992)、pEMU(Last等，Theor.Appl.Genet.81：581-588，1991)、MAS(Velten等，Embo J.3：2723-2730，1984)、小麦组蛋白(Lepetit e等，MoI.Gen.Genet.231：276-285，1992)和Atanassova等，Plant Journal 2：291-300，1992)、甘蓝型油菜ALS3(国际专利申请第WO 97/41228号)的基因的启动子；多种土壤杆菌属基因的启动子(见美国专利第4,771,002；5,102,796；5,182,200；和5,428,147号)。

用于植物的合适诱导型启动子包括：响应铜的ACEI系统的启动子(Mett等，Proc.Natl.Acad.Sci.90：4567-4571，1993)；小麦的两个响应苯磺酰胺灭草安全剂的基因的启动子(美国专利第5,364,780号和Gatz等，MoI.Gen.Genet.243：32-38，1994)和TnIO的Tet抗体的启动子(Gatz et al.，MoI.Gen.Genet.227：229-237，1991)。根据一个实施方案，用于植物的启动子是响应于植物通常不响应的诱导剂的启动子。这种类型的示例诱导型启动子是类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录能力受到糖甾激素(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.88：10421，1991)或用于被雌二醇激活的雌激素受体诱导型植物表达系统的嵌合转录激活因子XVE应用(Zou等，Plant J.24265-273，2000)的诱导。其它的用于植物的诱导型启动子在欧洲专利第332104号、国际公布第WO 93/21334和WO 97/06269号中进行了描述，在Lenk Trends Plant Sci.，3：352-358，1998，以及Zou和Chua，Curr.Opin.Biotechnol.，11：146-151，2000中进行了讨论。

最后，可使用由其它启动子的部分构成的启动子和部分或完全合成的启动子。见，例如Ni等，Plant J.7：661-676，1995，和国际公布第WO 95/14098号，其描述了这样的用于植物的启动子。

启动子可包括，或被改良从而包括一个或多个增强子元件。优选，启动子包括多个增强子元件。含有增强子元件的启动子与不包括它们的启动子相比提供更高的转录水平。适合用于植物的增强子元件包括PCISV增强子元件(美国专利第5,850,019号)、CaMV35S增强子元件(美国专利第5,106,739和5,164,316号)和FMV增强子元件(Maiti等，Transgenic Res.，6：143-156，1997)。还见，国际公布第WO 96/23898号Enhancers andEukaryotic Expression(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1983)。

为了有效表达，编码序列还优选可操作地连接到3’非编码序列。3’非编码序列包括转录终止序列和聚腺苷酸序列。3’非编码序列可从土壤杆菌属、植物病毒、植物和其它真核生物的侧翼区获得。适合用于植物的3’非编码序列包括花椰菜花叶病毒35S基因、菜豆蛋白种子储藏蛋白基因、豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亚基E9基因，小麦7S储藏蛋白基因、章鱼碱合成酶基因和胭脂碱合成酶基因的。

也可以使用5’非编码前导序列。5’非编码前导序列是从5’帽位点延伸至翻译起始密码子的mRNA的部分。mRNA的这部分区域对于植物的翻译起始是必须的，并且在调控基因表达中起到作用。适合用于植物的5’非编码前导序列包括苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因和烟草花叶病毒的。

DNA构建体可以为载体。载体可包含一个或多个复制系统，其可以使载体在宿主细胞中复制。自我复制的载体包括质粒、黏粒和病毒载体。或者，载体可以为整合载体，其可以将编码除草剂抗性基因产品的DNA序列整合到宿主细胞的染色体中。理想的是载体还具有插入DNA序列的独特的限制性酶切位点。如果载体不具有独特的限制性酶切位点，它可以被改良从而引入或去除限制性酶切位点从而使其更适合于进一步的操作。

适合用于表达当在植物中表达时产生除草剂抗性的核酸的载体包括，但是不限定于pMON979、pMON977、pMON886、pCaMVCN和Rogers等，Meth.Enzymol.，153：253-277，1987描述的来源于农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒的载体。核酸被插入到载体中，这样它就可操作地连接到合适植物活性启动子。适合用于核酸的植物活性启动子包括，但是不限定于CaMV35S、ACTJN、FMV35S、NOS和PCSLV启动子。可使用多种已知的方法将包含核酸的启动子插入到植物细胞中。例如，植物细胞的DNA转化包括，但是不限定于农杆菌介导的植物转化、原生质体转化、电穿孔、基因转移到花粉、注射入生殖器、注射入未成熟的胚和粒在粒子轰击。在美国专利第.5,756,290号中更充分地描述了这些方法，在美国专利第6,153,812号和引用的参考中描述了对小麦尤其有效的方法。还可以使用位点特异性重组系统从而减少拷贝数量和核酸在棉花植物基因组中的随机整合。例如，Cre/lox系统可被用于植物细胞的直接的LOX位点特异性重组。至少在Choi等，Nuc.Acids Res.28：B19，2000)中可见到该方法。

已发展了多种植物转化的方法，包括生物的和物理的植物转化方法。见，例如《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》中的《Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants》，Glick，B.R.和Thompson，J.E.Eds.(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)pp.67-88。此外，已有植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法。见，例如Gruber等，《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》中的《Vectors for Plant Transformation》inGlick，B.R.and Thompson，J.E.Eds.(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)pp。89-119。

可使用传统的育种技术将已经通过使用转化技术被设计到特殊小麦植株中的遗传性状转移到另外一个品系中，这样的育种技术在植物育种领域中是熟知的。例如，回交法可被用于将转基因从被转化的小麦植株转移到优良小麦品种中，产生的后代包含转基因。

通过转化引入具有农艺价值的转基因

农艺性状基因可在转化植物中表达。例如，可通过基因工程改造植物从而表达多种具有农艺价值的表型，或者可通过育种用具有转基因的植株将转基因引入植物。通过小麦的转化，可调控基因的表达从而增强抗病性、抗虫性、除草剂抗性、水胁迫和农艺性状以及作物品质性状。转化还可被用于插入控制或有助于控制雄性不育的DNA序列。小麦的天然的或非天然的DNA序列可被转化到小麦中并且被用于调控天然的或非天然蛋白质的水平。基于调控蛋白质表达的目的，反义技术、多种启动子、目标序列、增强序列和其它的DNA序列可被插入到小麦的基因组中。涉及此方面的示例基因包括，但是不限定于以下类别。

1.产生抗虫性或抗病性的基因

(A)植物的防御通常被植抗病性基因(R)的产物与病原体相应的无毒(Avr)基因的产物之间的相互作用激活。可以以克隆的抗性基因转化植物品种基因，将其改造成对特定病原菌具有抗性的植物。见，例如Jones等，Science 266：789(1994)(cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance toCladosporium fulvum)；Martin等，Science 262：1432(1993)(tomato Pto genefor resistance to Pseudomonas syringae pv.tomato encodes a protein kinase)；Mindrinos等，Cell 78：1089，1994(Arabidopsis RSP2gene for resistance toPseudomonas syringae)。赤霉病以及脱氧雪腐镰刀菌烯醇都是由病原体造成的。

镰刀菌已对小麦生产造成毁灭性损失。具有抗真菌作用的基因表达蛋白可以转基因被用于防止赤霉病。已鉴定了多种类别的蛋白质。实施例包括内切几丁质酶、外切几丁质酶、葡聚糖酶、硫堇、类甜蛋白、渗透蛋白、核糖体失活蛋白、黄酮、抗菌肽。在感染镰刀菌的过程中，产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇。证实脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产生提高病害的毒力。已将具有消除脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性的特性的基因(Adam和Lemmens，InInternational Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions，1996；McCormick等.Appl.Environ.Micro.65：5252-5256，1999)进行基因工程用于小麦。已识别了与脱氧雪腐镰刀菌烯醇竞争的合成肽(Yuan等，Appl.Environ.Micro.65：3279-3286，1999)。改变宿主的染色体，从而它们降低对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的亲和力，这也已被用于降低镰刀菌的毒性。用于帮助降低赤霉病的基因包括，但是不限定于

(镰刀霉)、PDR5(酵母)、tip-1(燕麦)、tip-2(燕麦)、leaftip-1(小麦)、tip(水稻)、tip-4(燕麦)、内切几丁质酶、外切几丁质酶、葡聚糖酶(镰刀霉)、permatin(燕麦)、种子hordothionin(大麦)、α-硫堇(小麦)、酸葡聚糖酶(苜蓿)、几丁质酶(大麦和水稻)、βII-1，3-葡聚糖酶(大麦)、PR5/tip(拟南芥)、抗真菌蛋白(玉米)、1类型RIP(大麦)、NPR1(拟南芥)、乳铁蛋白(哺乳动物)、乙二酰-CoA脱羧酶(细菌)、IAP(杆状病毒)、ced-9(线虫)和葡聚糖酶(水稻和大麦)。

(B)提供抗虫性，如小麦瘿蚊、小麦秆软伏(wheat stem soft fly)、壳叶甲虫和/或绿蝽的基因，例如H9、H10和H21基因。

(C)提供抗病性的基因，包括小麦锈病、小麦叶斑病病原菌、小麦颖斑病病原菌、白粉病、孺孢病、黑粉病、小麦腥黑穗病、镰刀菌病、细菌病害和病毒病害。

(D)苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或以其为模型的合成多肽。见，例如Geiser等，Gene 48：109(1986)，其公开了Btδ-内毒素基因。此外，可从美国模式培养物保藏所ATCC购买编码Btδ-内毒素基因的DNA分子(Manassas，Va.)，例如以ATCC登录号40098、67136、31995和31998。

(E)昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮和保幼激素，其变体，基于其的模拟物，或其拮抗剂或激动剂。见，例如Hammock等，Nature 344：458，1990公开的克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达，保幼激素的灭活剂。

(F)昆虫特异性肽或神经肽，其通过表达破坏感染的昆虫的生理。例如，见，Regan，J.Biol Chem.269：9，1994(表达克隆得到的编码昆虫利尿激素受体DNA)，和Pratt等，Biochem.Biophys.Res.Comm.163：1243，1989(甲虫蟑螂中识别的昆虫神经肽咽侧体抑制激素)。还见Tomalski等的美国专利第5,266,317号，其公开了编码昆虫特异性麻痹神经毒素。

(G)造成单萜烯、倍半萜烯、甾类化合物、用羟肟酸、苯丙类衍生物或其它的具有杀虫活性的非蛋白分子超积累的酶。

(H)参与修饰生物活性分子的酶，包括翻译后修饰；例如，糖解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶、葡聚糖酶，无论是天然或合成的。见以Scott等名义的PCT申请WO 93/02197，其公开了胼胝质酶基因的核酸序列。例如可从ATCC以登录号39637和67152获得含有几丁质酶编码序列的DNA分子。还可见Kramer等，Insect Biochem.Molec.Biol.23：691(1993)，其传授了编码钩虫烟草几丁质酶的cDNA的核酸序列，和Kawalleck等，Plant Molec.Biol 21：673，1993，其提供了西芹ubi4-2泛素的核酸序列。

(I)激活信号转导的分子。例如，见Botella等，Plant Molec.Biol.24：757，1994公开的绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核酸序列，和Griess等，PlantPhysiol.104：1467，1994，其提供了玉米钙调蛋白cDNA克隆的核酸序列。

(J)疏水力矩蛋白。见PCT申请WO95/16776(公开了抑制植物真菌病害的抗菌肽Tachyplesin的肽衍生物)和PCT申请WO95/18855(传授了提供抗病性的合成抗菌肽)，其内容分别通过引用结合到本文中作为参考。

(K)膜通道、通道离子载体或通道阻断剂。例如，见Jaynes等，PlantSci.89：43，1993公开了提供转基因烟草植物青核菌抗性的抗菌肽-β裂解肽模拟物的异源表达。

(L)病毒侵入蛋白或源于其的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对病毒感染和/或外壳蛋白来源的病毒造成的病害发展的抗性，以及相关的病毒。见Beachy等，Ann.Rev.Phytopathol.28：451，1990。外壳蛋白介导的抗性已被赋予转化植物抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、土豆病毒X、土豆病毒Y、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。

(M)昆虫特异性抗体或来源于其的免疫毒素。因此，针对于昆虫肠道的主要代谢功能的抗体可使被作用的酶失活，杀死昆虫。Cf.Taylor等，Abstract #497，Seventh Int′l Symposium on Molecular Plant-MicrobeInteractions(Edinburgh，Scotland，1994(通过单链抗体片断的产生在造成转基因烟草中的酶失活)。

(N)病毒特异性抗体。见，例如Tavladoraki等，Nature 366：469，1993显示了表达重组抗体的转基因植物免予被病毒进攻。

(O)由病毒或寄生虫自然产生的停止发育蛋白。因此，内切α-1，4-多聚半乳糖醛酸酶有助于真菌定殖和通过溶解植物细胞壁homo-α-1，4-半乳糖醛酸酶而使植物营养物质外泄。见Lamb等，Bio/Technology 10：1436，1992。Toubart等，Plant J.2：367，1992描述了编码豆科内切多聚半乳糖醛酸酶-抑制蛋白的基因的克隆和特征。

(P)由植物自然产生的发育停止蛋白。例如，Logemann等，Bio/Technology 10：305，1992已显示了表达对真菌病害具有提高的抗性的大麦核糖体失活基因的转基因植物。

(Q)参与系统获得抗性(SAR)反应的基因和/或发病相关基因。Briggs，Current Biology，5(2)，1995

(R)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers，Plant Physiol.101：709-712，1993；Parijs等，Planta 183：258-264，1991；和Bushnell等，Can.J.of PlantPath.20：137-149，1998)

(S)解毒基因，如烟曲霉毒素、白僵菌素、串珠镰刀菌素和玉米烯酮以及它们的结构相关衍生物。例如，见美国专利第5,792,931号。

(T)半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

(U)防御素基因。见WO03000863。

(V)提供线虫抗性的基因。见WO 03/033651和Urwin等，Planta204：472-479，1998。

2.提供除草剂抗性的基因

(A)发现乙酰羟酸合成酶使表达该酶的植物耐受多种类型的昆虫，其已被引入多种植物中(见，例如Hattori等，MoI Gen Genet 246：419，1995)。其它提供昆虫耐性的基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota等，PlantPhysiol.106：17，1994)，谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono等，Plant Cell Physiol 36：1687，1995)和各种磷酸转移酶的基因(Datta等，PlantMoI Biol.20：619，1992)。

(B)抑制生长点或分裂组织的除草剂，如咪唑啉酮或磺酰脲。这个类别的示例基因编码突变体ALS和AHAS酶，例如Lee等，EMBO J.7：1241，1988和Miki等，Theor.Appl.Genet.80：449，1990所描述的。还可见美国专利第5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937；和5,378,824号和国际公布WO 96/33270，其通过引用结合到本文中作为参考。

(C)草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶(EPSP)和aroA基因提供的耐性或抗性)或其它的膦化合物，如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶，PAT)和吸水链霉菌草丁膦乙酰转移酶，bar基因)，和吡啶氧基和苯氧基丙酸和六氢化苯(乙酰辅酶A羧化酶抑制剂编码基因)。见，例如，Shah等的美国专利第4,940,835号公开了EPSPS一种形式的核酸序列，其能提供草甘膦抗性。在Barry等的美国专利第5,627,061号中表述了编码EPSPS的基因。在美国专利2002/0062503中，Al Chen等描述了耐草甘膦的小麦植物。DNA构建体pMON30139通过转化被插入到小麦中，其具有EPSPS基因以及其它元件。还可见美国专利第6,248,876B1；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114B1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36，449；RE 37，287E；和5,491,288号；和国际公布WO 97/04103；WO 00/66746；WO 01/66704；和WO00/66747，其通过引用结合到本文中作为参考。表达编码草甘膦氧化还原酶酶基因的植物也具有草甘膦抗性，在美国专利第5,776,760和5,463,175号中进行了更详细的描述，其通过引用结合到本中作为参考。此外，可通过过量表达编码草甘膦N-乙酰转移酶基因可赋予植物草甘膦抗性。例如，见美国申请第60/244,385；60/377,175和60/377,719。

可以ATCC登录号39256获得编码突变aro基因的DNA分子，在Comai的美国专利第4,769,061号公开了该突变基因的核酸序列。Kumada等的欧洲专利申请第0333033号和Goodman等的美国专利第4,975,374号公开了谷氨酸合成酶基因的核酸序列，其提供对如L-草胺膦的除草剂的抗性。在Leemans等的欧洲专利第0242246号中提供了草胺膦-乙酰转移酶基因的核酸序列。De Greef等，Bio/Technology 7：61，1989描述了表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的嵌合，bar基因的转基因植物。还可见美国专利第5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616B1；和5,879,903号，其通过引用结合到本文中作为参考。Vasil等(Bio/Technology 10：667，1992)报道了通过粒子轰炸和使用bar基因来开发耐受草铵膦的小麦植物。Bar基因的应用还可产生对除草剂双丙氨磷的抗性。提供对苯氧基丙酸和六氢化苯，如稀禾定和吡氟氯禾灵的抗性的示例基因为Marshall等，Theor.Appl.Genet.83：435，1992描述的Ace 1-S1、Ace 1-S2和Ace 1-S3基因。

(D)抑制光合作用的除草剂，如三嗪(psbA和gs+基因)和氰苯(腈水解酶基因)。Przibilla等，Plant Cell 3：169，1991描述了通过编码突变psbA基因的质粒转化衣滴虫。在Stalker的美国专利第4,810,648号中公开了腈水解酶基因的核酸序列，以ATCC登录号53435、67441和67442可获得编码这些基因的DNA分子。Hayes等，Biochem.J.285：173，1992描述了编码谷胱甘肽-S-转移酶的DNA的克隆和表达。

(E)产生叶绿素必须的原卟啉原氧化酶，其对于所有植物的生存都是必需的。原卟啉原酶成为多种除草剂化合物的目标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物，造成它们完全的毁坏。在美国专利第6,288,306B1；6,282,837B1和5,767,373；和国际公布WO 01/12825中描述了具有改变的原卟啉原活性的耐受这些除草剂的植物的开发，其通过引用结合到本中作为参考。

3.赋予或提高粮食品质的基因

(A)高分子量的谷蛋白亚基(HMW-GS)的含量。已分离了不同的HMW亚基的基因克隆(Anderson等，In Proceedings of the 7th InternationalWheat Genetics Symposium，IPR，pp.699-704，1988；Shewry等In OxfordSurveys of Plant Molecular and Cell Biology，pp.163-219，1989；Shewry等Journal of Cereal Sci.15：105-120，1992)。Blechl等(J.Plant Phys.152：703-707，1998)用编码改良的HMW-GS的基因转化了小麦。还可见美国专利第5,650,558；5,914,450；5,985,352；6,174,725；和6,252,134，其通过引用结合到本文中作为参考。

(B)改良的脂肪酸代谢，例如，通过硬脂酰ACP脱饱和酶的反义基因转化植物从而提高植物的硬脂酸含量。见Knultzon等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 89：2624，1992.

(C)降低植酸含量，例如引入植酸酶编码基因可提高植酸的分解，给被转化植物提供更多的游离磷酸。例如，见Van Hartingsveldt等，Gene127：87，1993公开了黑曲霉植酸酶基因的核酸序列。还可见美国专利申请第10/255,817和10/042,894号和国际公布WO 99/05298，WO 03/027243，和WO 02/059324，其通过引用结合到本中作为参考。

(D)例如，通过以编码改变淀粉分支模式的酶的基因转化植物来实现改良碳水化合物组分。见Shiroza等，J.Bacteriol.170：810，1988(变形链球菌果糖基转移酶的核酸序列)；Steinmetz等，MoI.Gen.Genet.200：220，1985(枯草芽孢杆菌6-果糖基转移酶基因的核酸序列)；Pen等，Bio/Technology 10：292，1992(表达地衣芽胞杆菌α-淀粉酶的转基因植物的产生)；Elliot等，Plant Molec.Biol.21：515，1993(番茄转化酶基因核酸序列)，

等，J.Biol.Chem.268：22480，1993(大麦α-淀粉酶基因的定点突变)，和Fisher等，Plant Physiol.102：1045，1993(玉米胚乳淀粉分支酶II)。

4.控制雄性不育的基因

(A)在毡层特异启动子控制下应用化合物N-Ac-PPT引入脱乙酰酶基因(WO 01/29237)。

(B)引入多种雄蕊特异启动子(WO 92/13956，WO 92/13957)。

(C)引入芽胞杆菌RNA酶和芽胞杆菌RNA酶抑制剂基因(Paul等，Plant MoI.Biol.19：611-622，1992)。

5.提供农艺改良、营养改良或工业改良的基因。

(A)提高对干旱或高盐分水条件的水胁迫的耐性。

HVA1蛋白属于3类LEA蛋白，3类LEA蛋白包括其它的成员，如小麦pMA2005、棉花D-7、胡萝卜Dc3和油菜pLEA76。这些蛋白质的特征在于11mer氨基酸结构域的串联重复，其可形成可能的双染性α-螺旋结构，该结构具有带有疏水条纹的亲水表面。大麦HVA1基因和小麦pMA2005基因在核酸水平和预测的氨基酸水平上高度相似。这两个单子叶基因与棉花D-7基因和胡萝卜Dc3基因密切相关，它们共用相似的结构基因构成。因此LEA基因表达或LEA蛋白积累与多种植物的耐逆性之间具有联系。例如，在严重脱水的小麦幼苗中，高水平的3类LEA蛋白的积累与组织的脱水耐受性相关(Ried和Walker-Simmons，1993)。对水稻的几种籼稻品种的研究显示2类LEA蛋白(也称为脱水素)和3类LEA蛋白在根中的水平与敏感品种相比显著高于耐盐品种的。大麦HVA1基因被转化到小麦种。被转化的小麦植株对水胁迫表现出耐受性提高(Sivamani et al.Plant Science155：1-9，2000，and U.S.Pat.No.5,981,842.)。

(B)另外一个实施例，通过细菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因来提高甘露醇水平从而提高水胁迫耐性。为了产生具有对付缺水的遗传基础的植物，Tarczynski等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2600，1992；WO 92/19731，公开的No.12，1992；Science 259：508，1993)通过土壤杆菌介导的转化在烟草细胞中引入细菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因，mtlD。从这些被转化烟草细胞再生的转基因植物的根和叶组织含有多达100mM的甘露醇。对照植物不含有可检测到的甘露醇。为了确定转基因烟草植株是否对缺水表现出提高的耐受性，Tarczynski等将在有250mM的NaCl的存在下的转基因植物的生长与非转化对照植物进行了比较。在接触250mM的NaCl 30天之后，转基因植物的重量损失减少，相对于其非转基因的对照重量提高。作者得出这些转化烟草植物中的甘露醇有助于细胞水平的缺水耐受性。还可见美国专利第5,780,709号，和国际公布WO 92/19731，其通过引用结合到本中作为参考。已经发展了多种植物转化的方法，包括生物的和物理的植物转化方法。见，例如Miki等，《Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology》，Glick and Thompson，eds中的《Procedures for IntroducingForeign DNA into Plants》(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)pp.67-88。此外，现有表达载体和植物细胞的体外培养或植物的组织转化和再生。见，例如Gruber等，《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》Glick，B.R.and Thompson，J.E.Eds.中的《Vectors for Plant Transformation》(CRC Press，Inc.，Boca Raton，1993)P：89-119。

以上所述的转基因还可通过传统的育种法使用具有感兴趣的转基因的植物作为一个亲本来引入到本发明的耐草甘膦植物中。

本发明的耐草甘膦植物的突变

本发明的其它实施方案是用突变剂处理本发明的耐草甘膦小麦基因型和通过这样的突变产生的植物。在IAEA′s Manual on Mutation Breeding(IAEA，1977)中有关于突变剂和诱变种子或花粉的信息，可在C.F.Konzak，《Wheat and Wheat Improvement》第二版，ed.Heyne，1987的7B章《Mutations and Mutation Breeding》中找到关于突变育种的其它信息。

回交转换

本发明的其它实施方案是本发明的耐草甘膦小麦基因型的回交转换。当通过传统育种技术(非转化)引入DNA序列时，进行回交转换，如回交。无论是天然产生的或转基因DNA序列可使用这些传统的育种技术被引入。通过这些方法转移的理想性状包括，但是不限定于营养改良、工业改良、抗病性、抗虫性、除草剂抗性、农艺改良、粮食品质改良、蜡质淀粉、育种改良、种子生产改良和雄性不育。在K.A.Lucken的《Hybrid Wheat》(《Wheat and Wheat Improvement》ed.Heyne，1987的pp.444-452中讨论了胞质雄性不育基因、核雄性不育基因、化学杂交剂、雄性不育恢复基因和后面提到的使用的方法。其它性状基因的实施例包括：叶锈病抗性基因(Lr系列，如LrI、LrIO、Lr21、Lr22、Lr22a、Lr32、Lr37、Lr41、Lr42、和Lr43)，赤霉病抗性基因(QFhs.ndsu-3B和QFhs.ndsu-2A)，白粉病抗性基因(Wsml)，普通腥黑穗病抗性基因(Bt-IO)，和小麦条纹花叶病毒抗性基因(Wsml)，小麦双尾蚜抗性基因(Dn系列，如DnI、Dn2、Dn4、Dn5)、秆锈病抗性基因(Sr38)，黄锈病抗性基因(Yr系列，如YrI、YrSD、Yrsu、YrI 7、YrI 5、YrH52)、耐铝性基因(AIt(BH))，矮杆基因(Rht)，春化基因(Vm)，小麦瘿蚊抗性基因(H9、HlO、H21、H29)，粮食颜色基因(R/r)，草甘膦抗性基因(EPSPS)，草铵膦基因(bar、pat)和水胁迫耐性基因(Hval、mtID)。将感兴趣的性状从供体亲本转移到回交亲本，在这种情况下，本文公开的小麦植株。

单基因性状可来源于显性等位基因或隐性等位基因。通过直接选择与显性等位基因相联系的性状来选择具有感兴趣的性状的后代。具有通过隐性等位基因转移的性状的后代的选择必须种植和销售第一回交代从而确定哪个植株携带该隐性基因。隐性性状可能需要连续回交代中的额外的后代测试从而确定感兴趣的基因的存在。

本发明的另外一个实施方案是发展本发明的耐草甘膦小麦基因型的小麦植株的回交转换的方法，其涉及与本发明的耐草甘膦小麦基因型之一反复回交。回交的次数可以为2、3、4、5、6或更多，使用的回交的特定数目取决于供体亲本的遗传学和在回交设计中是否使用分子标记。见，例如《Principles of Cultivar Development》，Fehr，W.R.Ed.(Macmillan PublishingCompany，New York，1987)pp.722-723的《Wheat》，其通过引用结合本文中作为参考。通过使用回交法，所属领域的一般技术人员可发展具有至少70％、75％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的理想的小麦品种的或用于回交的基因型的遗传概貌。可通过系谱分析或通过使用遗传技术，如分子标记或电泳来测量回交转换中具有的遗传百分比。在系谱分析中，在与另外一个品系杂交之后平均50％的起始种质会被传递给后代，回交一次之后是75％，回交两次之后是87.5％，等等。分子标记也被用于证实和/或确定使用的回交亲本。从这种方法发展的回交转换会与回交亲本的相似。可通过表型逐一比较来测量这种相似性，以5％的显著水平来确定差异和相似。任何这样的比较都应是在造成被转移性状的环境条件下进行。

主体衍生品种

本发明的另外一个实施方案是任意本发明的耐草甘膦小麦基因型的主体衍生品种。根据UPOV公约规定，主体衍生品种可以通过，例如选择自然或诱导的突变体，或体细胞无性系变异体，从原始品种的植株选择变异个体，回交，或通过基因工程转化获得。进一步，将任意本发明的耐草甘膦小麦基因型的主体衍生品种定义为其生产必须重复使用这样的小麦基因型的或主要来源于这样的小麦基因型的(《International Convention for theProtection of New Varieties of Plants》1991年3月19日，修正，V章，14文章，5(c)部分).。

植物育种

本发明还涉及在植物育种中应用本发明的耐草甘膦小麦基因型的方法。

这样的一个实施方案是将本发明的耐草甘膦小麦基因型之一与小麦的其它品种杂交从而产生F1植株的第一代群体。通过这种方法产生第一代F1植株群体也是本发明的实施方案。该F1植株第一代群体应该包含所选的本发明的小麦基因型的一套基本完整的等位基因。所属领域的一般技术人员可使用育种手册或细胞学方法来确定这种方式中产生的特定F1植株，任意这样的个体植株也包含在本发明中。这些实施方案还包含应用转基因或回交转换本发明的耐草甘膦小麦基因型之一来产生第一代F1植株。

本发明的另外一个实施方案是发展后代小麦植株的方法，其包含将本发明的耐草甘膦小麦基因型之一与第二个小麦植株杂交。产生源于本发明的耐草甘膦小麦基因型之一的品系的特殊方法如下。所属领域的一般技术人员将本发明的耐草甘膦小麦基因型之一与另外一个小麦品种，如优良品种进行杂交。可种植通过该杂交产生的F1种子从而形成同类群体。F1种子含有一套选择的本发明的耐草甘膦小麦基因型的等位基因，和一套另外一个小麦品种的等位基因。F1基因组由50％的所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型和50％的优良品种构成。种植F1种子，并且使其自交，从而形成F2种子。平均来说，F2种子会具有50％的所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型的等位基因和50％的另外一个小麦品种的，但是该群体的多个个体植株具有比例更多的来源于所选的本发明的小麦基因型的等位基因(Wang J.和R.Bernardo，2000，Crop Sci.40：659-665；Bernardo，R.和A.L.Kahler，2001，Theor.Appl.Genet 102：986-992)。种植F2种子，根据表观观察和/或性状测量来选择植物。选择表现一个或多个来源于所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型的理想性状的后代，如草甘膦耐性，并且分别收获每个植株。以独立的行来种植每个植株的F3种子，并且使其自交。收获选择的行或行中的植株，单独脱粒。再次根据表观观察和/或测量需要的植株性状(如草甘膦耐性)来进行选择。重复种植和选择过程数次，直到获得源于所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型的纯合小麦植株。该纯合小麦植株具有源于所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型的理想性状，其中的一些性状未被与所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型的杂交的另外一个原始小麦品种表现出来，而一些由俩各种小麦品种都表现出来，但是目前处于与所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型表现的相同或更高的水平上。这样获得的纯合小麦植株，平均上其基因的50％来源与所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型，但是该群体的多个个体植株具有的等位基因更大比例地来源于所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型。可重复杂交、自交和选择的育种过程从而产生另外一个小麦植株群体，平均来说其基因的25％来源于所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型，但是该群体的多个个体植株具有的等位基因更大比例地来源于其。本发明的另外一个实施方案是接受了一个或多个来源于本发明的耐草甘膦小麦基因型之一的性状的纯合小麦植株，性状包括但是不限定于草甘膦耐性。可以以数种方式来改良前述的实施例，例如可在每一个自交代及逆行那个或不进行选择，可在确实的自花授粉过程发生之前或之后进行选择，或者在所描述的育种过程的任何时间点通过收获个体麦穗、植株、行或地块来进行个体选择。此外，可在该过程的任何步骤中使用双单倍体育种法。在每一个和任何自交代产生的植株群体也是本发明的实施方案，每个这样的群体由其基因的50％来源于所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型，其基因的25％来源于第二轮杂交、自交和选择中所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型，其基因的12.5％来源于第三轮轮杂交、自交和选择中所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型，等等的植株构成。

本发明的另外一个实施方案是获得来源于本发明的草甘膦小麦基因型的纯合小麦植株的方法，该方法是通过将所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型与另外一个小麦品种杂交，并且对F1种子或F1植株或通过该杂交的自交获得任意世代的小麦应用双单倍体法。

此外，本发明还涉及来源于本发明的耐草甘膦小麦基因型的纯合小麦植株的方法，该方法是通过将所选的本发明的草甘膦小麦基因型与小麦植株进行杂交，种植后代种子，随着种植步骤，重复与所选的本发明的耐草甘膦小麦基因型进行杂交或自交1至2次，1至3次，1至4次，或1至5次。因此，任意和所有的使用本发明的耐草甘膦小麦基因型的方法是本发明的一部分，包括自交、系谱育种、回交、产生杂交植物以及群体杂交。所属领域的一般技术人员可应用独特的淀粉谱、分子标记谱和/或育种记录来鉴定从这些育种法得到的后代品系或群体。

此外，本发明还包含与本发明的耐草甘膦小麦基因型相同的或更高的草甘膦耐性、产量、耐寒性和/或抗倒性的后代。可通过逐一的表型比较来测量这些性状的表现，以5％的显著水平来确定差异或相似性。任意这样的比较应该在相同的环境条件下进行。

通过参考以下的实施例能更好地理解本发明，这些实施例只是要显示目前所知的操作本发明的最佳模式。也不应认为本发明的范围限定于其。

具体实施方式

实施例1：通过大量筛选分离的草甘膦抗性突变体

2006年，在温室和大田中，对诱变的小麦植株进行大规模的草甘膦抗性筛选工作(表1)。在温室评价中，对用EMS诱变的四个春小麦品种的总计349,000个M2植株进行对草甘膦抗性的评价，喷雾施用和溶液培养都被采用。其中，20个植株耐受草甘膦；但是，以18oz/A Roundup ULTRA^TM再次进行检测，没有M3后代存活下来。2006年6月，在Pullman，WA的Spillman农场进行了Louise、Hollis、Tara 2002和Macon的一百五十万M2植株的大田评价。以草甘膦喷雾M2小麦植株两次：1)6月2号，6oz/ARoundup ULTRA^TM；和2)6月20号，9oz/A Roundup ULTRA^TM。总共157个M2植株存活(表2)。6月29号，这些假定为耐草甘膦植株被从大田移植到温室，8月收获每个自花授粉品系得到的M3。再次以18oz/ARoundup ULTRA^TM测试这些M3植株。其中，74株显示出不同程度的草甘膦耐性(表1)。具有高存活比例的M3家族中，还根据用于育种工作的杂交亲本的适当性将植株归类。基于作为切实可行的草甘膦抗性候选的考虑，去除了在草甘膦处理之后植物活力弱或生长速率慢的植株。例如，LouiseFR1-04和LouiseFR1-05都具有高存活百分率；但是，LouiseFR1-04的表型健康正常，而LouiseFR1-05具有不理想的短杆、多叶的外观，会限制繁殖能力。

表1.2005和2006年在温室和大田试验中筛选草甘膦耐性的EMS诱变的M2小麦植株的数量。还有假定的M2存活株的M3后代的再一次测试的数据。

	温室2005	温室2006	大田2006
				筛选的M2植株数	265,000	349,000	一百五十万
Roundup ULTRA的施用量	18oz/A	9oz/A	第一次施用：6oz/A第二次施用：9oz/A
				识别的假定耐草甘膦M2植株的数目	4	20	157
具有一些草甘膦耐受水平的M3家族	1“GT-Louise”	0	74

在表2、3、4和5中报告了在三叶期对M3家族的个体喷雾18oz/ARoundup ULTRA^TM一次的存活数据(存活＝耐受或抗草甘膦；死亡＝对草甘膦敏感或易感染草甘膦)。卡方(X2)统计分析(其测试预期的与观察到的分离比率的吻合度)被用于分析存活数据从而确定每个被测试的M3中的草甘膦抗性是来自单基因还是两个基因的突变。在表6中列出了具有显著卡方值的来源于这些M3家族的M4植株的重新测试。

表2.2006年大田试验中从现场营救(FR)的抗草甘膦M2突变体的M3植株的筛选结果。温室中，在三叶期以18oz/A Roundup ULTRA^TM喷雾M3植株一次。根据卡方分析，存活数据符合(X²＜3.84)3草甘膦敏感性(死亡)对1草甘膦耐性(存活)的分离比率，显示在每个突变体中存在单隐性的草甘膦抗性基因。

1.“死亡”表示该植株易受到草甘膦的感染。

2.“存活”表示该植株可抗18oz/A Roundup ULTRA^TM

3.“健康正常”表示该植株在表型上与未诱变的春小麦植株相似。这些个体代表了我们用EMS产生的最佳的单基因突变的实施例，其产生高水平的草甘膦除草剂耐性。

在表2中列出的所有基因型的分离率符合预期的单隐性基因的分离率。在每种情况下，大约75％的被测试的M3个体对草甘膦敏感(即，易感)，而25％耐受(即，抗)完全的商业施用速率。

表3.2006年大田试验中从现场营救(FR)的抗草甘膦的M2突变体的M3植株的筛选结果。温室中，在三叶期以18oz/A Roundup ULTRA^TM喷雾M3植株一次。根据卡方分析，存活数据符合(X²＜3.84)1草甘膦敏感性(死亡)对3草甘膦耐性(存活)的分离比率，显示在每个突变体中存在单显性的草甘膦抗性基因。

在表3中列出的三种基因型的分离率符合预期的单显性基因的分离率。在每种情况下，大约25％的被测试的M3个体对草甘膦敏感(即，易感)，而75％耐受(即，抗)18oz/A的RoundUp ULTRA^TM。

表4列出的二十六个基因型的M3个体的存活数据与预期的敏感(易感)对耐性(抗性)植株的15∶1分离比率一致，其符合对双基因性状的预期。在每个情况下，大约93.75％的测试M3个体对草甘膦敏感，而6.25％耐受18oz/A的RoundUp ULTRA^TM。在这种情况下，两个独特基因中的隐性突变导致草甘膦耐性提高。

我们的某些耐草甘膦小麦突变体是由位于相同的或不同的染色体上的两个基因中发生的突变造成的。这些结果显示了使用EMS诱变可在植物中产生多种类型的草甘膦遗传抗性(即，单一或两个基因)。它们还支持联合多个独立表现时耐受的草甘膦施用量低于商业应用建议的草甘膦耐性基因，将其应用在育种方法中从而产生草甘膦抗性品种的观念。这种策略还可被用于防止草甘膦抗性扩散到与小麦亲缘关系近的杂草种群(即，山羊草)。对于除草剂抗性作物植物来说，显性除草剂抗性基因向杂草种群的转移是慎重考虑的问题。如果，草甘膦抗性是一个或两个隐性突变的结果，由与杂草的远缘杂交形成F1植株经草甘膦的处理不能存活，并且也不可能产生抗性后代。

在温室中进行具有单隐性或单显性和双隐性基因或双显性基因的显著卡方值的M3家族的重新测试。在表6中列出了重新测试的结果。RoundUpULTRA^TM的施用量提高到27oz/A或更高，与商业施用建议一致。

表4.2006年温室试验中从现场营救(FR)的抗草甘膦的M2突变体的M3后代的筛选结果。温室中，在三叶期以18oz/A Roundup ULTRA^TM喷雾M3植株一次。根据卡方分析，存活数据符合(X²＜3.84)15草甘膦敏感性(死亡)对1草甘膦耐性(存活)的分离比率，显示在每个突变体中存在双隐性的草甘膦抗性基因。

MaconFR1-02	69	5	74	6.76	69.38	4.63	0.03
								MaconFR1-04	53	5	58	8.62	54.38	3.63	0.56
MaconFR1-16	74	2	76	2.63	71.25	4.75	1.70
								MaconFR1-16	98	3	101	2.97	94.69	6.31	1.85
MaconFR1-18	167	11	178	6.18	166.88	11.13	0.00
								MaconFR1-21	141	4	145	2.76	135.94	9.06	3.02
MaconFR1-22	79	10	89	11.24	83.44	5.56	3.78
								TaraFR1-12	67	3	70	4.29	65.53	4.38	0.46
TaraFR1-14	126	5	131	3.82	122.81	8.19	1.32
								TaraFR1-16	168	10	178	5.62	166.88	11.13	0.12
TaraFR1-17	172	6	178	3.37	166.88	11.13	2.52
								TaraFR1-24	128	5	133	3.76	124.69	8.31	1.41
TaraFR1-25	83	6	89	6.74	83.44	5.56	0.04
								HollisFR1-11	86	3	89	3.37	83.44	5.56	1.26
LouiseFR1-47	87	2	89	2.25	83.44	5.56	2.43

LouiseFR1-53	82	7	89	7.87	83.44	5.56	0.40
								LouiseFR1-58	86	3	89	3.37	83.44	5.56	1.26

表5.2006年温室试验中从现场营救(FR)的抗草甘膦的M2突变体的M3后代的筛选结果。温室中，在三叶期以18oz/A Roundup ULTRA^TM喷雾M3植株一次。根据卡方分析，存活数据符合(X²＜3.84)1草甘膦敏感性(死亡)对15草甘膦耐性(存活)的分离比率，显示在每个突变体中存在双显性的草甘膦抗性基因。

表6.2006年温室的重新试验中从现场营救(FR)的抗草甘膦的M3突变体的M4后代的筛选结果，以M3世代中单一或双基因模式的显著卡方值。在三叶期以27oz/A Roundup ULTRA^TM喷雾M4植株一次。根据卡方分析，存活数据符合(X²＜3.84)草甘膦敏感(死亡)对草甘膦耐受(存活)为3∶1(单隐性基因)、1∶3(单显性基因)、1∶15(双显性基因)或15∶1(双隐性基因)的预期分离比率。

2007年的春季，对2006年的温室重新试验中抗草甘膦的现场挽救(FR)M3突变体的M4后代进行大田试验。2007年5月24日施用Roundup ULTRA形式的草甘膦。使用蒙面喷杆喷雾机施用0.84kg ae/ha(32oz/A)和1.68kgae/ha(64oz/A)。喷雾嘴(Teejet XR 80015)离覆盖物14英寸远，并且高于其12英寸。在植株的5叶期和1-2分蘖期施用。气候条件是晴天，63-65华氏温度，南风转西风。土壤温度是140C。2007年6月15日收获存活株，并且移植到温室的容器中。

移植的包括一株来自15FR M4品系的32oz/A存活株。这些M4品系中的6个来源于相同的M3突变体，TaraFR1-15。

剩余的由于收获晚而未包括在大田试验中的FR M3突变体的M4后代在温室中通过使用32oz/A和64oz/A的施用量来被重新试验。收获所有M4存活株的M5种子，其于2008年在大田中以64oz/A和128oz/A的草甘膦喷雾量被重新测试。在实施例3中列出了存活株。

2007年春季，Louise、Hollis、Tara 2002、Macon和Zak的M2种子集合也被种植在WA，Pullman的Spillman农场的大田中。大约种植了970，000颗种子，在5月18日用64oz/A RoundUp ULTRA喷雾产生的幼苗。6月20日，一百个存活株被从大田移植到温室的容器中。这些M2存活株已产生自花授粉的种子。2008年的春季，以64oz/A和128oz/A.施用量在大田中重新测试存活的M3后代，没有存活株。

选择大田或温室筛选中在64oz/A的草甘膦施用量下存活的基因型作为将草甘膦抗性基因通过基因渗入到改良的春小麦作物中的育种亲本，并且在表7中列出。

表7.温室或大田试验中耐受64oz/A的Roundup ULTRA^TM的基因型列表。这些基因型代表了根据表型特征和/或草甘膦抗性的单隐性或双隐性基因的分离比率选择的育种候选。

IGT07092-0	中度正常	15∶1
			TaraFR1-20-2	健康正常	15∶1
Re-Mut 3.1 M3 Bulk	中度正常	3∶1
			Re-Mut 3.2 M3 Bulk	中度正常	15∶1
Re-Mut 3.3 M3 Bulk	中度正常	3∶1
			Re-Mut 3.4 M3 Bulk	中度正常	3∶1
Re-Mut 3.5 M3 Bulk	中度正常	3∶1
			MaconFR1-16 M4 Bulk	中度正常	15∶1
Re-Mut GTL 3.4-10*	健康正常	N/A
			TaraFR1-15-57*	健康正常	N/A

Louise M2 Bulk FR21-45*	全部健康正常	N/A
			Alpowa M2 Bulk FR21-32*	30个健康正常；2个矮化	N/A
Macon M2 Bulk FR21-10*	全部健康正常	N/A
			Louise Double Mutated M2 Bulk FR 21-13*	全部健康正常	N/A

1“健康正常”表示该植株与未诱变的春小麦植株在表型上相似。“中度”表示植株不如未诱变的春小麦植株旺盛，但是仍然表现正常。

2根据卡方分析，存活数据符合(X²＜3.84)草甘膦敏感(死亡)比草甘膦耐受(存活)为3∶1(单隐性基因)或15∶1(双隐性基因)的比率。

^*在Pullman，WA的Spillman农场筛选这些品系。为了确定分离比率，在温室中进行重新试验。

注意，在表7中，Louise M2 Bulk FR2 1-45、Alpowa M2 Bulk FR2 1-32、Macon M2 Bulk FR2 1-10和Louise Double Mutated M2 Bulk FR2 1-13代表这些M2集合的100个存活个体。例如，Louise M2 Bulk FR2有45个存活株，分别命名为M2 Bulk FR2-1、Louise M2 Bulk FR2-2等。

实施例2：识别GT-Louise的增强物

只耐受单次9oz/A的草甘膦施用的GT-Louise的耐草甘膦表型可通过在第二个基因制造突变来被提高，其可以在两次施用9oz/A的草甘膦之后存活。为了实现其，EMS再次诱变GT-Louise的M4作物，重新诱变的GT-Louise得到的M1种子被发展成M2，从而筛选草甘膦耐受水平的第二个基因的增强突变。在重新诱变的48个GT-Louise M3种子中，43个发芽并且自花授粉获得M2种子用于筛选。在温室中总共种植了13,706个重新诱变的GT-Louise种子，在2-3叶期首先用9oz/A的Roundup ULTRA^TM喷雾产生的M2植株。7天后，以9oz/A Roundup ULTRA^TM进行第二次的草甘膦施用。其中，751个M2植株在两次草甘膦施用中存活，表示这些植株可能在产生高于GT-Louise的草甘膦耐性的第二个基因具有突变。使这些M2植株自花授粉，重新测试得到的M3后代从而确定这种提高的草甘膦耐性水平是可遗传的。在751个M2存活株中，57个被认为是草甘膦耐性提高的优秀的候选者，因为施用两次6oz/A的草甘膦之后，在这些植株的被喷雾的叶子只表现出轻微的损伤，并且除了产生新的叶子和分蘖之外，继续生长。因为原始的GT-Louise的叶子在接触一次9oz/A比率的草甘膦之后死亡，然后产生新的分蘖，这些57个候选可能在被喷雾的叶子上产生提高的草甘膦耐性的第二个基因上具有新的突变。在剩余的694个M2存活株中，154个被认为是更好的候选者，因为在喷雾造成开始的两个叶子死亡之后，在根茎出现旺盛的再生长。这种再生长表现地比在其它的候选者和原始的GT-Louise中见到的更旺盛。如实施例1中对FR突变体，2007年春季，在大田试验中筛选396个Re-Mut GTL M2存活株的M3种子。6月15日从大田收获存活株，并且移植到温室中。移植的包括一个来源20Re-Mut GTL M3品系的32oz/A存活株。来源于相同的M2品系的M3品系的个体也在大田筛选中存活：Re-Mut GTL 3.33-1具有13个32oz/A存活株，Re-Mut GTL 3.33-8具有3个32oz/A存活株，Re-Mut GTL 3.33-11具有4个32oz/A存活株。

，收获M3的M4种子，并且在2007年秋季的温室筛选和2008年春季的大田筛选中使用64oz/A和128oz/A的RoundUp ULTRA^TM被重新测试。以这种施用量重新试验的M4植株没有存活的。提高草甘膦耐受水平的第二个方法涉及GT-Louise与同源配对突变体Ph1的杂交。2006年秋季，在GT-Louise和Ph1突变体之间进行杂交。种植这些杂交的F1种子，提高到F2代，使用18oz/A的RoundUp ULTRA^TM在温室中筛选F2植株。从两次杂交的后代得到存活株(IGT07004-No.1和No.2)(表8)，提高到F3代。以32oz/A和64oz/A的喷雾量重新测试F3植株。以32oz/A的喷雾量从IGT07004-No.2-0-1回收存活株。该杂交(IGT07004-No.2)的F2和F3的存活数据都符合3∶1的草甘膦敏感(死亡)对草甘膦耐受(存活)的比率，显示存在双隐性基因(表8)。

表8.2007年的温室试验中GT-Louise与Ph1杂交的F2和F3后代的筛选结果。在三叶期，以18oz/A Roundup ULTRA^TM喷雾F2植株一次。在三叶期，以32oz/A Roundup ULTRA^TM喷雾F3植株一次。根据卡方分析，对于IGT07004-No.1-0，存活数据符合(X²＜3.84)草甘膦敏感*死亡)对草甘膦(存活)为3∶1(单隐性基因)的比率，对于IGT07004-No.2-0和IGT07004-No.2-0-1为15∶1(双隐性基因)。

提高草甘膦遗传抗性

为了将独特的草甘膦抗性基因组合到同一基因型中，在温室中使用标准控制的交叉杂交的方法，已将Re-Mut GTL与GT-Louise和FR突变体进行杂交，以及相互杂交。我们希望单一突变体的两个或三个草甘膦耐性基因的组合效果会提供比任何一个单独基因提供的更高的耐受水平。

2006-2007的秋和冬季，在耐草甘膦突变体之间进行了147次杂交，对于提高的草甘膦耐性，标记为“IGT”。每次杂交得到的F 1杂交体自花授粉从而产生独立的用于除草剂筛选的F2后代。在温室中，以32oz/A和64oz/A的Roundup ULTRA^TM筛选这些F2后代，存活株被发展成下一代，随后在2008年在大田中以64oz/A(2x)和128oz/A(4x)使用比率的RoundupULTRA^TM重新测试。在实施例3中列出了2x和4x使用比率的草甘膦的存活株。重复重新试验，直到识别承受64oz/A比率的Roundup ULTRA^TM的纯合抗性品系。将独特的草甘膦抗性基因组合到同一基因型中的另外一个方法设计表6中列出的FR突变体(其表现出具有单隐性基因、单显性基因、双隐性基因和双显性基因)的杂交。2007年春季，建立了由以27oz/A喷雾的RoundUp ULTRA^TM存活的M4FR突变体构成的杂交区组。进行了半双列交配设计的60次杂交。在表6列出的IGT品系、Re-Mut GTL品系和FRI品系的Ix和2x存活株中进行了额外的杂交。对于草甘膦耐性提高的F1群体标记为“EGT”。2007年夏季晚期，收获F1种子，并且将其发展成F2代。2008年春季，在温室和大田中，以64oz/A和128oz/A的使用比率重新测试F2。在实施例3中列出了这些重新试验的存活株。

实施例3：大田筛选提高的草甘膦耐性突变体

2008年，在大田筛选中，5个新的耐草甘膦小麦基因型被确定为M2假定突变。使用前述的方法，但是以更高浓度的3.36kg酸当量每公顷(ae/ha)(4x大田施用量，128oz/A，3lbs.ae/A)的草甘膦来分离。分离数为Tara 0.4.1，Tara 0.4.2，Tara 0.4.3，Tara 0.4.4，和Louise FR3-1。以下的在温室筛选中显示了对64盎司每英亩(oz/A)的抗性：Tara 0.4.5和Tara 0.4.6。

2007年种植季确定的基因型在2008年在大田中被重新测试。以下的基因型在1.68kg ae/ha(2x大田施用量，64oz/A，1.5Ib ae/A)的草甘膦下存活：Macon FR3-1M2、GT-Louise和Louise FR1-62。只有一个单一突变事件的基因型在4x大田施用量(3.36kg ae/ha草甘膦)下存活，Louise FR1-42。

应注意，因为通过连续传代和选择遗传背景变得更清楚，GT-Louise M6在2x大田施用量

(1.68kg ae/ha)下存活。我们已确定与野生型的Louise相比，GT-Louise对草甘膦反应随着时间累积的莽草酸水平较低。该数据证实GT-Louise突变改变了草甘膦除草剂的目标-莽草酸途径。GT-Louise与背景不是草甘膦耐受的进行回交。以下的表9的该杂交的F2分离分析与单基因隐性性状一致。

表9.GT-Louise与非草甘膦耐性小麦的回交的F2分离分析

已通过独立的耐草甘膦基因型与另外一个的杂交，在将草甘膦耐性提高到更高浓度的草甘膦上取得进展，也就是，通过“基因聚合”。多种基因型被确定为在温室中提供对1×和2×的施用量的一致抗性，可被用于杂交。这些品系包括，但是不限定于：GT-Louise、Louise FR1-33-6、LouiseFR1-65-2、Louise FR1-43、Hollis FR1-9-14、Tara FR1-15-94-(alias Neo)、Tara FR1-20-2和它们的后代。2008年的大田筛选中，杂交的在1.68kg ae/ha(2x)下存活的F2后代(EGT群体)包括：EGT07073-0、EGT07081-0、EGT07100-0、EGT07111-0、EGT07118-0、EGT07130-0、EGT07132-0、EGT07138-0、EGT07139-0、EGT07140-0、EGT07143-0、EGT07146-0、EGT07149-0、EGT07154-0、EGT07155-0、EGT07156-0、EGT07158-0和EGT070180-0。2008年温室筛选中，杂交的在1.68kg ae/ha(2×)下存活的F2后代(EGT群体)包括：EGT07012、EGT07089和EGT07194。2008年的大田筛选中，杂交的在1.68kg ae/ha(2×)下存活的F3植株(IGT群体)包括：IGT07011-0-0、IGT07013-0-0、IGT07028-0-0、IGT07029-0-0、IGT07064-0-0、IGT07073-0-0。2008年温室筛选中，杂交的在1.68kg ae/ha(2×)下存活的F3植株(IGT群体)包括：IGT07041-0-0、IGT07050-0-0和IGT07073-0-0。2008年的大田筛选中，杂交的在3.36kg ae/ha(4×)下存活的F2植株(EGT群体)包括：EGT07162-0，2008年的大田筛选中，杂交的在3.36kg ae/ha(4×)下存活的F3植株(IGT群体)包括：IGT07022-0-0、IGT07027-0-0、IGT07030-0-0、IGT07031-0-0和IGT07074-0-0。

实施例4：恢复草甘膦抗性突变体的育种计划

根据自花授粉的突变体之间的遗传分离数据，通过该研究确定的几个耐草甘膦(GT)品系可能具有单基因或双基因抗性机制。因此，预期到以下的结果。

除草剂草甘膦的遗传抗性的单基因模式

a.通过单显性基因产生草甘膦抗性

预期，当以1×商业施用量的草甘膦喷雾时，在杂合植株的自花授粉的后代中存活对死亡的分离率为3(75％)∶1(25％)。

b.通过单隐性基因产生草甘膦抗性

预期，当以1×商业施用量的草甘膦喷雾时，在杂合植株的自花授粉的后代中存活对死亡的分离率为1(25％)∶7(75％)。

c.通过单半显性(加性)基因产生的草甘膦抗性

预期，当以1×商业施用量的草甘膦喷雾时，在杂合植株的自花授粉的后代中存活对中度(即，慢性死亡或耐受较低的除草剂比率)对死亡的分离率为1(25％)∶2(50％)∶1(25％)。

除草剂草甘膦的遗传抗性的双基因模式

a.通过双显性基因产生的草甘膦抗性

预期，当以1×商业施用量的草甘膦喷雾时，在杂合植株的自花授粉的后代中存活对死亡的分离率为15(93.75％)∶1(6.25％)。

b.通过双隐性性基因产生的草甘膦抗性

预期，当以1×商业施用量的草甘膦喷雾时，在杂合植株的自花授粉的后代中存活对死亡的分离率为1(6.25％)∶15(93.75％)。

c.通过一个显性基因和一个隐性基因产生的草甘膦抗性

预期，当以1×商业施用量的草甘膦喷雾时，在杂合植株的自花授粉的后代中存活对中度(即，慢性死亡或耐受较低的除草剂比率)对死亡的分离率为3(18.75％)∶13(62.50％)∶3(18.75％)。

部署有效的单基因或双基因草甘膦抗性

对于商业种植，考虑到当通过使用拖拉机或飞机施用法施用除草剂的途径中的喷雾过量，优选耐草甘膦小麦品种在1×至2×(分别为32oz/A和64oz/A的Roundup Ultra

)推荐的大田施用量下存活。对于对RoundupUltra

的商业施用量产生抗性的耐草甘膦基因，使用以下的方法将基因部署在改良的春小麦种植中。

部署单基因的草甘膦除草剂抗性

通过单显性基因产生的草甘膦抗性

改良品系(易感草甘膦)与耐草甘膦突变体品系交叉杂交。种植种子，以32oz/A Roundup Ultra喷雾产生的F1杂交植株从而证实在杂交过程中抗性基因被转移。使存活的F1植株自花授粉，收获产生的F2种子。种植种子，以32oz/A Roundup Ultra

喷雾产生的F2植株。预期百分之七十五的F2后代存活。存活植株自花授粉，收获产生的F3种子。以32oz/A的Roundup Ultra

筛选F3植株从而识别对于显性草甘膦抗性基因纯合的个体。具有显性草甘膦抗性基因纯合的F2植株的所有F3后代在商业施用量的草甘膦下存活。如果出现存活分离，产生F3家族的F2个体对于草甘膦抗性基因是杂合的。杂合的F2或F3被用作通过回交将该基因渗入到改良的种质的供体亲本，或用作传统的向前式育种杂交的亲本。在每个世代发展过程中，基于筛选的目的使用商业施用量的Roundup Ultra

，无论使用哪个基因部署方法来保证转移抗性基因和/或该基因存在于纯合状态中。

b.通过单隐性基因产生的草甘膦抗性

改良品系(易感草甘膦)与耐草甘膦突变体品系交叉杂交。种植种子，但是产生的F1植株未经草甘膦喷雾，因为该隐性基因被掩盖在杂合状态中(即，杂交植株易受到草甘膦感染)。从种植在温室中的自花授粉的F1植株收获F2种子。以32oz/A Roundup Ultra喷雾F2植株。预期，百分之二十五的F2后代的隐性草甘膦抗性基因是纯合的，在草甘膦处理中能够存活。使存活株自花授粉从而产生F3种子用于种植。以32oz/A的RoundupUltra

喷雾产生的F3植株，从而识别隐性草甘膦抗性基因是纯合的个体。存活的F2植株的所有后代在商业施用量的草甘膦下应该能够存活。纯合的F2或F3植株被用作通过回交育种将该基因渗入到改良种质中的供体亲本，或用作传统的向前式的育种杂交的亲本。在每代杂交之后，产生的杂交植株自花授粉，应以商业施用量的Roundup Ultra

筛选产生的后代从而保证该隐性抗性基因以纯合状态存在。

c.通过单半显性(加性)基因产生的草甘膦抗性

由于加性基因这一性质，当显性基因以纯合状态存在时，预期草甘膦抗性为最高表达水平。因此，以上的“a”中提出的部署策略可被用于部署该基因。

部署双基因草甘膦除草剂抗性

a.通过双显性基因产生的草甘膦抗性

改良品系(易感草甘膦)与耐草甘膦突变体品系交叉杂交。在温室中种植产生的种子，以32oz/A Roundup Ultra喷雾产生的F1杂交植株从而证实在杂交的过程中抗性基因被转移。从存活的F1植株收获F2种子，在温室中其被播种在平地中。以32oz/A Roundup Ultra喷雾F2植株。我们预期93.75％的F2后代存活。收获存活株自花授粉的种子，以32oz/A RoundupUltra

筛选产生的F3植株，从而识别显性草甘膦抗性基因为纯合的个体。具有显性草甘膦抗性基因纯合的F2植株的所有F3后代在商业施用量的草甘膦下都会存活。如果出现存活的分离，产生F3家族的F2个体的一个或两个草甘膦抗性基因是杂合的。纯合的F2或F3植株被用作通过回交育种将该基因渗入到改良种质中的供体亲本，或用作传统的向前式的育种杂交的亲本。在每个世代发展过程中，基于筛选的目的使用商业施用量的Roundup Ultra

，无论使用哪个基因部署方法来保证转移抗性基因和/或该基因存在于纯合状态中。

b.通过双隐性基因产生的草甘膦抗性

改良品系(易感草甘膦)与耐草甘膦突变体品系交叉杂交。产生的F1植株未经草甘膦喷雾，因为该隐性基因被掩盖在杂合状态中。收获自花授粉的F1植株的F2种子，以32oz/A Roundup Ultra

喷雾产生的F2植株。我们预期6.25％的测试的两个隐性基因都是纯合的F2后代存活。所有的存活株自花授粉从而产生F3种子。以以32oz/A Roundup Ultra筛选产生的F3植株，从而识别隐性草甘膦抗性基因纯合的个体。存活的F2植株的所有F3后代在商业施用量的草甘膦下存活。纯合的F2或F3植株被用作通过回交育种将该基因渗入到改良种质中的供体亲本，或用作传统的向前式的育种杂交的亲本。在每代杂交之后，产生的杂交植株自花授粉，以商业施用量的Roundup Ultra

筛选产生的后代从而保证该隐性抗性基因以纯合状态存在。

c.通过一个显性基因和一个隐性基因产生的草甘膦抗性

改良品系(易感草甘膦)与耐草甘膦突变体品系交叉杂交。种植种子，但是产生的F1植株未经草甘膦喷雾，因为该隐性基因被掩盖在杂合状态中。收获自花授粉的F1植株的F2种子。以32oz/A Roundup Ultra喷雾产生的F2植株。我们预期18.75％的F2后代存活(即，显性基因是纯合或杂合的，隐性草甘膦抗性基因是杂合的)。存活株自花授粉产生F3种子。以商业施用量二倍的、64oz/A的Roundup Ultra

筛选产生的F3植株。以2×推荐施用量筛选只会使那些具有高水平抗性的基因型存活，其可能去除了显性基因是杂合的基因型，这是理想的。存活的F2植株的所有F3后代存活，其显性和隐性草甘膦抗性基因分别是纯合的。存活的F2植株的所有F3后代在商业施用量的草甘膦下存活。纯合的F2或F3植株被用作通过回交育种将该基因渗入到改良种质中的供体亲本，或用作传统的向前式的育种杂交的亲本。在每代杂交之后，产生的杂交植株自花授粉，以2×商业施用量的Roundup Ultra筛选产生的后代从而保证显性和隐性抗性基因都以纯合状态存在。

提高草甘膦的遗传抗性

为了将独特的草甘膦抗性基因组合到同一基因型中，在温室中使用标准控制的交叉杂交方法，将GT突变体与GT-Louise杂交，以及互相杂交。我们希望独特的突变体的两个或三个草甘膦耐性基因的组合效果会提供比任何一个单独基因提供的耐受水平更高。

每次杂交产生的在32oz/A施用量的Roundup Ultra

下存活的F1杂交植株自花授粉产生用于除草剂筛选的分离的F2后代。以32oz/A RoundupUltra

筛选后代，存活株发展为下一代，随后以64oz/A Roundup Ultra

重新测试从而证实对商业施用量的抗性。重复该循环直到识别了耐受64oz/A施用量的Roundup Ultra的纯合耐性品系。将这些品系的种子提高到进行多位点评价，重复大田试验从而确定农艺能力，并且这些基因型还与该区域的农艺优良小麦种质杂交从而将基因部署到其它的遗传背景中。

存储信息

本文描述的耐草甘膦小麦品种包括，但是不限定于：在WA，Pullman，99164，华盛顿州立大学的地区生长的IGT07002-0、IGT07003-No.1-0、IGT07005-No.1-0、IGT07006-0、IGT07011-0-0、IGT07013-0-0、IGT07022-0-0、IGT07027-0-0、IGT07028-0-0、IGT07029-0-0、IGT07030-0-0、IGT07031-0-0、IGT07064-0-0、IGT07073-0-0、IGT07074-0-0、IGT07087-0、IGT07091-0、IGT07092-0、EGT07073-0、EGT07081-0、EGT07100-0、EGT07111-0、EGT07118-0、EGT07130-0、EGT07132-0、EGT07138-0、EGT07139-0、EGT07140-0、EGT07143-0、EGT07146-0、EGT07149-0、EGT07154-0、EGT07155-0、EGT07156-0、EGT07158-0、EGT07162-0、EGT07180-0、Re-Mut 3.1 M3 Bulk、Re-Mut3.2 M3 Bulk、Re-Mut 3.3 M3 Bulk、Re-Mut 3.4 M3 Bulk、Re-Mut 3.5 M3Bulk、Re-Mut GTL 3.4-10、Macon M2 Bulk FR2 1-10、MaconFR1-16 M4Bulk、Macon FR3-1 M2、TaraFR1-15-57、TaraFR1-15-94、TaraFR1-20-2、Tara 0.4.1、Tara 0.4.2、Tara 0.4.3、Tara 0.4.4、Tara 0.4.5、Tara 0.4.6、Alpowa M2 Bulk FR2 1-32、Louise M2 Bulk FR2 1-45、Louise DoubleMutated M2 Bulk FR2 1-13、Louise FR3-1、Louise FR1-33-6、Louise FR1-42、Louise FR1-43、Louise FR1-62、Louise FR1-65-2和Hollis FR1-9-14。在该申请未决的过程中，由以37 CFR 1.14和35 USC 122授予其资格的专利和商标专员决定能够接触这些植物和其种子的人。考虑到本申请的任意权利要求，通过购买获得根据布达佩斯公约认证的美国模式生物保藏所Manassas、Virginia和其它的种子保存中心提供的同一品种保存的至少2500种子，所有的对于品种公开获得的限制都被不可逆转地废除。

申请者不放弃以该专利或以植物品种保护法(7 U.S.C.2321 et seq.)授予其权利的任何侵犯。

参考文献

所有的发表物、专利和专利申请通过引用结合到本文中作为参考。然而在前述的说明书，联系某些其优选的实施方案描述了本发明，基于说明的目的列出了多个细节，所属领域的技术人员会清楚，本发明可以有其它的实施方案，本文的一些细节可以被大幅度变动而不偏离本发明的基础原则。

Claims (24)

1.一种小麦植株或其部分，耐受田间以草甘膦的异丙胺盐施用的3.36kg ae/h或更多酸当量的施用量，其中所述的小麦植株没有外源重组DNA。

2.根据权利要求1所述的小麦植株或其部分，包含单基因突变，对以草甘膦的异丙胺盐施用的3.36kg ae/h或更多酸当量产生草甘膦耐性。

3.一种小麦植株或其部分，包含产生草甘膦耐性的突变，其中所述的突变来源于选自由IGT07002-0、IGT07003-No.1-0、IGT07005-No.1-0、IGT07006-0、IGT07011-0-0、IGT07013-0-0、IGT07022-0-0、IGT07027-0-0、IGT07028-0-0、IGT07029-0-0、IGT07030-0-0、IGT07031-0-0、IGT07064-0-0、IGT07073-0-0、IGT07074-0-0、IGT07087-0、IGT07091-0、IGT07092-0、EGT07073-0、EGT07081-0、EGT07100-0、EGT07111-0、EGT07118-0、EGT07130-0、EGT07132-0、EGT07138-0、EGT07139-0、EGT07140-0、EGT07143-0、EGT07146-0、EGT07149-0、EGT07154-0、EGT07155-0、EGT07156-0、EGT07158-0、EGT07162-0、EGT07180-0、Re-Mut 3.1 M3 Bulk、Re-Mut 3.2 M3 Bulk、Re-Mut 3.3 M3 Bulk、Re-Mut 3.4 M3 Bulk、Re-Mut 3.5 M3 Bulk、Re-MutGTL 3.4-10、Macon M2 Bulk FR2 1-10、MaconFR1-16 M4 Bulk、MaconFR3-1 M2、TaraFR1-15-57、TaraFR1-15-94、TaraFR1-20-2、Tara 0.4.1、Tara 0.4.2、Tara 0.4.3、Tara 0.4.4、Tara 0.4.5、Tara 0.4.6、Alpowa M2Bulk FR2 1-32、Louise M2 Bulk FR2 1-45、Louise Double Mutated M2 BulkFR2 1-13、Louise FR3-1、Louise FR1-33-6、Louise FR1-42、LouiseFR1-43、Louise FR1-62、Louise FR1-65-2和Hollis FR1-9-14和它们的后代组成的组中的耐草甘膦小麦基因型。

4.根据权利要求3所述的小麦植株或其部分，其中所述的小麦植株耐受大田中以草甘膦的异丙胺盐施用的0.84kg ae/h或更多酸当量的施用量。

5.根据权利要求3所述的小麦植株或其部分，其中所述的小麦植株耐受大田中以草甘膦的异丙胺盐施用的1.68kg ae/h或更多酸当量的施用量。

6.根据权利要求3所述的小麦植株或其部分，其中所述的小麦植株耐受大田中以草甘膦的异丙胺盐施用的2.52kg ae/h或更多酸当量的施用量。

7.根据权利要求3所述的小麦植株或其部分，其中所述的小麦植株耐受大田中以草甘膦的异丙胺盐施用的3.36kg ae/h或更多酸当量的施用量。

8.根据权利要求3所述的小麦植株或其部分，其中所述的突变是隐性突变。

9.根据权利要求3所述的小麦植株或其部分，包含至少两个不同的产生草甘膦耐性的突变，其中所述的至少两个不同的突变中的至少一个来源于所述的耐草甘膦小麦基因型。

10.根据权利要求9所述的小麦植株或其部分，其中所述的至少两个不同的突变中的每一个均来源于所述的耐草甘膦小麦基因型。

11.根据权利要求9所述的小麦植株或其部分，其中所述的至少两个不同的突变是不同的小麦基因的突变。

12.根据权利要求3所述的小麦植株或其部分，包含选自由：雄性不育，对草甘膦以外的除草剂的抗性、抗虫性、抗病性；蜡质淀粉；改良的脂肪酸代谢，改良的植酸代谢，改良的碳水化合物代谢，改良的蜡质淀粉含量，改良的面筋含量和改良的水胁迫耐性组成的组中的性状。

13.根据权利要求12所述的小麦植株或其部分，包含抗病性性状。

14.根据权利要求13所述的小麦植株或其部分，包含对丝核菌根腐病的抗性。

15.一种根据权利要求3所述的的小麦植株的种子。

16.一种根据权利要求15所述的纯育种子。

17.一种小麦植株或其部分，通过种植根据权利要求15所述的种子产生。

18.一种小麦植株或其部分，具有根据权利要求3所述的小麦植株的所有生理和形态特征。

19.一种产生耐草甘膦植物的方法，包含：(a)将选择的小麦品种的植株与根据权利要求3所述的耐草甘膦小麦植株进行杂交，从而产生多个后代；(b)选择耐草甘膦的后代。

20.根据权利要求19所述的方法，包含；(a)将权利要求3所述的耐草甘膦小麦植株的种子生长的植株与所述的选择的小麦品种的植株进行杂交产生F1后代植株；(b)选择具有所述的耐草甘膦性状的F1后代植株；(c)将所述的选择的F1后代植株与所述的选择的小麦品种的植株杂交产生回交后代植株；(d)选择具有所述的耐草甘膦性状和所述的选择的小麦基因型的生理和形态特征的回交后代植株，从而产生选择的回交后代植株；和(e)连续重复步骤(c)和(d)三次或更多次从而产生选择的第四或更高的回交后代植株，所述回交后代植株包含当在相同的环境条件下生长时以5％显著水平确定的耐草甘膦性状和所述的选择的小麦基因型的所有生理和形态特征。

21.根据权利要求19所述的方法，包含：(a)将权利要求3所述的耐草甘膦小麦植株的种子生长出的植株与所述的选择的小麦品种的植株进行杂交产生F1后代植株，其中所述的选择的小麦品种包含所需的性状；(b)选择具有所述的所需性状的F1后代植株，从而产生选择的F1后代植株；(c)将所述的选择的后代植株与所述的耐草甘膦小麦基因型的植株进行杂交，从而产生回交后代植株；(d)选择具有所述的所需性状和所述的耐草甘膦小麦基因型的生理和形态特征的回交后代植株，从而产生选择的回交后代植株；和(e)连续重复步骤(c)和(d)三次或更多次，从而产生选择的第四或更高的回交后代植株，所述回交后代植株包含当在相同的环境条件下生长时以5％显著水平确定的所述的所需性状和所述的选择的小麦基因型的所有生理和形态特征。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述的所需性状选自由雄性不育、除草剂抗性、抗虫性、抗病性和蜡质淀粉组成的组。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的所需性状是抗病性性状。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的所需性状是丝核菌根腐病抗性。