CN102199191B - 一种小型无氧操作袋与层析柱串联的密封系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小型无氧操作袋与层析柱串联的密封系统，主要用于植物、微生物体内厌氧蛋白的分离纯化。该方法将试剂、器皿放入无氧操作袋中，所有试剂、缓冲液均用氮气鼓气，并加入连二亚硫酸钠除去溶氧，用高速珠磨法破碎组织或细胞，粗酶液经硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和离子交换层析纯化后，获得纯厌氧蛋白。国外相似方法是将所有用到的仪器、装置放入巨大的无氧装置中，占地面积大，保护气成本高，且操作困难；国内尚无相关技术报道。本发明的优点是操作简单易行，且成本较低。

Description

一种小型无氧操作袋与层析柱串联的密封系统

技术领域

本发明涉及一种小型无氧操作袋与层析柱串联的密封系统，主要用于植物、微生物体内厌氧蛋白的分离纯化。

背景技术

自然界中很多植物和微生物在无氧环境中能诱导出具有不同功能的厌氧蛋白。Sachs首次揭示严格无氧条件下植物根尖合成蛋白质数量锐减的现象。他用双向电泳技术观察到玉米幼苗在缺氧下约有20种多肽(ANPS)，其中10种分子量较大，10种较小。对照则有90余种多肽，ANPS合成在0～1h出现，20h达到最大，此后不再增加，96h玉米幼苗死亡。此后人们相继证明在大麦、木棉、番茄、豌豆和大豆等作物中也有类似的厌氧多肽合成模式，并发现无氧环境中某些有氧蛋白的合成受抑制与多聚体的解体有关。再后10余年，人们又通过纯化和测序，证明ADH、PDC、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)、淀粉合成酶(SUC)、甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶(ENO)、乳酸脱氢酶(LDH)、木葡聚糖转葡糖苷酶(XET)及甲酸脱氢酶(FDH)等为厌氧蛋白组分。其中大多数为糖酵解与发酵代谢的调节酶，XET是细胞壁代谢酶，与通气组织形成密切相关。FDH在生物氧化与细胞pH稳定中有专一的作用。此外，stephensen和stickland对江河淤泥中的细菌进行研究，发现某些细菌在无氧环境中会诱导出一种酶，能够利用氢气还原亚甲基蓝，他们把这种酶命名为氢酶。随后，在许多原核微生物、真核微生物如藻类、绿色植物甚至原生动物中都发现了氢酶的存在。

分离纯化这些厌氧蛋白具有重要意义，是揭示厌氧蛋白的诱导机制，对厌氧蛋白进行生化、分子遗传、定向进化等方面研究的重要前提，并将为利用厌氧蛋白解决人类社会面临的难题打下坚实的基础。

目前已报道的厌氧蛋白提取工艺是在巨大的无氧操作装置中完成，存在以下缺点：所有仪器、试剂集中在无氧装置内，导致全部操作步骤均需通过手套进行操作，很不方便；每次放入或取出物品均需要通入大量保护气，成本很高；若装置出现泄露现象，里面的蛋白将很快接触氧气，无法立即得到有效保护，从而导致蛋白失活。而将小型无氧操作袋与层析柱串联的密封提取装置，在国内外均未报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种工艺简单，操作方便，能有效构建无氧环境，用于厌氧蛋白分离纯化的系统。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种小型无氧操作袋与层析柱串联的密封系统，包括高纯氮气瓶、真空泵、真空阀、无氧操作袋、涡旋震荡器、.蠕动泵、层析柱；

高纯氮气瓶和真空泵分别通过密封管路与无氧操作袋内腔相连，它们的管路出口伸入无氧操作袋中，且在它们连接管路的高纯氮气瓶气体出口、真空泵气体入口、及无氧操作袋的气体进出口处均分别设置有真空阀；

无氧操作袋为二个，于其中一个无氧操作袋中设置有试剂瓶、涡旋震荡器和.蠕动泵，蠕动泵的出口通过管路与层析柱的进料口相连，层析柱的出料口通过管路伸入另一个无氧操作袋，在另一个无氧操作袋设置有收集瓶。

在氮气瓶出口处的管路上设有脱氧柱，以除掉混于氮气中的微量氧气；层析柱内预装有分子筛树脂或离子交换树脂；系统所用管路均由真空管连接而成；无氧操作袋与外界连接的管路或接口处设置有软密封件；所述软密封件为硅橡胶密封圈或密封夹条。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.使用小型无氧操作袋与层析柱串联系统，尽量减少使用手套操作的步骤，使操作更加简易方便。

2.缩小了无氧系统的总体积，因而每次取出或放入物品所需冲入的高纯氮气体积也相应减少，降低了分离纯化工艺的运行成本。

3.如果某个组件发生泄露，可以迅速断开与其他组件的连接，及时避免整个系统混入氧气，有利于保护厌氧蛋白活性。

4.采用高速珠磨法破碎绿藻细胞，比超声法破碎条件温和，防止超声功率过大导致蛋白破损；且珠磨法能避免厌氧蛋白因与系统中的微量氧气接触而失活。

附图说明

图1为本发明中的小型无氧操作袋与层析柱串联密封系统简图；

其中：1.高纯氮气瓶；2.真空泵；3.真空阀；4.无氧操作袋；5.涡旋震荡器；6.蠕动泵；7.层析柱。

具体实施方式

一种小型无氧操作袋与层析柱串联的密封系统，包括高纯氮气瓶、真空泵、真空阀、无氧操作袋、涡旋震荡器、.蠕动泵、层析柱；

高纯氮气瓶和真空泵分别通过密封管路与无氧操作袋内腔相连，它们的管路出口伸入无氧操作袋中，且在它们连接管路的高纯氮气瓶气体出口、真空泵气体入口、及无氧操作袋的气体进出口处均分别设置有真空阀；

无氧操作袋为二个，于其中一个无氧操作袋中设置有试剂瓶、涡旋震荡器和.蠕动泵，蠕动泵的出口通过管路与层析柱的进料口相连，层析柱的出料口通过管路伸入另一个无氧操作袋，在另一个无氧操作袋设置有收集瓶。

在氮气瓶出口处的管路上设有脱氧柱，以除掉混于氮气中的微量氧气；层析柱内预装有分子筛树脂或离子交换树脂；系统所用管路均由真空管连接而成；无氧操作袋与外界连接的管路或接口处设置有软密封件；所述软密封件为硅橡胶密封圈或密封夹条。

将小型无氧操作袋与层析柱串联起来，构建出无氧环境。将所需试剂、器皿放入无氧操作袋中，所有试剂均用氮气鼓气，并加入连二亚硫酸钠以除去溶氧。用高速珠磨法破碎组织或细胞。粗酶液经硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和离子交换层析纯化后，获得纯蛋白。

具体操作过程步骤如下：

1)将实验原料(植物、微生物的组织或细胞)及所需仪器、试剂放入上方无氧操作袋中，用真空泵抽除袋内空气后，将高纯氮气瓶中的氮气充入袋内。反复抽空气、充氮气3次，以确保袋内没有氧气存在。

2)在上方无氧袋内，所有试剂、缓冲液均用氮气鼓气10min，并加入20mM连二亚硫酸钠，除去溶氧。

3)在上方无氧袋内，将实验原料悬浮在缓冲液中，加入玻璃珠，在涡旋震荡器上剧烈震荡，破碎细胞，使蛋白释放到缓冲液中。

4)在粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末达到所需饱和度，同时不停搅拌。然后将粗酶液分装到离心管中，密封后拿出无氧操作袋，在4℃下高速离心。

5)把离心后的酶液拿入上方无氧操作袋。将无氧袋反复抽空气、充氮气3次。用蠕动泵将离心上清液泵入预装有分子筛树脂的层析柱中，再泵入缓冲液进行洗脱。在下方的无氧袋中收集目的蛋白组分。

6)将预装分子筛树脂的层析柱替换为预装有离子交换树脂的层析柱。

7)把步骤5)中收集到的目的蛋白组分装在密封离心管中，拿入上方无氧操作袋中。将无氧袋反复抽空气、充氮气3次。用蠕动泵将蛋白组分泵入预装有离子交换树脂的层析柱中，再泵入缓冲液进行洗脱。在下方的无氧袋中收集纯化后的厌氧蛋白。

如无特殊说明，所有步骤均在无氧环境中进行。所建立的小型无氧操作袋与层析柱串联系统如图1所示，将所需仪器、试剂放入无氧操作袋内后，用真空泵抽除袋内空气，然后通入高纯氮气，反复三次。所有用到的试剂均用高纯氮气鼓气10min，再加入20mM连二亚硫酸钠除去溶氧。需要离心的样品放在配有密封盖的离心管中，拿出无氧体系离心。需要层析的样品用蠕动泵打入层析柱中，分离后的组分在另一个小型无氧操作袋中收集，并检测活性。

氢酶活性的测定方法：以50mM磷酸缓冲液(pH6.8)作为缓冲液，以被连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)还原的甲基紫精(Methyl viologen，MV)作为电子供体。反应系统包括终浓度为10mM的MV和100mM的连二亚硫酸钠及500μl酶液。在55℃水浴中振荡孵育20min后，用气相色谱检测氢气含量。有氢气生成即证明酶液具有氢酶活性。

实施例1

海水亚心形四爿藻氢酶分离纯化

步骤1取生长对数后期，浓度约2×10⁶cells/mL的亚心形四爿藻3L，1500r/min离心浓缩2min。倒掉海水后，取鲜重为10g藻细胞，重新悬浮于100mL灭菌海水中，置于密闭玻璃瓶中。通氮气10min，排除容器中氧气后，在黑暗中诱导4h。

步骤2将玻璃瓶拿入无氧操作袋中，反复充N₂、抽真空三次后，将藻液分装于密封离心管中，1500r/min离心3min，去上清后重悬于10mL 50mM pH7.9的Tris-Hcl缓冲液中。在重悬液中加入10g预冷玻璃珠(直径1mm)，用涡旋震荡器最大强度混旋5次，每次1min，两次之间在冰上静置1min。然后在4℃下，10000r/min离心10min，取上清弃沉淀。

步骤3将上清液稀释至20mL，缓慢加入固体(NH₄)₂SO₄至50％饱和度，在4℃下，13000r/min离心10min，取上清弃沉淀。

步骤4在上清液中缓慢加入固体(NH₄)₂SO₄至80％饱和度，在4℃下，13000r/min离心10min，收集沉降下的蛋白，重新悬浮于5mL 50mmol/LpH7.9Tris-Hcl缓冲液中。

步骤5将5mL酶液用蠕动泵打入填装有Sephacryl S-100HR的凝胶过滤层析柱((1.8×90cm)中，用200mL 50mM pH7.9的Tris-Hcl缓冲液冲洗，按流出液的流出时间分成15管进行收集，采用气相色谱检测有氢酶活性的组分。

步骤6将有氢酶活性的凝胶过滤组分用蠕动泵打入填装有DEAE-Sehparose CL-6B的离子交换层析柱((2×13cm)中，先用100mL 50mM pH7.9的Tris-Hcl缓冲液冲洗，再用100mL含有0.1M Kcl的50mM pH7.9的Tris-Hcl缓冲液冲洗，采用气相色谱检测收集有氢酶活性的组分。

经SDS-PAGE检测，该组分中含有单一条带，确定其为亚心形四爿藻氢酶。

实施例2

淡水莱茵衣藻cc124氢酶分离纯化

步骤1取生长对数后期，浓度约2.5×10⁶cells/mL的莱茵衣藻cc124 3L，4000r/min离心浓缩5min。倒掉上清后，取鲜重为10g藻细胞，重新悬浮于100mL 50mM pH7.2磷酸缓冲液中，置于密闭玻璃瓶中。通氮气10min，排除容器中氧气后，在黑暗中诱导3h。

步骤2将玻璃瓶拿入无氧操作袋中，反复充N₂、抽真空三次后，将藻液分装于密封离心管中，4000r/min离心5min，去上清后重悬于10mL 50mM pH8.5的Tris-Hcl缓冲液中。在重悬液中加入10g预冷玻璃珠(直径0.8mm)，用涡旋震荡器最大强度混旋5次，每次1min，两次之间在冰上静置1min。然后在4℃下，12000r/min离心10min，取上清弃沉淀。

步骤3将上清液稀释至20mL，缓慢加入固体(NH₄)₂SO₄至35％饱和度，在4℃下，16000r/min离心10min，取上清弃沉淀。

步骤4在上清液中缓慢加入固体(NH₄)₂SO₄至70％饱和度，在4℃下，16000r/min离心10min，收集沉降下的蛋白，重新悬浮于5mL 50mM pH8.5Tris-Hcl缓冲液中。

步骤5将5mL酶液用蠕动泵打入填装有Sephacryl S-100HR的凝胶过滤层析柱((1.8×90cm)中，用200mL 50mM pH8.5的Tris-Hcl缓冲液冲洗，按流出液的流出时间分成20管进行收集，采用气相色谱检测有氢酶活性的组分。

步骤6将有氢酶活性的凝胶过滤组分用蠕动泵打入填装有DEAE-Sehparose CL-6B的离子交换层析柱((2×13cm)中，先用100mL 50mM pH8.5的Tris-Hcl缓冲液冲洗，再用100mL含有0.25M Kcl的50mMpH8.5的Tris-Hcl缓冲液冲洗，采用气相色谱检测收集有氢酶活性的组分，即莱茵衣藻cc124氢酶。

Claims (4)

1.一种小型无氧操作袋与层析柱串联的密封系统，其特征在于：包括高纯氮气瓶(1)、真空泵(2)、真空阀(3)、无氧操作袋(4)、涡旋震荡器(5)、.蠕动泵(6)、层析柱(7)；

高纯氮气瓶(1)和真空泵(2)分别通过密封管路与无氧操作袋(4)内腔相连，它们的管路出口伸入无氧操作袋(4)中，且在它们连接管路的高纯氮气瓶(1)气体出口、真空泵(2)气体入口、及无氧操作袋(4)的气体进出口处均分别设置有真空阀(3)；

无氧操作袋(4)为二个，于其中一个无氧操作袋中设置有试剂瓶、涡旋震荡器(5)和蠕动泵(6)，蠕动泵(6)的出口通过管路与层析柱(7)的进料口相连，层析柱(7)的出料口通过管路伸入另一个无氧操作袋，在另一个无氧操作袋设置有收集瓶；

在氮气瓶出口处的管路上设有脱氧柱，以除掉混于氮气中的微量氧气；

无氧操作袋(4)与外界连接的管路或接口处设置有软密封件。

2.按照权利要求1所述系统，其特征在于：层析柱内预装有分子筛树脂或离子交换树脂。

3.按照权利要求1所述系统，其特征在于：系统所用管路均由真空管连接而成。

4.按照权利要求1所述系统，其特征在于：所述软密封件为硅橡胶密封圈或密封夹条。 

Images