CN102181456B - 棉花成花素基因GhFT及其载体、构建体、细胞和多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种棉花成花素基因GhFT及其载体、构建体、细胞和多肽。本发明涉及棉花成花素基因及其应用。本发明克隆新疆主栽陆地棉的成花素基因GhFT1，研究该基因对植物开花的调节作用。本发明还涉及包含该基因的载体，宿主细胞和植物。利用该基因可以使植物的开花时间提前或者改良植物的性状。

Description

棉花成花素基因GhFT及其载体、构建体、细胞和多肽

技术领域

本发明涉及棉花成花素基因GhFT及其载体、构建体、细胞和多肽。该基因可用于促进植物早花或者改良植物的性状。

背景技术

开花是植物的一个极其重要的性状，它影响农作物的生育期进而影响产量和品质，因此一直以来备受关注。开花是显花植物重要的生理现象，是植物由营养生长向生殖生长转变的一个重要发育过程。目前一般认为植物的开花主要由四种途径，包括光周期途径、自主途径、春化途径、赤霉素途径。近年来随着分子生物学的发展，已经克隆了这些途径的诸多关键基因，对其功能的进一步研究，很好的解析了植物开花的生理机理及分子机制。其中这四个途径主要是影响了成花素基因FT(Flowering locus T)的表达，从而影响下游基因的表达，或促进或抑制植物开花。FT基因是开花信号途径中重要的基因之一，对FT基因和其编码蛋白功能的研究，使人们对成花素研究有了关键的突破。拟南芥的FT基因只有528bp，编码的蛋白属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-Binding Protein，PEBP)基因家族。PEBP蛋白最早从牛脑中分离，因易与磷脂酰乙醇胺结合而得名，PEBP蛋白在哺乳动物、酵母、蠕虫、果蝇、真菌、细菌和开花植物等物种都有分布，磷脂酰乙醇胺是植物生物膜中的主要磷脂，在信号传递过程中起着重要的作用。在拟南芥中，FT是一个开花途径整合因子，特异在长日条件下起开花促进作用。拟南芥中的TFL1(Terminal flower1)也是PEBP家族蛋白，和FT蛋白高度相似，但TFL1却是开花抑制因子。研究发现，其中83位氨基酸是决定FT/TFL1功能的关键位点，FT蛋白在该位点均为酪氨酸(Tyr)，而TFLI在该位点为组氨酸(His)，这一位点氨基酸的改变足以将FT/TFL1的功能逆转。

FT是光周期节律基因CO(CONSTANS)的早期激活目标基因，由光周期诱导的CO直接转录激活FT的表达。长日照条件下拟南芥的CO基因表达呈明显的昼夜节律(表达高峰在黄昏时分)，同时促进FT基因的表达，并使FT的表达也呈现明显的昼夜节律(表达高峰也出现在黄昏时分)，FT的表达促使AP1等下游花分生组织决定基因的表达，从而引起拟南芥开花；短日照条件下，CO也呈现明显的昼夜节律，此时CO抑制FT的表达，从而导致拟南芥开花延迟。借助分子生物学的研究手段表明，FT蛋白与FD蛋白相互作用，FD蛋白是含有碱性亮氨酸拉链蛋白(basic region-leucine zipper，b-ZIP)结构域的转录因子，FD在顶端分生组织中特异表达，共同促进下游成花基因AP1、LFY等的表达，从而促进开花。

一直以来，科学家探索这样一个问题：FT基因的mRNA是成花素？还是FT基因编码的蛋白是成花素？早年研究认为，FT基因的转录本即mRNA在叶片中表达以后，可以通过长距离运输到顶端的分生组织促进FD、AP1和LFY等基因的表达，促进植物开花，因此这种观点认为FT的mRNA是成花素。后来研究表明，FT-GFP融合的绿色荧光蛋白能够通过维管束从叶片运输到顶端分生组织，促进植物开花，因而这种观点认为FT蛋白是成花素，并且嫁接实验有力的证明了这一点。水稻的FT同源基因Hd3a、番茄的sFT基因编码蛋白也具有同样的移动现象。因此FT的蛋白是成花素的观点的证据更加充分一些。

目前在其它许多植物中克隆了FT同源基因，如：烟草、大豆、大麦、玉米、小麦、矮牵牛、番茄、杨树、蜜柑、葡萄、沙梨、花椰菜、春兰、阿拉伯芥、矮牵牛、玉山筷子芥、油菜、无花果、梅花、笋瓜、番木瓜、桃树、文心兰、向日葵、菊花、红叶黎、柑橘、枳实、马铃薯、蓖麻、牵牛花、毛环竹、黑麦草、梧桐、蔷薇等至少35种植物。比较其氨基酸序列，相似性最高可达90％以上，转基因证明FT基因的表达可促进植物提早开花，表明FT家族基因的结构和功能在不同的物种间存在着高度的保守性，该家族基因在调控开花上起着重要的作用。

综上所述，FT基因主要在叶片中表达，接受合适的光周期诱导后，FT蛋白从叶片移动到顶端组织。FT蛋白与顶端组织特异表达的FD基因编码产物之间结合，形成一种蛋白复合体。该复合体的形成会促进开花决定基因的表达，从而最终导致植物开花。开花是一个十分复杂的生理现象，到目前为止，虽然对FT基因进行了大量的研究，但仍然存在很多问题有待深入研究。例如，开花素基因FT蛋白是怎样完好无损地从叶传输到茎顶端分生组织的？而有些植物中同一个植物体内含有多个FT同源基因，它们之间又是如何分工协作的？还有FT基因启动子是诱导型启动子还是组织特异性启动子，这种启动子如何调控FT基因表达的？所有这些问题若能得到解决，将不仅有助于深入了解FT基因控制植物开花的分子机制，而且对通过转基因技术进行观赏植物花期调控具有重要的理论指导意义。所以欲深入了解FT基因的详细功能，还需从更多植物着手，克隆更多的FT基因。

棉花是重要的经济作物之一，但是有关棉花的FT同源基因的克隆和功能研究却没有报道。对棉花FT同源基因的分离和功能分析，为进一步研究植物开花的分子机制，通过基因工程手段调控棉花的开花时间，避开新疆等地区秋后低温对棉花造成的影响，对提高棉花产量和纤维品质具有重要的理论指导意义。

发明内容

本发明的目的是克隆棉花的成花素基因GhFT，并通过分子生物学的手段研究其对促进植物开花方面的功能，以期在棉花中利用该基因促进棉花早熟，免受秋后低温的危害，最终达到提高棉花产量的目的。

本发明涉及分离的棉花成花素基因GhFT，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID NO：1所示棉花的核苷酸序列；

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在中等严格条件、优选高严格杂交条件下杂交的棉花的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列的棉花序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的棉花核苷酸序列；

(4)与(1)的棉花核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上不同的棉花核苷酸序列；

(5)(1)-(4)任何一个的棉花核苷酸序列的活性片段；或

(6)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的棉花核苷酸序列。

本发明还涉及分离的多肽(也称蛋白质)，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，

(2)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或插入而与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列不同的棉花的氨基酸序列，

(3)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的棉花氨基酸序列，

(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段，和

(5)权利要求1或2的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

本发明还提供分离的棉花SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列。

本发明还涉及构建体，其包含本发明的多核苷酸。

本发明还涉及载体，其包含本发明的多核苷酸。所述载体可以是克隆载体或者用于表达所述多核苷酸的表达载体。

本发明还涉及细胞，其包含本发明的多核苷酸或本发明的构建体或本发明的载体。所述细胞可以是动物细胞、植物细胞或者微生物细胞，例如大肠杆菌细胞，优选植物细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

本发明还涉及本发明的方法生产的植物。

本发明的目的是通过如下措施分析棉花成花素基因GhFT的功能，来研究其对植物开花发育的调节作用：采用同源克隆的方法，从新疆棉花主栽品种中通过RT-PCR(反转录PCR)的方法，扩增了棉花的成花素基因GhFT的CDS(cDNA sequence，开放阅读框)序列(HM631972)。构建植物过量表达载体：p35S::GhFT，p35S::GhFT-GFP，及拟南芥韧皮部特异表达的启动子载体：pSUC2::GhFT-GFP；通过农杆菌介导法转入拟南芥中研究转基因植物开花的调节作用；通过半定量RT-PCR技术，研究GhFT基因在棉花不同组织的表达情况等；通过激光共聚焦显微镜观察观察p35S::GhFT-GFP，pSUC2::GhFT-GFP转基因植株的根尖细胞，研究GhFT-GFP融合绿色荧光蛋白的亚细胞定位及表达情况。

本发明首次分离新疆主栽陆地棉品种新陆早33号的成花素基因GhFT，并且通过分子生物学的手段研究该基因的表达，亚细胞定位，通过转化模式植物拟南芥研究其对植物开花发育的调节作用，研究结果表明GhFT基因可以促进拟南芥早花，暗示了该基因在棉花的转基因育种中具有重要利用价值。

附图说明

图1显示GhFT基因和其它FT基因的进化树(phylogenic tree)分析。

图2显示GhFT基因的组织表达的典型结果。

图3显示转p35S::GhFT载体研究的典型结果，图中1示过量表达GhFT使拟南芥提早开花，左为非转基因植株，右为转基因植株，bar＝1cm；图中2示转基因植株的半定量RT-PCR分析，图中3示转基因植物与非转基因植物莲座叶(rosette)的统计结果。

图4显示转p35S::GhFT-GFP载体研究的典型结果，左为非转基因植株，右为转基因植株，bar＝2cm。

图5显示转pSUC2::GhFT-GFP载体研究的典型结果，1作为非转基因植株、右为转基因植株，bar＝2cm；2为转基因植株根尖细胞GFP观察(绿色荧光蛋白主要集中在韧皮部)，bar＝20μm。

图6显示GhFT-GFP融合蛋白在拟南芥根尖细胞的亚细胞定位典型结果，左图是p35S::GFP转基因植株的根尖细胞GFP图片、右图是p35S::GhFT-GFP转基因植株的根尖细胞GFP和明视场合并(merge)的图片。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例一：GhFT基因CDS的克隆与分析

根据Columbia(Col)生态型拟南芥中已经发表的编码成花素基因FT(Flowering locusT)的氨基酸序列，登录号是AAF03926.1，在GenBanK(www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载该序列，以该序列为探针(query)，选择棉花的ESTs数据库，运行tBlastx程序，搜索到一个棉花的同源ESTs序列，登录号是UFL_438_68(ES826802)。

根据该EST序列的核苷酸序列，设计引物：Kpn I-GhFT-F：GGGGTACCATGCCTAGAGACAGAGATCCTTTGGT，见SEQ ID NO：3；XbaI-GhFT-R：GCTCTAGATCATGTCCTACGGCCACCGGATCCACT，见SEQ ID NO：4(下划线部分是Kpn I和Xba I酶切位点)。以新疆的陆地棉品种新陆早33叶片的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增，将扩增产出连接到pGEMT-easy(promega)，构建pGEMT::GhFT，通过转化大肠杆菌DH 5α，挑选阳性克隆测序(见SEQ ID NO：1)，分析测序结果表明确实是棉花的GhFT同源序列，氨基酸序列(见SEQ ID NO：2)同拟南芥的AtFT(AAF03936.1)有79.3％的相似性，并且包含完整的开放阅读框(总RNA的提取、反转录及PCR扩增的方法同实施例二)。

FT基因的进化树构建：目前文献已报道的通过过量表达或异位表达证明可促进开花的FT同源基因至少有17个，涉及13个物种。从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中下载这些基因，比较其编码的氨基酸序列，相似性很高，最高可达90％以上。利用MEGA 4.1(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，version 4.1)软件进行所有已知FT的系统进化分析，蛋白序列比对利用Clustal W程序进行，进化树利用Neighbor-Joining方法构建，其中进行1000次Bootstrap分析以使得分枝的结果更可靠。进化树分析结果见图1。进化树分析很清楚的表明了FT基因的系统进化关系，如果说拟南芥的AtFT，大豆的GmFT5a，牵牛花的InFT蛋白是FT家族蛋白的外类群的话，随后FT同源基因分别按照单子叶、双子叶植物进化，棉花的GhFTL1与苹果的MdFT1亲缘关系最近，比较其氨基酸序列相似性可达89.6％。在拟南芥、杨树中异位表达MdFT1都可明显的促进早花，在苹果中过量表达也可加速诱导开花。系统进化推测GhFTL1基因在棉花开花途径中起着重要作用。

向日葵(Helianthus annuus)的HaFT1(ADF32946.1)，HaFT2(ADF32947.1)，HaFT4(ADF32946.1)；南瓜(Cucurbita moschata)的CmoFTL1(ABR20498.1)，CmoFTL2(ABR20499.1)；番茄(Solanum lycopersicum)的SP3D(AAO31792.1)；欧洲山杨树(Populus tremula)的PtFT(ABD52003)；美洲黑杨(Populus deltoides)的PdFT2(AAS00056.1)；苹果(Malus x domestica)的MdFT1(BAD0834)；陆地棉(Gossypiumhirsutum)的GhFTL1(ADK95113.1)；柑橘(Citrus unshiu)的CiFT(BAA77836.1)；大豆(Glycine max)的GmFT2a(BAJ33491.1)；GmFT5a(BAJ33494.1)；水稻(Oryzasativa)的Hd3a(BAB61028)，RFT1(BAB78480.1)；大麦(Hordeum vulgare)的HvFT(ABV59389.1)；小麦(Triticum aestivum)的TaFT(AAW23034.1)；牵牛花(Ipomoeanil)的InFT(ABW73563.1)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtFT(AAF03936)。

实施例二：GhFT基因的组织表达分析

(1)实验方法

分别收集新陆早33的根、下胚轴、花、真叶、纤维和胚珠材料经液氮速冻，采用CTAB法提取总RNA，具体方法如下：1)棉花各组织材料液氮充分研磨后及时转入已在65℃水浴锅预热30分钟的CTAB提取缓冲液(2％CTAB，2％聚乙烯吡咯烷酮PVP，100mmol/L Tris-HCl，25mmol/L EDTA，2.0mol/L NaCl，2％巯基乙醇)中，充分混匀后65℃水浴10min，在此期间振荡2～3次；2)4℃，12000rpm/min，10min；3)缓慢吸取上清，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提一次，剧烈振荡后室温放置5min；4)4℃，12000rpm/min，10min；5)缓慢吸取上清，加入等体积的氯仿抽提两次，每次充分振荡，并室温放置5min；6)4℃，12000rpm/min，10min；7)取上清，加入1/3体积的8mol/L的LiCl和等体积的异丙醇，轻轻混匀后，-20℃放置2h；8)4℃，12000rpm/min，20min，弃上清，加入500μl 75％的乙醇洗涤两次；9)简单干燥后，用无RNase的水溶解。取各组织的总RNA经反转录成cDNA，cDNA模板的制备根据反转录酶的说明(promega，USA)。以引物：GhFT-F：GCAGACCACCTCTTGACCAAAGCAAG，见SEQ ID NO：5；GhFT-R：TAAGTAGCTGTGCGTATTCGTCATA，见SEQ ID NO：6，进行半定量RT-PCR，内参ubiquitin7扩增25个循环，GhFT基因扩增28个循环。PCR时，在25μl的反应体系中加入cDNA模板1μl，正反向引物各5nmol，2.5μl 10×PCR缓冲液(生工，上海)，dNTP各0.2mmol/L，1.5mmol/L MgCl₂，1U Taq DNA聚合酶(生工，上海)，ddH₂O补齐。PCR反应程序为：94℃3min后94℃30sec，60℃45sec，72℃1min，循环28，再72℃延伸10min。退火温度取决于引物。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上检测。

(2)实验结果

表明GhFT基因在棉花的根(Root)、下胚轴(Hypocotyle)、花(Flower)、真叶(Leaf)、纤维(Fibre)和胚珠(Ovule)中均有表达，在真叶和胚珠中表达更高些(图2)。

实施例三：基因转化

通过在拟南芥中的遗传转化，来研究棉花GhFT基因对植物开花的调节作用。

1、实验方法

(1)载体的构建

p35S::GhFT载体：测序正确的质粒pGEM T::GhFT经Kpn I和Xba I酶切，回收片段连接到经同样双酶切的质粒pCAMBIA2300上，构建载体：p35S::GhFT。

p35S::GhFT-GFP载体：首先利用分别含有BamH I和Xba I酶切位点的引物5’-GGGGTACCATGCCTAGAGACAGAGATCCTTTGGT-3’(见SEQ ID NO：7)和5’-TCTAGATGTCCTACGGCCACCGGATCCACT-3’(见SEQ ID NO：8)(下划线部分分别为BamH I和Xba I酶切位点)，以pGEM T::GhFT质粒DNA为模板扩增GhFT基因的CDS区，连接到载体pGEM Teasy(promega)，质粒测序正确后经BamH I和Xba I双酶切，回收插入片段连接到经同样双酶切的实验室已有的双元载体p35S::GFP上，构建好p35S::GhFT-GFP载体。

pSUC2::GhFT-GFP载体：首先利用分别含有EcoR I和Kpn I酶切位点的引物5’-GAATTCGAAAACGGAGAAACAAATAACAA-3’(见SEQ ID NO：9)和5’-GGTACCTATCCGAAGAGGAGAACAGTGAA-3’(见SEQ ID NO：10)(下划线部分分别为EcoR I和KpnI酶切位点)，以Col生态型的基因组DNA为模板扩增拟南芥韧皮部特异表达基因SUC2的启动子1700bp序列，PCR产物连接到载体pGEM T easy(promega)上，质粒测序正确后经EcoR I和Kpn I双酶切，回收插入片段连接到经同样双酶切的双元载体p35S::GhFT-GFP载体上，构建好pSUC2::GhFT-GFP载体。

(2)拟南芥的遗传转化：

拟南芥的栽培：Col种子的经20％Bleach灭菌处理，在4℃下春化3-4天后，均匀地将种子播撒在1/2的MS培养基上，其成分含有1％的Glucose，2.2g/L Murashige&Skoog MEDIUM(Duchefa Biochemie，Netherland)，0.05％的MES(Amersham，America)，0.8％Agar，pH 5.8。培养一周后，放置到25℃，16hr光照/8hr黑暗的光照培养间中，于2-3片真叶期，移栽到含有蛭石和营养土(1∶1)的盆钵中，之后放置到16hr光照/8hr黑暗的培养室里培养。

农杆菌侵染液的准备：载体p35S::GhFT、p35S::GhFT-GFP和pSUC2::GhFT-GFP分别转化农杆菌GV3101，转化后的克隆经PCR鉴定，挑选阳性的单克隆接种于20ml含50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为1.0左右，4000rpm离心10min收集菌体，将菌体重悬于2ml含5％蔗糖，0.02％silwet-77的溶液中，用于遗传转化。

拟南芥的遗传转化：培养拟南芥至茎高5-10cm时，去其顶生花序，刺激腋生花序生长。7-9天后，即可用于转化。转化前剪去所有果夹，且浇足水分。使用200μl的移液器将准备好的农杆菌液滴在花上。转化好的拟南芥用保鲜膜覆盖保湿，24小时后去除保鲜膜。隔一周后重复处理1-2次。转化好的植株经同样的生长条件使其正常生长，开花结果，收获的种子为T₀代。

转基因阳性植株的筛选；T₀代种子经灭菌和春化处理之后，播种在含有50μg/ml的卡那霉素的1/2MS培养基上。经25℃，16hr光照/8hr黑暗的培养室里生长约1周后，非转基因植株逐渐死亡，而转基因植株依然呈现绿色、根长，将阳性植株移栽到25℃，16hr光照/8hr黑暗的培养室里培养，单株收获的种子为T₁代。

转基因植株纯合体的筛选：将T₁代种子经灭菌和春化处理之后，播种在含有50μg/ml的卡那霉素的1/2MS培养基上。1周后统计绿苗和白化的分离比，挑选分离比接近3∶1的株系种植下去，种子单株收获，即为T₂代。T₂代种子经同样的方法筛选，在含有卡那霉素的1/2MS培养基上能够全部生长的即为纯合体，种植下去收获的种子为T₃代，即为纯合体种子。

2、实验结果

将p35S::GhFT载体转入拟南芥中，转基因植株明显出现早花表型(图3中1所示)，并且通过RT-PCR分析表明GhFT基因确实在转基因拟南芥中表达量提高了(图3中2所示)。统计转基因植株的莲座叶也明显少于野生型的(图3中3所示)，表明克隆的棉花的GhFT基因能调节植物的开花时间。

p35S::GhFT-GFP载体转基因植株(图4所示)也能明显的促进拟南芥早花，并且通过激光共聚焦能明显检测到绿色荧光蛋白GFP的表达(图6所示)，用拟南芥韧皮部特异表达的启动子构建的载体pSUC2::GhFT-GFP，转入拟南芥中，转基因植株的韧皮部可以检测到GFP的表达，转基因植株同样可以表现早花(图5中1所示)，并且转基因植株在韧皮部检测到绿色荧光蛋白GFP(图5中2所示)。

实施例四：GhFT基因在拟南芥根尖细胞的亚细胞定位分析

1、实验方法

载体构建和基因转化方法如上所述；

GFP观察：对筛选到的纯合的转基因植株p35S::GhFT-GFP的种子，经灭菌后播种到1/2MS(成分同上)培养基上，生长7天的幼苗，放在载玻片上，在激光共聚焦显微镜(Zeiss，LSM510)下观察根部细胞，用488nm激发GFP荧光。

2、实验结果

对p35S::GhFT-GFP转基因植株根尖细胞观察表明GFP绿色荧光蛋白不仅在细胞核中，在细胞质上也有(图6)，表明GhFT蛋白是一个细胞核和细胞质定位的蛋白。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.用于扩增棉花成花素基因GhFT的引物对，引物对序列为SEQ ID NO：3和SEQID NO：4。

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