CN102153605B - 一种咪唑立宾的提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种咪唑立宾的提纯方法，该方法是将咪唑立宾产生菌经发酵产生的发酵液依次进行如下三个步骤的操作：预处理、树脂富集、膜脱色浓缩制备咪唑立宾。本发明的方法与现有技术相比，具有浓缩倍数较高、产品纯度及活性高，质量稳定，且无二次污染等优点，并能够进行大规模推广应用，尤其是微生物水溶性代谢产物，应用前景广阔。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种生物领域的提纯方法，尤其涉及一种咪唑立宾的提纯方法。
【背景技术】
咪唑立宾（mizoribine，MZR）是1971年从霉菌的培养液中分离而得到的一种咪唑类核苷，后在放射菌（Actinomycetes）科的Streptomyces属streptomyces brefeldianum的发酵产物中也有咪唑立宾，其化学名为1-β-D呋喃核糖-4-氨甲酰基-5羟基咪唑内盐，是一种水溶性化合物。另外，咪唑立宾对核酸代谢中的嘌呤合成具有抑制作用，其进入机体细胞后，能够竞争性地抑制IMP脱氢酶和GMP合成酶，使细胞内的GMP减少，核酸的合成减少，从而进一步抑制细胞的增殖，因此，咪唑立宾可作为一种新型的免疫抑制剂，自1991年12月起在日本应用于临床肾移植，日本许多临床移植中心已将其作为肾移植后的常规免疫抑制药物，我国近年也将其作为肾移植抗排斥药用于临床，且咪唑立宾可用于治疗狼疮性肾炎、类风湿性关节炎、肾病综合征及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。
目前国内外咪唑立宾的生产方法主要有微生物发酵法和化学合成法。咪唑立宾的化学合成步骤多，反应条件苛刻，周期长，同时在进行碱基和核糖基团的缩合反应时，还需要进行基团的保护和去保护，从而造成合成反应的总收率偏低，成本居高不下；而微生物发酵生产咪唑立宾具有生产过程绿色、成本低等特点，是一条经济环保的生产途径。但是发酵过程中产生了大量深褐色的色素，而且对光和热不稳定，因此需要用适当的方法对其进行去除杂质、脱色、浓缩处理。现有的咪唑立宾产品生产工艺采用硅胶去色素和脱色液真空浓缩，但是实际效果不理想：其中硅胶对咪唑立宾有较强的吸附作用；且真空浓缩需要一定温度下操作而致使产品进一步降解，导致产品收率大为下降，因此需要寻找更有效的提纯方法。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种咪唑立宾的提纯方法，具有制备方法操作简单、纯化效率高、浓缩倍数较高、且稳定性良好等优点。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种咪唑立宾的提纯方法，将咪唑立宾产生菌经发酵产生的发酵液采用如下步骤进行操作：
（1）发酵液预处理：取适量咪唑立宾发酵液，并用碱性溶液将其pH值调至8.0～10.0，接着把调好pH值的该发酵液采用过滤膜进行常规过滤，从而得到咪唑立宾滤液；
（2）树脂富集：先将（1）中得到的咪唑立宾滤液以每分钟0.01～0.1倍填充床体积的速率泵入层析柱内，且该层析柱中已填装了经预处理的强碱性阴离子交换树脂；接着采用纯化水将层析柱内的溶液洗至中性，之后再用酸性溶液进行洗脱，并收集富集液，即获得咪唑立宾富集液；
（3）膜脱色浓缩：将（2）中获得的咪唑立宾富集液通过超滤膜进行脱色处理，且在该过程期间加入1～5倍富集液体积的纯化水，并收集膜滤出液，即含咪唑立宾的流出液；接着将该滤出液采用纳滤膜进行浓缩以获得咪唑立宾；
其中，所述的过滤膜为陶瓷膜，截留分子量为10KD～50KD；所述强碱性阴离子交换树脂是骨架为苯乙烯-二乙烯基苯共聚体上带有季氨基[N-(CH3)2C2H4OH]的阴离子交换树脂，或是D201树脂，或是D241树脂，或是D246树脂；所述超滤膜为聚醚砜超滤膜，其截留分子量为1KD～5KD；所述纳滤膜为聚酰胺纳滤膜，截留分子量为100D～1KD。
进一步地，所述过滤膜为陶瓷膜的优选截留分子量为30KD。
进一步地，所述酸性溶液为盐酸或磷酸或乙酸的一种。
进一步地，所述超滤膜的优选截留分子量为1KD。
进一步地，所述纳滤膜的优选截留分子量为300D。
本发明一种咪唑立宾的提纯方法的有益效果在于：制备方法操作简单、纯化效率高；在发酵液预处理、脱色浓缩过程中采用了膜技术，即采用膜过滤、膜脱色浓缩，具有高效、节能，过程易控制、操作方便、少污染等优点；咪唑立宾发酵液（呈深褐色）经过强碱性阴离子交换树脂的吸附层析，使目标产物得以富集；膜脱色去杂处理后得到浅黄色溶液，而且进一步膜浓缩，咪唑立宾最终浓缩倍数较高，且产品回收率达到85%以上，另外，本制备方法具有良好的稳定性，并能够进行大规模推广应用。
【具体实施方式】
本发明一种咪唑立宾的提纯方法，将咪唑立宾产生菌经发酵产生的发酵液采用如下步骤进行操作：（1）发酵液预处理：取适量咪唑立宾发酵液，并用碱性溶液将其pH值调至8.0～10.0，接着把调好pH值的该发酵液采用过滤膜进行常规过滤，从而得到咪唑立宾滤液；（2）树脂富集：先将（1）中得到的咪唑立宾滤液以每分钟0.01～0.1倍填充床体积的速率泵入层析柱内，且该层析柱中已填装了经预处理的强碱性阴离子交换树脂；接着采用纯化水将层析柱内的溶液洗至中性，之后再用酸性溶液进行洗脱，并收集富集液，即获得咪唑立宾富集液；（3）膜脱色浓缩：将（2）中获得的咪唑立宾富集液通过超滤膜进行脱色处理，且在该过程期间加入1～5倍富集液体积的纯化水，并收集膜滤出液，即含咪唑立宾的流出液；接着将该滤出液采用纳滤膜进行浓缩以获得咪唑立宾。另外，在本发明中，强碱性阴离子交换树脂可以选用骨架为苯乙烯-二乙烯基苯共聚体上带有季氨基[N-(CH3)2C2H4OH]的阴离子交换树脂、D201树脂、D241树脂、D246树脂中的任一种；酸性溶液为盐酸或磷酸或乙酸的一种；过滤膜采用陶瓷膜，其截留分子量为10KD～50KD；超滤膜为聚醚砜超滤膜，其截留分子量为1KD～5KD；纳滤膜为聚酰胺纳滤膜，截留分子量为100D～1KD。
为了更好的对本发明进行说明，本发明举了如下几个实施例，且在各个实施例中，为了使处理的效果较好，过滤膜优选截留分子量为30KD、超滤膜优选截留分子量为1KD、纳滤膜优选截留分子量为300D；因盐酸用量少，整体价格低廉，则酸性溶液选用盐酸；强碱性阴离子交换树脂采用较易购买得到的D201树脂，其是由上海华震科技贸易公司生产；此外，为了达到去除填装入层析柱内D201树脂中的杂质及活化其离子等目的，需对树脂进行预处理，采用的是常规的处理方法，具体操作为：将准备装柱使用的D201树脂先用50-60℃热水（清洁的自来水也可）反复清洗，浸洗至浸洗水不带褐色，泡沫很少时为止，接着将5L热水处理过的D201树脂装入Φ10×120cm的层析柱中，之后对树脂进行碱洗（采用10升5%氢氧化钠浸泡24小时），然后用纯化水洗至中性，接着酸洗（采用10升1.0mol/L盐酸浸泡24小时），再用纯化水洗至中性，之后再进行碱洗（采用10升5%氢氧化钠浸泡24小时），最后用纯化水洗至中性，即得到预处理的D201树脂，备用。
实施例一
取适量咪唑立宾发酵液用氢氧化钠调pH至8.0，并把调好pH值的该发酵液采用陶瓷膜进行常规过滤，从而得到咪唑立宾滤液；接着取50L咪唑立宾滤液以每分钟100ml的速率泵入已填装了经预处理的D201树脂的层析柱内，待滤液全部泵入后，采用纯化水淋洗层析柱至中性，之后再用0.05%盐酸进行洗脱，并收集富集液，最终获得20L咪唑立宾富集液；再把20L咪唑立宾富集液倒入超滤膜罐内进行脱色去杂处理，且在该过程期间补充纯化水60L，并收集膜滤出液(呈浅黄色，即含咪唑立宾的流出液)，将该滤出液采用纳滤膜进行浓缩，得浓缩液4L，咪唑立宾总收率91.2%。
实施例二
取适量咪唑立宾发酵液用氢氧化钠调pH至10.0，并把调好pH值的该发酵液采用陶瓷膜进行常规过滤，从而得到咪唑立宾滤液；接着取25L咪唑立宾滤液以每分钟80ml的速率泵入已填装了经预处理的D201树脂的层析柱内，待滤液全部泵入后，采用纯化水淋洗层析柱至中性，之后再用0.05%盐酸进行洗脱，并收集富集液，最终获得15L咪唑立宾富集液；再把15L咪唑立宾富集液倒入超滤膜罐内进行脱色去杂处理，且在该过程期间补充纯化水40L，并收集膜滤出液(呈浅黄色，即含咪唑立宾的流出液)，将该滤出液采用纳滤膜进行浓缩，得浓缩液3.5L，咪唑立宾总收率88.6%。
实施例三
取适量咪唑立宾发酵液用氢氧化钠调pH至9.0，并把调好pH值的该发酵液采用陶瓷膜进行常规过滤，从而得到咪唑立宾滤液；接着取40L咪唑立宾滤液以每分钟100ml的速率泵入已填装了经预处理的D201树脂的层析柱内，待滤液全部泵入后，采用纯化水淋洗层析柱至中性，之后再用0.05%盐酸进行洗脱，并收集富集液，最终获得20L咪唑立宾富集液；再把20L咪唑立宾富集液倒入超滤膜罐内进行脱色去杂处理，且在该过程期间补充纯化水50L，并收集膜滤出液(呈浅黄色，即含咪唑立宾的流出液)，将该滤出液采用纳滤膜进行浓缩，得浓缩液4L，咪唑立宾总收率90.6%。
综上，本发明制备方法操作简单、纯化效率高；在发酵液预处理、脱色浓缩过程中采用了膜技术，即采用膜过滤、膜脱色浓缩，具有高效、节能，过程易控制、操作方便、少污染等优点；咪唑立宾发酵液（呈深褐色）经过强碱性阴离子交换树脂的吸附层析，使得目标产物富集；膜脱色去杂处理后得到浅黄色溶液，而且进一步膜浓缩，咪唑立宾最终浓缩倍数较高，可达10倍以上，且产品回收率达到85%以上，另外，本制备方法具有良好的稳定性，并能够进行大规模推广应用。
Claims (5)
1.一种咪唑立宾的提纯方法，其特征在于：将咪唑立宾产生菌经发酵产生的发酵液采用如下步骤进行操作：
（1）发酵液预处理：取适量咪唑立宾发酵液，并用碱性溶液将其pH值调至8.0～10.0，接着把调好pH值的该发酵液采用过滤膜进行常规过滤，从而得到咪唑立宾滤液；
（2）树脂富集：先将（1）中得到的咪唑立宾滤液以每分钟0.01～0.1倍填充床体积的速率泵入层析柱内，且该层析柱中已填装了经预处理的强碱性阴离子交换树脂；接着采用纯化水将层析柱内的溶液洗至中性，之后再用酸性溶液进行洗脱，并收集富集液，即获得咪唑立宾富集液；
（3）膜脱色浓缩：将（2）中获得的咪唑立宾富集液通过超滤膜进行脱色处理，且在该过程期间加入1～5倍富集液体积的纯化水，并收集膜滤出液，即含咪唑立宾的流出液；接着将该滤出液采用纳滤膜进行浓缩以获得咪唑立宾；
其中，所述的过滤膜为陶瓷膜，其截留分子量为10KD～50KD；所述强碱性阴离子交换树脂是骨架为苯乙烯-二乙烯基苯共聚体上带有季氨基[N-(CH3)2C2H4OH]的阴离子交换树脂，或是D201树脂，或是D241树脂，或是D246树脂；所述超滤膜为聚醚砜超滤膜，其截留分子量为1KD～5KD；所述纳滤膜为聚酰胺纳滤膜，截留分子量为100D～1KD。
2.如权利要求1所述的一种咪唑立宾的提纯方法，其特征在于：所述过滤膜的优选截留分子量为30KD。
3.如权利要求1所述的一种咪唑立宾的提纯方法，其特征在于：所述酸性溶液为盐酸或磷酸或乙酸的一种。
4.如权利要求1所述的一种咪唑立宾的提纯方法，其特征在于：所述超滤膜的优选截留分子量为1KD。
5.如权利要求1所述的一种咪唑立宾的提纯方法，其特征在于：所述纳滤膜的优选截留分子量为300D。
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| CN1465410A (zh) * | 2002-06-27 | 2004-01-07 | 微创医疗器械(上海)有限公司 | 一种具有多层涂层的药物洗脱支架 |
| CN1478087A (zh) * | 2000-11-07 | 2004-02-25 | ��˹��ŵ�� | 作为蛋白激酶c抑制剂的吲哚基马来酰亚胺衍生物 |
-
2011
- 2011-03-02 CN CN201110050467.3A patent/CN102153605B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1341124A (zh) * | 1999-01-15 | 2002-03-20 | 诺瓦提斯公司 | 抗cd3免疫毒素及其治疗用途 |
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| CN1465410A (zh) * | 2002-06-27 | 2004-01-07 | 微创医疗器械(上海)有限公司 | 一种具有多层涂层的药物洗脱支架 |
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