CN102120772B - 一种嵌合抗体及免疫细胞 - Google Patents
一种嵌合抗体及免疫细胞 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102120772B CN102120772B CN 201010033761 CN201010033761A CN102120772B CN 102120772 B CN102120772 B CN 102120772B CN 201010033761 CN201010033761 CN 201010033761 CN 201010033761 A CN201010033761 A CN 201010033761A CN 102120772 B CN102120772 B CN 102120772B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- cells
- antibody
- gpat
- chimeric antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 57
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 claims description 32
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 claims description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 180
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 19
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 7
- -1 CD3 compound Chemical class 0.000 abstract description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract 1
- 102100039239 Amidophosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 35
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 35
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 26
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 26
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 17
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 17
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 101000986086 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 4
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 4
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- GECIDMICWWDIBO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3',6'-dihydroxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-5-carboxylate Chemical group C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=CC=2)OC(=O)C1=CC=2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O GECIDMICWWDIBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 2
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 2
- 210000001099 axilla Anatomy 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGQPPBQRUBVTIF-JBDRJPRFSA-N Ala-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LGQPPBQRUBVTIF-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- QQACQIHVWCVBBR-GVARAGBVSA-N Ala-Ile-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QQACQIHVWCVBBR-GVARAGBVSA-N 0.000 description 1
- OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N Ala-Leu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N Ala-Ser-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RTZCUEHYUQZIDE-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N Ala-Thr-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN SAHQGRZIQVEJPF-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- QRIYOHQJRDHFKF-UWJYBYFXSA-N Ala-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 QRIYOHQJRDHFKF-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N Arg-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N Arg-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N HJVGMOYJDDXLMI-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YHQGEARSFILVHL-HJGDQZAQSA-N Arg-Gln-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O YHQGEARSFILVHL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N Arg-Gly-Arg Chemical compound N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O HQIZDMIGUJOSNI-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N PHHRSPBBQUFULD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SSZGOKWBHLOCHK-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N SSZGOKWBHLOCHK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LYJXHXGPWDTLKW-HJGDQZAQSA-N Arg-Thr-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O LYJXHXGPWDTLKW-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XOZYYXMHMIEJET-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N Arg-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JREOBWLIZLXRIS-GUBZILKMSA-N Asn-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JREOBWLIZLXRIS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O SKQTXVZTCGSRJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N Asp-Lys-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UZFHNLYQWMGUHU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- GIKOVDMXBAFXDF-NHCYSSNCSA-N Asp-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GIKOVDMXBAFXDF-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N Cys-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O TVYMKYUSZSVOAG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 101100283497 Dictyostelium discoideum gpaF gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N Gln-Asn-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N TWHDOEYLXXQYOZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MSHXWFKYXJTLEZ-CIUDSAMLSA-N Gln-Met-Asn Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MSHXWFKYXJTLEZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UWMDGPFFTKDUIY-HJGDQZAQSA-N Gln-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UWMDGPFFTKDUIY-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N Glu-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CGYDXNKRIMJMLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N Glu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SBCYJMOOHUDWDA-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- LVCHEMOPBORRLB-DCAQKATOSA-N Glu-Gln-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O LVCHEMOPBORRLB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKLRYVLERDYDBI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ITBHUUMCJJQUSC-LAEOZQHASA-N Glu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O ITBHUUMCJJQUSC-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NKRWVZQTPXPNRZ-SRVKXCTJSA-N His-Met-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NKRWVZQTPXPNRZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 101001057612 Homo sapiens Dual specificity protein phosphatase 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- VGSPNSSCMOHRRR-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N VGSPNSSCMOHRRR-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000011416 KIR2DL4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N BABSVXFGKFLIGW-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HRTRLSRYZZKPCO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- RTIRBWJPYJYTLO-MELADBBJSA-N Leu-Lys-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N RTIRBWJPYJYTLO-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- WUHBLPVELFTPQK-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WUHBLPVELFTPQK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N Lys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QUCDKEKDPYISNX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- LMVOVCYVZBBWQB-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LMVOVCYVZBBWQB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N Met-Ala-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PWPBGAJJYJJVPI-PJODQICGSA-N Met-Ala-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 PWPBGAJJYJJVPI-PJODQICGSA-N 0.000 description 1
- UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N Met-Gly-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O UZWMJZSOXGOVIN-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N Met-Lys-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O AXHNAGAYRGCDLG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N Met-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008043 NK cell inhibitory receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011794 NU/NU nude mouse Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N Phe-Val-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 CDHURCQGUDNBMA-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- LSIWVWRUTKPXDS-DCAQKATOSA-N Pro-Gln-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O LSIWVWRUTKPXDS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UPJGUQPLYWTISV-GUBZILKMSA-N Pro-Gln-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UPJGUQPLYWTISV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N Pro-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O ULWBBFKQBDNGOY-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- LVVBAKCGXXUHFO-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LVVBAKCGXXUHFO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPCZVWHJWJFTFN-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N Ser-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZKOKTQPHFMRSJP-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- OSFZCEQJLWCIBG-BZSNNMDCSA-N Ser-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OSFZCEQJLWCIBG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N LGIMRDKGABDMBN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N Thr-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SHOMROOOQBDGRL-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N Thr-Gly-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- KZURUCDWKDEAFZ-XVSYOHENSA-N Thr-Phe-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N)O KZURUCDWKDEAFZ-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N Trp-Arg-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(=O)O)N SCQBNMKLZVCXNX-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BURPTJBFWIOHEY-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N Tyr-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NUQZCPSZHGIYTA-HKUYNNGSSA-N Tyr-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N NUQZCPSZHGIYTA-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- AGKDVLSDNSTLFA-UMNHJUIQSA-N Val-Gln-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N AGKDVLSDNSTLFA-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 1
- PWCJARIQERIIGF-BZSNNMDCSA-N Val-Met-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N PWCJARIQERIIGF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003127 anti-melanomic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010059459 arginyl-threonyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 102000043381 human DUSP5 Human genes 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010077158 leucinyl-arginyl-tryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010090333 leucyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001875 tumorinhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010000998 wheylin-2 peptide Proteins 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种嵌合抗体及免疫细胞。本发明的嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、HLA-A2分子的跨膜区片段、CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段。本发明嵌合体抗体可表达于任何细胞的表面，当使其表达于免疫细胞表面时，该免疫细胞便通过其上的目的抗体具有了特异的免疫功能，所以本发明的嵌合抗体可以随着其中的目的抗体的不同而特异结合多种抗原。本发明的嵌合抗体、单域抗体及表达嵌合抗体的免疫细胞在细胞免疫治疗中将会有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种嵌合抗体及免疫细胞。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer，NK)是淋巴细胞的一个亚类，在宿主对恶性肿瘤的细胞免疫应答中扮演了重要的角色。NK细胞对肿瘤的杀伤无MHC限制性，无特异性，不需抗原预先致敏。许多细胞因子(包括IL-2)能增强NK细胞的杀瘤活性。NK细胞的功能受其细胞表面表达的活化受体和抑制性受体的调节。
研究表明，NK细胞能有效杀伤MHC-I分子下调的肿瘤细胞，这使得它们能有效杀伤逃逸免疫应答的肿瘤变异细胞。许多研究表明，体外培养的、活化的自体或异体的NK细胞通过释放穿孔素和细胞因子，能有效抑制小鼠体内肿瘤的生长。然而，NK细胞的分离和扩大培养在技术上存在很大的难度。而且，病人起源的NK细胞功能受到损害，即使在体外经过淋巴因子活化培养后也不能恢复，这使得该方法的应用受到很大的限制。最重要的是，NK细胞的体外扩增比较困难，而且少数扩增得到的各批次的NK细胞也不一样，导致应用于临床实验的NK细胞无法标准化，这就促使研究者去探索细胞毒NK细胞系的特性和治疗潜力。连续生长的人IL-2依赖的NK-92细胞系被认为是一个很好的肿瘤免疫治疗的候选效应细胞。研究证实，NK-92细胞对多种不同来源的恶性细胞在体外和人源化的小鼠体内模型中均显示了很强的细胞毒活性。而且，NK-92细胞对同种异体的正常细胞没有毒性。目前，研究者正在评价NK-92细胞临床应用的安全性与有效性。NK-92细胞具有活化的NK细胞的功能，它们表达典型的NK细胞表面受体，缺少Fc-γRIII(CD16)。它们的高内源性的细胞毒活性极有可能归因于NK细胞抑制性受体的缺乏。NK-92细胞仅表达一种抑制性受体，即KIR2DL4，该受体通过结合靶细胞表面的人白细胞抗原G(HLA-G)来抑制NK细胞的细胞毒活性。
NK-92-MI细胞是NK-92细胞的变体，持续性分泌中等水平的IL-2，保留了母本细胞的表型特征和高细胞毒活性，但具有NK-92细胞所不具备的几个优点：首先，NK-92-MI细胞具有不依赖外源IL-2的长期的高细胞毒活性，因此避免了系统注射IL-2所产生的毒性；其次，NK-92-MI细胞的保持和扩增比母本细胞系更简单，不需在培养基中另加IL-2，这对NK细胞的大规模扩增显得尤其重要；而且，NK-92-MI细胞能杀伤体外和异种移植的小鼠体内的人肿瘤细胞系。
研究表明，嵌合受体能成功表达在NK-92细胞系的表面，赋予NK-92细胞特异、有效地杀伤表达膜抗原的肿瘤细胞的能力。这类嵌合受体具有两个功能：抗体片段依赖的抗原结合；信号受体的活化结构域依赖的效应细胞活化。然而，因为抗体不能穿透细胞膜去结合胞内表达的肿瘤抗原，这使得以该类抗原为靶标的NK-92或NK-92-MI的细胞靶向治疗至今停滞不前。而且，因为大多数肿瘤抗原都是胞内蛋白，寻找能特异结合该类抗原的抗体将极大地扩展肿瘤靶向治疗的适用范围。
研究表明，细胞内的肿瘤抗原被蛋白酶或溶酶体降解为小肽，与HLA-I或HLA-II分子结合后，形成HLA/peptide复合物，被呈递到肿瘤细胞表面，进而被T细胞表面的TCR受体识别，介导T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
目前，以抗体为基础的肿瘤靶向治疗常用的抗体是单链抗体或抗体Fab段，与它们相比，单域抗体具有几个独一无二的优点：(1)单域抗体仅含有抗体重链的一个可变区，是最小的全功能性的抗原结合片段，因此容易进行基因工程操作；(2)单域抗体与人的VH3域有很高的同源性。这些特性使它们成为肿瘤靶向治疗的极合适的候选抗体。直到现在，仅有一篇文献报道了以单域抗体为基础的免疫毒素用于肿瘤的免疫治疗。
通过杂交瘤技术制备MHC/肽复合物特异的TCR样抗体仍存在很大的技术难度。重组抗体及噬菌体展示技术的发展为TCR样抗体的制备提供了新的途径。
Gp100是黑色素细胞分化抗原，定位于细胞内，被加工后以MHC/肽复合物的方式呈递到肿瘤细胞表面，进而被T细胞识别和杀伤。Gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)是主要的HLA-A2限制性的表位。研究表明，以特异识别HLA/gp 100-肽复合物的Fab抗体为基础的免疫毒素能有效抑制裸鼠体内人黑色素瘤细胞的生长。源于黑色素肿瘤浸润的HLA-A2限制性的CTL能识别gp100表位。这些报告证实HLA-A2/gp100-肽复合物是肿瘤靶向治疗的有效靶标。目前，仅有一篇文献报道了以HLA-A2/gp100-肽复合物特异的Fab抗体为基础的免疫毒素用于黑色素瘤的免疫治疗，未见以HLA-A2/gp100-肽复合物特异的单域抗体为基础的靶向治疗的报道，也未见以HLA-A2/gp100-肽复合物特异的抗体为基础的细胞靶向治疗的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可在细胞表面表达的嵌合抗体，这种抗体特别适用于在杀伤细胞中表达，然后使细胞行使杀伤性免疫功能。
本发明所提供的嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、HLA-A2分子的跨膜区片段、CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段。
本发明所提供的嵌合抗体还可以是如下的抗体：其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、标签、跨膜区片段、胞内区片段；所述目的抗体为识别MHC-肽复合物的肽特异性的抗体。此抗体即是附加了标签的抗体，附加标签的作用在于便于检测嵌合抗体的表达。
所述跨膜区片段可为HLA-A2分子的跨膜区片段；所述胞内区片段可为CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段；所述标签可为Myc标签。
所述Myc标签的氨基酸序列具体可如序列表中序列2所示；所述HLA-A2分子的跨膜区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示；所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列4所示。
所述目的抗体的氨基酸序列具体可如序列表中序列1所示。
本发明的另一个目的是提供一种特异结合黑色素瘤细胞分化抗原HLA-A2/gp 100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物的单域抗体。
本发明所提供的单域抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
表达上述任一所述抗体的免疫细胞也属于本发明的保护范围。
所述表达上述任一所述抗体的免疫细胞具体可以是通过向宿主细胞中导入所述抗体的编码基因得到的。
上述任一所述单域抗体或嵌合抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述单域抗体的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述单域抗体的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码所述单域抗体的DNA分子；
所述嵌合抗体中所述Myc标签的编码基因具体可为序列表中序列6所示的DNA分子；
所述嵌合抗体中所述HLA-A2分子的跨膜区片段的编码基因具体可为如下a)或b)或c)的基因：
a)其核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；
b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；
c)与a)或b)限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子；
所述嵌合抗体中所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的编码基因具体可为如下I、II或III的基因：
I其核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子；
II在严格条件下与I限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子；
III与I或II限定的DNA序列有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子；
上述严格条件是，在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也均属于本发明的保护范围。
所述转基因细胞系的宿主细胞具体可为免疫细胞；所述免疫细胞具体可为自然杀伤细胞。
实验证明，本发明的单域抗体能特异结合固化的HLA-A2/gp100209-217(215E)(1MDQVPESV)复合物，不能结合固化的HLA-A2/p65495-503或HLA-A2/Core18-27对照复合物。GPAT-pen五聚体能特异结合gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)肽脉冲的T2细胞，而不结合无关肽脉冲的T2细胞或无肽脉冲的T2细胞。表明，本发明的单域抗体能与黑色素瘤表面呈递的HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物结合，且特异性强。
本发明嵌合体抗体可表达于任何细胞的表面，当使其表达于免疫细胞表面时，该免疫细胞便通过其上的目的抗体具有了特异的免疫功能，所以本发明的嵌合抗体可以随着其中的目的抗体的不同而特异结合多种抗原。例如，本发明的嵌合体抗体GPAT-ζ能表达于NK-92-MI细胞的表面，含有该嵌合体抗体编码基因的NK-92-MI细胞(即NK-92-MI-GPAT-ζ细胞)与母本NK-92-MI细胞相比，无论是体内还是体外，均更能有效地、特异的裂解表达HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物的黑色素瘤细胞，杀伤率高。
本发明的表达嵌合抗体的免疫细胞可以用于靶向多种黑色素瘤细胞进行细胞免疫治疗，与现有的免疫毒素治疗方法相比，细胞免疫治疗具有如下优点(1)效果确切，有效率高。一般为40-50％，对有些癌症，有效率高达70％；(2)无明显毒副作用，病人不痛苦；(3)适应症广；(4)特别适用于多发病灶或有广泛转移的恶性肿瘤。因此，本发明的嵌合抗体、单域抗体及表达嵌合抗体的免疫细胞在细胞免疫治疗中将会有广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组载体pVT2-GPAT和pVT2-GPAT-pen的结构示意图。
图2为GPAT单体及GPAT五聚体的电泳图。
图3为GPAT的抗原结合特异性检测。
图4为GPAT-pen对肽脉冲的T2细胞的特异结合。
图5为嵌合抗体GPAT-ζ的结构示意图及在NK-92-MI细胞表面的表达。
图6为NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)肽脉冲的T2细胞、p65495-503肽或Core18-27肽脉冲的T2细胞的杀伤活性。
图7为NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对人黑色素瘤细胞Malme-3m、Mel-624或T2细胞的杀伤活性。
图8为NK-92-MI-GPAT-ζ细胞的体内抗黑色素瘤活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
原核表达载体pVT2(Zhang等，J Mol Biol，335，2004，49-56)(中国科学院微生物研究所)。
实施例1、HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)特异的单域抗体(GPAT)的制备与功能验证
NK-92-MI细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-2408；T2细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-1992TM；人黑色素瘤细胞Malme-3m购自ATCC，产品目录号HTB64。
人NK-92-MI细胞系和人的T淋巴瘤/B细胞杂交细胞T2(HLA-A2+and gp100-)用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的1640完全培养基培养。
NK-92-MI-GPAT-ζ细胞用含有1000μg/ml G418的1640完全培养基培养。
人黑色素瘤细胞系Mel-624(HLA-A2+和gp100+)和Malme-3m(HLA-A2+和gp100+)用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM完全培养基培养。
一、单域抗体(GPAT抗体)的编码基因的制备
以表达GPAT的噬菌体(北京表源生物技术有限公司)为模板，以gpaF：5’
TAATAA
CGCAGGCGCGTCTGGGGGAG 3’和gpaR：5’
ATTATTATGGGCCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT 3’
为引物，PCR扩增得到编码GPAT的cDNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列5所示，扩增得到的基因两端的酶切位点为BbsI/ApaI。该GPAT抗体的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
二、重组载体pVT2-GPAT和pVT2-GPAT-pen的构建
(1)重组载体pVT2-GPAT-pen的构建：
原核表达载体pVT2自身依次含有信号肽片段的编码序列、VTB1片段的编码序列、连接子、myc标签的编码序列和His标签的编码序列。将序列表中序列5所示的GPAT片段克隆到原核表达载体pVT2的BbsI/ApaI位点，得到pVT2-GPAT-VTB1重组质粒，命名为pVT2-GPAT-pen，其中GPAT-pen是由序列表中序列5所示的GPAT片段、VT1B的编码序列、Myc标签(EQKLISEEDL)的编码序列和His标签的编码序列融合而成，GPAT-pen的结构示意图如图1B所示。(1表示信号肽片段的编码序列、2表示GPAT片段，3表示VT1B的编码序列，4表示连接子，5表示Myc标签的编码序列，6表示His标签的编码序列)
Myc标签的氨基酸序列如序列表中序列2所示；Myc标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。
大肠杆菌中的B亚基毒素基因VT1B能自我装配形成五聚体，将该亚基融合到目的蛋白的C端，可使融合蛋白五聚体化。
(2)重组载体pVT2-GPAT的构建：
将引物ABF(cggcggcggct)和ABR(ccggagccgccgccgggcc)直接退火得到编码三个甘氨酸、两端酶切位点为ApaI/BspEI的DNA片段，将该片段以读码框一致的方式克隆到用ApaI/BspEI酶切位点消化过的pVT2-GPAT-pen载体，VT1B序列被删除，得到重组质粒pVT2-GPAT，其中，GPAT由序列表中序列5所示的GPAT片段、myc标签(EQKLISEEDL)的编码基因和由5个组氨酸组成的His标签的编码基因融合而成，GPAT的结构示意图如图1A所示(1表示信号肽片段的编码序列、2表示GPAT片段，3表示连接子，4表示Myc标签的编码序列，5表示His标签的编码序列)。
三、重组载体转化大肠杆菌得到重组菌
将重组载体pVT2-GPAT转入大肠杆菌TG1，通过氨苄青霉素筛选、酶切鉴定得到阳性克隆，再测序验证，得到含有重组载体pVT2-GPAT的重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT。按照同样的方法，得到含有重组载体pVT2-GPAT-pen的重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT-pen。
四、GPAT-pen五聚体和GPAT单体的表达与纯化
将重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT和TG1/pVT2-GPAT-pen分别接种到含100μg/ml氨苄青霉素钠的10ml LB培养基中，37℃，220rpm振摇过夜。将10ml培养物接种到含有100μg/ml氨苄青霉素钠的1L LB培养基中，37℃，220rpm振摇5小时。5小时后，加入1mM IPTG到培养物中诱导蛋白表达，24℃，180rpm，继续振摇培养22h。将培养物在8000g离心15分钟。将沉淀重悬在25ml 20mM的Tris-Hcl(pH 8.0)缓冲液中，加入5mg溶菌酶，室温反应30分钟。然后，将混合物用超声破碎仪超声，直到混合物变清澈后，12000rpm，20分钟离心，重复两次，通过0.22μM滤纸过滤。His5标记的GPAT和GPAT-pen通过金属离子亲和层析(IMAC)(GE Healthcare)进行纯化。纯化的蛋白通过10％SDS-PAGE进行分析。
重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT表达的目的蛋白是由GPAT、连接子、Myc标签和His标签组成的单体融合蛋白。
重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT-pen表达的目的蛋白是以GPAT、VTB1、连接子、Myc标签和His标签组成的融合蛋白为单体形成的五聚体。
实验设3次重复，电泳结果如图2所示(1表示融合蛋白五聚体，2表示融合蛋白单体)。GPAT-pen和GPAT以可溶形式在大肠杆菌TG1中表达，在变性条件下，目标蛋白GPAT的分子量约为17kDa，目标蛋白GPAT-pen五聚体的分子量约为24kDa。纯化的蛋白纯度大于95％。三次实验重复GPAT-pen的产量分别是9mg/L培养物、10mg/L培养物、9.5mg/L培养物，三次实验重复GPAT的产量分别是95mg/L培养物、100mg/L培养物、90mg/L培养物。
五、GPAT的功能验证
(一)ELISA方法检测GPAT的抗原结合特异性
(1)BSA的生物素标记：将BSA用sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce，Rockford)进行标记，标记方法按照说明书进行。
(2)HLA-A2-肽复合物的生物素标记：
HLA-A2-gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)、HLA-A2-CMV p65495-503(NLVPMVATV)、HLA-A2-HBV Core18-27 (FLPSDFFPSV)的制备均根据Dirk Busch制备Tetramer protocol中的相关步骤进行(Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.Science 274，94-6)。概述如下：将HLA-A2分子的细胞外部分和β2m轻链在大肠杆菌中以包涵体的形式表达，再加相应的肽进行折叠；在折叠后，再将HLA-A2-肽复合物浓缩。所有肽由SBS Genetech Co.(Beijing)合成。
以上各复合物的生物素标记：用BirA生物素化连接酶(Avidity)进行生物素化，然后通过Superdex 200(GE Healthcare)柱进行纯化。
(3)ELISA方法检测GPAT的抗原结合特异性
将生物素化的BSA(10μg/ml，稀释于PBS，pH 7.4)过夜包被在96孔板(NUNC，maxi sorp)中，用PBST(含0.1％Tween 20的PBS，pH 7.4)洗三次后，加入抗生物素蛋白链菌素(10μg/ml，稀释于PBS，pH7.4)，温育1小时。用PBST洗三次后，将生物素化的HLA-A2-肽复合物(5μg/ml，稀释于PBS，pH7.4，呈递gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)，p65495-503或Core18-27三种不同的肽)通过抗生物素蛋白链菌素包被在96孔板上。仔细洗涤后，96孔板用MPBS(含2％牛奶的PBS，pH7.4)阻断30分钟，再加入重组大肠杆菌TG1/pVT2-GPAT表达的目的蛋白(50μg/ml，稀释于PBS，pH7.4)室温温育1小时，然后用抗myc的抗体(9E10克隆，用MPBS稀释)染色，接下来用HRP-偶联的山羊抗小鼠的免疫球蛋白(用MPBS稀释)染色。用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺试剂(Jingmei，China)进行检测。用2M硫酸终止反应，用读板器测A450值。用小鼠抗人HLA-A2的单克隆抗体BB7.2作为阳性对照以检测复合物的正确折叠。实验设3次重复。结果如图3所示(A表示HLA-A2/gp 100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物，B表示HLA-A2/CMV p65495-503(NLVPMVATV)复合物，C表示HLA-A2/HBV Core18-27(FLPSDFFPSV)复合物；1表示实验组，2表示单克隆抗体BB7.2阳性对照)。GPAT能特异结合固化的HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物，不能结合固化的HLA-A2/p65495-503或HLA-A2/Core18-27对照复合物。HLA-A2构象特异的单克隆抗体BB7.2作为阳性对照，证实HLA-A2/肽复合物成功地包被到了96孔板上。
(二)通过FACS检测GPAT-pen对肽脉冲的T2细胞的特异结合
T2细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-1992TM。
T2细胞含有HLA-A2基因，但仅在细胞表面表达很低水平的HLA-A2分子，不能呈递内源性抗原。外源肽的脉冲能稳定HLA-A2分子，进而提高T2细胞表面HLA-A2分子的表达水平。为了检测GPAT是否能特异结合细胞表面表达的HLA-A2/gp100209-21(215E)(IMDQVPESV)7复合物，本实验将特异肽gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)，无关肽p65495-503或Core18-27脉冲的T2细胞用作靶细胞，通过FACS分析的方法来分析结合能力。
检测GPAT-pen对肽脉冲的T2细胞的特异结合：将2×106个T2细胞与20μM的肽置于RPMI-1640培养基中，37℃温育4小时；洗细胞，将细胞重悬在染色缓冲液中(含0.5％BSA与2mM EDTA的PBS缓冲液)，细胞浓度调整为5×106个细胞/ml，将3μg融合蛋白五聚体GPAT-pen加入到100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟。洗细胞，将细胞重悬在100μl含有1μg抗myc抗体的染色缓冲液中，冰浴30分钟。洗细胞，将细胞重悬在含1μl FITC标记的山羊抗小鼠多克隆抗体的100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟，洗细胞，将细胞重悬在0.5ml的染色缓冲液中，用FACScan仪器(Guava Easycyte mini)进行检测，结果用Flowjo软件进行评价。
用BB7.2检测HLA-A2的总体表达水平：2×106个T2细胞与20μM的肽在RPMI-1640培养基中，37℃温育4小时，洗细胞，将细胞重悬在染色缓冲液中(含0.5％BSA与2mM EDTA的PBS)，细胞浓度调整为5×106细胞/ml，将1μg BB7.2加入到100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟。洗细胞，将细胞重悬在含1μl FITC标记的山羊抗小鼠多克隆抗体的100μl染色缓冲液中，冰浴30分钟，洗细胞，将细胞重悬在0.5ml的染色缓冲液中，用FACScan仪器(Guava Easycyte mini)进行检测，结果用Flowjo软件进行评价。
实验设3次重复。表明，GPAT-pen五聚体能特异结合gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)肽脉冲的T2细胞，而不结合无关肽脉冲的T2细胞或无肽脉冲的T2细胞(图4A)。HLA-A2构象特异的单克隆抗体BB7.2用于检测肽脉冲的T2细胞表面上调表达的HLA-A2，证实肽正确的装载到了T2细胞表面(图4B)。图4中，gp100表示HLA-A2-gp100209-217 (215E)(IMDQVPESV)的结果、CMV表示HLA-A2-CMV p65495-503(NLVPMVATV)的结果、HBV表示HLA-A2-HBV Core18-27(FLPSDFFPSV)的结果、不加肽表示不加任何肽的结果。
实施例2、嵌合抗体GPAT-ζ的构建与应用
一、含有嵌合抗体GPAT-ζ的编码基因的重组载体的构建
GPAT-ζ嵌合抗体的编码基因由HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)特异的单域抗体GPAT的编码基因(图5A中GPAT)、编码Myc标签(EQKLISEEDL)的序列(图5A中Myc标签)、人HLA-A2分子的跨膜区片段(氨基酸291-340)的编码基因(图5A中TM，即下述a2tm)，人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段(氨基酸52-164)的编码基因(图5A中ζ)融合而成，其结构如图5A所示。
人HLA-A2分子的跨膜区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示；人HLA-A2分子的跨膜区片段的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。
人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列具体可如序列表中序列4所示；人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的编码基因如序列表中序列8所示。
将单域抗体GPAT的编码基因、编码Myc标签(EQKLISEEDL)的序列、人HLA-A2分子的跨膜区片段(氨基酸291-340)的编码基因，人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段(氨基酸52-164)的编码基因，以读码框一致的方式顺次插入到自带信号肽序列的真核表达载体pEF/myc/ER(Invitrogen，catalog V890-20)中，单域抗体GPAT的编码基因插入到载体的pstI/BamHI位点，由编码Myc标签(EQKLISEEDL)的序列、人HLA-A2分子的跨膜区片段(氨基酸291-340)的编码基因、人CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段(氨基酸52-164)的编码基因组成的融合基因插入到载体的BamHI和NotI位点。
单域抗体GPAT的编码基因的获得：以表达GPAT的噬菌体(北京表源生物技术有限公司)为模板，以pEF-gpat-sense：(gatctgcaggcgtctgggggaggctt)和pEF-gpat-anti-sense：(ctGGATCCTGAGGAGACGGTGAC)为引物，PCR扩增得到GPAT片段，其两端的酶切位点为pstI/BamHI；将该GPAT片段插入pEF/myc/ER的pstI/BamHI位点，得到pEF-GPAT重组质粒。
pEF-A2TM购自invitrogen，产品目录号为V893-20；pEF-ζ购自invitrogen，产品目录号为V893-20。
myc-a2tm-ζ片段的获得：以pEF-A2TM为模板，用P1和P2引物通过PCR扩增得到myc-a2tm片段。以pEF-ζ为模板，用P3和P4引物通过PCR扩增得到a2tm-ζ片段。以上述两种PCR产物为模板，用P1和P4引物通过重叠PCR扩增得到myc-a2tm-ζ片段。将myc-a2tm-ζ片段通过BamHI和NotI酶切位点插入pEF-GPAT重组质粒，得到pEF-GPAT-ζ重组质粒，该重组质粒中含有GPAT-ζ嵌合抗体基因。
P1：ctggatccgaacaaaaactcatct
P2：ttttctatctgagctcttcctcctccacatcacagcacgcg
P3：aggaagagctcagatagaaaaagagtgaagttcagcaggag
P4：tgacgcggccgcttagcgagggggcag
二、GPAT-ζ嵌合抗体在293T真核细胞中的表达
293T真核细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-11268。
1、用磷酸钙法将pEF-GPAT-ζ重组质粒转入293T真核细胞。
转染前一天，按4x105个细胞/孔，将293T细胞接种到6孔板中。将10μgpEF-GPAT-ζ质粒稀释到50μl双蒸水中，再加入50μl 500mM的氯化钙，混匀。将混合物逐滴加入到等体积的2xHeBs溶液中，混匀。室温温育15分钟后，将沉淀加入细胞中，37℃，温育5小时，换培养基。
2xHeBs溶液：每100ml 2xHeBs溶液中含有Nacl 1.636g，HEPES 1.19g，Na2HPO40.0213g，pH值为7.00。
2、嵌合抗体GPAT-ζ在293T细胞中的表达
转染48小时后，消化转染的293T和对照293T细胞，4℃，300g离心5分钟，将沉淀重悬在裂解缓冲液(0.5％NP40in PBS)中，细胞浓度调整为1x107个细胞/毫升，冰浴10分钟后，13,000rpm，4℃，离心15分钟，吸上清，加入4xSDS上样缓冲液中，94℃加热5分钟。将10μl样本加入10％SDS-PAGE的上样孔中，用抗myc的单克隆抗体(Epigenbiotec)做免疫印记检测，检测GPAT-ζ在真核细胞293T中的表达。
实验设3次重复，结果如图5B所示。检测到一条分子量大小为35kDa的蛋白条带(第2泳道)，这与预测的分子量大小不太一致(约为33kDa)，这是由于抗体片段或跨膜区的糖基化造成的。该结果显示嵌合抗体能在真核细胞中成功表达。
三、GPAT-ζ嵌合抗体在NK-92-MI细胞中的表达
NK-92-MI细胞购自ATCC，产品目录号为CRL-2408。
1、NK-92-MI细胞的基因修饰
用电转染方法将pEF-GPAT-ζ重组质粒转入NK-92-MI细胞。
NK-92-MI细胞用the sysytem进行电转。1.5x106个NK-92-MI重悬在0.1毫升电转缓冲液中，加入4μg pEF-GPAT-ζ质粒，混匀。电转后(电转参数：脉冲电压1000v；脉冲宽度50毫秒；脉冲数1)，将细胞放入1毫升含10％胎牛血清，不含抗生素的1640培养基中，培养48小时后，加入0.6mg/ml的G418，选择正确转入pEF-GPAT-ζ重组质粒的阳性细胞，命名为NK-92MI-GPAT-ζ阳性细胞。
2、富集表达GPAT-ζ嵌合抗体的NK-92-MI细胞
通过FACS分选富集高表达嵌合抗体的NK-92-MI-GPAT-ζ细胞。将1x107G418抵制的NK-92MI-GPAT-ζ细胞重悬在1mlPBS缓冲液中，加入20μg抗myc的单克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，用PBS洗两次，细胞重悬在1mlPBS中，加入20μg FITC标记的山羊抗小鼠的IgG多克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，用FACSCalibur(BD Biosciences)进行分选。
实验设3次重复。结果如图5C-c所示。分选得到的细胞显示了均一的、高水平的GPAT-ζ表达。这些NK-92-MI-GPAT-ζ细胞群体用在接下来的实验中。
3、嵌合抗体GPAT-ζ在NK-92-MI细胞表面的表达
将5x105个NK-92-MI-GPAT-ζ和5x105个NK-92-MI细胞分别重悬在100μl PBS中，加入1μg抗myc的单克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，PBS洗两次后，将细胞重悬在100μl PBS中，加入1μg FITC标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(Epigenbiotec)，冰浴30分钟，PBS洗两次，将细胞重悬在500μl PBS中，用GuavaEasycyte mini(Guava Technologies.Inc，CA)流式细胞仪检测表面表达。
将1x106个NK-92-MI-GPAT-ζ和1x106个NK-92-MI细胞分别重悬在100μl PBS中，加入1μg HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)PE-标记的四聚体(Epigenbiotec)，37℃温育30分钟。PBS洗两次，将细胞重悬在500μl PBS中，用GuavaEasycytemini(Guava Technologies.Inc，CA)流式细胞仪检测表面表达。
实验设3次重复。结果GPAT-ζ嵌合抗体在NK-92-MI细胞表面的表达通过四聚体染色得到证实。多于90％富集的NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能特异结合可溶性的HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)四聚体(图5C-a)，而不能结合可溶性的HLA-A2/Core18-27四聚体或HLA-A2/p65495-503四聚体(图5C-b)；而且，对照NK-92-MI细胞不能结合可溶性的HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)四聚体(图5C-a)，这说明GPAT-ζ嵌合抗体对抗原的结合有特异性。
四、NK-92-MI-GPAT-ζ和NK-92-MI细胞的细胞毒活性
人黑色素瘤细胞Malme-3m购自ATCC，产品目录号HTB64；人黑色素瘤细胞Mel-624(Peter Shamamian，Marie Mancini，Yutaka Kawakami，Nicholas P.Restifo，Steven A.Rosenberg，and Suzanne L.Topal ian.Cancer ImmunolImmunother.1994 August；39(2)：73-83.)中国科学院微生物研究所。
通过以FACS为基础的检测方法分析NK-92-MI-GPAT-ζ和母本NK-92-MI细胞对gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)肽脉冲的T2细胞、p65495-503肽或Core18-27肽脉冲的T2细胞的杀伤活性。
对于T2细胞的肽脉冲：3x106个T2细胞用PBS洗两次，重悬在0.1ml完全的1640培养基中，分别加入0.01ml 0.2M的gp100209-217(IMDQVPESV)(215E)(IMDQVPESV)或p65495-503 (NLVPMVATV)或Core18-27(FLPSDFFPSV)肽，37℃温育4小时。对于靶细胞的5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(Sigma-aldrich，st.Louis，MO)染色：2x106个靶细胞(人黑色素瘤细胞Malme-3m，人黑色素瘤细胞Mel-624或T2)或2x106个肽脉冲的T2靶细胞用PBS洗两次，重悬在0.25ml 0.2％BSA/PBS溶液中。将1.5μl 5mM的5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯稀释到2.5ml 0.2％BSA/PBS溶液中，混匀。将0.25ml的上述稀释液加入0.25ml的细胞悬液中，混匀，避光，37℃水浴10分钟，期间振摇2-3次，加入0.5ml的胎牛血清终止染色，PBS洗细胞两次，用完全1640培养基重悬靶细胞。调整细胞浓度为1x105个/ml，将靶细胞按照100μl/孔加入96孔圆底聚苯乙烯板中，自发释放孔再加入100μl完全1640培养基，实验组再分别加入100μlNK-92-MI效应细胞或NK-92-MI-GPAT-ζ效应细胞。每种效应细胞设置6个不同的效靶比32∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1和1∶1。将细胞混匀，300g离心5分钟，37℃，5％CO2温育4小时。温育后，将细胞悬液转移到1.5ml的小离心管中，混匀，加入1μl 1mg/ml的碘化丙啶(Sigma-aldrich，st.Louis，MO)，冰上放置3分钟后加入100μl完全1640培养基，用Guava Easycyte mini(Guava Technologies.Inc，CA)检测荧光强度。同时，设置仅含靶细胞或效应细胞的对照管。5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯和碘化丙啶双阳性的细胞为死亡的靶细胞。杀伤率的计算公式：5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯和碘化丙啶双阳性的细胞数/5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯单阳性的细胞数。
实验设3次重复。
检测NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)肽脉冲的T2细胞、p65495-503肽或Core18-27肽脉冲的T2细胞的杀伤活性的实验结果表明，仅gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)肽脉冲的T2细胞能被NK-92-MI-GPAT-ζ细胞裂解，而p65495-503肽或Core18-27肽脉冲的T2细胞都不能被NK-92-MI-GPAT-ζ细胞裂解(图6，1表示gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)肽脉冲的T2细胞，2表示p65495-503肽脉冲的T2细胞，3表示Core18-27肽脉冲的T2细胞)。对照NK-92-MI细胞不能裂解任何一种肽脉冲的T2细胞。以上结果显示，GPAT-ζ嵌合抗体能特异识别并激活NK-92-MI细胞对表达HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)的靶细胞的杀伤活性。
检测NK-92-MI-GPAT-ζ细胞对人黑色素瘤细胞Malme-3m、Mel-624或T2细胞的杀伤活性的实验结果表明，NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能特异裂解表达HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物的Malme-3m或Mel-624细胞，而不能裂解HLA-A2+/gp100-的T2细胞(图7，1表示人黑色素瘤细胞Malme-3m，2表示人黑色素瘤细胞Mel-624，3表示T2细胞)。以上结果显示，NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能特异杀伤自然呈递HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物的黑色素瘤细胞。
五、NK-92-MI-GPAT-ζ和NK-92-MI细胞的体内抗肿瘤活性
雄性bablc nu/nu裸鼠(4-6周龄)购自北京大学医学部实验动物中心。
将右腋接种1x107个Malme-3m肿瘤细胞的裸鼠任意分组，每组6只，再用NK-92-MI-GPAT-ζ细胞加以治疗，记录肿瘤体积，记录天数为32天。具体方法为：将Malme-3m细胞(1x107个/0.2ml PBS)注射到裸鼠的右腋皮下(第0天)，NK-92-MI或NK-92-MI-GPAT-ζ细胞(5x107个细胞/注射/0.2ml PBS)或对照PBS在第1天和第5天注射到相同的位置。肿瘤直径每周观察两次，肿瘤体积根据下面的公式计算：肿瘤体积＝长x(宽)2x 0.5。组间统计学差异通过双尾Student’s t检验评价。当肿瘤直径达到3.0cm时，将所有小鼠杀死。P＜0.05被认为具有显著统计学差异。
实验设3次重复。结果如图8所示(1表示NK-92-MI-GPAT-ζ细胞实验组，2表示NK-92-MI细胞对照组，3表示PBS对照组)，表明，与PBS对照组相比，NK-92-MI细胞治疗组没有显著的抑瘤作用(P＞0.05)。相反，与对照组相比，NK-92-MI-GPAT-ζ治疗组能显著抑制肿瘤的生长(P＜0.05)。与NK-92-MI治疗组相比，在治疗的晚期(第22到第32天)，NK-92-MI-GPAT-ζ治疗组显示了明显的统计学差异(P＜0.05)(图8)。以上结果显示，NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能有效减慢表达HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物的肿瘤在小鼠体内的生长，即NK-92-MI-GPAT-ζ细胞能在体内杀伤呈递HLA-A2/gp100209-217(215E)(IMDQVPESV)复合物的肿瘤。
序列表
<110>中国科学院微生物研究所
<120>一种嵌合抗体及免疫细胞
<160>8
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Ala Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Val Asp Ala Met Ala Trp Phe
20 25 30
Arg Gln Thr Arg Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Ser Arg
35 40 45
Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser
50 55 60
Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser
65 70 75 80
Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Tyr
85 90 95
Trp Arg Gly Ser Tyr Tyr Thr Glu Gly Asn Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Arg Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210>3
<211>50
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile
1 5 10 15
Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile
20 25 30
Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp
35 40 45
Arg Lys
50
<210>4
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210>5
<211>360
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gcgtctgggg gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 60
ggacgcacct tcaatgtcga tgccatggct tggttccgcc agactcgcgg gaaggagcgt 120
gagtttgtag cagctattag ccggagtggt ggtagcacgt actatgcaga ctccgtgaag 180
ggccgattca gcatctccaa agacaacgcc aaaaacacga tgtatctgca aatgaacagc 240
ctcaaacctg aggacacggc catttattac tgtgcagctg caatctactg gcgtggtagt 300
tactacactg aaggcaacta tgactactgg ggccagagga cccaggtcac cgtctcctca 360
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 30
<210>7
<211>150
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>7
cccaagcccc tcaccctgag atgggagccg tcttcccagc ccaccatccc catcgtgggc 60
atcattgctg gcctggttct ctttggagct gtgatcactg gagctgtggt cgctgctgtg 120
atgtggagga ggaagagctc agatagaaaa 150
<210>8
<211>339
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
Claims (12)
1.一种嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、跨膜区片段、胞内区片段；所述目的抗体为识别MHC-肽复合物的肽特异性的抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述跨膜区片段为HLA-A2分子的跨膜区片段；所述胞内区片段为CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段。
2.一种嵌合抗体，其氨基酸序列由N端至C端依次为目的抗体、标签、跨膜区片段、胞内区片段；所述目的抗体为识别MHC-肽复合物的肽特异性的抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述跨膜区片段为HLA-A2分子的跨膜区片段；所述胞内区片段为CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段；所述标签为Myc标签。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗体，其特征在于：所述HLA-A2分子的跨膜区片段的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
4.根据权利要求2所述的嵌合抗体，其特征在于：所述Myc标签的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述HLA-A2分子的跨膜区片段的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
5.一种单域抗体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示。
6.表达权利要求1-5中任一所述抗体的免疫细胞。
7.权利要求5所述单域抗体或权利要求1-4中任一所述嵌合抗体的编码基因。
8.根据权利要求7所述的编码基因，其特征在于：
权利要求5所述单域抗体的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列5所示的DNA分子；
权利要求2或4所述嵌合抗体中所述Myc标签的编码基因为序列表中序列6所示的DNA分子；
权利要求1-4中任一所述嵌合抗体中所述HLA-A2分子的跨膜区片段的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列7所示的DNA分子；
权利要求1-4中任一所述嵌合抗体中所述CD3复合蛋白ζ链的胞内区片段的编码基因为核苷酸序列是序列表中序列8所示的DNA分子。
9.含有权利要求8所述编码基因的重组载体。
10.含有权利要求8所述编码基因的重组菌。
11.含有权利要求8所述编码基因的转基因细胞系。
12.含有权利要求8所述编码基因的表达盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010033761 CN102120772B (zh) | 2010-01-08 | 2010-01-08 | 一种嵌合抗体及免疫细胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010033761 CN102120772B (zh) | 2010-01-08 | 2010-01-08 | 一种嵌合抗体及免疫细胞 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102120772A CN102120772A (zh) | 2011-07-13 |
| CN102120772B true CN102120772B (zh) | 2013-05-08 |
Family
ID=44249457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010033761 Expired - Fee Related CN102120772B (zh) | 2010-01-08 | 2010-01-08 | 一种嵌合抗体及免疫细胞 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102120772B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104561069A (zh) * | 2013-10-23 | 2015-04-29 | 深圳先进技术研究院 | 含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用 |
| CN107663239A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-02-06 | 天津天锐生物科技有限公司 | 一种识别hla‑a2/nlvpmvatv的单域抗体 |
| CN107686522A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-02-13 | 天津天锐生物科技有限公司 | 一种识别hla‑a2/sllmwitqc的单域抗体 |
| CN108276493B (zh) * | 2016-12-30 | 2023-11-14 | 南京传奇生物科技有限公司 | 一种嵌合抗原受体及其应用 |
| EP3549597A1 (en) * | 2018-04-06 | 2019-10-09 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Synthetic signalling constructs and its use |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1613873A (zh) * | 2003-11-08 | 2005-05-11 | 中国科学技术大学 | 抗肿瘤表面抗原p185单抗嵌合抗体及其制备方法 |
-
2010
- 2010-01-08 CN CN 201010033761 patent/CN102120772B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1613873A (zh) * | 2003-11-08 | 2005-05-11 | 中国科学技术大学 | 抗肿瘤表面抗原p185单抗嵌合抗体及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 袁建林等.抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达.《第四军医大学学报》.2001,(第五期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102120772A (zh) | 2011-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11466085B2 (en) | Anti-PD-L1 nanobody, coding sequence and use thereof | |
| CN109096395B (zh) | 阻断型cd47纳米抗体及其用途 | |
| JP5225266B2 (ja) | 融合タンパク質、その使用、およびその製造方法 | |
| JP5148804B2 (ja) | 癌の治療に特に有用な免疫擬装の方法及び薬学的組成物 | |
| Zhang et al. | Retargeting NK‐92 for anti‐melanoma activity by a TCR‐like single‐domain antibody | |
| AU2002363861A1 (en) | Antigen presenting cell targeting conjugate, an intigen presenting cell contacted with such conjugate, their use for vaccination or as medicament, and methods for their production or generation | |
| US20080293636A1 (en) | Protein Constructs Designed for Targeting and Lysis of Cells | |
| CN102120772B (zh) | 一种嵌合抗体及免疫细胞 | |
| KR20230017226A (ko) | Cd40 결합 단백질 | |
| CN115403671A (zh) | 靶向Claudin18.2的纳米抗体及其用途 | |
| CN115068625A (zh) | Pd-l1和tlr7双靶向纳米抗体偶联药物及其在抗肿瘤中的应用 | |
| US8449889B2 (en) | Immuno-molecules containing viral proteins, compositions thereof and methods of using | |
| JP7462578B2 (ja) | プログラム可能な免疫細胞受容体複合体システム | |
| WO2015172341A1 (zh) | 针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和t细胞抗原的双特异性抗体 | |
| Novak et al. | Selective antibody‐mediated targeting of class I MHC to EGFR‐expressing tumor cells induces potent antitumor CTL activity in vitro and in vivo | |
| WO2018121474A1 (zh) | 一种识别hla-a2分子与rmfpnapyl短肽形成的复合物的单域抗体 | |
| CN113461825A (zh) | 一种抗pd-l2纳米抗体及其应用 | |
| US12234273B2 (en) | Programmable immunocyte receptor complex system | |
| WO2024094159A1 (zh) | 靶向人源ror1的单域抗体 | |
| CN117836321A (zh) | 抗牛痘病毒抗原抗体以及相关组合物和方法 | |
| KR20240006506A (ko) | 항-백시니아 바이러스 항원 항체 및 관련 조성물 및 방법 | |
| CN116410332A (zh) | 抗间皮素纳米抗体嵌合抗原受体及其应用 | |
| AU2008243241B2 (en) | Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer | |
| CN114605538A (zh) | 靶向cd19的人源化抗体及其用途 | |
| ZA200309308B (en) | Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANTONG BIOLOGICAL SCIENCE PARK DEVELOPMENT INVEST Free format text: FORMER OWNER: MICROBIOLOGY INST., CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Effective date: 20131008 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 100101 CHAOYANG, BEIJING TO: 226002 NANTONG, JIANGSU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20131008 Address after: 226002, No. 118, city road, Gangzha District, Jiangsu, Nantong Patentee after: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Address before: 100101 Beijing city Chaoyang District Datun Road No. 3 Patentee before: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160718 Address after: 100101 Beichen West Road, Beijing, No. 1 hospital, No. 3, No. Patentee after: Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences Address before: 226002, No. 118, city road, Gangzha District, Jiangsu, Nantong Patentee before: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130508 Termination date: 20190108 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |